Agitacion

Las células vegetales son capaces de sintetizar una
amplia variedad de sustancias que se han vuelto
indispensables en la vida del hombre. Proteínas,
grasas, carbohidratos, cosméticos, analgésicos,
cardiotónicos, colorantes naturales, aditivos para
alimentos, pesticidas naturales y enzimas, son
ejemplos de ellas. Entre éstas, aquéllas que no son
formadas por las células durante el metabolismo
primario son denominadas metabolitos secundarios.
Muchas de estas sustancias son de alto valor comercial
y están siendo demandadas en cantidades que no
han podido ser satisfechas a nivel mundial, por lo
que la industria química ha hecho grandes esfuerzos
para fabricarlas pero con resultados muy limitados
(Vasconsuelo y Boland, 2007).
Debido a la dificultad de su síntesis química y a que
no son producidos por microorganismos, muchos de
los metabolitos secundarios que son elaborados por
las plantas, continúan obteniéndose por métodos
tradicionales (cultivos en campo). Además de ser
dependientes, entre otros factores, de cambios
climáticos, estacionales, problemas geopolíticos y
tenencia de la tierra; la producción de metabolitos
secundarios de interés comercial mediante cultivos
en campo presenta muchos problemas asociados,
principalmente a variaciones en la calidad y la
cantidad del producto. Todos los inconvenientes
mencionados, sumados al intento de lograr satisfacer
la creciente demanda mundial de sustancias que
son sintetizadas por las plantas, han incentivado la
Efecto de la Relación Agitación-Aireación sobre el Crecimiento Celular y la Producción
de Azadiractina en Cultivos Celulares de Azadirachta indica A. Juss
Agitation-Aeration Relation Effects on Cell Culture of Azadirachta indica A. Juss Neem on Azadirachtin
Production
in a Stirred Tank Bioreactor
Juan Carlos Bedoya Pérez1
y Rodrigo Alberto Hoyos Sánchez2
Resumen. Se evaluó la producción de azadiractina a partir
de células de Azadirachta indica A. Juss, establecidas en un
biorreactor sometido a variaciones en la velocidad de agitación
y el caudal del aire suministrado al medio de cultivo. Además, se
determinó el efecto del oxigeno disuelto en el medio de cultivo,
sobre el crecimiento celular y la producción del metabolito,
mediante la estimación del coeficiente de transferencia de oxígeno
(kL
a), la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR), la velocidad
de consumo de oxígeno (OUR) y el consumo celular específico
de oxígeno (SOUR). Los resultados mostraron que el crecimiento
celular y la producción de azadiractina, están fuertemente
influenciados por las condiciones de mezclado presentes en el
biorreactor, indicando un alto grado de sensibilidad de las células al
estrés hidrodinámico. Por otra parte, se evidenció que los valores
de kLa y OTR aumentaron al incrementar la velocidad de agitación
y aireación, lo que favoreció la transferencia de masa, mientras
que ocurrió lo contrario con la OUR y la SOUR, posiblemente
debido a la pérdida de la viabilidad celular, al incrementar los
esfuerzos cortantes dentro del biorreactor.
Palabras claves: Biorreactor de tanque agitado, cultivo de células
vegetales, coeficiente de transferencia de oxígeno (kL
a), velocidad
de transferencia de oxígeno (OTR), velocidad de consumo de
oxígeno (OUR), consumo específico de oxígeno (SOUR).
Abstract. It was evaluated the production of azadiractin from
cells of Azadirachta indica A. Juss, established in a biorreactor
submitted to variations in the speed of agitation and the air flow
provided to the culture medium. Besides, it was determined
the effect of the oxygen dissolved in the culture medium, on
cellular growth and production of the metabolite, by means of
estimating the oxygen transfer coefficient (kL
a ), oxygen transfer
rate (OTR), oxygen uptake rate (OUR), and the cellular specific
oxygen uptake rate (SOUR). The results showed that the cellular
growth and azadiractin production, are strongly influenced by the
mixed conditions in the biorreactor, indicating a high degree of
sensitivity of cells to the hydrodinamic stress. On the other hand,
it was evident that kLa and OTR values, increased to promote the
agitation speed and air supply, which favoured the mass transfer,
whereas it was opposite with the OUR and the SOUR, possibly
because of the loss of the cellular feasibility, to put up the cut
effects inside the biorreactor.
Key words: Bioreactor stirred tank, plant cell culture, oxygen
transfer coefficient (kL
a), oxygen transfer rate (OTR), Oxygen
uptake rate (OUR), specific oxygen uptake rate (SOUR).
1
Ingeniero Químico. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. A.A. 1779, Medellín, Colombia.
<jcbedoy1@unal.edu.co>
2
Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. A.A. 1779, Medellín, Colombia.
<rhoyos@unal.edu.co>
Recibido: Noviembre 10 de 2008; Aceptado: Febrero 8 de 2010
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín 63(1):5293-5305. 2010

Bedoya, J.C.; Hoyos, R.A.
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín 63(1): 5293-5305. 20105294
búsqueda de métodos de producción alternativos,
entre los cuales, las técnicas biotecnológicas de
cultivo in vitro de células vegetales en condiciones
estáticas o de movimiento en medios de cultivo líquido
han recibido especial atención porque permiten
obtenerlos en cantidades significativas y en términos
económicamente viables (Gerth et al., 2007).
