Protocolosy wiki

FASE 1.- MICROPROPAGACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Ve a la poyata y toma un vaso de
precipitados llénalo de agua destilada
en el grifo.
1º.- Preparación del medio de cultivo o crecimiento:
Chopo (Populus sp. 3 meses)
Ve a la poyata donde se encuentra el agitador coloca
el vaso sobre el agitador y ve añadiendo (toca cada
bote) los siguientes ingredientes por este orden:
PROTOCOLO- FASE I
• 1X Murashige Skooh -S1b.
• 2% Sacarosa.
• 0,8% agar, pH 5,8Ahora añadir:
Ajustar el pH a 5,8 colocando el vaso en el
medidor de pH.
2º.- Pasar el medio a una botella, (ponerle una cinta
de autoclave en la tapadera) y llevar al autoclave.

Llevar los brotes nuevo al fitotrón y dejarlos durante durante 6 semanas,
allí estarán a 25⁰C con un fotoperiodo de luz de 16horas de luz y 8 horas
de oscuridad.
•
PROTOCOLO- FASE I
4º.- Encender la cabina de flujo laminar, y poner las pinzas y tijeras que
están en la cabina en el esterilizador de boles de vidrio.
3º.- Recoger bandeja con botes estériles cercanos al autoclave. Recoger
ahora el bote con medio del autoclave y llevarlo a la cabina.
5º.- Una vez que el medio está atemperado. Añadir:
7º.- Sacar con las pinzas el árbol y colocarlo sobre la placa petri de
cristal, cortarlo en brotes con al menos una hoja cada uno y transferir cada
brote a un tubo, clavando el brote.
Ahora sal del fitotrón, vuelve a entrar y comprueba si tus plantas han
crecido correctamente, si es así habrás pasado la fase I, (cada vez que
salgas y entres habrá pasado una semana de tiempo).
6º.- Repartir 2 cm del medio en cada bote estéril y dejar solidificar (cambia el
color de amarillento a grisáceo).
(si el medio se endurece será imposible añadir el IAA, (0,5 mg/L ) no se
debe esperar demasiado):

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformación Bacteriana
Pasos a llevar a cabo:
- la PCR.
- la ligación.
- la transformación bacteriana.
2º.- Recoge el soporte con hielo y toma del frigorífico a -20ºC :
PCR
1º.- Enciende la máquina de PCR, el termobloque tarda en calentarse.
- ADN molde a partir del cual se amplificará el gen (100ng/ul).
- Oligonucleótidos (primer) derecho e izquierdo 100uM (forward and reverse).
- Tampón de la enzima polimerasa.
- Cloruro de Magnesio 25mM.
- Mezcla standard de dNTP 1mM (dinucleótidos trifosfato).
- ADN polimerasa (5u/ul).
- Agua destilada.
3º.- Ve a tu poyata y en un tubo de PCR mezcla los componentes, para ello coge la
pipeta de su soporte (los componentes se mezclan de forma automática).
4º.- Introduce la mezcla en la PCR (tubo verde) y pulsa start, cuando acabe la
PCR, guarda el fragmento amplificado a -20ºC.

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformación Bacteriana
LIGACIÓN
1º.- Enciende el termobloque a 16ºC.
2º.- Recoge el soporte con hielo y toma del frigorífico a -20ºC :
- ADN plasmídico (el vector).
- ADN amplificado por PCR (el gen de interés, tubo verde).
- Tampón de la enzima ligasa.
- Enzima ligasa.
- Agua destilada.
3º.- Ve a tu poyata y en un tubo de PCR mezcla todos los
componentes, tomando la pipeta.
4º.- Introduce el tubo con la mezcla en el termobloque, deja o/n (overnight) es
decir, 8-10h a 16ºC.
Si los has hecho bien, ya tienes el gen dentro del plásmido para el siguiente
paso, ahora debes introducir el plásmido en la bacteria.
5º.- Guarda el plásmido a -20ºC.

