Lacasas
- 1. Biotecnología Microbiana INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Pleurotus sajor-caju producción de lacasas 9QM2 EQUIPO 3, SECCIÓN 1
- 2. CLASIFICACION TAXONÓMICA • Nombre Científico: Pleurotus spp. • Nombre Vulgar: Orellanas, orejas de palo, hongo ostra. • Reino Fungi • Phylum: Basidiomycota • Subclase: Basidiomycetes • Clase: Agaricomycetidae • Orden: Agaricales • Familia: Pleurotaceae • Género: Pleurotus • Especie: sajor-caju Pleurotus sajor- caju (Lentinus sajor-caju)
- 3. MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA • Hongo comestible • Color es blanco • Su carne es compacta en el sombrero y fibrosa y blanca en el pie con sabor y olor agradable. • El sombrerillo de esta seta es redondeado, con la superficie lisa, abombada y convexa cuando es joven, aplanándose luego poco a poco.
- 4. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA • Presentan un micelio de color blanco, una textura algodonosa, cantidad regular de micelio aéreo en medio de cultivo.
- 5. ENZIMA LACASA • Es una glicoproteína dimérica o tetramérica, usualmente presenta cuatro átomos de cobre. • Son enzimas pertenecientes al grupo de las oxidasas de cobre azul. • Catalizan la oxidación de un substrato orgánico o inorgánico y la reducción de oxígeno molecular a agua, por medio de un mecanismo de transferencia de un electrón.
- 6. IMPORTANCIA INDUSTRIAL • Remover compuestos xenobióticos de residuales acuosos. • Destoxificación de compuestos fenólicos en vinos. • Obtención de hidrolizados de lignocelulosa antes de ser usados para la fermentación alcohólica por S. cerevisae. • Decoloración de colorantes textiles.
- 8. Tinción simple de colonias Evaluación cualitativa Producción de lacasas con ABTS ( 3 etilbenzotiazolina-6 acido sulfónico) Micrografía de micelios de Plerotus spp. a) Dicariótico (con fibulas) y b) monocariótico (sin fibulas).
- 9. AISLAMIENTO SECUNDARIO Matraces Fernbach C/100 litros del medio Bran Flakes durante 7 días.
- 10. ACTIVIDAD ENZIMATICA Siringalazina (4-hidroxi-3,5-Dimetoxibenzaldehidazina) en un amortiguador de acetatos 100 mM, pH 4.5 λ530 nm
- 11. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA El caldo de cultivo (100 litros) se centrifugó en una centrífuga tubular marca Sharples Modelo AS-16 a 15 000 RPM (13 200 g). Posteriormente, el sobrenadante se concentró por ultrafiltración en un equipo de fibra hueca de 20 litros marca Amicon Modelo DC 10 L. La primera filtración se realizó en un cartucho de fibra hueca (H5 MP-43) con un corte de 0.1 Hm. La segunda filtración y concentración se realizó con un cartucho (H10 P10-20) con un corte de 10 000 Da, obteniéndose un volumen de 3.8 litros. Centrífuga tubular
- 12. La solución enzimática concentrada se sometió a un fraccionamiento por precipitación con sulfato de amonio. La primera precipitación se llevó a cabo con 50% de saturación a 4°C. El precipitado se desechó y el sobrenadante se llevó al 100% de saturación de sulfato de amonio. El precipitado de esta segunda fracción se redisolvió en 900 mL de amortiguador 60 mM de fosfato de sodio, pH 6.0. La solución enzimática se dividió en volúmenes de 100 mL y dializó en una membrana de 12 000 Da contra 4 L de un amortiguador 10 mM de fosfatos, pH 6.0, a 4°C. El solvente de diálisis se cambió dos veces.
- 13. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA La solución se sometió a una cromatografía de intercambio aniónico débil sobre DEAE-celulosa (dietilaminoetilcelulosa) de Sigma-Aldrich Co, eluyendo con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M en un amortiguador 10 mM de fosfatos pH 6.0. Las fracciones que presentaron actividad fueron colectadas y concentradas en una celda de ultrafiltración con una membrana de 10 000 Da de corte. Finalmente, la solución se sometió a una cromatografía de intercambio aniónico fuerte utilizando resina High Q (Bio-Rad laboratorios) y eluyendo con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M en un amortiguador 10 mM de fosfatos pH 6.0.