Guia de microscopia
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Este documento es una guía para estudiantes de un curso práctico de biología celular en la Universidad de la República en Uruguay. Incluye 10 módulos prácticos que cubren temas como introducción a la microscopía, propiedades de la membrana plasmática, obtención de fracciones subcelulares, morfología celular ultraestructural, desarrollo embrionario y tipos de células diferenciadas. El documento también proporciona información general sobre los requisitos para aprobar el curso, asist
Guia de microscopia
- 1. Universidad de la República Facultad de Ciencias Uruguay Curso Práctico de Biología Celular Guía del estudiante 2011
- 2. Indice Información General. Módulo Práctico I: Introducción a la Microscopía Práctico 1: Funcionamiento del microscopio de luz. Práctico 2: Introducción a la micrometría. Obtención y análisis de medidas de longitud microscópica y aproximación a la microscopía electrónica. Módulo Práctico II: Algunas propiedades de la membrana plasmática Práctico 3: Permeabilidad de Membrana y Viabilidad Celular Módulo Práctico III: Obtención y Análisis de algunas fracciones subcelulares Práctico 4: Núcleo Práctico 5: Mitocondria Práctico 6: Cloroplasto Módulo Práctico IV: Morfología Celular Ultraestructural Práctico 7: Ultrestructura celular Módulo Práctico V: Adquisición de Multicelularidad Práctico 8: Ciclo Celular Práctico 9: Desarrollo embrionario temprano de equinodermos, anfibios y mamíferos Práctico 10: Desarrollo embrionario temprano en aves Módulo Práctico VI: Células Diferenciadas Práctico 11: Células Epiteliales Práctico 12: Células Conjuntivas Práctico 13: Células Musculares Práctico 14: Células Nerviosas. Ejercicios
- 3. Información general Ganancia del curso El curso práctico de Biología Celular se gana con el cumplimiento de los siguientes requisitos. Primero, la asistencia - registrada con puntualidad - al 75% de las actividades. Segundo, la entrega de preguntas respondidas al inicio de cada clase y del informe correspondiente al día de actividad práctica al final de la misma (necesaria para el registro de la asistencia). Las preguntas del comienzo de clase representan un 40% de la aprobación del informe. El informe no aprobado equivale a una insasistencia. Asistencia La asistencia a este curso es obligatoria. Esto significa que se espera una asistencia completa y puntualidad en cada una de las instancias programadas (tolerancia de cinco minutos). Usted debe asistir al grupo en el cual se inscribió. En caso de no poder asistir a su práctico asignado podrá recuperar dicha actividad durante el transcurso de la semana en aquellos prácticos con cupo disponible, solamente con certificado médico de la D.U.S. (División Universitaria de Salud). Seguridad en el laboratorio • Esta prohibido comer, beber, tomar mate, o fumar durante la clase práctica. • Debe tomar especial cuidado con el manejo de sustancias químicas y colorantes, por lo cual se exhorta al uso de túnica y a prestar atención a las recomendaciones de su docente. • Debe reportar cualquier tipo de accidente. • Todos los teléfonos celulares deben permanecer en silencio durante la clase. Libros de texto • Alberts, B.; Bray, D; Lewis, J.; Roberts, K. & Watson, J. Biología Molecular de la Célula (4ª Ed). • Lodish, H. et al. Molecular Cell Biology. 5ª ed. (2004) Ed. Freeman. • Karp, G. Biología Celular y Molecular. Ed. Mc Graw - Hill Interamericana • Weiss, L. Histología. 5ª ed. (1986). Ed. El Ateneo, Buenos Aires. • Fawcett, D.W. Tratado de Histología. 12ª ed. (1995) Ed. Interamericana. • Carlson, B.M. Embriología básica de Patten. 5ª ed. (1990), Ed. Interamericana, México. • Gilbert, S.F. Developmental Biology. 3ª a 6ª eds. (1991-2002) Sinauer Associates Inc. Publishers.
- 4. Práctico 1 – Introducción a la Microscopía 1 FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO DE LUZ Objetivos: Introducción a técnicas microscópicas de uso común en Biología Celular y a herramientas básicas para el manejo de microscopios fotónicos. Introducción: Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta de enorme importancia en el desarrollo de distintas disciplinas científicas. Si bien el uso de lentes magnificadoras para la observación de detalles en estructuras pequeñas comenzó en la antigua Roma, no fue hasta el desarrollo del microscopio de luz, durante el siglo XVII, que este instrumento fue utilizado en la biología. Una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro, muy por debajo del tamaño más pequeño que puede apreciar el ojo humano (100 μm). Para observar estructuras tan pequeñas y para distinguir detalles dentro de éstas, es necesario el uso de lentes magnificadoras. Una lente convexa constituye un microscopio simple, pero generalmente no logra aumentos mayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener magnificaciones mayores se desarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un sistema de lentes que logran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto. En el microscopio compuesto existen básicamente dos sistemas de lentes, uno ocular y otro objetivo, además de todo el sistema mecánico encargado de darle soporte. Dentro de los componentes no ópticos del microscopio se encuentran la base o pie y el brazo del microscopio, los cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio se localiza la fuente de luz del mismo, o el espejo responsable de dirigir la luz natural hacia la muestra. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca el espécimen, y posee un orificio que permite el pasaje de la luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos que permiten el desplazamiento en el plano xy del espécimen. A ambos lados del estativo se disponen, generalmente, de forma concéntrica los tornillos de enfoque del microscopio (macrométrico y micrométrico), encargados de mover hacia arriba y abajo la platina para poner en foco el espécimen. Por encima de la platina se localiza el revólver portaobjetivo donde se encuentran las lentes objetivas de distinto aumento. La rotación del revólver coloca a cada una de las lentes en el eje óptico. Siguiendo el camino del eje óptico se encuentra el tubo donde se localizan elementos del sistema óptico. La parte óptica propiamente dicha está constituida por el condensador, la lente objetiva y la ocular. El condensador es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de la fuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. El condensador posee un tornillo de enfoque que permite su movimiento hacia arriba y abajo para lograr una óptima iluminación del espécimen. Además posee un diafragma o iris que regula la cantidad de luz que atraviesa el condensador y llega al espécimen, así como el ángulo del cono de luz. Las lentes ocular y objetiva son lentes convergentes, que describiremos en detalle más adelante.
- 5. Imagen final Lente ocular Figura 1: Esquema del funcionamiento de un microscopio compuesto. La luz proveniente de una fuente pasa a Imagen intermedia través de una lente condensadora y luego atraviesa al espécimen localizado en el soporte o platina del microscopio. La lente objetiva forma luego una imagen real (es decir que puede ser proyectada en una pantalla) Lente objetiva intermedia que se proyecta justamente en el diafragma fijo de la lente ocular. Esta imagen es posteriormente espécimen aumentada aún más por la lente ocular generándose una imagen virtual (no puede ser proyectada en una pantalla) invertida del objeto que es percibida por el ojo como si Lente condensadora estuviese a 2.5 cm de distancia. Fuente de luz Características de las lentes objetivas: La lente objetiva está compuesta por un conjunto de lentes, de las cuales la más frontal (primera lente que atraviesan los rayos de luz en la lente objetiva) se encarga de generar una imagen magnificada del objeto. El resto de las lentes se encargan de corregir aberraciones ópticas. La aberraciones (distorsiones) esféricas o cromáticas son inherentes al diseño de toda lente. Las aberraciones de tipo esféricas hacen que el campo se vea curvo cuando en realidad es plano. Las aberraciones cromáticas son producto de los distintos índices de refracción de las diferentes longitudes de onda que componen la luz blanca, y hacen que los objetos se vean borrosos. Las lentes objetivas que presentan correcciones para ambos tipo de aberración se denominan planapocromáticas. La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como su magnificación, apertura numérica, correcciones, etc. (figura 2). Las lentes objetivas de un microscopio, que poseen distinto poder de magnificación, suelen estar diseñadas para proyectar la imagen intermedia en el mismo punto del tubo, de manera que es necesario hacer únicamente pequeñas correcciones con los tornillos de enfoque cuando se cambia de lente durante la observación. Los microscopios que poseen este tipo de lentes se denominan parafocales. Además, el centro del campo de observación es el mismo en los distintos lentes, por lo cual se denominan paracentrales. Rosca de ajuste al portaobjetivos magnificación Tipo de objetivo (corrección de aberraciones lentes Objetivo de inmersión en aceite o correctivas agua Apertura numérica Grosor de cubreobjetos Banda de color que indica lente frontal magnificación (magnificación) Figura 2: Complejidad de una lente objetiva y nomenclatura estándar. (Modificado de http://www.olympusmicro.com).