PROTOCOLO- FASE II: Transformación Bacteriana
1º.- Recoge el soporte con hielo y saca un tubo de bacterias de -80ºC y déjalo
en hielo, las bacterias deben descongelarse lentamente para disminuir la tasa
de mortalidad.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
2º.- Toma del frigorífico a -20ºC el ADN plasmídico que contiene el gen y
déjalo en hielo.
3º.- Ve al aparato de electroporación que está dentro de tu cabina, toca la
cubeta para depositar en ella una mezcla del plásmido y de la bacteria que
acabas de descongelar, el choque eléctrico abre las paredes bacterianas y el
plásmido entra en la bacteria.
4º.- Coloca el tubo en el horno a 37ºC para que las bacterias se recuperen
durante 1hora (20 segundos virtuales), (después las bacterias del tubo se pasarían
a una placa petri con medio de cultivo en presencia de antibiótico, sólo crecerían
las bacterias que contienen tu gen con el plásmido que le confiere resistencia a
dicho antibiótico, de la placa se toma una colonia que se crece en medio líquido
en el horno a 37ºC, estos pasos se realizan virtualmente dentro del horno y no los
realiza el avatar) del horno obtendrás finalmente un tubo falcon con la bacteria
lista para transformar la planta.
Si el cultivo ha crecido, pasa a la
siguiente fase!!!!

PROTOCOLO- FASE III
1º.- Recoge el Falcon con las bacterias del horno y llévalo a la cabina de flujo.
TRANSFORMACIÓN VEGETAL
2º.- Recoge los árboles de 3 meses de la cámara visitable y llévalas a la
cabina.
3º.- Al tocar el material vegetal éste pasa a quedar cortado en trozos este
material quedará dentro del medio con la bacteria la cual transforma el
material.
4º.- Lleva las placas a la cámara visitable y espera a que se vayan generando
callos, entra y sale de la cámara para observar los resultados, recuerda que la
fase de desdiferenciación celular se salta en la práctica virtual.
5º.- Cuando observes explantos sobre el callo llévalos a la cámara y traslada
los brotes a botes de plástico con medio, estos botes son de plástico, son más
grandes y servirçan para inocular los árboles crecidos en su interior.
6º.- Lleva los botes a la cámara, espera a que crezcan y llévalos a la cabina de
flujo para inocularlos con patógenos.

PROTOCOLO- FASE VI
1º.- Recoge las plantas de los botes de plástico, llévalos a la cabina.
INOCULACIÓN Y FENOTIPADO
2º.- Recoge el inóculo de hongo o de bacteria marcado como tal en el horno
de incubación. (el paso de preparado del inóculo no se lleva a cabo en
virtual).
3º.- Traslada el inóculo del erlenmeyer al bote de spray tocándolo.
4º.- Inocula con spray tomándolo y acercándolo al bote de plástico que
contiene el árbol.
5º.- Cierra el bote y llévalo a la cámara, observa los síntomas al cabo de 1,2,3
y 4 semanas virtuales (recuerda que cada vez que entras y sales pasa una
semana).
6º.- Anota los resultados del fenotipado y extrae conclusiones.

FUNDAMENTOS FASE V: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD IN VITRO DEL
ANTIBIÓTICO VEGETAL
FUNDAMENTOS FASE VI:
LOCALIZACIÓN SUBCELULAR Y TISULAR DEL ANTIBIÓTICO VEGETAL
ESTAS FASES
SE ENCUENTRAN EN PROCESO……………..

Se trata de una fitohormona reguladora
del crecimiento vegetal del grupo de las
auxinas. Estas hormonas desempeñan un
papel fundamental en el desarrollo
vegetal ya que promueven la elongación
celular, el desarrollo radicular, el
crecimiento del fruto y son responsables
de la dominancia apical.
Se sintetizan en la yemas, en los tejidos
jóvenes, frutos y embrión.
Todas las auxinas son compuestos que
poseen un anillo aromático y un grupo
carboxílico. El miembro más importante y
potente de las auxinas es el ácido
indolacético. Existen análogos sintéticos
de las auxinas como el 2,4-D (ácido 2,4-
diclorofenoxiacético), el ácido indol
butírico (IBA) y el ácido naftalen acético
(ANA).
Ácido indolacético

ADN (ácido desoxirribonucleico) o DNA (deoxyribonucleic acid). Tipo de ácido
nucleico, macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información
genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de
algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria.
Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un
polinucleótido. Cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una
base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un
grupo fosfato que actúa de enlace entre nucleótidos.
http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/dna
Para más información:
ADN

ADN molde
Secuencia de ADN que sirve de referencia para la ADN polimerasa.