Los procesos biotecnológicos que utilizan células
vegetales en medios de cultivo líquido, son una
importante alternativa de producción, ya que bajo
condiciones controladas no presentan los problemas
del cultivo en campo; sin embargo, la producción a
nivel comercial y competitivo de sustancias con un
alto valor comercial, sólo es posible cuando se utilizan
biorreactores que permitan obtener cantidades
significativas de éstos de una manera rentable
(Murthy et al., 2008). Existen algunas publicaciones
sobre estudios de crecimiento de células vegetales
orientados a la producción de metabolitos secundarios
en biorreactores (Huang et al., 2002; Jeong et al.,
2006; Pakrash y Srivastrava, 2008). Varias especies
han centrado la atención de los investigadores por el
potencial de comercialización de las sustancias que
producen; entre ellas la especie Azadirachta indica
A. Juss, sobresale como una fuente confiable de
compuestos que son altamente eficientes en el control
de plagas que afectan las cosechas de vegetales,
granos y cítricos (Orozco y Rodríguez, 2007).
Entre los más de 300 metabolitos secundarios que
produce A. indica (Orozco y Rodríguez, 2007), los
triterpenoides (limonoides) están considerados como
los principales, de los cuales la azadiractina es el más
importante en el control de insectos. La azadiractina
es un potente bioinsecticida que no afecta los insectos
benéficos, animales o al hombre y su producción
actual, no satisface los requerimientos del mercado
en términos de calidad y cantidad (Capataz, 2005;
Orozco y Rodríguez, 2007); razón por la cual, hace
algunos años se vienen realizando estudios sobre
el cultivo de células de A. indica en biorreactores
que permitan obtener cantidades significativas
de azadiractina de una manera rentable, pero aún
existen muchos problemas que impiden su escalado
y producción a nivel industrial (Raval et al., 2003;
Pakrash y Srivastra, 2005a, 2007, 2008).
Se han desarrollado medios de cultivo y propuesto
algunas condiciones adecuadas de operación en el
establecimiento de cultivos celulares de A. indica en
biorreactores (Capataz, 2005; Pakrash y Srivastra,
2005a, 2007, 2008), pero aún no se encuentran
publicados estudios en los que se determinen
condiciones apropiadas de mezclado (Orozco y
Rodríguez, 2007), lo cual se requiere si se tiene en
cuenta que en la producción a gran escala de estos
compuestos, es necesario establecer condiciones
adecuadas de agitación-aireación, que garanticen
la transferencia continua de nutrientes desde
el medio de cultivo hasta las células sin generar
problemas de estrés hidrodinámico que afecten el
crecimiento celular, la producción del metabolito
de interés y que no permitan la caída de la
concentración de oxígeno disuelto en el medio de
cultivo, hasta valores críticos que puedan generar
limitaciones en el proceso (Jeong et al., 2006).
En el caso de procesos microbianos el mezclado
del fluido afecta la fisiología celular y la producción
de metabolitos (Enfors et al., 2001), pero existe
la necesidad de investigar el efecto del proceso
de mezclado sobre la fisiología y metabolismo en
cultivos de células vegetales en biorreactores. En el
aumento de escala, la eficiencia del mezclado tiende
a disminuir debido a la necesidad de aumentar las
velocidades de agitación-aireación, que mantengan
las condiciones de mezclado de pequeña escala,
pero la sensibilidad de las células vegetales a los
esfuerzos cortantes impiden este incremento
lo que puede generar la sedimentación celular,
disminuir el crecimiento celular y al mismo tiempo
la productividad del proceso (Huang et al., 2002).
En la presente investigación se utilizaron las técnicas
in vitro de cultivo de tejido vegetal, para el estudio
del comportamiento de las suspensiones celulares
de A. indica en un biorreactor de tanque agitado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Establecimiento del cultivo de tejido in
vitro de A. indica. Para esta fase se realizó el
procedimiento recomendado por Capataz (2005).
Establecimiento del cultivo en biorreactor.
Preparación de inóculos. Se seleccionaron aquellas
suspensiones que contenían entre 60-80 % (P/V) de
biomasa fresca (entre 12 y 15 g L-1
de biomasa seca)
a las cuales se les realizó control microbiológico,
mediante cultivos en medio sólido (AGAR). En
matraces de 500 mL con un volumen de 40 mL de
medio de cultivo, fueron adicionados 200 mL de las
suspensiones anteriores, las cuales se mantuvieron en

Efecto de la relación agitación-aireación sobre el crecimiento....
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín 63(1): 5293-5305. 2010 5295
un agitador orbital sin aireación forzada a una velocidad
de agitación de 120 rpm. Este material se utilizó a los
siete (7) días para inocular el biorreactor de 7 L.
Modo de operación y características
del biorreactor de tanque agitado con
suspensiones celulares de A. indica. Las
características del biorreactor en el cual se estudió
la cinética de crecimiento de A. indica se especifican
en la Tabla 1. Las células de A. indica se cultivaron
en el biorreactor de 7 L con un volumen efectivo de
trabajo aproximado de 3,0 L. El biorreactor junto
con 2,5 L de medio de cultivo fresco (Capataz, 2005)
fue esterilizado a 121 ºC y 20 lb/pulg2
durante 20
minutos. La inoculación se realizó en cámara de
flujo laminar y se operó a diferentes combinaciones
de agitación (120, 180, 250 rpm) – aireación (0,1;
0,3 vvm) a 27 °C y luz permanente.
Tabla 1. Características del biorreactor para el estudio de las suspensiones de Azadirachta indica A. Juss.
Elemento Medida
Volumen del tanque (L) 7
Volumen de trabajo (L) 2,24 – 6,0
Diámetro interno del tanque (m) 0,16
Diámetro del agitador (m) 0,048
Tipo de agitador Propela marina
Número de bafles 3
Ancho de bafles (m) 0,009
Tipo de aireador Poroso
Diámetro del aireador (m) 0,01
Bajo las condiciones anteriores se realizaron las
fermentaciones batch con células de A.indica.Se evaluó
el crecimiento celular, la variación en la concentración
de azúcares reductores, la producción de azadiractina,
el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno
y el consumo específico de oxígeno. Cada fermentación
tuvo una duración de 30 días.