- 6. Iluminación: Para obtener buenas imágenes es importante el uso de una correcta iluminación, utilizando tanto fuentes naturales como artificiales de luz. La iluminación debe ser brillante y uniforme en toda la muestra, lo cual se logra en los microscopios actuales utilizando el sistema de iluminación Köhler. En este sistema, una lente colectora colocada por delante de la fuente generadora de luz proyecta una imagen aumentada de la fuente de luz, cuyo foco se localiza exactamente en el diafragma o iris del condensador. Al atravesar el condensador se genera un haz de rayos paralelos que iluminan de manera uniforme la muestra. El diafragma del condensador regula el ángulo del cono de luz que alcanza el espécimen. Modificando la posición del condensador con el tornillo de ajuste del condensador y variando también la apertura del diafragma iris del condensador se logra que el filamento de la fuente de luz se localice en el plano focal de la lente objetiva. Es así que se obtienen condiciones óptimas de iluminación de la muestra. La función de un microscopio será entonces generar una imagen magnificada del objeto, esto es una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles del mismo, es decir que debe tener resolución. Generalmente a magnificaciones mayores, mayor será la resolución de la imagen, aunque esto no siempre es cierto. Es importante comprender entonces las diferencias entre magnificación (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en la imagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, esta no aportará información al observador, la magnificación deja de aportar información útil para transformarse en “magnificación vacía”. Límite de resolución: El límite de resolución se define como la menor distancia que puede haber entre dos puntos para ser distinguidos como dos entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia es de 100 μm, es decir que dos puntos que estén separados una distancia menor a 100 μm serán percibidos por el observador como un único punto. La capacidad de distinguir (separar) detalles pequeños será entonces el poder de resolución del microscopio. 100μm 60μm Teniendo en cuenta esta definición, el poder de resolución de un microscopio aumenta cuando la mínima distancia entre dos puntos que pueden distinguirse como dos objetos disminuye. El límite de resolución de una lente puede calcularse utilizando la ecuación de Abbe: Donde λ es la longitud de onda de trabajo, y AN es la 0.61 apertura numérica, la que se calcula como: Límite de Resolución AN = . sen θ. A.N La apertura numérica depende de dos parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente (2θ), y el índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva () (figura 3). Nótese que al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellos lentes de gran apertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre el espécimen y el extremo inferior de la lente objetiva es muy pequeña (figura 3).
- 7. θ Lente objetiva distancia de trabajo espécimen Figura 3: Apertura angular de una lente objetiva. condensador Considerando las ecuaciones anteriores es evidente que existen tres maneras de modificar el límite de resolución de una lente: variando la longitud de onda de trabajo, variando el índice de refracción, y el ángulo del cono de luz que incide sobre la muestra. Trabajando con longitudes de onda cercanas al violeta (ver apéndice), se logra el mejor poder de resolución, es decir valores de límite de resolución pequeños. Por otro lado, para modificar el ángulo del cono de luz que incide sobre la muestra puede variarse la distancia del condensador al objeto o el diseño del condensador. Para variar el índice de refracción, lo que se hace es modificar el elemento que está en contacto con el objeto y con la lente objetiva. El índice de refracción (n) del aire es 1, el del agua es 1.33 y el del aceite y vidrio es aproximadamente 1.51 (figura 4). Por tal motivo utilizando aceite entre el preparado y la lente objetiva, se logra que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvíen poco y sean captados por la lente. Figura 4: Principio de trabajo de lentes de objetivas de inmersión en aceite. La presencia de aceite en el espacio comprendido entre el cubreobjetos y la lente objetiva, incrementa el número de rayos provenientes del espécimen que son captados por la lente objetiva. (Fuente: http://www.olympusmicro.com) En algunas aplicaciones del microscopio no es necesario utilizar lentes objetivas de gran apertura numérica ya que los detalles de la muestra pueden ser apreciados utilizando lentes con aperturas numéricas más pequeñas. Esto además es importante ya que el trabajo con lentes objetivas de gran apertura numérica trae aparejado el inconveniente de la disminución de la profundidad de campo, la cual puede ser entendida como la distancia hacia arriba y abajo del plano focal real del espécimen que se encuentra en foco. Otra desventaja es que la distancia de trabajo (ver figura 3) es forzosamente menor en lentes de mayor apertura numérica (pues es mayor).
- 8. Tipos de microscopía de luz: 1) Microscopía de campo claro: En este tipo de microscopía la imagen es obtenida por simple transmisión de la luz a través del preparado. Como la luz debe atravesar la muestra, esta puede ser un aplastado, un dispersado o un corte muy delgado del espécimen. Si las muestras no poseen contraste, el mismo se genera mediante la tinción del espécimen, utilizando colorantes que poseen afinidad por distintos elementos celulares. El procedimiento para obtener preparados histológicos implica una serie de etapas que se detallan a continuación: a) Fijación: Tiene por objetivo conservar la estructura celular o tisular de manera que ésta mantenga una estructura lo más similar posible a la estructura in vivo. Se utilizan para esto medios físicos (congelación, calor, desecación) o químicos. Los fijadores químicos son moléculas pequeñas que penetran rápidamente en la muestra estabilizando las moléculas que componen la muestra y evitando alteraciones en el preparado y la retracción del tejido. Además la fijación permeabiliza las células para permitir la entrada del colorante. Ejemplos de fijadores son el formaldehído, alcohol, glutaraldehído, etc. b) Inclusión: Muchas muestras son demasiado gruesas como para examinarlas directamente, por lo cual deben realizarse cortes finos (5-10m). Para realizar dichos cortes las muestras son embebidas en un medio de soporte que les otorgue consistencia permitiendo una sencilla manipulación del material. Generalmente se utilizan ceras o resinas – por ejemplo, parafina - que en su estado líquido rodean y penetran en los intersticios de la muestra, y luego por enfriado o polimerización pueden ser transformados en un bloque rígido. c) Corte: Se utiliza un aparato denominado micrótomo que posee una cuchilla muy afilada y un sistema de avance micrométrico de la muestra. Los cortes se colocan sobre un portaobjetos para su posterior tinción. Figura 5. Esquema de un micrótomo. Una porción de tejido embebido en parafina es seccionada con una cuchilla de acero para luego teñir y observar al microscopio óptico. (Fuente: Alberts y cols., Molecular Biology of the Cell, 2004) d) Tinción: Existe una gran cantidad de colorantes que muestran distinta afinidad por elementos particulares de la célula. Entre los más usados se encuentran la hematoxilina y la eosina. El primero de ellos tiñe de violeta estructuras celulares aniónicas como el ADN, ARN y algunas proteínas. Por su parte la eosina tiñe de rosado estructuras catiónicas como ciertas proteínas, por lo cual constituyen un buen par para realizar tinciones generales.