Agar
Polisacárido sulfatado complejo compuesto principalmente por galactosa y ácido
glucurónico. Se extrae normalmente de algas rojas y se usa como agente solidificante en
medios de cultivo.
Tiene dos propiedades importantes:
-No es asimilable por los microorganismos, sólo es un sustrato o matriz, esto hace que el
medio de cultivo no se altere por el crecimiento.
-Se funde por encima de 100 C pero no solidifica hasta temperaturas por debajo de
45 C, esto permite ser utilizado en el laboratorio a temperaturas toleradas por las
manos humanas, y cultivar los microorganismos en un amplio rango de temperaturas.
Su utilización en medios de cultivo data del siglo XIX cuando la esposa de W. Hesse
(colaborador de R. Koch) se enteró de las dificultades de su esposo para cultivar
microorganismos en medios sólidos, y le aconsejó utilizar el espesante de sus
mermeladas (el agar).

Agitador de laboratorio
Instrumento de laboratorio diseñado para mezclar líquidos, o líquidos y sólidos. Existe una
variedad de agitadores basados en la aplicación:
- Agitador de bandeja: se trata de una superficie que gira en el plano accionada por un
motor . Se suele utilizar para mezclar cosas delicadas, como geles para tinción. Los
agitadores orbitales poseen balanceo, lo que contribuye a una mezcla mas eficiente.
- Agitador magnético: se basa en un motor eléctrico regulable en velocidad de giro que crea
un campo electromágnetico que hace girar un imán colocado en el recipiente de mezcla
(matráz, vaso de precipitados, etc). Este tipo de mezcladores suelen presentar una
superficie calefactora que facilita la disolución de solutos. Estos agitadores son muy
populares para la elaboración de soluciones, medios, etc, en volúmenes que van desde los
pocos ml a varios litros.
- Agitador de noria: los recipientes estancos giran en el plano vertical, como una noria.
- Agitador de vórtice (vortex), se trata de agitadores para mezclar volúmenes relativamente
pequeños (desde pocos microlitros hasta ml) en una amplia variedad de tubos de
laboratorio (eppendorf, falcon, tubos de ensayo, etc). El movimiento excéntrico del eje
orbital crea un vórtice o vortex que facilita una mezcla rápida y eficiente.

Agrobacterium tumefaciens
Bacteria que origina una enfermedad denominada tumor de cuello en algunas plantas. La
bacteria infecta heridas de la planta e incorpora un fragmento de ADN llamado ADN-T de
su plásmido Ti (inductor de tumores) en el genoma de la planta hospedadora. Este ADN-T
contiene genes de virulencia que inducen el tumor . Este mecanismo puede utilizarse
para transferir ADN foráneo a una célula vegetal, para ello se modifica el plásmido Ti
sustituyendo parte del ADN-T por el ADN (gen) de interés y eliminando los genes de
virulencia.

Cámara diseñada para mantener el ambiente
estéril requerido para trabajar con cultivos de
células o tejidos. Se consigue mediante el paso de
un flujo continuo no turbulento de aire esterilizado
por filtración a través de la zona de trabajo.
El flujo de aire puede ser horizontal o vertical.
En las cabinas de flujo horizontal, el aire filtrado
mediante filtros de alta eficiencia HEPA, atraviesa
la cámara central en una corriente laminar
horizontal que se expulsa por la abertura frontal
de la cabina.
En las campanas de flujo vertical, el aire filtrado
fluye a modo de cortina y evita que las
micropartículas y aerosoles que se puedan crear
en la manipulación contaminen al manipulador y
al ambiente. Mediante un sistema de aspiración se
recoge el aire contaminado y después de pasarlo
por unos filtros, se expulsa al exterior.
Cabina de flujo laminar

