2. Microscopia y tinción

Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos Objetivos Conocer - La relación entre la estructura y función de los microorganismos Asimilar - La estructura de los procariotas los hace enormemente interesantes en microbiología aplicada Capacidad Manejar las técnicas más frecuentes en un laboratorio de Microbiología y aprenda a plantear experimentos sencillos y a interpretar y discutir científicamente los resultados Manejar, ajustar y mantener los microscopios Teñir y observar microorganismos

Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos Capítulo 2: El estudio de la estructura microbiana: Microscopía y preparación del especimen

Las lentes y el desvío de la luz La luz es refractada (desviada) cuando pasa de un medio a otro El índice de refracción Es una medida del grado en el que una sustancia reduce la velocidad de la luz La dirección y la magnitud de la desviación se determina por los índices de refracción de los dos medios que forman la interfase Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

Lentes Una lente convexa enfocará los rayos luminosos en un punto concreto denominado punto focal (F) La distancia entre el centro de la lente y el punto focal es la distancia focal (f) Los aumentos que proporciona una lente están relacionados con la distancia focal A menores distancias focales  más aumentos Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

El microscopio óptico Tipos Microscopio de campo claro Microscopio de campo oscuro Microscopio de contraste de fase Microscopio de fluorescencia Son microscopios compuestos La imagen se forma por la acción de  2 lentes Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

El microscopio de campo claro Produce una imagen oscura sobre un fondo luminoso En general de 3 a 5 objetivos con lentes diferentes (si la imagen permanece enfocada a medida que se cambian los objetivos el microscopio se denomina parfocal ) Aumento total (producto del aumento de las lentes del ocular y el objetivo) Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

Resolución de un microscopio (d) Capacidad de una lente de separar o distinguir entre objetos pequeños que están próximos La longitud de onda de la luz empleada es un factor fundamental en la resolución (filtro azul en los microscopios del laboratorio) A menor longitud de onda  mayor resolución Distancia de trabajo distancia entre la superficie frontal Fundamentos y tipos de microscopios ópticos Tabla 2.2 Propiedades de los objetivos de un microscopio óptico (n sen θ) θ =Apertura angular d= 0.5 λ/n sen θ n = índice de refracción Aceite de inmersión aumenta el índice de refracción N agua = 1.33 N aceite : 1.45

Microscopio de campo oscuro Produce una imagen iluminada del objeto sobre un fondo oscuro Se emplea para observar organismos vivos en preparaciones sin teñir Treponema Fundamentos y tipos de microscopios ópticos Diafragma de campo oscuro Condensador Abbé = produce un cono hueco de luz

Microscopio de contraste de fases Aumenta el contraste entre las estructuras intracelulares que tienen ligeras diferencias en el índice de refracción Excelente para observar células vivas sin teñir Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

Microscopia de contraste de interferancia diferencial o técnica Nomarski Similar a la de contraste de fases Crea imágenes sobre la base de una detección de diferencias en el índice de refracción y el espesor de la muestra Excelente para observar células vivas Emplea luz polarizada Esto mejora el contraste y da como resultado una imagen tridimensional Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

Brightfield microscopy image of cultured epithelial cells using a 20X objective Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective. Differential Interference Contrast (DIC or Nomarski) image of cultured epithelial cells using a 20X objective.

Microscopía de fluorescencia Expone un especimen a luz ultravioleta, violeta o azul En general, el especimen se tiñe con fluorocromos Se observa, en un fondo oscuro, una imagen brillante del objeto como resultado de la fluorescencia emitida por la muestra Fundamentos y tipos de microscopios ópticos Protozoo flagelado Crithidia luciliae teñido con anticuerpos fluorescentes Live/Dead stainig: Mezcla de Micrococcus luteus y Bacillus cereus (verdes vivas, rojas muertas)

Preparación y tinción de la muestra Aumenta la resolución Acentúa las características morfológicas Conserva la muestra Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica

Preparación (Fijación) Proceso mediante el cual se procesan y fijan en su posición las estructuras internas y externas de la célua Además se mata al microorganismo y se fija firmemente al porta objetos (microscope slide) Fijación por calor Preserva la morfología general pero no las estructuras internas Fijación química Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Ej.: aldehídicos (al formaldehído, el paraformaldehído, el glutaraldehído, la acroleína), el ácido ósmico el tetróxido de osmio los compuestos mercúricos y crómicos, los alcoholes, la acetona, el dietil-pirocarbonato.