- 9. 2) Microscopía de contraste de fase: Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de la muestra es tan bajo que, independientemente del aumento o del poder de resolución del microscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantener inalterada la muestra, sin matarla o teñirla, se recurre a técnicas que permiten incrementar el contraste natural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz a través de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojo humano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de una forma que no es uniforme, ya que retardan el pasaje de la misma de manera variable dependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerá del índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo que generalmente es de 1/4. El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en los especímenes biológicos transformando las diferencias de desfasaje de las ondas en diferencias de amplitud (intensidad) que sean apreciables. El sistema posee un mecanismo constituido por un disco opaco con un anillo transparente que se inserta en el condensador del microscopio. Existe un anillo complementario en la lente objetiva, que tiene como función separar los rayos que atravesaron la muestra, de los que no lo hicieron. Casi toda la luz que atraviesa el anillo transparente en el condensador, pero no atraviesa la muestra, pasa luego por el anillo del objetivo. La luz que atraviesa la muestra será retrasada y no atravesará el anillo de la lente objetiva en ese plano. El microscopio transforma el desfasaje de 1/4λ en uno de 1/2λ. Al existir dicho desfasaje entre las ondas que atraviesan la muestra y las que no, éstas pueden interferir con las ondas que no son retrasadas por la muestra, de manera destructiva (desfasaje de 1/2λ) generando oscuridad, o constructiva (desfasaje de λ) generando zonas brillantes (Figura 6). Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el transcurso de ciertos procesos biológicos ya que permite la observación de células vivas y no es necesario fijar y teñir la muestra para generar contraste. 3) Microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC): El fundamento es similar al de contraste de fase, pero reduce al mínimo los artefactos ópticos que ésta posee y aumenta la resolución. Separa por completo la luz directa de la difractada utilizando prismas y transmisión de luz a través de vías complicadas. No se observan halos brillantes donde hay cambios bruscos del índice de difracción de la luz, pero sí se genera un falso volumen de la muestras (Figura 5). Figura 6: Observación de distintos especimenes biológicos utilizando microscopía óptica de contraste de fases (a, c, e) y microscopía de contraste interferencial (DIC) (b, d, f). (de http://www.olympusmicro.com) 4) Microscopía de epifluorescencia:
- 10. 4) Microscopía de epifluorescencia: Algunas moléculas o átomos son capaces de absorber energía, pasando de un estado basal a uno excitado o energizado, y rápidamente volver a un estado basal mediante la emisión de luz o calor. Cuando el decaimiento ocurre mediante la emisión de luz, el fenómeno se denomina fluorescencia. Las moléculas que exhiben este comportamiento son denominadas fluorocromos, y cada uno es capaz de excitarse a una determinada longitud de onda y emitir a otra longitud de onda distinta y mayor a la de excitación. Estas moléculas se utilizan en microscopía de fluorescencia para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de los elementos que componen la célula. Esto permite identificar distintas moléculas o conjuntos de moléculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos elementos celulares, o puede ser acoplado químicamente a otras moléculas como anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente celular. En el microscopio de epifluorescencia, la luz accede a la muestra desde la parte superior y no la atraviesa, al mismo tiempo se colecta la luz emitida por la muestra utilizando la misma lente. El microscopio cuenta con una lámpara de mercurio o xenón que emite distintas longitudes de onda que atraviesan una serie de lentes colectoras y un diafragma, hasta que alcanza un espejo que desvía la luz en sentido vertical hacia la lente objetiva y atravesando ésta hacia la muestra. Antes de llegar a la muestra la luz atraviesa un filtro que selecciona la longitud de onda de excitación dependiendo del fluorocromo que se esté utilizando. La luz emitida por la muestra es captada por la lente objetiva y luego de atravesar un sistema de filtros que impide el paso de la luz de excitación reflejada pero sí la emitida por la muestra, llega a la lente ocular (figura 7). (a) filamentos de actina aparato de golgi proteína de membrana neuronal filamentos de actina aparato de Golgi proteína de membrana neuronal (b) verde azul Figura 7: Imágenes de distintos elementos celulares obtenidas con epifluorescencia (a). Esquema del sistema óptico de un microscopio de epifluorescencia. La selección del juego de filtros se realiza en cada caso de acuerdo a las características espectrales del fluorocromo de elección (b).
- 11. 5) Microscopía láser confocal: El principio de este tipo de microscopía es el mismo al descrito en la sección anterior, pero tiene como principal ventaja la eliminación de la señal fuera de foco. Se utiliza un láser que ilumina la muestra a diferentes alturas, generando secciones ópticas de la muestra. Además se reduce la pérdida de fluorescencia por fotooxidación debido a que la intensidad del láser puede ser regulada. Un láser escanea la superficie del preparado en el plano xy para cada plano z. Luego la señal es captada por un fotomultiplicador y digitalizada. Mediante una computadora se puede realizar el análisis y procesamiento posterior de la imagen utilizando un software especial (Figura 7). Las imágenes obtenidas para cada plano z de la muestra, pueden ser luego agrupadas para realizar reconstrucciones tridimensionales del preparado. Un componente fundamental del microscopio láser confocal es el pinhole, una apertura localizada por delante del fotomultiplicador que evita el pasaje de fluorescencia de distintas regiones de la muestra que no están en foco; la luz proveniente de regiones localizadas por encima o por debajo del plano focal no converge en el pinhole y por lo tanto no será detectada por el fotomultiplicador (Figura 8). a computadora fotomultiplicador filtro de barrera de emisión Filtros de densidad neutra y de excitación espejo dicroico generador de barrido lente objetiva célula por encima del foco en foco por debajo del foco Figura 8: Esquema de microscopio laser confocal
- 12. APENDICE 1: Procedimiento para el uso correcto del microscopio de luz ¡ATENCIÓN! Use los tornillos macro y micrométricos moviéndolos lentamente. ¡La rotura de cubreobjetos puede ser extremadamente perjudicial para la lente frontal del objetivo, pudiendo dañarla en forma irrecuperable! Si desplaza un microscopio hágalo manteniendo siempre el instrumento en posición vertical, tomándolo del brazo y levantándolo, NUNCA lo arrastre sobre una superficie para moverlo (la vibración provocada afloja y desajusta las lentes). 1 - Coloque el preparado en la platina, verificando que el cubreobjetos quede hacia arriba y que el material quede centrado en el orificio de la platina. 2 - Encienda la fuente de luz y ajuste el voltaje de la lámpara. 3 - Abra el diafragma iris del condensador al máximo. 4 - Suba el condensador hasta la posición máxima. 5 - Verifique que el material en el preparado está iluminado. En los microscopios que no tienen luz incorporada: mueva el espejo, controlando desde el exterior, hasta que la luz incida sobre el material en la platina. 6 - Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico del instrumento. 7 - Observando del exterior y utilizando el macrométrico, acerque el objeto hasta el tope superior de la platina. 8 - Observando por el ocular baje la platina lentamente con el macrométrico hasta obtener una imagen nítida. Corrija el foco con el micrométrico. 9 - Corrija la iluminación, bajando el condensador y cerrando el diafragma iris hasta obtener el máximo de contraste en un campo uniformemente iluminado. 10 - Para pasar a un objetivo de mayor aumento, verifique primero si los objetivos son parafocales. a) Objetivos parafocales: Coloque el objetivo de mayor aumento en el eje óptico. Corrija el foco con el micrométrico. b) Objetivo no parafocal: Baje la platina con el macrométrico. Coloque el objetivo de mayor aumento en el eje óptico. Observando desde el exterior acerque el objetivo hasta un milímetro del cubreobjeto. Observe por el ocular y repita el paso 8. 11 - Corrija la iluminación, subiendo el condensador y modificando el diafragma iris hasta obtener condiciones de iluminación como en el paso 9. 12 - Para pasar a otros aumentos superiores repita los pasos 10 y 11. Para acercar el objetivo al cubreobjetos tenga en cuenta la distancia de trabajo de ese objetivo, (los valores de esa distancia están en la tabla del apéndice de este protocolo). El ayudante le dará instrucciones especiales para el enfoque e iluminación con el objetivo de inmersión. Al terminar de trabajar, verifique: - que la platina esté seca y bájela hasta el tope. - que no queda un preparado en ella. - que la intensidad de la luz fue bajada al mínimo y luego apague la fuente de luz. - que el tubo queda en posición vertical en los microscopios de ángulo vertical. - que la lente objetiva que quedó en posición sea la de menor aumento. - que el tornillo de ajuste del cabezal de los oculares esté ajustado y los oculares firmes.
- 13. APÉNDICE 2: Longitudes de onda (nm) en la región visible del espectro electromagnético. Violeta..... Azul........Verde......Amarillo....... Naranja.....Rojo....... Nombres y símbolos de los factores colocados delante de las unidades. Factor Prefijo Símbolo 10-1 deci (d) 10-2 centi (c) 10-3 mili (m) 10-6 micro () 10-9 nano (n) 10-12 pico (p) 10-15 femto (f) Características de algunos objetivos plano-acromáticos (los utilizados en clase pueden tener especificaciones diferentes) Aumentos Distancia de Trabajo (mm) 4x 13.80 10x 7.10 20x 1.40 40x 0.48 60x 0.43 100x(aceite) 0.20 åX n 2 ( X i X ) i Promedio = X = Desvío Estándar = n i 1 n å i 1 n 1 Xi = valores obtenidos, n = número de casos
- 14. Práctico 2 – Introducción a la Microscopía 2 INTRODUCCIÓN A LA MICROMETRÍA. OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE MEDIDAS DE LONGITUD MICROSCÓPICA Y APROXIMACIÓN A LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. Objetivos: Obtención y análisis de medidas de longitud microscópica. Introducción a la microscopía electrónica. A) Realización de medidas utilizando el microscopio óptico: Para medir un objeto en un microscopio se utilizan dos reglas, una ocular y otra objetiva. La regla o micrómetro ocular es un disco de vidrio que se coloca por debajo de la lente ocular. Posee grabada una escala con 50 divisiones que deben ser calibradas, es decir, debe adjudicársele un valor en micras a cada una de sus divisiones, para cada uno de los objetivos del microscopio. Para ello se utiliza la regla objetiva, la cual es una escala grabada en un portaobjetos. Esta última posee 100 divisiones, cada una correspondiendo a 10 μm, por lo cual el largo total de esta regla es de 1mm. Comparando la regla ocular con la regla objetiva, se obtiene el valor de cada unidad arbitraria (UA) de la reglilla ocular, para cada aumento del microscopio (Figura 1). ¿Por qué es necesario calibrar la regla ocular?, ¿Por qué no se mide directamente con la regla objetiva?.