Métodos analíticos
Determinación de la curva de crecimiento en
el biorreactor. Para la determinación de la curva
de crecimiento se empleó el peso fresco y peso seco
celular. Cada tres (3) días se colectaron muestras de
25 mL de medio de cultivo, de las cuales se tomaron
dos (2) alícuotas de 5 mL cada una. De cada alícuota
se separó el sobrenadante de la biomasa mediante
filtración al vacío utilizando cómo filtro papel Whatman
Nº 1 previamente secado (60 ºC durante 24 horas) y
pesado. La biomasa retenida, junto con el filtro fue
secada a 60 ºC durante 24 horas, para luego ser
pesada nuevamente; en tanto que, el medio libre de
células (sobrenadante), fue utilizado para realizar la
determinación de azúcares reductores en el medio y
de azadiractina extracelular (Orozco, 2002).
Determinación de azúcares reductores. Se empleó
el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller,
1959). De cada alícuota (numeral 2.3.1) se tomaron
0,5 mL del sobrenadante al 10% (se mezclaron 50 μL
de sobrenadante con 450 μL de agua destilada) y
se agregaron 0,5 mL de reactivo DNS. Todas las
muestras fueron agitadas vórtex durante 30 seg y
colocadas a ebullir en baño María por cinco min.
A continuación, fueron enfriadas con agua-hielo,
posteriormente se les adicionaron 14 mL de H2
O
destilada. Se dejaron reposar durante quince
(15) min para luego leer la absorbancia en un
espectrofotómetro a 540 nm. La curva de calibración
se realizó a partir de un stock de glucosa (4 mg mL-
1
) haciendo diluciones para obtener concentraciones
desde 0,02 hasta 0,1 g L-1
.
Extracción y cuantificación de azadiractina por
cromatografía líquida (HPLC). La determinación
del contenido intracelular de azadiractina se realizó
a muestras celulares provenientes de callos friables
y suspensiones celulares en matraces agitados, y
a aquellas muestras tomadas cada tres días del
biorreactor. En los dos primeros casos (callos y
suspensiones) se eligieron al azar 3 muestras;
de cada uno de los callos, se tomaron 2 g (peso
fresco) y de cada una de las suspensiones se
tomaron 20 mL de solución homogenizada
mediante agitación magnética; el resto de la
biomasa fue utilizada para determinar la relación
peso seco/peso fresco. En el caso de las muestras
tomadas del biorreactor, se realizó la extracción de
azadiractina a partir de 15 mL de muestra de cultivo.

Cada muestra fue centrifugada a 3.000 rpm durante
10 min, la biomasa se lavó con suficiente agua
destilada y fué macerada, para posteriormente hacer
la extracción con metanol, CH3
OH (3 x 10 mL). En
seguida los extractos metanólicos se mezclaron y
concentraron al vacío en un rotoevaporador R-3000
Büchi por debajo de 45 °C hasta sequedad; después
se adicionaron 10 mL de agua destilada más 1 mL
de cloruro de sodio (NaCl 5% p/v) y se extrajeron
nuevamente con diclorometano, CH2
Cl2
(3 x 10 mL).
Las fases acuosas fueron descartadas y las capas
de diclorometano se combinaron y se secaron con
2 g de sulfato de magnesio (MgSO4
) para retirar el
exceso de agua. Los extractos se rotoevaporaron
nuevamente hasta sequedad y fueron re-disueltos en
2 mL de metanol HPLC y almacenados a -4 °C (Balaji
et al., 2003; Capataz, 2005; Dai et al., 1999; Giraldo
et al., 2002; Mordue et al., 1995; Schaaf, 2000).
En el caso de metabolitos extracelulares, 10 mL
de muestra libre de células del biorreactor fueron
mezclados con 5 mL de diclorometano en un embudo
de separación y agitados por 1 min. Posteriormente,
la fase de diclorometano fue removida. Este
procedimiento se realizó 3 veces y todas las fracciones
de diclorometano fueron combinadas retirando el
exceso de agua con sulfato de magnesio (MgSO4
)
el cual fue removido por filtración. Los extractos
extracelulares fueron rotoevaporados al vacío hasta
sequedad por debajo de 45 ºC, re-disueltos en 2 mL
de metanol HPLC y almacenados a -4 °C.
Los extractos se analizaron mediante HPLC utilizando
alícuotas de 10 mL en una columna LiChroCART
125-4 LiChrospher 100 RP-18 (125 mm x 4,6 mm
D.I, diámetro de poro 5 µm) (Merck, Alemania). Se
utilizó como fase móvil acetonitrilo: agua (30:70),
empleando una velocidad de flujo de 0,7 mL min-1
durante 8 min; los picos fueron detectados a 218 nm.
La cantidad de azadiractina presente fue calculada
por comparación de las áreas bajo la curva o picos
de absorción obtenidos para cada muestra y una
muestra de referencia de azadiractina al 95% de
pureza (Sigma A 7430), para lo cual se utilizó una
curva estándar generada por la inyección directa de
diluciones sucesivas (0,5; 2,5; 5; 10; 30; 60; 80; 100;
150 y 200 ppm) (Capataz, 2005; Schaaf, 2000). Cada
inyección (10 µL) fue repetida tres veces utilizando
un automuestreador.
Evaluación del consumo y el coeficiente
volumétrico de transferencia de oxígeno (kL
a).
La tensión de oxígeno disuelto, TOD (porcentaje de la
concentración de saturación de oxígeno en el medio),
fue monitoreada continuamente utilizando un
sensor de oxígeno disuelto (D100 Series OxyProbe,
Broadley and James Corp.); el consumo de oxígeno
y el coeficiente volumétrico de transferencia de
oxígeno, kL
a, se estimaron cada 3 días mediante
el método dinámico sin control de oxígeno disuelto
(Trejo et al., 2007).