Callo
Los tejidos dañados que crecen de forma desorganizada se conocen, en las plantas, como
callos.
En las técnicas del cultivo in vitro, se denomina callo al tejido desdiferenciado formado
por células vegetales totipotentes (células capaces de regenerar un organismo completo
si las condiciones ambientales y los estímulos son los adecuados) que crecen en medios
con nutrientes.
Los callos se pueden obtener al introducir explantes o pequeñas porciones de tejidos
como hojas, cotiledones o raíces , en medios de inducción de callo.
También se pueden obtener callos al pasar protoplastos aislados a medios de inducción
de callo, donde se regeneran de nuevo las paredes celulares y se induce su división
celular.
Para regenerar con éxito una planta a partir de una célula individual indiferenciada es
necesario cultivar los callos en un medio que posea nutrientes y hormonas de
crecimiento (fitohormonas) . Éstas controlan el crecimiento y la diferenciación de las
células vegetales: las auxinas regulan el crecimiento de la raíz, y las citoquininas inducen
el crecimiento de los brotes e inhiben de este modo el crecimiento de la raíz. La
proporción entre citoquininas y auxinas es decisiva.

Clonación
En sentido general es obtener copias idénticas de un organismo, célula o molécula.
Clonación génica es la inserción de un fragmento de ADN en un vector o en un
cromosoma hospedador para diferentes propósitos como su multiplicación o su
expresión entre otros.

Codificar
Según la Real Academia de la Lengua Española, codificar es “transformar mediante las
reglas de un código la formulación de un mensaje”.
En genética molecular se dice que los genes codifican proteínas. Esto quiere decir que los
genes contienen un mensaje (la información necesaria para la síntesis de una proteína)
que sigue las reglas de un código (el código genético). Para entender el mensaje
codificado de un gen, éste tiene que ser traducido (traducción genética).

Código genético
El código genético es el conjunto de normas por las que la información codificada en el
material genético (secuencias de ADN o ARN) se traduce en proteínas (secuencias de
aminoácidos) en las células vivas. El código define la relación entre secuencias de tres
nucleótidos, llamadas codones, y aminoácidos. Un codón se corresponde con un
aminoácido específico.
El número de codones posibles es 64, de los cuales 61 codifican aminoácidos (siendo
además uno de ellos el codón de inicio, AUG) y los tres restantes son sitios de parada
(UAA, llamado ocre; UAG, llamado ámbar; UGA, llamado ópalo). La secuencia de codones
determina la secuencia aminoacídica de una proteína en concreto, que tendrá una
estructura y una función específicas.
El código genético es universal, específico, continuo y degenerado.
Para más información:
· Los códigos genéticos (tablas):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=tgencodes#SG1

Cultivo de bacterias (líquido y en placa).
Los microorganismos que se utilizan en el laboratorio son cultivos puros, proceden de
una sola célula. Las bacterias se cultivan en el laboratorio en condiciones asépticas, todo
el material utilizado debe ser estéril. Se utilizan incubadores donde se controla que la
temperatura y las necesidades de oxígeno sean las óptimas para cada bacteria.
Dependiendo de las necesidades el medio de cultivo puede ser líquido o sólido.
-los medios líquidos se utilizan para obtener gran cantidad de células de un
microorganismo concreto, se utilizan matraces o tubos que se incuban en agitación.
-los medios de cultivo sólido se consiguen añadiendo antes de la esterilización agar
como agente solidificante. El medio, estéril, fundido a Tª>45ºC, se reparte en placas de
Petri (circulares con tapa no hermética). Esto permite inmovilizar las células
permitiéndoles crecer y formar masas visibles, las colonias. Generalmente se utiliza para
conseguir aislar colonias.

El cultivo in vitro se define como el cultivo en
un medio nutritivo, en condiciones estériles,
de semillas, órganos, explantos, tejidos, células
y protoplastos de plantas.
En el cultivo in vitro se controlan y optimizan
los factores físicos (luz, Tª y humedad),
nutricionales y hormonales, y se excluyen
todos los microorganismos y plagas que
puedan afectar a la planta.
Cultivo in vitro
Planta de chopo de 3 meses de edad
cultivada in vitro

Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
Unidades fundamentales del ADN formadas por tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5º
de un azúcar desoxirribosa y una base nitrógenada (adenina (A), tionina (T), citosina (C) y
guanina (G)).