- 15. Figura 1: Diagrama del procedimiento de calibración para tres aumentos distintos.
- 16. B) Microscopía electrónica: Los componentes estructurales de las células pueden observarse con alta resolución mediante microscopía electrónica. El microscopio electrónico resulta una herramienta indispensable a la hora de entender el contexto ultraestructural en el cual ocurren los procesos celulares y subcelulares. Al estudiar los fundamentos de la microscopía óptica, expresamos el límite de resolución mediante la ecuación de Abbe (LR = 0.61λ/AN). De la misma se deduce que disminuyendo la longitud de onda se logra mejorar el límite de resolución de un microscopio. Una forma de lograr esto es utilizando un haz de electrones en lugar de luz como fuente de radiación. La longitud de onda de un haz de electrones dependerá de la velocidad de los mismos, a medida que su velocidad aumenta, disminuye la longitud de onda y pueden resolverse elementos más pequeños. En un microscopio electrónico, un haz de electrones es acelerado en condiciones de vacío mediante diferencias de potencial que van desde 10.000 a 100.000 voltios. Por ejemplo a 60.000 voltios, la longitud de onda del haz de electrones será de 0.005 nm y el límite de resolución será de 0.003 nm, lo cual se localiza en la escala atómica. Este límite de resolución es sin embrago inalcanzable ya que las aberraciones esféricas de las lentes obligan a disminuir la apertura numérica de las mismas, por lo cual el límite de resolución real se encuentra entre 0.1-0.5 nm. El microscopio electrónico de transmisión consta básicamente de una columna hueca en cuyo extremo superior se localiza un filamento de tungsteno que actúa como fuente de electrones. El haz de electrones generado es enfocado por una serie de electroimanes que actúan como lentes condensadoras y objetivas. La muestra se coloca en un soporte que se introduce en el trayecto del haz de electrones. Si estos no se encuentran con materia durante su trayectoria, no serán dispersados y llegaran a impactar en una pantalla en la parte inferior de la columna, observándose una estructura brillante. Si en cambio, los electrones chocan con alguna estructura durante su trayectoria, serán dispersados, no impactarán en la pantalla y se observará una estructura oscura. La dispersión de electrones al entrar en contacto con la muestra, dependerá de su estructura (densidad atómica de sus componentes y número de átomos por unidad de área). Dado que los átomos que componen la materia orgánica son en su mayoría de peso atómico bajo (C, H, O, N, etc), el material biológico posee poca capacidad de dispersión de electrones. Por ejemplo, con la técnica de rutina, para lograr un buen contraste, la muestra debe ser primero fijada (generalmente se emplea glutaraldehído y tetróxido de osmio), luego incluída en alguna resina, posteriormente cortada (corte ultrafinos de entre 40 y 70 nm) y por último teñida con metales pesados (acetato de uranilo o citrato de plomo) que le confieren mayor densidad a las estructuras celulares (este paso puede ser previo a la inclusión). Existen básicamente dos tipos de microscopios electrónicos: en los microscopios electrónicos de transmisión (MET) se obtiene una imagen de los electrones “transmitidos” a través del espécimen, en los microscopios electrónicos de barrido (MEB) se genera la imagen correspondiente a los electrones que rebotan en la muestra, más la de los electrones secundarios emitidos por ella. Estos electrones son capturados por un detector generando una imagen tridimensional (Figuras 2 y 3).
- 17. Fuente de electrones Haz de electrones Fuente de electrones Lente condensadora Haz de electrones espécimen Lente condensadora Lente objetiva PANTALLA Lente de proyección electrones dispersados espécimen Imagen magnificada M.E.T M.E.B Figura 2: Diagrama esquemático de funcionamiento de microscopios electrónicos de transmisión (M.E.T) y de barrido (M.E.B). Figura 3: Microscopios electrónicos de transmisión (izquierda) y de barrido (derecha)
- 18. Principales estrategias metodológicas para la preparación y observación de material al microscopio electrónico: La metodología escogida para preparar las muestras, va a depender del tipo de material y del tipo de información que busquemos obtener. Técnica de rutina (MET) - Fijación: paraformaldehído, glutaraldehído, tetróxido de osmio, ácido tánico. - Inclusión: resinas de distinta naturaleza (araldita, epon, LR White, Spurr) - Secciones ultrafinas: 40 – 70 nm. - Contraste con sales metálicas pesadas: acetato de uranilo, citrato de plomo. Aplicación: visualización de estructuras biológicas subcelulares. Técnica de inmunomarcación (MET) - Emplea anticuerpos unidos a partículas de oro coloidal (de 2 a 150 nm) como método de localización al MET. Este procedimiento puede realizarse previo a la inclusión del material en una resina (generalmente hidrofílica como el LRW), ó luego de realizar las secciones ultrafinas (post-inclusión), dependiendo del protocolo a seguir. Aplicación: localización de moléculas. Técnica de tinción negativa (MET) - Esparcido de partículas (fijadas o no) sobre un film de soporte. - Sombreado con sales metálicas pesadas: acetato de uranilo, citrato de plomo, ácido fosfotúngstico. Aplicación: visualización de microorganismos (bacterias y virus), de macromoléculas, de complejos macromoleculares o de nanopartículas de materiales inertes. Técnica de sombreado rotativo con metales (MET) - Sembrado de micro partículas sobre un film de soporte. Sombreado con oro, oro-paladio y otras aleaciones evaporadas sobre la preparación. Aplicación: visualización de macromoléculas aisladas (ADN o proteínas) y microorganismos. Técnica de criofractura (MET) - Fijación del material (en frío o no). Fractura de la muestra en un ambiente con alto vacío y en frío. Evaporación de platino-carbón o tungsteno-tántalo para construcción de la réplica. Digestión de la muestra biológica con ácido (crómico o sulfúrico). Aplicación: visualización de réplicas de superficies de materiales biológicos. Técnica de criograbado profundo (MET) - Fijación del material (en frío o no). Fractura de la muestra en un ambiente con alto vacío y en frío. Sublimación del hielo. Evaporación de platino-carbón o tungsteno-tántalo para construcción de la réplica. Digestión de la muestra biológica con ácido (crómico o sulfúrico). Aplicación: visualización de elementos intracelulares no solubles. Técnica de rutina para Microscopía Electrónica de Barrido Fijación: paraformaldehído, glutaraldehído, tetróxido de osmio, ácido tánico. Deshidratación y secado de punto crítico con CO2. Evaporación de metales sobre la superficie de la muestra (oro, oro-paladio, platino o tungsteno). Aplicación: Análisis de la superficie de muestras biológicas completas o porciones de las mismas. Este tipo de microscopio permite además, la visualización de determinados materiales sin necesidad de procesamiento previo.