Diseño experimental. Los efectos de la variación en
la velocidad de agitación, aireación y de su interacción
sobre la cinética de crecimiento de A . indica y la
producción de azadiractina en un biorreactor agitado
de 7 L fueron estudiados mediante un diseño factorial
3x2 (Tabla 2). Todos los tratamientos se hicieron por
duplicado con dos repeticiones para cada análisis
realizado. Las muestras se tomaron cada tres días
durante los 30 días de cultivo correspondientes a
cada tratamiento, para la estimación de cambios en el
tiempo de la concentración de biomasa, concentración
de glucosa y producción de azadiractina. Igualmente,
cada 3 días se evaluó el coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno (kL
a), el consumo de oxígeno
Tabla 2. Factores y niveles del diseño experimental empleados en el estudio de las suspensiones de Azadirachta
indica A. Juss.
Factores Niveles
Agitación (rpm) 120 180 240
Aireación (vvma
) 0,1 0,3
a
Volumen aire/(volumen de medio/minuto)
(OUR) y la velocidad de transferencia de oxígeno al
medio de cultivo (OTR).
Los valores obtenidos para cada una de las variables-
respuesta mencionadas, se utilizaron para establecer
estadísticamente, con un nivel de significancia del
5%, la influencia de cada factor y su interacción sobre

el desempeño del proceso. Otras variables como:
concentración máxima de biomasa, concentración
máxima de azadiractina y los valores promedios de
contenido intracelular de azadiractina, kL
a, OTR y
OUR, fueron también consideradas como variables-
respuesta para establecer diferencias entre las medias
de cada tratamiento y la influencia de los factores, así
como su interacción sobre las variaciones consideradas
significativas. Se utilizó la prueba de Fisher con un
nivel de confianza del 95%. Todos los datos fueron
analizados con el paquete estadístico SAS System para
Windows, versión 6.12., utilizando como apoyo para
digitación de datos, la realización de tablas y gráficas
del programa Microsoft Office Excel 2003.
RESULTADOS
Las condiciones de trabajo (agitación, aireación)
correspondientes a los tratamientos realizados, los
parámetros cinéticos (productividad de biomasa,
productividad volumétrica, velocidad específica de
crecimiento, tiempo de duplicación) y las máximas
concentraciones de biomasa y producto obtenidas se
encuentran en la Tabla 3.
Crecimiento celular de A. indica en el
biorreactor. En la Figura 1 se presentan las
concentraciones de biomasa obtenidas en cada
uno de los tratamientos. Las concentraciones (g/l)
promedio de biomasa obtenidas durante la fase
estacionaria fueron 11,97 ± 0,72 (120 rpm, 0,1
vvm), 11,09 ± 0,79 (120 rpm, 0,3 vvm), 8,96 ±
0,30 (180 rpm, 0,1 vvm), 8,05 ± 0,17 (180 rpm,
0,3 vvm), 5,92 ± 0,19 (240 rpm, 0,1 vvm) y 5,10 ±
0,25 (240 rpm, 0,3 vvm).
Mediante el análisis estadístico se determinó que la
velocidad de agitación y el caudal de aire suministrado
al medio de cultivo tuvieron un efecto significativo
sobre la concentración máxima celular obtenida.
Tabla 3. Parámetros cinéticos promedios obtenidos para cultivos celulares de Azadirachta indica A. Juss bajo
diferentes combinaciones de agitación-aireación en un biorreactor agitado.
Agitación
(rpm)
Caudal aire
(vvm)
Biomasa
máxima
(g seco L-1
)
Aza. máxima
(mg L-1
)
Qxa
(g seco/L-1
d-1
)
Qpb
(mgAza/L-1
d-1
)
μc
(1 d-1
)
tdd
(d)
120 0,1 12,80 ± 1,21 6,71 ± 0,37 0,430 ± 0,042 0,220 ± 0,015 0,083 ± 0,004 8,4 ± 0,33
120 0,3 11,99 ± 0,87 6,47 ± 0,41 0,394 ± 0,017 0,216 ± 0,023 0,078 ± 0,003 8,9 ± 0,17
180 0,1 8,51 ± 0,59 3,15 ± 0,27 0,291 ± 0,021 0,077 ± 0,006 0,062 ± 0,003 11,2± 0,43
180 0,3 9,14 ± 0,93 4,31 ± 0,19 0,298 ± 0,035 0,127 ± 0,011 0,058 ± 0,005 12,0± 0,26
240 0,1 6,01 ± 0,24 1,30 ± 0,06** 0,170 ± 0,012 ------ 0,022 ± 0,006 31,5± 0,31
240 0,3 5,22 ± 1,03 0,83 ± 0,18** 0,114 ± 0,009 ------ 0,044 ± 0,002 15,8± 0,49
a
Productividad de Biomasa: Qx = (Concentración biomasa máxima – Concentración biomasa inicial) / días
de cultivo.
b
Productividad de Producto: Qp = (Concentración Aza. máxima – Concentración Aza. inicial) / días de cultivo.
c
Velocidad Específica de Crecimiento (Fase exponencial): µ = Ln (x/x0
) /(t-t0
), x y x0
son las concentraciones
celulares en la fase exponencial en el tiempo t y t0
respectivamente. t0
es el tiempo en el que inicia el crecimiento
exponencial. µ se calculó como la pendiente de la recta obtenida en un gráfico de Ln (x/x0
) vs. (t-t0
),
d
Tiempo de Duplicación: td = (Ln 2)/ µ.
Concentración de azúcares reductores en
el medio de cultivo. Las concentraciones de
azúcares reductores en el medio se incrementaron
significativamente durante los 12 primeros días del
cultivo (Figura 2). En el caso de las fermentaciones
realizadas a 120 y 180 rpm el crecimiento celular llegó
a una fase estacionaria correspondiente al agotamiento
de la fuente de carbono en el medio de cultivo. En
las corridas realizadas a 240 rpm, el crecimiento
celular se detuvo aún con la presencia de azúcares
reductores en concentraciones superiores a 5 g L-1
.
