Colesterol HDL - LDL e Insertos de WienerLab y Valtek
- 1. HDL - LDL CURSO: BIOQUÍMICA DOCENTE: Sandoval Vegas, Miguel INTEGRANTES: Morales Ore, Gladys Quiroz Valverde, Claudia Rojas Vasquéz, Kevin
- 2. LÍPIDOS Grasas del organismo en general. Componentes elementales ácidos grasos. Colesterol miembro de la familia de los lípidos. * Necesario para llevar a cabo funciones vitales de nuestro organismo. * Forma parte de la membrana de todas las células. * Base de muchas hormonas: Cortisol, Testosterona, Progesterona, Vitaminas liposolubles (Vitamina D) y de las sales biliares.
- 3. Colesterol, es una sustancia: Sólida Blanca Cristalina No tiene olor ni sabor
- 4. ORIGEN DE LAS GRASAS DEL ORGANISMO 1. Síntesis interna: Por el hígado que las traslada al intestino a través de la bilis. 2. Ingreso del exógeno a través de la dieta.
- 5. Los lípidos son insolubles en el agua, por lo que se asocian a proteínas para su transporte a través de la sangre LIPOPROTEÍNAS LDL colesterol (Low Density Lipoprotein) HDL colesterol (High Density Lipoprotein)
- 6. FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de baja densidad (LDL) presentes en la muestra, precipitan en presencia de fosfotungstato e iones magnesio. El sobrenadante contiene las lipoproteínas de elevada densidad (HDL), cuyo colesterol se cuantifica espectrofotométricamente mediante las reacciones acopladas descritas a continuación:
- 7. CONTENIDO Y COMPOSICIÓN • A. Reactivo: 1 x 50 mL. Fosfotungstato 0,4 mmol/L, cloruro de magnesio 20 mmol/L. • S. Patrón de Colesterol HDL: 1 x 5 mL. Colesterol 15 mg/dL. Patrón primario acuoso. CONSERVACIÓN Conservar a 2-8ºC. El Reactivo y el Patrón son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminación durante su uso. Indicaciones de deterioro: • Reactivo: Presencia de partículas o turbidez. • Patrón: Presencia de partículas o turbidez.
- 8. REACTIVOS ADICIONALES Estos reactivos auxiliares deben ser utilizados junto con el Reactivo de Colesterol contenido en cualquiera de los kits de Colesterol BioSystems (cod. 11805, 11505, 11506, 11539). PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Tanto el Reactivo como el Patrón están listos para su uso. EQUIPO ADICIONAL Centrífuga de sobremesa Baño de agua a 37ºC (opcional) Analizador, espectrofotómetro o fotómetro para lecturas a 500 ± 20 nm
- 9. MUESTRA Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El Colesterol HDL en suero o plasma es estable 7 días a 2-8ºC. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro, no interfieren.
- 10. PROCEDIMIENTO Precipitación 1. Pipetear en un tubo de centrífuga. 2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Centrifugar durante 10 minutos a un mínimo de 4.000 r.p.m. 4. Recoger con cuidado el sobrenadante (Nota 2). Colorimetría 5. Atemperar el Reactivo (kit de Colesterol) a temperatura ambiente. 6. Pipetear en tubos de ensayo: (Nota 3) 5. Atemperar el Reactivo (kit de Colesterol) a temperatura ambiente. 6. Pipetear en tubos de ensayo: 7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 10 minutos a 37ºC. 8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 30 minutos.
- 11. CÁLCULOS La concentración de colesterol HDL en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general: Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol HDL suministrado
- 12. VALORES DE REFERENCIA Las concentraciones de colesterol de HDL varian considerablemente con la edad y el sexo. El siguiente valor discriminante ha sido recomendado para identificar indivíduos con elevado riesgo de enfermedad coronaria.
- 13. CONTROL DE CALIDAD Se recomienda el uso de los Sueros Control de Lípidos niveles I (cod. 18040) y II (cod. 18041) para verificar la funcionalidad del procedimiento de medida. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, así como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables.
- 14. CARACTERÍSTICAS METROLÓGICAS Límite de detección: 0,3 mg/dL = 0,008 mmol/L Límite de linealidad: 150 mg/dL = 3,9 mmol/L. Repetibilidad (intraserie): Reproducibilidad (interserie): Sensibilidad analítica: 1,75 mA⋅dL/mg = 67,6 mA⋅L/mmol. Veracidad: Los resultados obtenidos con estos reactivos no muestran diferencias sistemáticas significativas al ser comparados con reactivos de referencia. Interferencias: La lipemia (triglicéridos 10 g/L) no interfieren. La hemolisis (hemoglobina > 5 g/L) y la bilirrubina (> 10mg/dL) pueden interferir. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir
- 15. CARACTERÍSTICAS DIAGNÓSTICAS Las HDL participan en la captación del colesterol de los tejidos y en su transporte hacia el hígado donde se elimina en forma de ácidos biliares. Existe una correlación positiva entre concentraciones bajas de HDL-colesterol en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con niveles reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crónicas, hiperalimentación intravenosa, malnutrición severa, diabetes, anemia crónica, alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier, analfalipoproteinemia, estrés agudo, algunos medicamentos y el tabaco. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
- 16. NOTAS: 1. Se pueden modificar los volúmenes de muestra y Reactivo A, manteniendo la misma proporción. 2. El sobrenadante debe ser completamente claro. En caso de persistir la turbidez o de no obtener una buena sedimentación del precipitado, adicionar otros 0,5 mL de Reactivo A, mezclar bien y centrifugar de nuevo. Multiplicar el resultado obtenido por 1,7 para corregir la dilución efectuada. 3. Estos reactivos pueden utilizarse en la mayoría de analizadores automáticos. Solicite información a su distribuidor. 4. La calibración con el patrón acuoso suministrado puede causar sesgos, especialmente en algunos analizadores. En estos casos, se recomienda calibrar usando un patrón de base sérica (Calibrador Bioquímica, cod. 18011 y 18044).