- 19. Mediciones mediante programas informáticos. Cuando el objeto a medir se encuentra en el nivel ultraestructural debemos recurrir a programas informáticos para realizar las mediciones. Algunos de esos programas pueden usarse también para realizar medidas en micrografías tomadas en microscopios fotónicos. Al final de éste capítulo encontrará una pequeña guía para el uso del Image J, programa que podrá utilizar en el práctico. Pequeño manual práctico para realizar mediciones (microscópicas) con ImageJ La clave para poder tomar medidas es tener al menos 2 imágenes tomadas con la misma magnificación y la misma resolución. Nos centraremos aquí en la utilización de un instrumento de calibración para microscopía que es el micrómetro objetivo. Sin perjuicio de ello, ImageJ nos permite medir cualquier cosa en una imagen utilizando cualquier instrumento de calibración también contenido en una imagen tomada a la misma distancia utilizando los mismos principios (por ejemplo cuántas manzanas mide mi heladera de largo). 1.- Abrir la imagen que contiene la reglilla objetiva (File > open) 2.- Medir: Utilizando la herramienta selecionar líneas rectas... trazar una línea de selección del largo de la división conocida del micrómetro objetivo El programa nos dará una medida en píxeles de la línea que acabamos de trazar. Noten que para que las líneas tengan 0º o 90º respecto a la horizontal pueden mantener presionada la tecla “mayúsculas” (shift o la que tiene la flechita para arriba para complacer a todos). El programa también nos devolverá el ángulo con que hemos trazado nuestra línea de selección:
- 20. 3- Establecer la escala (Analyze > Set Scale...) ImageJ reconocerá la medida que hemos hecho previamente en el campo “Distancia en píxeles”. i) Ingresamos la distancia conocida en micras que hemos medido en los pasos anteriores en el campo “Distancia Conocida” (Known Distance) ii) Ingresamos la unidad de medida que hemos utilizado en el campo “Unidad de Longitud” (Unit of Length), en nuestro caso, hemos utilizado la micra, por lo que ingresaremos: um iii) Por último, seleccionamos la casilla “Global”, para que ésta calibración sea aplicable a todas las imágenes con que trabajemos, y no se limite sólo a la imagen en que hemos realizado la medida. Aceptamos estos cambios con el botón OK 4.- Abrimos la imagen en la que queremos tomar la medida. Recordemos que la foto debe ser tomada con la misma magnificación con que tomamos la foto de la reglilla objetiva que hemos realizado la calibración. 5.- Repetimos con ésta imagen el paso 2 con la herramienta de selección lineal 6.- Solicitamos al programa que mida lo que hemos seleccionado (Analyze > Measure)
- 21. La última columna (Length) de la tabla de resultados que nos devuelve el programa tiene el dato de longitud que nos interesa. 7.- (*Bonus) Si queremos agregar una barra de escala a la imagen utilizando la calibración que hemos realizado iremos a: Analyze > Tools > Scale Bar... El menú de opciones de la barra de escala es bastante sencillo: Width in μm: Es el ancho que queremos que tenga la barra de escala en la unidad que estemos utilizando. Height in Es la altura que va a tener nuestra barra en píxeles (podemos probar con 10 y ver si pixels: nos satisface...). Va a depender del tamaño de nuestra imagen. Font size: Es el tamaño de la letra (podemos intentar con... ¿20 tal vez?). A gusto del consumidor Apelo al buen criterio del usuario, pero lo importante es que contraste con el color de Color: fondo. En términos generales, barras negras sobre fondos claros, y barras blancas sobre fondos oscuros. Adan y raza, azar y nada
- 22. Para independizarnos del color de fondo de la imagen podemos ponerle un fondo a Background: nuestra barra de escala. Suele usarse cuando el fondo de la imagen es heterogéneo para que la barra se vea. Define la ubicación de la barra. Típicamente se coloca abajo y a la derecha (lower Location: right), pero es cuestión de gustos, como todo. +----------------|ImageJ es software libre y de código abierto|----------------+ | | | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, | | Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009. | +------------------------------------------------------------------------------+ ...siempre que puedan, ¡prefiéranlo!
- 23. Práctico 3 – Algunas propiedades de la membrana plasmática PERMEABILIDAD DE MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR Objetivos: Analizar los fenómenos de ósmosis a través de la membrana plasmática de células animales y vegetales. Comprender los conceptos de permeabilidad de membrana, osmolaridad e isotonicidad y su importancia. Introducción a las pruebas de viabilidad celular mediante el uso de colorantes vitales. 1) PERMEABILIDAD DE MEMBRANA Las membranas biológicas comparten una estructura general común. Están constituidas por una bicapa muy delgada de moléculas lipídicas y proteicas (aproximadamente 5 nm de espesor) que forman estructuras dinámicas y fluidas. Una de las principales funciones que desempeñan es mantener las diferencias esenciales entre el medio intracelular y extracelular actuando como barreras selectivamente permeables. Conceptos básicos: 1) Permeabilidad de membrana: - membranas permeables: permiten el pasaje de todo tipo de moléculas. - membranas semipermeables: permiten el pasaje de un sólo tipo de molécula. - membranas selectivamente permeables: poseen diferentes grados de permeabilidad a distintas moléculas. 2) Tonicidad de una solución: - solución hipotónica: menor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. - solución isotónica: igual concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. - solución hipertónica: mayor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. 3) Ósmosis: Movimiento de agua en respuesta al gradiente de concentración de solutos. La fuerza que dirige este movimiento se conoce como presión osmótica. No todos los solutos ejercen el mismo efecto osmótico (concentraciones iguales de sales y moléculas no ionizables no ejercen la misma presión osmótica). 4) Osmolaridad: Es una medida de concentración que indica la presión osmótica ejercida por una solución. Depende del número de partículas disueltas en la solución independientemente de su naturaleza. La concentración fisiológica del interior celular es 0,3 osmolar. Es de suma importancia considerar esta condición para la preparación de toda solución que interactúe con células vivas.
- 24. Ejemplo: - 1 mol de glucosa disuelta en 1 litro de agua (solución de glucosa 1M) genera una solución 1 osmolar. - 1 mol de NaCl disuelto en 1 litro de agua (solución de cloruro de sodio 1M) genera una solución 2 osmolar debido a que el cloruro de sodio se disocia en Na + y Cl- generando 2 partículas osmóticamente activas en la solución. 2) PRUEBA DE VIBLIDAD CELULAR La determinación de la viabilidad celular es el conteo de las células vivas (sanas) o muertas en una muestra. Generalmente los métodos de determinación de la viabilidad se basan en el análisis de dos parámetros: actividad metabólica de la célula o integridad de membrana plasmática. Los métodos más comunes para evaluar la integridad de membrana y así determinar el índice de células viables en una suspensión celular son los test de exclusión de colorantes vitales (ej.: Azul Tripán). Las células vivas, cuyas membranas celulares estén integras, excluyen a estos colorantes en forma activa. El método del Azul Tripán pone en evidencia el funcionamiento de un mecanismo de transporte activo a través de la membrana plasmática. Por este procedimiento se visualizan las células mediante un microscopio y se cuentan las células muertas (azules) en el total de la muestra. Este método es utilizado por ejemplo previo a iniciar un cultivo, para determinar cuantas células vivas existen, permitiendo optimizar las condiciones de cultivo. Además puede emplearse para determinar la eficacia de agentes terapéuticos en la búsqueda de drogas, o en tests toxicológicos. Protocolo de obtención de células para iniciar un cultivo primario (no será utilizado en clase) - Cortar los órganos en trozos de menos de 2mm con 2 escalpelos en una gota de tampón salino (PBS, pH 7.2-7.4). - Agregar 1-1.5ml de solución de tripsina (en tampón salino pH 7.2-7.4, con EDTA). - Incubar 15min a 37ºC y agregue aproximadamente 4 ml de medio de cultivo suplementado con suero. - Pipetear repetidamente (sin hacer espuma) a fin de obtener una suspensión celular homogénea. - Tomar una muestra de 500µl y agregar 500µl de solución de Azul Tripán diluida. - Observar rápidamente al microscopio montando una gota entre porta y cubreobjeto. Tampón fosfato salino (PBS) NaCl (8.0g), KCl (0.2g), Na2HPO4 (2.1g), KH2PO4 (0.2g), H2O (1litro). Sol. concentrada de azul tripán: 200mg de Azul Tripán en 50ml de agua destilada. Diluir 4 veces en PBS. Tripsina: enzima proteolítica no específica. EDTA: agente quelante de cationes divalentes.