Producción de azadiractina. Los resultados
obtenidos para la concentración intracelular de
azadiractina en las muestras tomadas a partir
de callos y suspensiones se presentan como
promedios en la Tabla 4 y para cada uno de los
tratamientos realizados en la Figura 3. Se registró
una disminución del 57,1% en la concentración de
este metabolito al pasar de medio sólido (callo)
a medio líquido (suspensión). No se encontró la
presencia de azadiractina extracelular en ninguna
de las muestras analizadas.

0
2
4
6
8
10
12
14
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Tiempo (días)
Azúcaresreductores(gL-1
)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Tiempo (días)
Biomasa(gcelsecasL-1
)
Figura 1. Concentraciones celulares de Azadirachta indica A. Juss en el biorreactor para diferentes
combinaciones de agitación-aireación. (◊) 120 rpm-0.1 vvm, (□) 120 rpm-0,3 vvm, (+) 180 rpm-0,1 vvm, (x)
180 rpm-0,3 vvm, (*) 240 rpm-0,1 vvm, (○) 240 rpm-0,3 vvm.
Figura 2. Concentración de azúcares reductores en las suspensiones celulares de Azadirachta indica A. Juss
en el biorreactor para diferentes combinaciones de agitación-aireación. (◊) 120 rpm-0,1 vvm, (□) 120 rpm-0,3
vvm, (+) 180 rpm-0,1 vvm, (x) 180 rpm-0.3 vvm, (*) 240 rpm-0,1 vvm, (○) 240 rpm-0,3 vvm.
Figura 3. Concentración de azadiractina en suspensiones celulares de Azadirachta indica A. Juss para
diferentes combinaciones de agitación-aireación en el biorreactor. (◊) 120 rpm-0.1 vvm, (□) 120 rpm-0,3 vvm,
(+) 180 rpm-0,1 vvm, (x) 180 rpm-0,3 vvm, (*) 240 rpm-0,1 vvm, (○) 240 rpm-0,3 vvm.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Tiempo (días)
Aza(mgL-1
)

Tabla 4. Concentración intracelular de azadiractina y relación peso/seco peso fresco en callos y suspensiones
celulares de Azadirachta indica A. Juss.
mg Aza/g seco Peso seco/Peso fresco
Callo 0,912 ± 0,223 0,038 ± 0,004
Suspensión 0,391 ± 0,027 0,028 ± 0,003
Figura 4. Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kL
a) para cada combinación agitación-aireación
en suspensiones celulares de Azadirachta indica A. Juss. (∆) 0,3 vvm, (♦) 0,1 vvm.
En términos de la concentración, la velocidad
de agitación fue un factor influyente sobre la
producción de azadiractina, pero no se encontró
efecto sobre esta variable respuesta del caudal
de aire suministrado ni de la interacción entre los
factores analizados. La concentración promedio
de azadiractina en mg azadiractina/ g seco fue
de 0,54 ± 0,07 (120 rpm, 0,1 vvm), 0,60 ± 0,08
(120 rpm, 0,3 vvm), 0,38 ± 0,07 (180 rpm, 0,1
vvm), 0,48 ± 0,06 (180 rpm, 0,3 vvm), 0,21 ±
0,21 (240 rpm, 0,1 vvm) y 0,21 ± 0,26 (240 rpm,
0,3 vvm).
kL
a, OTR, OUR y SOUR. En la Figura 4 se muestran
los valores promedios obtenidos para el kL
a. Puede
notarse un mayor impacto de la velocidad de agitación
sobre este parámetro, aunque a medida que aumenta
la velocidad del agitador, es más significativa la
influencia del caudal de aire suministrado. En general
no se registraron grandes variaciones en el valor de
kL
a durante los 30 días de cultivo para cada una de las
corridas realizadas. Las variaciones más notables se
presentaron en las corridas realizadas a 120 rpm con
una disminución máxima del 23,3% a 0,1 vvm y de
13,2% a 0,3 vvm, con respecto a los valores máximos
obtenidos para el tratamiento respectivo.
En la Figura 5 se muestra la velocidad específica
de consumo de oxígeno (SOUR) en el transcurso
del tiempo para cada uno de los tratamientos. La
actividad metabólica de las células representada
por el consumo específico de oxígeno mostró
grandes variaciones durante las diferentes fases
de crecimiento. Se aprecia que en cada uno de los
tratamientos aumentó en forma significativa, al inicio
de la fase exponencial y luego disminuyó con el
paso del tiempo, pasando por sus valores iniciales
al finalizar esta etapa. Para la fase estacionaria el
consumo de oxígeno cayó drásticamente, indicando
una disminución del metabolismo aerobio celular, lo
cual puede estar asociado a la falta de nutrientes en
el medio, o a la pérdida de viabilidad celular en el
caso de las corridas realizadas a 240 rpm. Respuestas
similares se han obtenido para cultivos de Panax
ginseng (Thanh et al., 2006) y Stizolobium hassjoo
(Huang et al., 2002).
Se realizó una gráfica en la cual se especifican
simultáneamente la velocidad de consumo (OUR) y
la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR). Los
resultados obtenidos para las corridas realizadas a

120 rpm se muestran en la Figura 6. La OTR tuvo
un aumento continuo durante todo el proceso de
crecimiento celular y sufrió una leve disminución
durante la fase estacionaria. La OUR por su parte,
incrementó rápidamente al inicio y durante la fase
de crecimiento exponencial, finalmente disminuyó
en la fase de declive y estacionaria indicando una
fuerte reducción en la actividad metabólica celular,
relacionada con las bajas o nulas velocidades de
crecimiento celular y el agotamiento de la fuente de
carbono en el medio de cultivo. Los máximos valores
de la OTR corresponden a las mínimas concentraciones
de oxígeno registradas en el medio a 120 rpm
(61,8 ± 3,7% y 58,9 ± 2,6% de la concentración
de saturación a 0,1 y 0,3 vvm, respectivamente).
