Informe absorbancia
- 1. Absorbancia Pedro Antonio Rodríguez Ospina Angie Lorena Luna Mendoza Estudiantes de Ingeniería Sanitaria Facultad del medio ambiente y recursos naturales Universidad Distrital Francisco José de Caldas INTRODUCCIÓN La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda está relacionada con el paso óptico y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos relaciones están combinadas en la ley de Lambert-Beer: Log Io / I = ∈ c l en donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectivamente, l el paso óptico de la muestra absorbente (cm), c la concentración de la especie absorbente (moles/litro) y ∈ el coeficiente de absorción molar (M-1 cm -1). La expresión log Io / I se denomina absorbancia y se designa por A (siendo adimensional). Fijando el paso óptico (habitualmente 1 cm), resulta que la absorbancia A es directamente proporcional a la concentración del soluto absorbente. El coeficiente de absorción molar varía con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, la longitud de onda y también con el pH. La aplicación obvia de la ley de Lambert- Beer es el uso del colorímetro para determinar la concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (p. ej. Carotenos, clorofila, hemoglobina, etc.). La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o aminoácidos después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados coloreados. Los espectros de absorción, gráficos que relacionan absorbancia con longitudes de onda, son frecuentemente utilizados en Bioquímica para la caracterización e identificación de biomoléculas. En esta práctica se realizará un sencillo análisis espectrofotométrico consistente en la obtención del espectro de absorción y construcción de una curva patrón para verificar la ley de Lambert-Beer, calcular el coeficiente ∈ y determinar la concentración de una muestra . RESUMEN La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta práctica se darán a conocer las características generales y conceptos
- 2. Absorbancia Pedro Antonio Rodríguez Ospina Angie Lorena Luna Mendoza Estudiantes de Ingeniería Sanitaria Facultad del medio ambiente y recursos naturales Universidad Distrital Francisco José de Caldas relacionados con la espectrofotometría. A continuación y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas. OBJETIVOS Determinar la concentración de una solución por espectrofotometría. Establecer una relación entre la absorbancia y la concentración de una solución (Curva de calibración). MARCO TEÓRICO Un espectrofotómetro o colorímetro hace uso de la transmisión de la luz a través de una solución para determinar la concentración de un soluto dentro de la solución. Un espectrofotómetro difiere de un colorímetro en la manera en la cual la luz es separada en sus longitudes de onda componentes. Un espectrofotómetro usa un prisma y un colorímetro utiliza filtros. Ambos se basan en un diseño simple en el cual la luz de una determinada longitud de onda pasa a través de una muestra y se mide la cantidad de luz que es transmitida. Esto es realizado colocando una fotocelda del otro lado de la muestra. Todas las moléculas absorben energía radiante en una longitud de onda u otra. Esas que absorben energía dentro del espectro visible son conocidos como pigmentos. Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben luz en el rango ultravioleta. La absorbancia: Es el negativo del logaritmo en base 10 de la transmitancia. A = - log10 T A=absorbancia T=transmitancia La absorbancia es más útil en espectrofotometría que la transmitancia, debido a que la representación gráfica de la concentración versus la absorbancia produce una línea recta. La representación gráfica de la concentración versus la transmitancia es exponencial. El -log calcula el inverso de la transmitancia, de tal manera que laabsorbancia aumenta con la concentración creciente de colorante. La relación de la absorbancia con la concentración se encontró por dos bioquímicos que tiene la ecuación para
- 3. Absorbancia Pedro Antonio Rodríguez Ospina Angie Lorena Luna Mendoza Estudiantes de Ingeniería Sanitaria Facultad del medio ambiente y recursos naturales Universidad Distrital Francisco José de Caldas una línea recta, y= mx +b, dónde la m es la pendiente de la línea y b es la intercepción de la recta con el eje y. Si la medición se realiza de tal manera que b = 0 (es decir, una solución que no contiene colorante no tiene absorbancia), y si substituimos a absorbancia por y, entonces la concentración por x, m, llegamos a la formulación de la Ley de Beer-Lambert: A = ε Cl Donde A = absorbancia C = concentración molar ε = el coeficiente de extinción molar para una determinada longitud de onda l = distancia que atraviesa la luz por la muestra en centímetros. Después de registrar la absorbancia para una serie de muestras de concentración conocida (estándares), se hace una gráfica del valor de absorbancia (el eje vertical o Y)vs la concentración (el eje de las abscisas o X). La pendiente de la línea es el coeficientede extinción (ε). Espectro de absorbancia El análisis de pigmentos a menudo precisa un uso diferente de un espectrofotómetro. En la utilización del instrumento para la determinación de la concentración de una sustancia(las Leyes de Beer-Lambert), la longitud de onda fue determinada y colocada en un valor a todo lo largo del procedimiento. Este valor es determinado por un análisisde la absorción de una solución variando la longitud de onda. Independientemente del equipo utilizado, la línea de base debe ser continuamente fijada cada vez que la longitud de onda sea variada. Al utilizar un espectrofotómetro con un solo portaceldas, el equipo es colocado en0A/100%T con el “blanco”, la longitud de onda es colocada y luego la muestra es colocada y leída. La longitud de onda es variada por arriba o por abajo, el equipo es colocado en 0A/100%T con el “blanco”, se coloca la misma muestra y es leída. Este procedimiento se repite con todos los valores de longitud de onda que vayan a ser utilizados. En este procedimiento, la muestra es la misma, pero la longitud de onda es variada. Los compuestos tienen diferentes coeficientes de absorción para cada longitud de onda. Así, cada vez que la longitud de onda es alterada, el instrumento debe ser recalibrado.
