ComprovaçãO CientíFica

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA E FARMACOLÓGICA DO EXTRATO SECO PADRONIZADO OBTIDOS DAS FOLHAS DA Dicksonia sellowiana

Carl Nathan: Nature 420, 846-852(2002)

Gökhan S. Hotamisligil: Nature 444, 860-867(2006)

Toren Finkel and Nikki J. Holbrook: Nature 408, 239-247(2000)

A asma é uma doença grave que afeta pessoas de todas as idades, culturas e localizações geográficas. Embora cada pessoa possa apresentar sintomas, diferentes, a definição de asma é muito específica. A asma é um distúrbio inflamatório crônico dos pulmões, caracterizada por chiado, falta de ar, opressão torácica e tosse, a qual estima-se afetar mais de 100 milhões de pessoas em todo o mundo. ASMA

Família: Dicksoniaceae Espécie: Dicksonia sellowiana Nomes populares: xaxim ; samambaiaçú Definição: em 1844 pelo cientista botânico Presl Hook Considerado verdadeiro fóssil vivo das florestas pré-históricas.

Objetivo Geral Analisar a ação do extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana no controle da nocicepção e inflamação através de estudos farmacológicos “in vivo”, utilizando diferentes protocolos experimentais em camundongos. Analisar os eventuais efeitos toxicológicos do extrato seco padronizado em camundongos.

Animais Camundongos Swiss (25-40 g) machos e/ou fêmeas mantidos em ciclo claro/escuro de 12 h, com ração e água ad libitum . Os procedimentos realizados foram conduzidos de acordo com as normas éticas para o estudo de dor com animais de laboratório (Zimmermann, 1983). Materiais e Métodos

RESULTADOS DE TOXICIDADE AGUDA

Efeito do tratamento agudo com o extrato seco padronizado da Dicksonia sellowiana , administrado pela via oral, sobre o percentual de mortalidade em camundongos.

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana (○ – 100 mg/kg; ▲- 500 mg/kg; ∆ - 1000 mg/kg; ■ - 5000 mg/kg) ou com o veículo (● – salina, 10 ml/kg) sobre a massa corporal dos animais

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do coração dos animais

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do pulmão dos animais

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do fígado dos animais

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do rim dos animais

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do baço dos animais

- O extrato seco padronizado obtido das folhas da Dicksonia sellowiana administrado agudamente por via oral para camundongos, tanto machos quanto fêmeas até a dose de 5.000 mg/kg, apresentou boa tolerabilidade e baixa toxicidade quando avaliado sobre diversos parâmetros comportamentais. Além disso, não foi observado morte nos animais até a maior dose utilizada (5.000 mg/kg ). Conclusão - I - O extrato causou pequenas alterações comportamentais tais como diminuição da sensibilidade ao aperto de cauda , principalmente em doses mais elevadas. No entanto, estas alterações foram observadas somente nas primeiras 4 h após a administração do produto.

- O extrato não produziu nenhum sinal de toxicidade aguda, durante os 15 dias de observação , além de não alterar de forma significativa o peso de vários órgãos vitais tais como: coração, pulmão, fígado, baço e rim. Conclusão - II - Conclui-se, portanto que o extrato seco padronizado obtido das folhas da Dicksonia sellowiana quando administrado agudamente pela via oral para camundongos de ambos os sexos demonstrou boa tolerabilidade e ausência de efeitos tóxicos agudos importantes , justificando assim a continuação dos estudos toxicológicos crônicos

RESULTADOS DE TOXICIDADE CRÔNICA

Efeito do tratamento crônico, durante 90 dias consecutivos, com o extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana, administrado pela via oral, sobre o percentual de mortalidade em camundongos. A dose letal 50 (DL50) calculada para o extrato da Dicksonia sellowiana foi de 1609,0 e 1461,0 mg/kg para os camundongos fêmeas e machos, respectivamente. Extrato padronizado de Dicksonia sellowiana (mg/kg, v.o.) Sexo N Morte (%) 0 Macho 10 20 Fêmea 10 10 300 Macho 10 20 Fêmea 10 10 600 Macho 10 20 Fêmea 10 10 1000 Macho 10 40 Fêmea 10 40 2000 Macho 10 65 Fêmea 10 60