- 17. SIGNIFICANCIA CLINICA El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es precursor de los ácidos biliares, esteroides, y vitamina D. El colesterol es transportado por tres lipoproteínas, la lipoproteína de alta densidad (HDL), la de baja densidad (LDL), y la de muy baja densidad (VLDL). Castelli y colaboradores han reportado que hay una estrecha relación entre los niveles de HDL-Colesterol y el riesgo de enfermedad coronaria. La evaluación de los niveles de HDL-Colesterol y Triglicéridos provee una valiosa herramienta para la predicción de enfermedad coronaria, y la clasificación de las dislipidemias
- 18. FUNDAMENTOS DEL METODO El HDL-Colesterol es obtenido precipitando selectivamente las lipoproteínas LDL y VLDL, quedando el primero en solución. El HDL-Colesterol en solución se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm.
- 19. Conservados entre 15° y 30°C. y protegidos de la luz, estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Composición del Reactivo: Acido fosfotúngstico 0,55 mM Cloruro de Magnesio 25 mM Preparación del Reactivo de Trabajo: El reactivo se provee listo para su uso. Debe complementarse el uso del reactivo precipitante con el reactivo para la determinación enzimática de colesterol VALTEK®. REACTIVOS: MUESTRA: Utilizar suero libre de hemólisis. La muestra debe tomarse con el paciente en ayunas. Los tubos y material de vidrio deben estar limpios y libres de residuos de detergentes. El colesterol es estable 7 días a temperatura ambiente, y 6 meses en congelador. MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO Espectrofotómetro manual o automático o fotocolorímetro de filtros con cubeta termoestable, capaz de medir absorbancia a 505 nm. (rango 500 - 550 nm.), baño termoregulado, cronómetro, pipetas, kit Colesterol LS VALTEK®.
- 20. TÉCNICA Precipitación: Agregar en un tubo de centrífuga 0.5 mL de reactivo precipitante y 0.2 mL. de muestra, mezclar y esperar 15 minutos a temperatura entre 20º y 30ºC. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. o 3 minutos a 10.000 r.p.m. Colorimetría: Llevar el reactivo Colesterol Total a la temperatura que se realizará el ensayo. Nota: Utilizar como Standard el provisto en el kit de Colesterol Total, con el valor asignado de 76,5 mg/dL de Colesterol HDL.
- 21. CALCULOS
- 22. CONTROL DE CALIDAD Se recomienda utilizar un control sérico específico para Colesterol HDL. Cada laboratorio debe disponer de su propio Control de Calidad y establecer las correcciones necesarias en caso de que no se cumpla con las tolerancias permitidas para los controles. ADVERTENCIAS Y MEDIDAS DE PRECAUCION Después de centrifugar, el sobrenadante debe ser claro. Sueros con concentraciones de triglicéridos superior a 1000 mg/dL deben diluirse con suero fisiológico antes de precipitar. El resultado obtenido se multiplica por el factor de dilución. La formula para el calculo del LDL-Colesterol es válida sólo en muestras con concentraciones de triglicéridos inferior a 1000 mg/dL
- 23. ESPECIFICACIONES DE DESEMPEÑO Linealidad: hasta 400 mg/dL. Para valores superiores a 400 mg/dL, diluir la muestra con suero fisiológico y el resultado obtenido se multiplica por el factor de dilución. Límite de detección: 1,0 mg/dL. Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = 0.005 A Interferencias: Hemoglobina sobre 0,5 gr/dL, bilirrubina sobre 10 mg/dL y la lipemia (triglicéridos sobre 1000 mg/dL) podrían interferir en la técnica. Otros medicamentos y sustancias podrían interferir
- 24. RANGOS DE REFERENCIA Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de referencia en función de la población de pacientes. Los rangos de referencia que se enumeran a continuación están tomados de la bibliografía existente.
- 25. . FUNDAMENTO Esta técnica emplea un método de separación basado en la precipitación específica de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por acción del sulfato de polivinilo en el suero, sedimentación del precipitado por centrifugación y subsiguiente ensayo como colesterol residual del resto de lipoproteínas (HDL + VLDL) contenidas en el sobrenadante claro. El colesterol-LDL se calcula por diferencia, restando el colesterol del sobrenadante del colesterol total de la muestra
- 26. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD • Conservar a 2-8ºC • MUESTRA: • Suero libre de hemólisis • Ayunas desde la noche anterior a la extracción +12 HRS • La muestra de sobrenadante obtenida tras la precipitación de las lipoproteínas LDL se prepara y ensaya el día de la extracción. • Las muestras pueden conservarse 3 dias a 4-8ºC. No congelar.
- 27. TÉCNICA • PRECIPITACIÓN • Equilibrar reactivos y muestras a temperatura ambiente 10 MINUTOS • Pipetear en tubos de centrífuga rotulados • Centrifugar 10 minutos a 6000 r.p.m. o 2 minutos a 12000 r.p.m. • Separar una alíquota del sobrenadante y medir la tasa de colesterol.
- 28. II. COLORIMETRÍA • Equilibrar los componentes del kit y del Colesterol MR a temperatura ambiente. • Preparar 2 series de ensayos para medir en paralelo el colesterol total del suero y el del sobrenadante. • Seguir para el colesterol total las instrucciones de la metódica. Pipetear en tubos rotulados:
- 29. CÁLCULO:
- 33. DO ABS. 0.5 cm 0.25 0.75 cm 0.37 1.25 cm 0.63 1.5 cm 0.76 1.75 cm 0.88 2.0 cm 1.01