- 25. Práctico 4 – Fraccionamiento Subcelular 1 OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE ALGUNAS FRACCIONES SUBCELULARES Objetivos: • Introducción a los métodos de obtención de fracciones subcelulares: conceptos de homogeneización, centrifugación diferencial y en gradiente. • Identificación, caracterización y análisis de pureza de las fracciones subcelulares obtenidas (núcleos, mitocondrias y cloroplastos). Observación de la morfología microscópica de los organelos aislados y/o en cortes. Fraccionamiento subcelular: Los métodos de microscopía permiten analizar en gran medida la anatomía y localización de los organelos celulares, pero si se quiere ahondar en su funcionamiento deben realizarse ensayos bioquímicos, para lo cual generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas en los distintos organelos. La obtención de esta fracción puede dividirse en dos partes denominadas homogeneización y fraccionamiento (típicamente mediante centrifugación diferencial). La homogeneización consiste en disgregar los tejidos en las células que los componen y luego realizar la lisis de las células, de tal modo que se liberen sus componentes, en particular sus organelos, sin que estos sufran mayores daños. El uso de instrumentos como morteros, jeringas, homogeneizadores permiten la disgregación y lisis celular. Si se parte de un cultivo celular, no es necesario separar las células y se pasa directamente a la lisis celular. Para esto también existen diversas alternativas como el uso de detergentes que solubilicen las membranas, el “shock” osmótico y el uso de ultrasonido. Una vez que se tienen todos los componentes celulares libres, es necesario separarlos en fracciones, es decir, realizar su fraccionamiento. El método más utilizado para este fin es la centrifugación diferencial. Cuando los diferentes componentes celulares se encuentran suspendidos en un líquido, tienden a sedimentar hacia el fondo debido a la gravedad. Para acelerar este proceso, se puede colocar el tubo conteniendo esta suspensión en un rotor giratorio, de forma de someter a las partículas a una fuerza centrífuga. Este procedimiento se denomina centrifugación, y el equipo especializado en el que se realiza se denomina centrífuga. ¿Qué sucede cuando las partículas suspendidas son sometidas a una fuerza centrífuga? Las partículas van a moverse hacia el fondo del tubo, pero a su vez dos fuerzas van a oponerse a este movimiento, la fuerza de fricción y la fuerza de flotación generada por el líquido desplazado. Esta contraposición de fuerzas hace que eventualmente cada partícula sedimente a velocidad constante, de acuerdo a la siguiente ecuación: v = (m × ω2 × r) (1 - ρo/ρ) f m es la masa de la partícula, ω2r es la aceleración que se genera en el rotor, ρo es la densidad del líquido en el que están suspendidas las partículas, ρ es la densidad de la partícula y f es el coeficiente de fricción de la partícula. Rearreglando esta ecuación, obtenemos: v = m (1 - ρo/ρ) ω2 × r f Esta ecuación implica que, para una aceleración constante, la velocidad de sedimentación depende de la masa de la partícula, de su densidad y coeficiente de fricción, y de la densidad del líquido. En particular, cuanto mayor sea la masa de la partícula, más rápido sedimentará. También vale la pena notar que la
- 26. partícula solo sedimentará si su densidad es mayor a la del líquido (ρ o/ρ < 1), mientras que si es igual o menor permanecerá quieta o flotará. El cociente v / (ω2 × r) es una constante que se denomina coeficiente de sedimentación, y la unidad en que se expresa es el Svedberg (S), en homenaje a uno de los pioneros de la centrifugación. Cuanto más grande este coeficiente mayor será la velocidad de sedimentación. Frecuentemente la velocidad de centrifugación se expresa indirectamente en términos de la fuerza centrífuga resultante y su relación con la constante g de gravedad. Por ejemplo, una velocidad correspondiente a 1000g es aquella a la cual las partículas son sometidas a una aceleración 1000 veces mayor que la gravedad. Puesto que los distintos componentes celulares difieren en su masa y densidad, van a tender a sedimentar a distintas velocidades. Esto implica que, realizando sucesivos pasos de centrifugación variando la fuerza centrífuga y la duración, puede hacerse que algunos componentes celulares sedimenten mientras que otros permanezcan en suspensión. Esta metodología se conoce como centrifugación diferencial. 1. Homogeneización 2. Centrifugación Diferencial 1º centrifugación 2º centrifugación 3º centrifugación 10 min 800g 15 min 20.000g 60 min 105.000g Fracción Fracción Fracción pellet mitocondrial microsomal nuclear Homogenato sobrenadante En la figura se esquematiza un fraccionamiento subcelular. Por ejemplo, partiendo de un órgano como puede ser el hígado, se procede a la disgregación mecánica y lisis celular obteniéndose un homogeneizado, es decir una suspensión con los componentes celulares. Si se centrifuga este homogeneizado, a baja velocidad por un tiempo corto (10 minutos a 800g) se obtiene un sedimento o pellet que contiene los núcleos, es decir la fracción nuclear. Los núcleos son las primeras partículas en sedimentar ya que poseen el coeficiente de sedimentación más grande (106 -107 S). Si se extrae el sobrenadante (todo aquello del homogeneizado que no sedimentó) se transfiere a otro tubo y se vuelve a centrifugar ahora a mayor velocidad y durante más tiempo (15 minutos a 20.000g), se obtiene un segundo “pellet” que contiene la fracción mitocondrial.
- 27. Si se repite el procedimiento y se centrifuga el segundo sobrenadante (60 minutos a 105.000g) se obtiene la fracción microsomal, es decir vesículas de membrana intracelular y ribosomas principalmente. El sobrenadante de esta tercera centrifugación constituye la fase soluble o citosol de la célula, que contiene proteínas solubles, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y partículas pequeñas. Cuando comienza la centrifugación las partículas se encuentran distribuidas en todo el tubo. Por tal motivo, partículas pequeñas que se encuentren cerca del fondo llegarán rápidamente al sedimento o serán arrastradas por las partículas más grandes. Esto hace que las fracciones de los organelos más grandes estén contaminados con organelos más pequeños. Por lo tanto si se quieren eliminar organelos más pequeños de las fracciones de organelos más grandes, deben hacerse varias centrifugaciones para deshacerse de los primeros. Alternativamente se pueden realizar centrifugaciones en gradiente de densidad. En un tubo se colocan soluciones (sacarosa, percoll, ficoll, etc) de densidad creciente hacia el fondo del tubo, y en la parte superior se coloca el homogeneizado. La partícula sedimentará hasta alcanzar la posición en el gradiente que presente igual densidad. En el esquema se coloca un homogeneizado sobre una Homogeneizado en solución de sacarosa 2M. En estas condiciones sólo son Sacarosa 1M capaces de sedimentar los núcleos, que son las partículas Sacarosa 2M más densas, y no así el resto de los organelos, que permanecerán en la parte superior del tubo
- 28. NÚCLEO Objetivo: Identificación de una fracción subcelular enriquecida en núcleos mediante la reacción de Feulgen y comparación con núcleos en cortes histológicos. Estudio de la ultraestructura del núcleo. Introducción: El núcleo es el organelo celular donde se localiza el ADN. Su forma varía dependiendo del tipo celular, puede ser esférico, ovoide o multilobulado. Su tamaño oscila entre 3 a 15 m y su posición depende del tipo celular. Está delimitado por una envoltura nuclear constituida por dos membranas celulares (dos bicapas lipídicas) separadas por una cisterna perinuclear. Esta envoltura se continúa en el citoplasma con el retículo endoplásmico rugoso, y por lo tanto su cara externa presenta ribosomas asociados. En la cara interna de la envoltura se localiza una red de filamentos intermedios denominada lámina nuclear, constituida por las proteínas denominadas laminas. Tanto la lámina nuclear como la envoltura se ven interrumpidas en regiones denominadas poros nucleares, destinados al transporte de moléculas desde y hacia el citosol. En el interior del núcleo el ADN que constituye los cromosomas se empaqueta con proteínas denominadas histonas. El conjunto del ADN, las histonas, y proteínas cromosómicas no histonas, se denomina cromatina. La unidad fundamental de empaquetado recibe el nombre de nucleosoma y está constituido por un octámero de histonas rodeado por dos vueltas de ADN. La cromatina posee diversos grados de compactación dentro del núcleo, y pueden existir variaciones durante el ciclo celular. En su estado más laxo o descondensado la cromatina se denomina eucromatina y se aprecia en microscopía electrónica de transmisión como regiones electrón-lúcidas (ver figura). Esta cromatina es transcripcionalmente activa ya que permite el acceso de factores de transcripción y toda la maquinaria enzimática necesaria para la transcripción. La cromatina condensada se denomina heterocromatina y se observa en microscopía electrónica de transmisión como regiones electrón-densas, generalmente asociadas a la envoltura nuclear. Esta cromatina se asocia con estados transcripcionalmente inactivos ya que dificulta el acceso de factores de transcripción al ADN. Es importante recordar que la compactación y descompactación de la cromatina son fenómenos reversibles. Podemos encontrar diferentes niveles de compactación del ADN que van desde la fibra de 2 nanómetros (doble hélice de ADN), pasando por la fibra de 11nm que corresponde al “collar de cuentas” que incluye los nucleosomas
