PCR.pptx
- 1. Andrea Victoria Aguilar López Myrna Yared Castañeda de la Cruz 8°B REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
- 2. ¿Qué es? La PCR es una técnica para la síntesis “in vitro” de secuencias específicas de ADN. Forma simple y rápida de multiplicar el ADN. Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 3. Kary Mullis utilizó la PCR para la amplificación del gen de la B- globina y el dx prenatal de la anemia falciforme Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 4. Mullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5’->3’ usando un molde de cadena sencilla pero a partir de una región de doble cadena. Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 5. Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1. Desnaturalización 2. Hibridación 3. Extensión Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 6. Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94°C durante 30’’- 1’. DESNATURALIZACIÓN Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 7. DESNATURALIZACIÓN La doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97°C). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya. Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 8. En este caso la temperatura y el tiempo dependen de 3 factores relacionados con los oligonucleótidos: la composición de bases, el tamaño y la concentración. En la práctica, la temperatura puede oscilar entre 45°C y 65°C, durante un tiempo comprendido entre 30’’ y 1’. HIBRIDACIÓN Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 9. Los cebadores se unen a las zonas 3’ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65°C). HIBRIDACIÓN Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 10. En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72°C. Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72°C. El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1’. ELONGACIÓN Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 11. También llamada etapa de elongación, se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad en la dirección 5’->3’ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. EXTENSIÓN Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 12. Este proceso se lleva a cabo en un termociclador de ADN Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 13. Una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8… Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 14. Tiene una longitud definida por los extremos 5’ de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea amplificar. Es el fragmento que se almacena de manera exponencial durante la reacción. Producto corto Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 15. Producto largo: es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la muestra y cuyos extremos 3’ no están definidos. Producto largo Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 16. Se realiza normalmente mediante corrido electroforético. Dependiendo del tamaño de la amplificación 7 de la resolución que deseemos usaremos diferentes genes (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio, tinción de plata, fluorescencia, radiactividad. DETECCIÓN DEL PRODUCTO DE LA PCR Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 17. La PCR es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado se amplifique y obtengamos un resultado falso. • Lugar físico exclusivo para realizar la PCR • Uso de instrumental exclusivo para la PCR • Utilización de reactivos y tubos estériles • Uso de guantes por el manipulador • Realización de controles de blanco CONTAMINACIÓN EN LA PCR Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
- 18. Mas, E., Poza, J., Ciriza J., Zaragoza, P., Osta, R., Rodellar, C. (2014). Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Laboratorio de Genérica, Bioquímica y Grupos Sanguíneos. BIBLIOGRAFÍA