En todas las corridas realizadas la concentración de
oxígeno disuelto decreció levemente durante la fase
lag (donde la concentración de biomasa es pequeña)
y disminuyó rápidamente hasta un nivel mínimo en la
fase exponencial.
En el caso de la velocidad específica de consumo
de oxígeno (SOUR) se encontró un efecto
significativo de la velocidad de agitación y de
aireación, mientras que para la OUR hubo un
efecto significativo de la interacción entre estos
factores.
DISCUSIÓN
Figura 5. Velocidad específica de consumo de oxígeno (SOUR) para cada uno de los tratamientos realizados
en el biorreactor para la producción de azadiractina a partir de cultivos celulares de Azadirachta indica A. Juss.
(◊) 120 rpm-0,1 vvm, (□) 120 rpm-0,3 vvm, (+) 180 rpm-0,1 vvm, (x) 180 rpm-0,3 vvm, (*) 240 rpm-0,1
vvm, (○) 240 rpm-0,3 vvm.
Figura 6. Comparación entre valores experimentales máximos obtenidos para la velocidad de consumo de
oxígeno (OUR) y la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) en la producción de azadiractina a partir
de cultivos celulares de Azadirachta indica A. Juss. . (◊) 120 rpm-0,1 vvm, (□) 120 rpm-0,3 vvm. La línea
punteada corresponde a la OTR y la línea continua a la OUR.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Tiempo (días)
SOUR(mgO2gsecoh-1
)
0
4
8
12
16
20
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Tiempo (días)
----OUR(mgO2L-1
h-1
)
0
4
8
12
16
20
__OTR(mgO2L-1
h-1
)

Crecimiento celular de A. indica en el biorreactor.
Para cada combinación agitación-aireación (Figura 1) las
curvas de crecimiento de cultivos celulares de A. indica
en el biorreactor mostraron un incremento gradual en la
acumulación de biomasa respecto al tiempo, alcanzando
las máximas concentraciones celulares después del día
21 del cultivo. Patrones de crecimiento similares han
sido observados previamente para cultivos celulares de
A. indica en matraces agitados y biorreactores (Capataz,
2005; Raval et al., 2003; Pakrash y Srivastra, 2008) e
igualmente para otros cultivos de células vegetales
como Panax ginseng (Thanh et al., 2006; Han y Zhong,
2003) Panax notoginseng (Zhong et al., 1999), Taxus
chinensis (Zhong et al., 2002) y Catharantus roseus
(Tate y Payne, 1991).
La concentración y la productividad de biomasa
máximas obtenidas en esta investigación (12,8 g seco
L-1
, 0,43 g seco L-1
d-1
a 120 rpm y 0,1 vvm) superan
los valores obtenidos en investigaciones previas
realizadas con A. indica en la Universidad Nacional de
Colombia sede Medellín, en las que se utilizó el mismo
equipo y montaje experimental de esta investigación
a velocidades de agitación de 200 rpm y caudales
de aire de 0,2 vvm. Muñoz et al. (2006), observaron
concentraciones y productividades máximas de biomasa
de 9,2 g seco L-1
y 0,27 g seco L-1
d-1
respectivamente.
El estrés hidrodinámico creado por velocidades
de agitación superiores a 180 rpm tuvo un efecto
significativo sobre la acumulación de biomasa dentro
del biorreactor. Al comienzo del cultivo (fase lag)
no hubo crecimiento celular como respuesta a la
intensidad de mezclado. Al aumentar la velocidad
de agitación se presentaron fases de acoplamiento
más largas (9, 12 y 15 días a 120, 180 y 240 rpm,
respectivamente) indicando aumentos en los tiempos
de adaptación celular a las nuevas condiciones del
cultivo. Los resultados obtenidos a velocidades de
agitación de 120 rpm, condición de operación bajo la
cual se generó el menor estrés hidrodinámico en esta
investigación, presentaron los mejores rendimientos
en términos de máxima concentración de biomasa
(12,80 ± 1,21 g seco L-1
), velocidad de crecimiento
(0,083 ± 0,004 día-1
), productividad de biomasa
(0,430 ± 0,042 g seco L-1
día-1
) y productividad de
producto (0,220 ± 0,015 mg azadiractina L-1
día-1
).
Para una velocidad de flujo de aire de 0,1 vvm, se
presentó una disminución en la concentración máxima
de biomasa del 28,59% (180 rpm) y 53,05% (240
rpm) respecto a la máxima concentración de biomasa
alcanzada (12,8 g seco L-1
a 120 rpm), mientras que
para un caudal de 0,3 vvm las disminuciones fueron
del 33,52% y 59,22%, respectivamente. Las mejores
productividades de biomasa se lograron con una
velocidad de agitación de 120 rpm (Tabla 3), valores
que representan un aumento en el rendimiento del
190,5% y 194,8% con respecto a los valores obtenidos
a 240 rpm y del 43,1% y 27,4% con respecto a los
valores obtenidos a 180 rpm a velocidades de aireación
de 0,1 y 0,3 vvm, respectivamente. Estas variaciones
significativas muestran la importancia del proceso de
mezclado sobre el crecimiento de células de A. indica
en biorreactores agitados mecánicamente.