- 29. (complejo de histonas rodeadas de dos vueltas del ADN), la fibra de 30nm, la de 300nm, la de 700nm hasta el cromosoma mitótico. El nucléolo es una región dentro del núcleo, no delimitada por membrana, donde ocurre la transcripción del ARNr y ensamblado de las subunidades ribosomales por separado. Allí se localizan loops de ADN de distintos cromosomas, que contienen clusters de genes de ARNr. Cada uno de estos clusters se denomina Región Organizadora Nucleolar (NOR). En una micrografía electrónica de transmisión pueden distinguirse tres regiones en el nulceolo: (1) una región pálida denominada componente fibrilar o centro fibrilar que contiene ADN que no está siendo transcrito, (2) un componente fibrilar denso que contiene moléculas de ARNr que están siendo sintetizadas, y (3) componente granular que contiene partículas precursoras ribosomales en maduración. El tamaño del nucleolo refleja su actividad por lo que varía en distintos tipos celulares y puede variar también dentro de una misma célula. En esta práctica, analizaremos una fracción subcelular obtenida mediante el siguiente protocolo a partir de un hígado de rata: (no será realizado en la clase) - Homogeneización del hígado de rata en un homogeneizador Potter-Elvehjem, (10% peso/volumen) en 0.32 M sacarosa, 3 mM MgCl2 en baño de hielo con 20 incursiones del émbolo. - Filtración en gasa del homogeneizado. - Centrifugación del filtrado a 700g, durante 10 min a 4ºC. - Resuspensión del pellet en 1 M sacarosa, 1 mM MgCl2, sembrado sobre sacarosa 2M y centrifugación a 50000g durante 1h a 4ºC. - El pellet resultante se resuspende en un pequeño volumen de 2.4 M sacarosa, 1 mM MgCl 2, 10% glicerol y se conserva a -20ºC hasta el momento de usar. Para realizar el análisis de esta fracción utilizaremos la reacción de Feulgen-Rossenbeck. Este es un método de determinación cualitativa y cuantitativa de ADN in situ. Analizaremos además de los núcleos íntegros (fracción subcelular), los núcleos en cortes histológicos utilizando la misma reacción. El primer paso de esta reacción incluye la hidrólisis del ADN con HCl 1N a 60ºC, de manera de extraer las purinas únicamente, dejando un grupo aldehído expuesto en la posición 1' de las desoxirribosas. La preparación se incuba luego con el reactivo de Schiff (incoloro a causa del tratamiento con H 2SO3), el que se combina con esos grupos aldehído libres restaurando el grupo cromógeno de la molécula (cada molécula del reactivo de Schiff se combina con 2 grupos aldehído), dando una coloración fucsia. El ARN no se marca con esta técnica ya que se hidroliza casi completamente durante el primer paso de la reacción y el ARN remanente no se encuentra depurinado. purina S S pirimidina pirimidina pirimidina + S HCl 1N 60ºC S: Ractivo de Schiff
- 30. Práctico 5 – Fraccionamiento Subcelular 2 MITOCONDRIA Objetivos: • Identificación de una fracción subcelular enriquecida en mitocondrias mediante la detección de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH). • Estudio de la ultraestructura de la mitocondria. Introducción: La mitocondria es el lugar donde ocurre la mayor parte de las reacciones del metabolismo oxidativo en las células eucariotas. Esto es, es el sitio en el cual se realiza la mayor parte de la degradación oxidativa de compuestos como carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos, que terminan dando lugar a la generación de energía en forma de síntesis de ATP. La mitocondria es un organelo de morfología y tamaño variables, pero que típicamente tiene una forma elipsoide, de aproximadamente 0,5 μm de diámetro y 1 μm de largo. Las mitocondrias están delimitadas por dos membranas, una membrana externa lisa y una membrana interna extensamente invaginada. El espacio entre ambas membranas se conoce como espacio intermembrana, y las invaginaciones de la membrana interna, que amplían enormemente su área, se denominan crestas (Figura 1). El compartimento interno de la mitocondria es la matriz mitocondrial. Mientras que la membrana externa permite la difusión libre de moléculas de hasta 10 kDa, la membrana interna sólo deja pasar libremente O2, CO2 y H2O, y posee varios transportadores que controlan el pasaje de diversos metabolitos. Figura 1: Representación de una mitocondria.
- 31. H+ espacio H+ H+ intermembrana complejo complejo e- complejo membrana e- e- e- NADH Q citocro mo b-c1 cit c citocro mo deshidrogena sa oxidasa interna FAD NAD+ 2 H 2O 4 H+ + O2 acetil-CoA NADH oxalacetato matriz citrato mitocondrial NAD+ malato isocitrato CICLO DE KREBS NAD+ fumarato NADH FADH2 -cetoglutarato NAD+ FAD succinato succinil-CoA NADH Figura 2: Resumen de las reacciones del ciclo de Krebs y de la cadena respiratoria que tienen lugar en la mitocondria. En la figura anterior se esquematizan dos de los principales procesos metabólicos que ocurren en la mitocondria, y que nos van a permitir identificarla: el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. El resultado neto del ciclo de Krebs es la oxidación de un grupo acetilo (CH 3−C=O) perteneciente a la acetil- CoA a dos moléculas de CO2, y en paralelo la reducción de tres NAD+ y un FAD para dar 3 NADH y un FADH2, respectivamente. Todas las enzimas que catalizan las reacciones del ciclo de Krebs se hallan en la matriz mitocondrial, excepto la succinato deshidrogenasa, cuya actividad mediremos, que está inserta en la membrana mitocondrial interna. En la cadena respiratoria, los electrones de alta energía del NADH y el FADH 2 pasan por sucesivos complejos aceptores de potencial redox creciente, con lo que esta energía se va liberando. En cada complejo se bombean protones hacia el espacio intermembrana, con lo que se establece una diferencia de concentración de H+ (y de carga) a través de la membrana mitocondrial interna. La energía liberada por el transporte de electrones queda almacenada en forma de un gradiente electroquímico. Los tres complejos, así como los dos transportadores, que constituyen la cadena respiratoria, están insertos en la membrana mitocondrial interna. Los electrones provenientes del NADH pasan al complejo NADH deshidrogenasa, y de allí pasan a la coenzima Q, una pequeña molécula hidrofóbica, que los transporta al complejo citocromo b-c1. Los citocromos son proteínas que contienen grupos hemo, en los que un átomo de hierro alterna entre los estados de oxidación Fe (II) y Fe (III). Existen varios tipos de citocromos, que pueden hallarse formando parte de complejos, o bien aislados, como el citocromo c, que transporta electrones del complejo citocromo b-c1 al complejo citocromo oxidasa. En este complejo, los electrones llegan a su aceptor final, el O2, para formar H2O. La oxidación del FADH2 es menos favorable que la del NADH, y sus electrones entran en la cadena respiratoria más adelante, siendo cedidos a la coenzima Q. El FADH2 está unido covalentemente a la succinato deshidrogenasa, que está inserta en la membrana mitocondrial interna, como mencionamos más atrás.
- 32. La succinato deshidrogenasa es una enzima que sólo se encuentra en mitocondrias, y por lo tanto la medición de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en una fracción subcelular. Esto se puede realizar utilizando un aceptor artificial de electrones que tenga mayor afinidad por los electrones que el FAD. En el práctico utilizaremos 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto cambia el color según su estado de oxidación: es azul cuando se encuentra en estado oxidado e incoloro cuando está reducido. Succinato fumarato DCPIP ox. DCPIP red. (azul) (incoloro) Figura 3: Esquema de las reacciones durante la reducción del aceptor artificial de electrones. Protocolo de fraccionamiento subcelular para la obtención de mitocondiras (no será realizado en clase): 1. Homogeneización (en frío) de hígado de rata en un homogeneizador Potter-Elvehjem, en buffer Tris-HCl (15 mM) pH 7.4, sacarosa 0.33 M y EDTA 0.025 mM, a 1000 rpm., con 5 incursiones del émbolo. 2. Filtración en gasa del homogeneizado. 3. Centrifugación del filtrado a 800g durante 10 min. a 4ºC. 4. Se descarta el pellet y se centrifuga el sobrenadante por 10 min. a 8200 g a 4ºC. 5. Se descarta el sobrenadante y se resuspende el pellet en buffer de homogeneización. Se centrifuga igual que en paso 4). 6. El pellet resultante se resuspende en aprox. 0.5 ml de buffer de homogeneización y se guarda a - 20ºC hasta el momento de usarlo.