Efeito do tratamento crônico, durante 90 dias consecutivos com o extrato padronizado de Dicksonia sellowiana, administrado pela via oral, sobre a variação de ingesta média de comida e bebida dos camundongos ao final de tratamento. - Os valores representam a média da variação da ingesta sólida (g/animal/dia) e liquida (ml/animal/dia) de 4 - 10 animais  o erro padrão da média. - Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0), * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001. Grupo (mg/kg, v.o.) Sexo Ração (g) H 2 0 (mL) 0 Macho 6,05 ± 0,19 5,76 ± 0,15 300 Macho 4,61 ± 0,15 *** 3,88 ± 0,13 *** 600 Macho 5,04 ± 0,25 ** 4,42 ± 0,17 *** 1000 Macho 5,38 ± 0,18 * 4,42 ± 0,19 *** 2000 Macho 5,04 ± 0,24 ** 4,45 ± 0,23 *** 0 Fêmea 4,77 ± 0,21 3,92 ± 0,27 300 Fêmea 4,00 ± 0,14 * 3,35 ± 0,16 600 Fêmea 4,14 ± 0,23 * 3,69 ± 0,25 1000 Fêmea 5,47 ± 0,21 * 4,45 ± 0,24 2000 Fêmea 3,78 ± 0,28** 2,94 ± 0,28*

Efeito do tratamento crônico, durante 90 dias consecutivos, com o extrato padronizado de Dicksonia sellowiana, administrado pela via oral, sobre a massa do baço, rim, coração, pulmão e fígado dos camundongos. Os valores representam a média de peso dos órgãos de 4 - 10 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%. Os valores foram obtidos através da relação (em percentagem) do peso dos órgãos pela massa corpórea dos animais (através da seguinte formula: peso do órgão/peso do animal x 100)

- O extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana administrado por via oral para camundongos durante 90 dias , tanto em machos quanto em fêmeas nas doses de 300, 600, 1000 e 2000 mg/kg, apresentou de maneira geral boa tolerabilidade e relativa toxicidade quando avaliado sobre diversos parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos. Conclusão - III - O extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana administrado por via oral para camundongos durante 90 dias provocou a letalidade de 65 e 60% dos camundongos machos e fêmeas na dose de 2000 mg/kg, respectivamente. As DL50s calculadas foram 1609,0 e 1461,0 mg/kg para os camundongos fêmeas e machos, respectivamente

- Foram observadas alterações importantes no consumo de ração e água nos camundongos machos e redução da ingesta de ração nos camundongos fêmeas em todas as doses analisadas e de água somente na dose de 2000 mg/kg nos camundongos fêmeas, contudo ocorreu redução do peso corporal nos camundongos machos e fêmeas somente na dose de 2000 mg/kg . Conclusão - IV - O extrato causou em camundongos machos aumento significativo dos níveis plasmáticos de glicose em todas as doses analisadas e de colesterol e triglicérides nas maiores doses utilizadas , enquanto que nas fêmeas ocorreu apenas aumento de albumina, globulina, glicose e colesterol nas doses de 600, 1000 e 2000 mg/kg.