Electroforesis de ADN
Técnica separativa utilizada para resolver fragmentos de ADN de distinto tamaño en
función de la carga eléctrica.
La separación electroforética se lleva a cabo sobre matrices semisólidas, generalmente
de agarosa o de poliacrilamida (sólo para moléculas de ADN de tamaño menor a
100,000 pb).
El ADN tiene una carga eléctrica neta negativa debido fundamentalmente a los grupos
fosfato que contiene, de manera que, al someterlo un campo eléctrico, se desplazará
hacia el polo positivo (ánodo). En principio las moléculas de una mezcla de ADN se
moverán a una velocidad proporcional a su tamaño. Las moléculas de ADN mas
pequeñas se mueven mas rápido a través de los poros de la matriz y son las que migran
mas lejos.

Enzimas de restricción
Fueron descubiertas en los años 60 por Werner Arber y Hamilton D. Smith como
mecanismo de protección de las bacterias contra los virus bacterianos (bacteriófagos).
Las bacterias cortan el ADN (digestión del ADN) del virus exógeno con enzimas, las
denominadas endonucleasas de restricción (enzimas de restricción). El ADN propio de las
bacterias, en cambio, está protegido por grupos metilo (-CH3) adicionales, que bloquean
su acción.
En 1970 Herbert W. Boyer, descubrió que estas enzimas no cortan arbitrariamente el
ADN, sino sólo exactamente en determinadas pares de bases. Cada tipo de enzima es
capaz de reconocer y cortar una secuencia especifica de ADN, generando extremos de
ADN romos (p. ej.: SmaI) o cohesivos (p. ej.: EcoRI).
Hoy se conocen más de 1200 enzimas de restricción. Sin embargo, sólo algunas de ellas
son interesantes para la ingeniería genética. Los fragmentos de ADN obtenidos por una
de estas enzimas pueden ser unidos entre si por enzimas de ligación.
5 … G A A T T C … 3
3 … C T T A A G … 5
EcoRI
5 … C C C G G G … 3
3 … G G G C C C … 5
SmaI

Extremos complementarios de ADN
Extremos escalonados o cohesivos de una molécula de ADN que son producidos por una
enzima de restricción, y que presentan afinidad específica entre sí.

Fenotipado:
Definir el fenotipo de un organismo

Fenotipo:
Apariencia externa de un organismo; características visibles de un organismo
debidas a la interacción de su genotipo y el medio ambiente.

Cámara en la que se puede realizar el cultivo de plantas en condiciones ambientales
(luz, Tª y humedad) estrictamente controladas.
El crecimiento de plantas en un fitotrón minimiza el impacto de las variaciones
ambientales en el crecimiento de las plantas, reduce la incidencia de contaminaciones por
patógenos o plagas, y permite unas condiciones de confinamiento ideales para el
crecimiento de plantas en fase de experimentación.
Fitotrón

Duración de la luz del día o período de iluminación diaria que se suministra durante el
crecimiento de las plantas.
La duración de los periodos de iluminación o de oscuridad regula actividades de las
plantas asociadas al crecimiento, desarrollo, formación de órganos de reserva, floración y
letargo.
Las plantas se clasifican según su respuesta fotoperiódica en:
• Plantas de día corto: aquellas que florecen con periodos de luz inferiores a un cierto
valor crítico.
• Plantas de día largo: aquellas que florecen con periodos de luz superiores a un cierto
valor crítico.
• Plantas neutras: aquellas que florecen con independencia del fotoperiodo.
Fotoperiodo

Gel de agarosa
Matriz semisólida formada por polímeros derivados de carbohidratos que se utiliza
como soporte para la separación mediante electroforesis de fragmentos de ácidos
nucleicos o proteínas. La agarosa es un compuesto soluble en agua a temperaturas
superiores a los 60ºC y solidifica posteriormente por debajo de los 45ºC.

Gen
Un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el
caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una
macromolécula con función celular, que puede ser una proteína (a partir de ARN
mensajero), ARN ribosómico o ARN de transferencia.
El gen es considerado como la unidad de almacenamiento de información genética y
unidad de herencia al transmitir esa información a la descendencia. El conjunto de genes
de una especie se denomina genoma.

Genoma
Material genético correspondiente a la dotación cromosómica completa de una
especie.