- 33. Práctico 6 – Fraccionamiento Subcelular 3 CLOROPLASTO Objetivos: Obtención de una fracción subcelular enriquecida en cloroplastos. Identificación de cloroplastos en dicha fracción. Estudio de la ultraestructura del cloroplasto. Introducción: En algas y plantas superiores, la fotosíntesis ocurre en el cloroplasto. Este organelo posee, al igual que la mitocondria, una envoltura compuesta de dos membranas, una externa y una interna, pero además posee un tercer sistema de membrana, la membrana tilacoidal. Esta membrana forma pequeños sacos aplanados, denominados tilacoides, cuyo lumen es el espacio tilacoidal. Los tilacoides se apilan, formando bloques denominados grana (cada bloque en singular es un granum). Los grana están interconectados por regiones de la membrana tilacoidal alargadas, denominadas laminillas del estroma, cuyo lumen es continuo con el espacio tilacoidal. El estroma es el espacio interno del cloroplasto que queda por fuera de la membrana tilacoidal (Figura 1). Figura 1: Representación esquemática de un cloroplasto. La fotosíntesis es un complejo proceso en el cual la energía de la luz se usa para generar energía química en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH, que se usan a su vez para convertir el CO 2 del aire en carbohidratos, liberándose paralelamente O2 a partir de agua (en plantas, algas y algunas bacterias). La reacción global de la fotosíntesis es: 6 CO2 + 6 H2O 6 O2 + C6H12O6
- 34. Las reacciones de la fotosíntesis pueden agruparse en dos clases, las reacciones fotoquímicas, que ocurren en la membrana tilacoidal y en las que se generan ATP y NADPH, y las reacciones bioquímicas, que comienzan en el estroma del cloroplasto y continúan en el citosol, en las que el CO 2 es convertido en carbohidratos. luz estroma luz NADP+ + H + membrana tilacoidal NADPH e- e- complejo b6-f e- e- fotosistema I e- e- NADP fotosistema II pQ pC Fd reductasa 4 H+ + O2 2 H2O H+ espacio tilacoidal Figura 2: Esquema del camino seguido por los electrones durante las reacciones fotoquímicas. Las reacciones fotoquímicas, mediante las que se obtiene ATP y NADPH, constituyen un proceso de dos fases, denominado fotofosforilación no cíclica, para distinguirlo de otro proceso, la fotofosforilación cíclica, en el que solo se genera ATP. En la primera fase de la fotofosforilación no cíclica, la absorción de luz por el fotosistema II le permite remover electrones provenientes del agua y transferirlos a una cadena de transporte, hasta llegar al fotosistema I. Allí, una nueva absorción de luz confiere suficiente energía a los electrones para poder reducir a su aceptor final, el NADP+, formando NADPH (Figura 2). Los fotosistemas son complejos formados por varios polipéptidos y distintos tipos de pigmentos, y en ellos la luz absorbida se utiliza para excitar a un electrón en una molécula de clorofila particular. En el fotosistema II, este electrón es transferido a la plastoquinona, una pequeña molécula análoga a la coenzima Q de la fosforilación oxidativa. Cada electrón transferido por el fotosistema II se repone con uno proveniente del agua, en una compleja reacción cuyo resultado final es la liberación de O 2 a partir de agua. La plastoquinona transfiere electrones al complejo b6-f, análogo al complejo b-c1 de la mitocondria, el cual bombea protones dentro del espacio tilacoidal. La plastocianina, una proteína pequeña que contiene un átomo de cobre que varía de estado de oxidación, transporta electrones desde el complejo b6-f hasta el fotosistema I. Allí, la absorción de un fotón aumenta la energía de estos electrones, que pueden reducir a la ferredoxina, una proteína con un grupo prostético que contiene hierro y azufre. Esta a su vez transfiere los electrones al NADP+, en una reacción catalizada por la enzima NADP reductasa. Además de generar NADPH, este proceso de transporte de electrones provoca la acumulación de protones en el espacio tilacoidal, con la consecuente generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana tilacoidal, el cual es usado para sintetizar ATP. En 1937, Robert Hill descubrió que cuando cloroplastos aislados son iluminados en ausencia de CO 2, son capaces de reducir un aceptor artificial, liberando O2 paralelamente. Este resultado fue una de las primeras demostraciones de que el CO2 no participa directamente en el proceso que produce O2, y puede resumirse en la siguiente reacción química, denominada reacción de Hill: luz, cloroplastos H2O + A AH2 + ½ O2
- 35. En el práctico realizaremos un protocolo de separación de pigmentos fotosintéticos mediante cromatografía. Los pigmentos fotosintéticos son responsables de absorber y atrapar la energía lumínica en los primeros pasos de la fotosíntesis. Los principales pigmentos son las clorofilas. En plantas verdes existen las clorofilas a y b. También existen pigmentos accesorios llamados carotenoides. Dada su estructura molecular, las clorofilas son capaces de absorber luz en el rojo y el azul del espectro visible y transmiten en el verde. Los carotenoides, por su parte, absorben en el azul y transmiten en el amarillo-anaranjado. Ya que el espectro de absorción de los pigmentos accesorios difiere del de las clorofilas, tienen el efecto de ampliar el rango de longitudes de onda que puedan ser utilizados en la fotosíntesis. La cromatografía es un procedimiento para separar los componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Existen varios tipos de cromatografía pero en todos los casos la separación se logra por la distribución de los componentes en una fase estacionaria (fija) y una fase móvil. En la cromatografía en papel, los componentes de la mezcla se separan en zonas discretas en una tira de papel de filtro, utilizando en la fase móvil una mezcla de solventes en la cual cada componente de la muestra a separar se disuelve de manera diferencial. La fase estacionaria está constituida por el papel. Durante la cromatografía existen dos fuerzas opuestas. La fuerza del solvente en movimiento que se extiende por capilaridad hacia el otro extremo del papel, que tiende a llevarse cada componente consigo. También existe una fuerza de resistencia debida a la disolución de cada componente en la fase estacionaria. De la interacción de estas dos fuerzas en cada componente de la muestra, es que resulta la separación de cada uno de ellos. El grado de separación obtenido es una función de la solubilidad relativa de cada componente en la fase estacionaria y la fase móvil (Figura 3). Figura 3: Esquema de una cromatografía en papel.
- 36. Práctico 7 – Ultraestructura ANÁLISIS DEL MOVIMIENTO DE MELANOSOMAS Introducción: Los vertebrados poseen células pigmentarias especializadas derivadas de la cresta neural. En peces y anfibios se ubican en la dermis y se las denomina melanóforos, mientras que en mamíferos se llaman melanocitos y se las encuentra en la epidermis. El pigmento (melanina) es producido y almacenado en organelos relacionados a los lisosomas, denominados melanosomas (Figura 1). El grado de pigmentación está dado, no por el número de melanosomas, sino por su redistribución en la célula entre dos estados alternativos: agregado y disperso (Figura 1). Estos procesos están regulados por estímulos extracelulares, que en peces es mediado por neurotransmisores, mientras que en anfibios por hormonas. En ambos casos este mecanismo le permite al animal cambiar su coloración, lo cual es importante para la respuesta de camuflaje y la interacción social. Por otro lado, en mamíferos, los melanocitos epidérmicos extienden prolongaciones que contactan alrededor de 30 queratinocitos subyacentes. La redistribución de los melanosomas en este caso se desencadena a raíz de otros estímulos, por ejemplo la exposición a radiación ultravioleta, y una vez que alcanzan la periferia de la célula, el pigmento es exocitado hacia los queratinocitos, lo que refuerza la fotoprotección (Ref 2). Figura 1: Esquema de la redistribución de melanosomas en melanóforos. Los trazos gruesos indican microtúbulos y los trazos cortos, finos indican microfilamentos. Las micrografías electrónicas de transmisión de la izquierda muestran melanosomas de mamíferos en diferentes estadios de formación de la melanina. Los melanosomas constituyen un modelo de estudio de la biología de organelos relacionados a lisosomas y además, es uno de los modelos más utilizados para el estudio del movimiento de organelos en función de señales extracelulares. Algunas de las hormonas que influyen sobre la localización de los melanosomas incluyen a la melanotonina, que induce la agregación mientras que la hormona estimulante de melanocitos (MSH) promueve la dispersión. Hasta el momento se sabe que, a nivel intracelular, la dispersión de los melanosomas está mediada por una elevación del nivel de AMP cíclico, mientras que, la agregación se da por una disminución en su concentración. Sin embargo no se conoce que otros intermediarios están relacionados con este fenómeno. Los dos principales sistemas de transporte de organelos y vesículas son los microtúbulos para el transporte a grandes distancias y los filamentos de actina para desplazamientos
- 37. cortos y/o para el posicionamiento. Los primeros estudios sobre el transporte de pigmento en melanóforos establecieron que los microtúbulos participan en el transporte de melanosomas, por medio de experimentos en los que se reconstituía el movimiento de los mismos in vitro. Estos experimentos demostraron que existían dos actividades motoras de polaridad opuesta involucradas en este movimiento: kinesina II es la responsable del movimiento de dispersión de los melanosomas, mientras que la dineína citoplásmica es la responsable del movimiento de agregación. Estas moléculas también están involucradas en el movimiento de otros organelos en la célula. Los melanosomas también pueden ser transportados a lo largo de microfilamentos, identificándose a la proteína motora miosina V como relacionada a este movimiento. La dispersión de los melanosomas depende de un mecanismo compartido entre el transporte asociado a microtúbulos y microfilamentos, mientras que el movimiento de agregación es dependiente únicamente del transporte por microtúbulos, con mecanismos moleculares conservados entre vertebrados. Este mecanismo podría extenderse a otros organelos en la célula, el que puede darse por la cooperación entre el transporte asociado a microtúbulos y microfilamentos (Ref 2). Referencias 1. Marks M.S., Seabra M.C. (2001) The melanosome: membrane dynamics in Black and White. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2:738 2. Tomado de http://www.proweb.org/kinesin/Melanophore.html en una contribución de V. Gelfand and S. Rogers