En cuanto al caudal de aire suministrado al medio
de cultivo, no se encontró un efecto significativo de
esta variable operacional sobre el crecimiento celular
dentro del rango ensayado. Aunque, en general,
existió una disminución en la velocidad de crecimiento
al aumentar el caudal de aire manteniendo constante
la velocidad de agitación (Tabla 3); además, para
todos los tratamientos evaluados, durante la fase
estacionaria las corridas realizadas a 0,1 vvm
superaron la concentración de biomasa obtenida a
0,3 vvm. La razón de estas diferencias no es clara,
pero la disminución en concentraciones a 0,3 vvm
podría deberse a un mayor grado de arrastre de
compuestos gaseosos del medio (CO2
, C2
H4
y otros
compuestos volátiles), que están implicados en el
crecimiento celular y la producción de metabolitos
secundarios (Smart y Fowler, 1981; Jeong et al.,
2006). Igualmente el aumento en el caudal de aire
de 0,1 a 0,3 vvm incrementó considerablemente la
generación de espuma dentro del biorreactor y su
acumulación sobre la superficie del líquido, lo que
favoreció la separación de las células del medio de
cultivo, su adhesión a las paredes del recipiente y
probablemente afectó la toma de nutrientes por
parte de las células reduciendo las velocidades de
crecimiento y los rendimientos del proceso, efecto
que fue más fuertemente percibido a 180 rpm,
condición en la que se alcanzaron altos niveles de
biomasa y pequeños agregados celulares.
Concentración de azúcares reductores en el
medio de cultivo. La cinética de crecimiento de
las células de A. indica en el biorreactor mostró una
dependencia directa de la concentración de azúcares
reductores en el medio de cultivo. En la Figura 2
se observa cómo durante la fase de latencia (los
primeros 12 días) las células se encargan de desdoblar

la sacarosa para su posterior aprovechamiento.
Esto probablemente indica la presencia de enzimas
secretadas al medio o presentes en la superficie
celular que permitieron la hidrólisis extracelular
de sacarosa y por tanto la formación de glucosa
y fructosa, fenómeno que ha sido observado en
diferentes cultivos de células vegetales (Shin et al.,
2003). En el caso de las fermentaciones realizadas
a 120 y 180 rpm el crecimiento celular llegó a una
fase estacionaria correspondiente al agotamiento
de la fuente de carbono en el medio de cultivo y
posiblemente limitando el proceso de crecimiento
por la falta de nutrientes. En las corridas realizadas
a 240 rpm, el crecimiento celular se detuvo aún con
la presencia de azúcares reductores en el medio de
cultivo con concentraciones superiores a 5 g L-1
, lo
que demuestra que el factor limitante del crecimiento
no estuvo asociado con la fuente de carbono en
el medio y que probablemente el crecimiento fue
afectado por la pérdida de viabilidad celular creada
por la intensidad de mezclado.
Producción de azadiractina. La velocidad de
agitación afectó considerablemente la producción de
azadiractina. Al aumentar la velocidad de agitación
hubo una disminución continua en el contenido
intracelular de azadiractina hasta el punto de no
detectarse la presencia de este compuesto a nivel
intracelular después del día 15 para una velocidad
de agitación de 240 rpm (Tabla 3, Figura 3). A 120
rpm la curva de producción de azadiractina muestra
un patrón similar al de crecimiento celular y, a pesar
de ser un metabolito secundario, su producción
se presenta durante toda la fase de crecimiento,
alcanzando su máximo valor al finalizar esta etapa
(0,66 mg azadiractina/g célula seca a 0,1 vvm y 0,59
mg azadiractina/g célula seca a 0,3 vvm).
En las fases estacionarias correspondientes a las
fermentaciones realizadas a 120 rpm hubo una
disminución en el tiempo, de la concentración
intracelular de azadiractina, lo cual puede estar
directamente relacionado con la formación de
agregados celulares más grandes al finalizar la etapa
de crecimiento exponencial a esta misma velocidad
de agitación. A 120 rpm y a mediados de la fase
exponencial se generó la precipitación de biomasa
al fondo del biorreactor; esta deficiencia en el
mezclado pudo alterar la producción de azadiractina
por limitaciones de oxígeno disuelto. Un aumento
en el tamaño de agregados celulares disminuye los
procesos difusionales y limita la toma de nutrientes
por parte de las células, especialmente aquellas que
se encuentran en el centro de los mismos, alterando
los procesos metabólicos celulares y la producción de
metabolitos secundarios (Zhong et al., 2002).
En la Figura 3 se notan algunas diferencias sobre la
producción de azadiractina generadas por la velocidad
de aireación. En general las concentraciones promedios
de este metabolito en la fase estacionaria fueron
superiores a 0,1 vvm (6,48 y 4,02 mg azadiractina L-1
a
120 y 180 rpm, respectivamente) respecto a los valores
obtenidos a 0,3 vvm (5,95 y 2,79 mg azadiractina L-1
a 120 y 180 rpm, respectivamente) indicando que
la sobre-aireación puede inhibir considerablemente
la producción de azadiractina, efecto que es más
evidente a 180 rpm (disminuciones del 30,6% al
variar la aireación de 0,1 a 0,3 vvm) mostrando que
la interacción entre las variables operacionales es
significativa. La explicación a estas disminuciones
puede radicar en los cambios en la composición
gaseosa del medio por el arrastre de moléculas
volátiles a mayores velocidades de aireación
(Schlatman et al., 1993).