Hospedador
Organismo que alberga a otro organismo o a un vector de clonación.

Inocular:
Introducir un patógeno o sus partes en una planta huésped o un órgano de la planta.

Inóculo:
Un patógeno o sus partes capaces que pueden causar infección cuando son transferidos
a un sitio favorable.

Ligación y clonaje
Proceso de Ligación.- Se inserta o “pega” el gen (fragmento obtenido en la PCR
dentro del vector (normalmente un plásmido) el gen se inserta en un cassete de
secuencia conocida que generalmente, concede resistencia a un antibiótico .
(enzima ligasa)
Tras el proceso de polimerización ó amplificación la ligasa establece puentes de
hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias formando enlaces
covalentes entre las mismas. Los extremos de ADN podrán ser romos ó
cohesivos.
Reacción de ligación: Contiene la enzima de ligación (ligasa), el tampón adecuado
para la actividad enzimática, el ADN plasmídico obtenido mediante midiprep y el
inserto amplificado por PCR. La relación de cantidades entre ADN plasmídico e
inserto en la reacción depende de sus tamaños. La reacción suele llevarse a cabo
durante una noche en un baño a 16ºC de temperatura.

Medidor de pH (también denominado pH-metro)
Instrumento para medir la acidez o basicidad de una solución acuosa. El pH-metro
típico consta de una sonda sensor o electrodo conectado a un medidor electrónico que
procesa y muestra la lectura de pH.
La mayoría de las sondas de pH se fabrican en vidrio. El diseño de la sonda se basa en
un tubo hueco a modo de celda en cuyo interior hay un electrodo inmerso en una
solución tampón referencia (0.1 mol/L KCl a pH 7). La parte exterior de la sonda
también llamada bulbo esta hecha en un sílice poroso muy fino (SiO2) donde se aloja
un segundo electrodo expuesto a la solución a valorar. Cuando los dos electrodos están
conectados con un medidor de pH, la diferencia de voltaje se amplifica permitiendo la
lectura el pH de la muestra.
La precisión de un pH-metro depende en gran medida de la calibración previa al uso, es
por ello que se recomienda que se calibre diariamente usando al menos tres soluciones
tampón de referencia (pH 4, pH 7 y pH 10 suelen ser los recomendados). El proceso de
calibrado corrobora el voltaje producido por la sonda (aproximadamente 0.06 voltios
por unidad pH) con la escala pH de la solución tampón standard.

Medio de cultivo
Son soluciones estériles con todos los nutrientes necesarios para cultivar
microorganismos en el laboratorio. A menudo los medios están tamponados para que el
pH sea el óptimo.
Lo medios de cultivos se clasifican según su composición en:
-medios de cultivo definido- se conoce la composición exacta de todos su nutrientes.
-medios de cultivo complejos- incluye en su composición un hidrolizado del que se
desconoce su composición química exacta como peptonas (hidrolizado de carne),
extracto de levaduras…etc.
Además se pueden diseñar medios de cultivos específicos para seleccionar o enriquecer
un microorganismo concreto.

Es un medio que promueve la desdiferenciación es decir, la pérdida de las características
de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático.
Los medios de inducción de callo se encontrarían dentro de este tipo de medios.
Medio de des-diferenciación de células

Medio de inducción de callo
Medio que se emplea para la inducción de la formación de callos a partir de explantes.
Se trata de un medio nutritivo al que además se añaden citoquininas y auxinas, como
reguladores del crecimiento, con el fin de promover la división celular y obtener células
con elevada capacidad regenerativa.

Micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados
para multiplicar plantas asexualmente de forma rápida, eficiente y en grandes cantidades.
La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas idénticas a una planta
madre, que puede haber sido obtenida por transformación, mutagénesis o mejora
genética. La micropropagacion se utiliza también para obtener plantas libres de
enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se
propagan eficientemente.
En la micropropagación, a partir de un fragmento (explanto) de una planta seleccionada
(llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con plantas
genéticamente idénticas, denominadas clones. El explanto más usado para los procesos de
propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas.
Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas:
1. Preparación de la planta madre.
2. Desinfección de explantos.
3. Cultivo in vitro del material seleccionado.
4. Multiplicación de brotes
5. Enraizamiento
6. Aclimatación
Micropropagación