Colorantes y tinción simple Colorantes (dyes) Hacen más visibles las estructuras internas y externas aumentando el contraste con el fondo Tienen dos características fundamentales Grupos cromóforos Grupos químicos con dobles enlaces conjugados Dan al colorante su color Afinidad por los componentes celulares se unen mediante enlaces iónicos (los más comunes) , covalentes o hidrófobos Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica

Tipos de tinción Tinción simple Se emplea un solo colorante. Se dividen en dos clases generales Colorantes básicos se emplean frecuentemente Tienen cargas positivas Ej.: Cristal violeta, fucsina básica, safranina, verde malaquita Colorantes ácidos se emplean menos frecuentemente Tienen cargas negativas Ej.: Eosina, Fucsina ácida Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Safranina

Tipos de tinción Tinción diferencial Se emplean dos o más colorantes Divide a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción: Ej.: Tinción de Gram Ej.: Tinción ácido alcohol resistente Tinción de Gram Es la tinción diferencial más empleada Divide a las bacterias en grupos diferentes según diferencias en la pared celular Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica

Gram positiva Gram negativa Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica

Tipos de tinción Tinción Ácido-alcohol resistente (Acid-fast staining) Se tiñen calentando una mezcla de fucsina básica y fenol (Método de Ziehl-Neelsen) Tras la tinción no se decoloran fácilmente debido al elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células En particular ácidos micólicos (lípidos hidroxílicos de cadena ramificada) Mycobacterium leprae Colorante de contraste: azul de metileno Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Particularmente útil en la tinción de miembros del género Mycobacterium Ej., Mycobacterium tuberculosis – causente de la tuberculosis Ej., Mycobacterium leprae – causante de la lepra

Tinción de estructuras específicas Tinción negativa Se emplea frecuentemente para visualizar las capsulas difusas que rodean a algunas bacterias Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden sobre un porta Las capsulas se observan sin color sobre un fondo oscuro Cryptococcus neoformans – tinción negativa con tinta china Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica

Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton) Técnica de doble tinción Las esporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita Después de desteñir se contratiñe con safranina quedando las células vegetativas y las endosporas con colores diferentes Son difíciles de teñir por eso se observan también en tinciones simples Tinción de flagelos Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente colorante como para ser observados Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o fucsina básica (Método de Gray) Tinción de estructuras específicas Bacillus cereus Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Vibrio cholerae O1

Métodos directos el primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo de marcador fluorocromo (pierde fluorescencia con el tiempo) Se pueden emplear varios anticuerpos diferentes Ej.: 3 Sistemas de marcaje inmunocitoquímico Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Tinción de estructuras específicas Métodos indirectos El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso. Es más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la señal. basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder reconocer un gran número de anticuerpos primarios diferentes

Métodos del anticuerpo no marcado o de puente Un problema importante en el uso de anticuerpos (primarios o secundarios) marcados las técnicas químicas de formación de enlace covalente entre el anticuerpo y el marcador pueden destruir parcialmente la reactividad del anticuerpo. En el método de puente sencillos la primera capa está formada por el anticuerpo primario (por ej. obtenido en conejo). La segunda capa por un anti-anticuerpo, secundario (por ejemplo oveja anti conejo), la tercera por un anticuerpo anti-peroxidasa (por ejemplo conejo anti peroxidasa) producido en la misma especie que el primario y la cuarta por peroxidasa. Sistemas de marcaje inmunocitoquímico Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Tinción de estructuras específicas

Microscopio electrónico Se emplean haces de electrones para producir un imagen La longitud de onda de los haces de electrones es mucho menor que la de la luz, dando lugar a un gran aumento de la resolución Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos Límites de resolución de un microscopio 0,2 µm

