Bacterias
- 1. INFORME “MEDIOS DE CULTIVO” Objetivo: el objetivo del siguiente informe será aprender a preparar un medio de cultivo como medio para la diagnosticaciòn de bacterias patógenas como asítambién conocer los diferentes tipos de cultivo y las distintas colonias. Medios de Cultivo Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Clasificación de los medios de cultivo Según su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente. b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. Según su consistencia a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa. b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio líquido". c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar. Según su composición: A causa de los requerimientos químicos del mundo microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar componentes químicos del medio.
- 2. a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemplo: agar común o caldo común. b) ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. c) SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos). Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos: Cambio de pH Cambio de temperatura: la mayoría de las bacterias crece óptimamente entre 20º C y 40º C. Ajuste en la tensión de oxígeno: es importante en la selección de aerobios y anaerobios. Ajuste en la tensión de anhídrido carbónico: muchos patógenos importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensión más allá de la atmosférica. Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias tenemos: Antisépticos: sustancias antibacterianas inespecíficas que pueden actuar como inhibidores. Por ejemplo: el medio de cultivo comercial S - S (Salmonella - Shigella) que contiene verde brillante (inhibe las bacterias grampositivas) y sales biliares (que inhiben un gran número de gramnegativas menos enterobacterias). Otro ejemplo es el medio de Mc Conkey que contiene cristal violeta (inhibe las grampositivas pero no las enterobacterias) Antibióticos: sustancias antibacterianas específicas que impiden el crecimiento de aquellosmicroorganismos que no nos interesa que crezcan en ese medio. Un ejemplo es el medio de Thayer - Martin con VCN (vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el aislamiento de gonococos. La penicilina inhibe la mayoría de las grampositivas. Otro ejemplo es el medio de Sabourand - cloranfenicol para el aislamiento de Cándida albicans. d) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH. e) DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que contienen un agente que inhibe las especies no deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente infeccioso. El enriquecimiento es una técnica que utiliza un medio selectivo líquido para permitir el desarrollo de un microorganismo a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Así, aquellos microorganismos para los que el ambiente sea más favorable crecerán más que los otros y finalmente serán predominantes
- 3. Un gran número de medios de cultivo usados en el laboratorio de microbiología son mixtos, es decir que tienen como finalidad la de varios grupos de los mencionados. Materiales: Sopa instantánea en sobrecito “Knorr” Agar Agar (es una gelatina vegetal de origen marino) Capsula de Petri Vaso de precipitado Ansa Mechero Muestras de microorganismos (pisos, boca, escaleras, dinero, agua de inodoro, etc.) Procedimiento: Primero debemos preparar una solución de alcohol al 70%, con el cual lograremos mantener estériles tanto los materiales que vamos a utilizar como parte del ambiente en el cual realizamos nuestro procedimiento. El alcohol al 70% tiene la propiedad de desnaturalizar proteínas de bacterias y es más efectivo si se usa un poco diluido que si se usa concentrado (96%). Esto es porque el alcohol deshidrata a las bacterias con las que entra en contacto, es decir, entra en ellas y desplaza al agua que contienen en su interior, dejándolas incapacitadas para ejercer su metabolismo. El hecho de que se use diluido es que de esta forma permanece más tiempo en las superficies para actuar, ya que si se usa concentrado el alcohol se evapora muy rápido. Para la preparación de 100ml de alcohol al 70%, utilizando una alcohol de 96º utilizamos la siguiente formula: C1xV1=C2xV2 donde C1=96º, V1(es el volumen que deseo averiguar), C2=70% y V2=100ml. De la misma concluimos que debemos tomar un volumen de 72,9ml de alcohol al 96% y agregarle agua hasta llegar a un volumen final de 100ml para llevarlo a la concentración deseada. Preparación del medio de cultivo: Peptona de caseína 5g/l Sopa “Knorr”=8g/l Extracto de carne 3g/l Agar 13g/l
- 4. Como usaremos un vaso de precipitado de 700ml, nos queda que debemos 9,1 partes de Agar Agar en 700ml y 5,6 partes de sopa. El medio de cultivo que prepararemos es de tipo “Solido”. 1) Colocamos un vaso de precipitado con agua a calentar sobre un mechero Bunsen. 2) Con el agua hirviendo, agregamos la sopa y mezclamos con una varilla de vidrio hasta que se disuelva bien. 3) Luego se agrega el agar agar. 4) La capsula de Petri por lo general suele estar estéril (autoclave), en nuestro caso usaremos capsulas plásticas. 5) Antes de volcar una porción de la mezcla en la capsula, debemos acercar el borde del vaso de precipitado al mechero para eliminar los rastros de microorganismos y trabajar en el medio másestéril posible.
- 5. 6) Agregamos una porción del medio de cultivo a la capsula de Petri y tapamos. La preparación debe estar tibia, ya que si su temperatura es mayor, puede depositar vapor en la tapa, lo cual “arrastraría” microorganismos hacia la misma. 7) Una vez realizado este paso, se acerca nuevamente el vaso de precipitado al mechero para seguir con las demás muestras. 8) Pasamos un ansa de metal por una solución de alcohol al 70% y tomamos las muestras que luego vamos a sembrar (método Siembra por Extensión) en la capsula, en este caso “dinero de Brasil” y “agua de uno de los inodoros del IMBOQ”. 9) Tapamos las capsulas, las damos vuelta, las rotulamos y las guardamos en un lugar seco (laboratorio del Instituto). Cuando comiencen a aparecer las primeras UFC, para poder contabilizarlas dibujamos una “cuadricula”. 10) Al cabo de las siguientes semanas de observación se experimenta el crecimiento de las primeras UFC.
- 6. 11) En los días siguientes agregamos a la capsula pequeños círculos de papel filtro con un “limpiador especial”, pero no se observaron cambios apreciables. 12) Luego, realizamos el mismo procedimiento pero con alcohol 96º. Se respeta los mismos principios del antibiograma, la cual es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones y se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos. Conclusión: En nuestras muestras obtuvimos un patrón similar al que se observa en la imagen, por lo cual se observa una inhibición del crecimiento de los microorganismos que allí estaban creciendo. Según Brock, se clasifica al Alcohol como antiséptico y desinfectante con concentraciones más efectivas entre el 60-85%, y de forma general en el laboratorio se emplea al 70% para desinfectar. Su efectividad radica en la disolución de lípidos celulares (especialmente las membranas) y la desnaturalización de proteínas.
- 7. 1. Diferenciar entre un adenovirus, virus de la influenza y un bacteriófago. 2. ¿Se puede observar un virus por microscopio óptico? 3. ¿Cómo puede variar el genoma de un virus? 4. ¿Cómo puede variar la cápside de un virus? 5. ¿Qué determina la especificidad de un virus? Explica cómo atacan los distintos virus a las células hospedadoras? 6. ¿Siempre entra la partícula viral durante la infección viral? 7. Describir las distintas estrategias de replicación del genoma viral. 8. Explicar la fase lisogénica y lítica de un bacteriófago. 9. ¿Por qué algunas partículas virales tienen una envoltura lipídica y otras envoltura de proteínas? 10. ¿Qué es un PSTV? 11. ¿Dónde se replica un viroide? 12. ¿Dónde se replican los viroides y los priones? 13. ¿Cuál es la función de un antiviral? O qué función se busca qué tenga un antiviral y por qué?