- Em conjunto, as análises bioquímicas, hematológicas, e anatomo-patológicas (macroscópica e microscópica) realizadas nos animais tratados com salina (controle) ou com as diversas doses do extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana (300, 600, 1000 e 2000 mg/kg) por via oral durante 90 dias, detectaram alterações pontuais em alguns desses parâmetros , demonstrando que o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana quando administrado cronicamente para camundongos de ambos os sexos demonstrou média tolerabilidade e razoáveis sinais toxicicidade, principalmente em relação à letalidade. Conclusão - V

NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO ÁCIDO ACÉTICO Modelo de nocicepção simples, rápido e de observação inequívoca; Substâncias que atuam tanto no SNC quanto SNP; Liberação de mediadores endógenos da dor (bradicinina, serotonina, histamina, citocinas (IL-1, TNF, entre outras), PG’s...); Injeção i.p. de ácido acético (0,6%, 10 ml/kg); Contração da musculatura abdominal e extensão de uma das patas posteriores (COLLIER et al., 1968; BENTLEY et al., 1981) . Quantificado cumulativamente (0 a 20 min), considerado como índice de nocicepção. Características: Método: Azul de Evans (2,5%, 100  l, intra-orbital)

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pelo ácido acético em camundongos

Efeito antinociceptivo (analgésico) da Indometacina e da L-NOARG na nocicepção causada pelo ácido acético em camundongos

Efeito antinociceptivo (analgésico) do extrato e de frações obtidas da D. sellowiana na nocicepção causada pelo ácido acético em camundongos

NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA FORMALINA Modelo de nocicepção que mais se aproxima da dor clínica (TJOLSEN e HOLE, 1997) ; Apresenta 2 fases distintas de nocicepção, envolvendo diferentes mediadores químicos; 1ª fase (0 a 5 min, neurogênica), estimulação direta dos nociceptores (fibras C e A  ), associada a liberação de AAE, neuropeptídeos, HIST e 5-HT. Interfase (5 a 15 min, silenciosa), atuação das vias inibitórias. 2ª fase (15 a 30 min, inflamatória), liberação de mediadores pró-inflamatórios (BK, HIST, PG’s, 5-HT e adenosina). Injeção de 20 µl de formalina (2,5%), na pata posterior direita de camundongos; Contato do animal, lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina; Quantificado cumulativamente (0-5 e 15-30 min), considerado como índice de nocicepção. Características: Método:

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pela formalina em camundongos

Comportamento de “biting” induzido por diferentes agentes flogísticos SP 0,1 nmol/sítio D. sellowiana (10-1000 mg/kg, v.o.) 60’ 5 e 15’ IL-1  1 pg/sítio TNF-  0,1 pg/sítio

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pela substância P em camundongos

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pela Interleucina 1 β em camundongos

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pelo TNF- α em camundongos

- Esses resultados analisados em conjunto, indicam que o extrato obtidos da D. sellowiana apresenta significativo efeito antinociceptivo em camundongos . - Além disso, os nossos dados também mostram que o extrato foi efetivo em reduzir a nocicepção induzida por diferentes agentes flogísticos (IL-1beta, TNF-alfa e SP) envolvidos na gênese da inflamação e na dor. Conclusão - VI

PLEURISIA Lavagem da cavidade Aplicação Contagem Total de Células Diferencial Exsudato Câmera de Neubauer

EFEITO DA D. sellowiana NA PLEURISIA INDUZIDA PELA CARRAGENINA EM CAMUNDONGOS

EFEITO DA INDOMETACINA E DA DEXAMETASONA NA PLEURISIA INDUZIDA PELA CARRAGENINA EM CAMUNDONGOS

- Esses resultados analisados em conjunto, indicam que o extrato obtidos da D. sellowiana apresenta significativo efeito antiinflamatório em camundongos . - Além disso, os nossos dados também mostram que o extrato foi efetivo em reduzir tanto a migração quando a extravasamento de plasmático induzida pelo agente flogístico (Carragenina) em camundongos. Conclusão - VII

- Esses resultados parcial do presente estudo analisados em conjunto, indicam que o extrato seco padronizado obtidos da folhas da D. sellowiana apresenta significativo efeito antiinflamatório e antinociceptivo em camundongos . - Além disso, os nossos dados também mostram que o extrato apresenta reduzidos efeitos toxicológicos tanto agudo quanto crônico, justificando a continuidade dos estudos. Fornecendo portanto subsídios científicos para a sua utilização popular, bem como na produção de um fitoterápico. Conclusão - VIII

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