Microscopio electrónico de transmisión Los electrones se dispersan cuando atraviesan una sección fina de la muestra Los electrones transmitidos (aquellos que no se dispersan) se emplean para producir una imagen Las regiones más densas de la muestra dispersan más electrones y aparecen más oscuras Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos

Microscopio electrónico de barrido Crea la imagen a partir de los electrones reflejados en la superficie de la muestra Produce imágenes en 3D de las características superficiales de la muestra Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos

Preparación de la muestra Los procedimientos son similares a los empleados en microscopía óptica Para la microscopía electrónica de transmisión las muestras deben ser cortadas muy finas (de 1-2 µm a 60 nm) con un ultramicrotomo Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica También pueden fracturarse en frio ( criofractura ) con una cuchilla quedando expuesta la membrana interna

Preparación de la muestra La muestra se fija químicamente (Ej.: Glutaraldehido) y se tiñe con materiales electrodensos (Uranilo, platino y plomo) También puede emplearse inmunodetección si se marcan los anticuerpos con oro coloidal (esferas de 2-3 nm adsorbidas a los anticuerpos) Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica

Ochoa de Alda et al. 2004 Immunolocalization of NblA, a protein involved in phycobilisome turnover, during heterocyst differentiation in cyanobacteria. Microbiology1 50:1377-84. 0,5 µm 0,5 µm Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica

Otros métodos de preparación Sombreado Recubrimiento de la muestra con una capa fina de un metal pesado La muestra se recubre desde un lado de forma que unas áreas se cubren más que otras La zona cubierta, más electrodensa se ve clara y la zona menos cubierta más oscura Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica

Nuevas técnicas de microscoía Se emplean haces de luz láser para iluminar la muestra Un ordenador recoge y agrupa las imágenes de cada punto para generar una imagen tridimensional Permite controlar la profundidad del campo que se observa eliminando o reduciendo la información fuera del plano Permite recolectar secciones ópticas seriadas de especímenes gruesos Nuevas técnicas de microscopía Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL)

Nuevas técnicas de microscopía Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL) Cultured epithelial cells triple stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired with a 20X objective (left) and a 100X objective (right).

Microscopio de efecto tunel (Scanning tunneling microscope, STM) Permite ver átomos (sustancias conductoras) en la superficie de un sólido Un punta muy fina (terminada en un solo átomo) se aproxima a la muestra Una corriente constante (tunneling current) se aplica entre la sonda y la muestra Para mantener la corriente constante a medida que se desplaza la sonda, ésta debe moverse alejándose y acercándose a la muestra Las variaciones de corriente son detectados y empleadas para crear una imagen Tiene una enorme resolución Permite observar incluso átomos Nuevas técnicas de microscopía Microscopía con sonda de Barrido Los electrones que rodean los átomos de la superficie se proyectan desde el borde de la superficie a una corta distancia

Microscopio de fuerza atómica (Atomic force microscope, AFM) Similar a la microscopia de efecto túnel pero para materiales no conductores ya que no aplica un voltaje Un punta muy fina se mueve sobre la superficie de la muestra a una distancia constante A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrónicas de los átomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automático para mantener constante la fuerza recibida. Los movimientos ascendentes y descendentes de la sonda son detectados y empleados para crear una imagen Se emplea para muestras poco conductoras Nuevas técnicas de microscopía Microscopía con sonda de Barrido

Imagen AFM del virus del mosaico de nabo amarillo en el que se observa la estrutura de la cápsula Características superficiales de una espora de Bacillus atrophaeus (a) Espora hidratada (b), Detalle de ésta mostrando estructuras de cilindros ordenados que se pliegan tras hidratarse (c). Imagenes AFM a–e) Imagenes AFM de la compactación progresiva del ADN de levadura por el efecto de la proteína AbF2. Nuevas técnicas de microscopía Microscopía con sonda de Barrido 2 nm Imagen STM del ADN

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