La concentración más alta de azadiractina obtenida
durante el cultivo fue de 6,71 mg L-1
(120 rpm, 0,1
vvm), valor que supera la concentración obtenida en
matraces agitados en estudios previos realizados (4,4
mg L-1
, 120 rpm, luz permanente, 35 ºC) (Capataz,
2005) y da un visto bueno a la posibilidad de realizar
procesos de escalado con esta línea celular. Al
comparar estos resultados con los disponibles en la
literatura en los cuales se observaron productividades
de azadiractina entre 10 y 72,81 mg L-1
en matraces
agitados (Balaji et al., 2003; Capataz 2005; Kuruvilla
et al., 1999; Prakash y Srivastava, 2005a; Raval et
al., 2003) y entre 45 y 81,3 mg L-1
en diferentes
tipos de biorreactores (Prakash y Srivastava, 2005a,
2005b, 2008; Prakash et al.,2005), se hace evidente
la necesidad de realizar estudios sobre otros factores
que afecten el crecimiento celular y la producción
de azadiractina, que permitan obtener mayores
velocidades de crecimiento, concentraciones más
altas de biomasa y de producto que hagan más
atractiva la propuesta de implementar y escalar la
producción in vitro de células de A. indica.
kL
a, OUR Y OTR. La velocidad de agitación y el caudal
de aire suministrado al medio de cultivo afectaron
considerablemente los contenidos de oxígeno disuelto
en el medio de cultivo y los valores de kL
a, OTR y
SOUR. En cada uno de los tratamientos y para el

mismo día de cultivo los contenidos de oxígeno, la
kL
a, OTR y SOUR generalmente incrementaron con
el aumento de la velocidad de agitación y aireación,
mientras, ocurrió lo contrario con los valores de la SOUR,
indicando consecuencias directas de las variaciones de
estos parámetros operacionales sobre las características
del medio de cultivo y las células de A. indica. Las
disminuciones registradas a 240 rpm en la SOUR durante
la fase de crecimiento exponencial y la fase estacionaria
respecto a aquellos obtenidos a velocidades de agitación
de 120 y 180 rpm indican la posible pérdida de viabilidad
celular bajo estas condiciones de operación.
En suspensiones celulares de A. indica la mínima
velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) fue
de 41,6 mg O2
L-1
h-1
a nivel de erlenmeyer con
aireación forzada y a este escala no se encontraron
condiciones limitantes de oxígeno (Raval et al.,
2003). En todas las fermentaciones realizadas en
esta investigación, la mínima OTR obtenida fue de
4,38 mg O2
L-1
h-1
(180 rpm, 0,3 vvm, día 0) mientras
que la máxima SOUR fue de 8,39 mg O2
L-1
h-1
(120
rpm, 0,1 vvm, día 18) a los que correspondieron
valores de 1,45 y 14,02 mg O2
L-1
h-1
para la SOUR
y OTR respectivamente. La mínima diferencia entre
los valores de estos dos parámetros (SOTR-OUR) se
calculó en 0,33 mg O2
L-1
h-1
(180 rpm, 0,1 vvm, día
12). Como lo indican los resultados anteriores, los
valores de la OTR siempre superaron los de la SOUR
indicando que no existieron limitaciones del proceso
en términos de oxígeno disuelto (Figura 6).
De otro lado, la variación en el tiempo de la SOUR
en cultivos celulares de A. indica mostró un patrón
de comportamiento similar al de la concentración
de biomasa y estuvo influenciada por la fase de
crecimiento. Hubo un incremento del valor de este
parámetro durante la fase lag y especialmente
durante la fase de crecimiento exponencial, mientras
que sus valores decrecieron lentamente al finalizar
esta última fase para mantenerse prácticamente
constantes durante la fase estacionaria. Por su
parte, la SOUR incrementó rápidamente durante
la fase lag e inicios de la fase exponencial hasta
alcanzar valores máximos para luego disminuir
a medida que se incrementaba el tiempo de
fermentación. Resultados similares se han obtenido
en cultivos celulares de Stizolobium hassjo (Huang
et al., 2002), Panax notoginseng (Thanh et al.,
2006) y de A. indica en matraces agitados (Raval et
al., 2003).
Los máximos valores de SOUR correspondieron al
inicio de las fases exponenciales del crecimiento
celular (Figura 5) en las que es de esperarse que
ocurra un incremento en la actividad celular asociada
con el inicio de la división celular. A 120 rpm se
registraron las mayores caídas en el valor de este
parámetro respecto a sus valores máximos para
cada tratamiento. Hay que recordar que para esta
misma velocidad de agitación se formaron agregados
celulares más grandes los cuales probablemente
afectaron la transferencia de oxígeno entre el medio
de cultivo y las células disminuyendo la SOUR. A
velocidades de 180 rpm los valores de SOUR
superaron los obtenidos a 120 rpm durante la fase
estacionaria lo cual es debido, probablemente, a que
el aumento en la velocidad de agitación disminuye
el tamaño promedio de los agregados celulares y
mejora la velocidad de transferencia de oxígeno entre
el medio de cultivo y las células (Huang, et al, 2002).
CONCLUSIONES
La velocidad de agitación fue un factor influyente en
el rendimiento de cultivos celulares de A. indica en el
biorreactor. A 120 rpm se generó la mejor condición
de operación en esta investigación, aunque favoreció
la formación de agregados celulares más grandes lo
que pudo provocar la disminución en el contenido
intracelular de azadiractina al final del cultivo. A
180 y 240 rpm se obtuvo un mezclado uniforme
pero existieron disminuciones considerables en los
rendimientos de biomasa y producto que indicaron
un alto grado de sensibilidad de las células de A.
indica ante los esfuerzos cortantes generados bajo
estas condiciones de operación.
La relación agitación-aireación tuvo un efecto
significativo sobre el coeficiente volumétrico de
transferencia y el consumo celular de oxígeno. En
general, al aumentar los niveles de agitación y aireación
se presentaron aumentos considerables en la velocidad
de transferencia de oxígeno al medio de cultivo y
disminuciones en los consumos específicos de oxígeno,
indicando respectivamente, mejoras en la velocidad
de difusión molecular y la posible pérdida de viabilidad
celular ante el incremento en la intensidad del mezclado.
Bajo las condiciones de operación establecidas en
esta investigación no se presentaron limitaciones del
proceso de crecimiento celular y síntesis de azadiractina
asociadas con bajas concentraciones de oxígeno
disuelto en el medio de cultivo.
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