- 4. Absorbancia Pedro Antonio Rodríguez Ospina Angie Lorena Luna Mendoza Estudiantes de Ingeniería Sanitaria Facultad del medio ambiente y recursos naturales Universidad Distrital Francisco José de Caldas MATERIALES Y REACTIVOS Balon aforado de 25 ml vidrio de reloj Pipeta graduada de 10 ml Beacker de 50 ml Agitador de vidrio Tubos de ensayo (8) Gradilla Agua destilada Muestras Equipos Balanza , Espectrofotómetro RESULTADOS Tabla 1. Índice de absorbancia y concentración del sulfato de cobre a partir del volumen de dilución. Solución de Sulfato de cobre (ml) Concentración (M) Absorbancia 21 0.002 0.050 3 0.006 0.159 5 0.01 0.295 6 0.012 0.345 7 0.014 0.406 Imagen 1. Índice de absorbancia Fuente: Propia-Tomada por Angie Luna. Fecha: 27/09/15 Imagen 2.Preparación de la muestra en blanco. Fuente: Propia-Tomada por Angie Luna. Fecha: 27/09/15
- 5. Absorbancia Pedro Antonio Rodríguez Ospina Angie Lorena Luna Mendoza Estudiantes de Ingeniería Sanitaria Facultad del medio ambiente y recursos naturales Universidad Distrital Francisco José de Caldas Grafico 1 .Curva de calibración Los datos graficados en la curva de calibración, son datos obtenidos luego de unos cálculos previamente realizados. Para mayor claridad y veracidad de los mismos, se anexan cada uno de los cálculos empleados. ANALISIS DE RESULTADOS La Tabla N° 1 muestra la absorbancia calculada para cada una de las soluciones patrón, éstos valores son los empleados para la construcción de la curva de calibración . Al realizar la curva de calibración para los valores de absorbancia con respecto a los de concentración de los patrones (tabla N° 1), se puede apreciar que varía linealmente en función de la concentración de sulfato, tal como se esperaba. Aún cuando la tendencia no es exactamente una recta si se aproxima bastante a dicha forma y las desviaciones de la linealidad se pueden deber a errores en la preparación de las soluciones patrón, donde éstos afectan directamente la concentración de las muestras, afectando de manera significativa las tendencia de la curva de calibración, lo cual influyó en los valores obtenidos de absorbancia y por ende no se obtuvo perfectamente una recta. La grafica N° 1 es la representación gráfica de la curva de calibración del equipo utilizado. CONCLUSIONES La absorbancia de longitud de onda es una propiedad física que nos permite identificar semejanzas entre ciertos compuestos. Esta característica física depende de las concentraciones de las soluciones. En esta práctica, la absorbancia de longitud de onda se debía a la diferente concentración de una misma solución. En biotecnología, microbiología y bioquímica, este principio se puede utilizar para la cuantificación de sustancias y microorganismos. La absorbancia de longitud de onda arroja información sobre la naturaleza de la sustancia e indica qué cantidad de la sustancia está presente en la muestra en cuestión. y = 29.469x - 0.0588 R² = 0.9979 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.02 0.04 0.06 0.08 Curva de Calibración Absorbancia Concetración
- 6. Absorbancia Pedro Antonio Rodríguez Ospina Angie Lorena Luna Mendoza Estudiantes de Ingeniería Sanitaria Facultad del medio ambiente y recursos naturales Universidad Distrital Francisco José de Caldas BIBLIOGRAFÍA ● Harris, D. C. Análisis Químico Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed. Reverté, 2007. ● Higson, S. P. J. Química Analítica. 1ª ed. Capítulo 5. Ed. Mc Graw Hill. 2007. ● Martínez Urreaga, J.; Narros Sierra, A.; De La Fuente García-Soto, M.M.; Pozas Requejo, F.; Díaz Lorente, V.M. Experimentación en Química General. Capítulo 5. Ed. Thomson Paraninfo, 2006. ● Hernández-Hernández, L.; González- Pérez, C. Introducción al análisis instrumental. Capítulo 3. Ed. Ariel Ciencia, 2002.