Miniprep
Consiste en el proceso de extracción y purificación de ADN plasmídico (plásmido).
Muchos métodos han sido desarrollados para purificar los plásmidos de bacterias, pero
en todos ellos se pueden diferenciar tres pasos comunes:
1.- Crecimiento en medio selectivo (p. ej.: en presencia del antibiótico adecuado) del
cultivo bacteriano. Las condiciones de crecimiento pueden variar dependiendo de la
capacidad de replicación del plásmido.
2.- Concentración y lisado de las bacterias. Las bacterias son recogidas y concentradas
por centrifugación. Para poder lisarlas se usan múltiples métodos, incluyendo
tratamientos con detergentes, disolventes orgánicos, choque osmótico o térmico.
3.- Purificación del plásmido. Son muy variados los métodos empleados en el laboratorio.
Lo que se pretende es poder obtener una gran cantidad de alta calidad de la estructura
intacta del plásmido.

Patógeno
Que produce enfermedad, del griego πάθος (pathos), "enfermedad“, y γενής (genēs) ,
"productor de". Es un agente infeccioso que produce un daño, la enfermedad, en el
huésped (planta o animal).

PCR
Reacción en cadena de la polimerasa: Método para amplificar in vitro un segmento
específico de ADN que utiliza dos cebadores que hibridan en los dos extremos del
segmento con polaridad opuesta, y que sirven como punto de inicio para la replicación
exponencial mediante ciclos sucesivos de la secuencia que se encuentra entre ellos.
http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

pH
Forma de expresar la acidez y basicidad de disoluciones acuosas. Se define como el
logaritmo negativo de la concentración (moles/L) de ion H+ (H3O+):
• pH=log1/H3O+ o pH=-log[H3O+]
El agua destilada presenta un pH 7 o neutro a 25ºC. Soluciones con pH menores de 7 se
denominan ácidas, y soluciones con pH mayores a 7 se denominan básicas.

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.
Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más
versátiles y más diversas, realizando una enorme cantidad de funciones diferentes.
Las proteínas de todos los seres vivos están determinadas mayoritariamente por su
genética (con excepción de algunos péptidos antimicrobianos de síntesis no ribosomal).
Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el
grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes.
La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen mediante el código
genético. Los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas en la
modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula, o como
parte de mecanismos de control. Las proteínas pueden también asociarse para formar
complejos proteicos estables.
Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes que
las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a señales o factores externos. El conjunto de las
proteínas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteoma.
Proteína

Regulación transcripcional de un gen
Las células necesitan regular los tipos y cantidades de macromoléculas que generan, el
primer nivel de regulación es en la expresión génica, es decir el control de la
transcripción o la cantidad de ARNm que se produce de ciertos genes.
Hay proteínas y moléculas que siempre son necesarias en la célula (expresión
constitutiva) sin embargo, la mayoría sólo se requieren en momentos puntuales de su
desarrollo.
El control de la transcripción se hace a través de proteínas que se unen al DNA. El
control negativo se hace a través de proteínas represoras que impiden la unión de la
RNA-polimerasa. Por el contrario, el control positivo lo llevarán a cabo proteínas que se
unen al DNA y activan la transcripción

Resistente (frente a patógenos)
Es el organismo que expresa resistencia, que es capaz de evitar o reducir el ataque de
agentes infecciosos causantes de enfermedad. En contraposición con el organismo
susceptible, el resistente presenta menor acumulación del patógeno en su organismo que
se manifiesta con frecuencia en una apariencia sana sin síntomas de enfermedad. Así
mismo, el término tolerante describe al organismo que muestra una apariencia normal o
con menores síntomas de enfermedad, aún presentando una acumulación elevada del
patógeno.
La resistencia puede deberse a la existencia de barreras preexistentes o a mecanismos
inducibles. Entre los mecanismos inducibles se distinguen:
•Defensa inducible por PAMPS (PTI, PAMP triggered immunity), debido al
reconocimiento por parte de un receptor presente en la membrana del hospedador
de un patrón molecular asociado al patógeneno (PAMP).
•Defensa inducible por efectores (ETI, effector triggered immunity), debido al
reconocimiento por parte de una proteína de resistencia del hospedador de un
efector, una factor producido por el patógeno para alterar el metabolismo de la célula
hospedadora.

Síntomas de enfermedad
Los síntomas de la enfermedad son el conjunto de manifestaciones externas o internas del
huésped diferentes del estado normal que están asociadas generalmente al desarrollo de
una enfermedad.
La palabra síntoma proviene del griego σύμπτωμα, "accidente, infortunio, aquello que
ocurre”.
Suelen ser característicos de cada tipo de agente patógeno. Se utilizan con frecuencia para
la identificación del agente responsable de la enfermedad <1 >. Tienen la contrapartida de
que la percepción de un síntoma es frecuentemente es subjetiva y difícilmente mesurable.
Ejemplos de síntomas asociados a enfermedades de plantas son:
Clorosis o amarilleamiento de partes de la planta por destrucción de la clorofila
Marchitez o falta de frescura y/o inclinación de las hojas por carencia de agua.
Necrosis o muerte del tejido de la planta
Podredumbre o destrucción húmeda del tejido vegetal
<1> http://extension.oregonstate.edu/catalog/pdf/ec/ec1562-s-e.pdf

Susceptible (frente a patógenos).
Es el organismo que está en riesgo de ser infectado por un agente infeccioso. En
contraposición con el organismo resistente, el susceptible cuando es infectado presenta
una mayor acumulación del patógeno en su organismo, que se manifiesta habitualmente
con la presencia de unos síntomas asociados a la enfermedad.
La susceptibilidad puede ser debida a que el hospedador no dispone de barreras o
mecanismos de resistencia contra el agente patógeno o a que el agente patógeno produce
una serie de factores (efectores) que alteran el metabolismo de la célula hospedadora
suprimiendo la resistencia.

Tampón
Solución que previene el cambio de pH tras la adición de pequeñas cantidades de
ácidos o bases. Está compuesto por un ácido débil y su correspondiente sal con una
base fuerte, o por una base débil y su correspondiente sal con un ácido fuerte.

Traducción genética
La traducción es el segundo proceso de la síntesis proteica (el primer proceso es la
expresión génica). La traducción ocurre en el citoplasma de la célula, donde se
encuentran los ribosomas. Los ribosomas están formados por una subunidad pequeña y
una grande que rodean al ARNm. En la traducción, el ARN mensajero se decodifica para
producir un polipéptido específico de acuerdo con las reglas especificadas por el código
genético. Es el proceso que convierte una secuencia de ARNm en una cadena de
aminoácidos para formar una proteína. Es necesario que la traducción venga precedida
de un proceso de transcripción. El proceso de traducción tiene cuatro fases: activación,
iniciación, elongación y terminación (entre todos describen el crecimiento de la cadena
de aminoácidos, o polipéptido, que es el producto de la traducción).
Programas on-line para la traducción de secuencias:
http://web.expasy.org/translate/

La transformación refiere a un cambio genético estable producido al transferir ADN
exógeno a una célula.
Un cierto número de mecanismos están disponibles para transferir ADN a células
vegetales:
1. La transformación mediada por Agrobacterium, es la más simple transformación vegetal.
El tejido vegetal (generalmente hojas) es cortado en pequeños pedazos, ej. 10x10 mm, y
sumergidos por 10 minutos en una solución que contiene Agrobacterium. Algunas células
adyacentes al corte serán transformadas por la bacteria, que transfiere su ADN a la célula.
Estas células son regeneradas in vitro en medio selectivo. Algunas especies pueden ser
transformadas tan sólo al sumergir las flores en la suspensión de Agrobacterium, y luego
sembrar las semillas en un medio selectivo.
2. Biobalística: Pequeñas partículas de oro o tungsteno cubiertas de ADN, que se disparan
a células vegetales jóvenes o embriones vegetales. La eficiencia de transformación es más
baja que utilizando Agrobacterium, pero la mayoría de las plantas pueden ser
transformadas con este método.
3. Electroporación: Crea agujeros momentáneos en la membrana celular utilizando golpes
eléctricos, lo que permite que el ADN entre a la célula.
Transformación

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