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“Projeto de um Sistema de Registro de
Sinais de Neurônios in vitro em Matriz de
Microletrodos”
Dissertação de Mestrado em Ciência da
Computação - FACCAMP
Aluno: Francisco Fambrini
Orientador: Prof. Dr. José Hiroki Saito

18/Dezembro/2013

Sumário da Apresentação
1- Introdução: Objetivos da dissertação
2- Revisão sobre MEA e sua aplicação em
registros de sinais neuronais
3 – Visão global do projeto de dissertação
4 – Detalhamento das partes desenvolvidas
5 – Resultados obtidos
6 – Conclusões e trabalhos futuros

Objetivos
• Objetivo principal: Projeto de um Sistema de Registro de
Sinais de Neurônios (SRSN) em Matrizes de Multieletrodos.
• Objetivos subjacentes:
1) soquete elétrico para MEA padrão
2) pré-amplificador e filtros
3) amplificador e conversor analógico/digital
4) transmissão de sinais via USB

Principais Contribuições
• Desenvolvimento de um projeto alternativo para registro de
sinais biológicos, levando-se em conta a possibilidade de
ajuste para as características de relação sinal/ruído e taxa de
aquisição, em conformidade com os sinais produzidos pelas
MEAs.
• Devido a essa possibilidade de ajuste para as características, o
mesmo projeto pode ser aproveitado para o desenvolvimento
de outros sistemas semelhantes de aquisição de sinais
biológicos como EEG ou ECG, sistemas MEA de alta densidade,
aproveitando a escalabilidade do projeto, e interface cérebro
máquina (Brain Computer Interface).

Neurônios e células da Glia
As células da glia são formadas pelos astrócitos
protoplasmáticos e fibrosos, pelos oligodendrócitos
e pelas micróglias. Cabe aos neurônios o papel de
produzir e propagar os sinais elétricos através do
transporte de íons em suas membranas.
O papel da glia é de fornecer sustentação mecânica,
proteção e nutrição aos neurônios.

Funções das células gliais
• As células da glia são capazes de modificar os sinais nas fendas
sinápticas entre os neurônios, fornecem nutriente e oxigênio para
eles, isolam um neurônio do outro, destroem germes invasores e
removem células mortas.
• Mantêm a homeostase do tecido nervoso, formam mielina e
participam na transmissão de sinais no sistema nervoso, podendo
influenciar o local da formação das sinapses. Podem ser essenciais
para o aprendizado e para a construção da memória, além de
importantes na recuperação de lesões neurológicas, porém
prejudicam o a captação dos sinais elétricos quando in-vitro na
MEA.

Eficiência, produção e consumo de energia do
tecido nervoso
A produção de energia do corpo humano é de cerca de 1,5 W/kg.
Nosso Sol produz cerca de 4 × 10^26 W.
Massa do Sol é de 2 × 10^30 kg, o que resulta em uma produção
de apenas 0,0002 W/kg.
A relação Energia/Massa é muito menor na estrela do que no corpo
humano, o que evidencia a extrema eficiência termodinâmica
dos organismos dos mamíferos.
O cérebro é responsável por consumir 20% da energia do corpo
humano, cerca de 24 W.
A área de superfície do cérebro é de cerca de 1.500 cm2 a 2.000
cm2

Níveis de energia no cérebro
Se o cérebro consome 24 W de potência e possui área de
superfície média de 0,2 m2 então, a taxa de consumo energético
médio do tecido nervoso é dada pela equação (1):

Se o cérebro consome 24 W de potência e possui área de superfície média de 0,2 m2
então,O diâmetro de cada eletrodo dado tecido nervoso é dada pela equação (1):
• a taxa de consumo energético médio MEA padrão é de 30 µm , a área

do eletrodo é da ordem de 7 ×
então, substituindo essa
área na equação (1), conclui-se que a energia consumida e gerada
por unidade de área de tecido nervoso submetida a ação de cada
eletrodo é de apenas aproximadamente 84 nW.

Spikes e Bursts
• Spikes são picos de atividade elétrica de neurônios e grupos de
neurônios. Um sinal elétrico gravado a partir da MEA possui picos e
outra parte sem atividade elétrica denominada ruído biológico.
• Os softwares de aquisição e registro de dados calculam o desvio
padrão do ruído biológico da atividade basal do tecido nervoso.
Para detectar um spike é preciso estabelecer um limiar que é
calculado como sendo um múltiplo do desvio padrão.

• Um burst é uma sequência de 5 a 10 spikes cuja distância
temporal é arbitrada (escolhida) pequena. Intervalos entre
bursts tem duração mínima de 100 ms tipicamente

Spike: um múltiplo (arbitrado) da média do
desvio padrão dos sinais da atividade basal.

Parâmetros importantes para estudo dos sinais em
MEA
Quanto aos spikes:
a) Número total de spikes;
b) Quantidade de spikes que formam bursts;
c) Porcentagem de spikes aleatórios;
d) Frequência média de spikes em um burst (spikes/segundo);
Quanto aos bursts:

a) Taxa média de bursts (bursts/minuto);
b) Número total de bursts;
c) Média de spikes por bursts;
d) Duração dos bursts (ms);
e) Intervalo entre bursts (segundos).

O janelamento deve ser pequeno o suficiente para pegar toda a extensão de
um spike. A detecção errada de spikes leva a dados inválidos ao final da
análise.

ISI e IBI
a) ISI, Intervalo entre spikes consecutivos;
b) IBI, Intervalo entre dois bursts consecutivos.

Os softwares de aquisição e registro de dados devem ser capazes
de identificar e medir ISI e IBI nos sinais registrados. A
importância em estudar os spikes é que a informação está
contida nos spikes e no atraso entre dois spikes consecutivos.
Também existe informação relevante no intervalo de tempo
entre os bursts.

PWM: Pulse Width Modulation
Em circuitos eletrônicos digitais, a informação pode ser processada de modo similar
ao que ocorre nos tecidos nervosos biológicos, usando-se uma técnica
denominada PWM (Pulse Width Modulation) ou Modulação por Largura de Pulsos.
Variando-se o intervalo de tempo entre os pulsos, o PWM carrega informações que
pode ser transformada para o domínio analógico.
Neurônios disparando spikes assemelham-se a geradores PWM em eletrônica.

MEA: Multielectrode Array
•

É uma interface bioeletrônica entre o mundo biológico e o mundo eletrônico.
As células neurais em tecidos (fatias) ou dissociadas são colocadas sobre um
circuito elétrico (Rutten, 2001). Os eletrodos da MEA são também usados para
estimulação elétrica extracelular in vitro, aplicando pulsos controlados de
tensão ou corrente nos eletrodos. Pode-se medir e registrar através do
computador a resposta ao estímulo elétrico evocado ou, então, o sinal elétrico
espontâneo gerado pelas células.

MEA: Matriz de Microeletrodos

A MEA denominada padrão, fabricado pela Multi Channel System, possui 60
eletrodos em um layout de 6×10 ou 8×8 sem os microeletrodos nos vértices. Tais
microeletrodos podem ser redondos (de titânio) com diâmetro de 30µm e o
material isolante é o nitrito de silício. Utilizado em múltiplas aplicações de registro
de sinais eletrofisiológicos: cultura de neurônios dissociados ou fatias de tecido
localizados diretamente sobre os eletrodos.

Exemplo de Aplicação da MEA em farmacologia
• Pode ser usada para fazer estudos sobre a obesidade. MEA atua como um
biosensor para testes in vitro de drogas com ação sobre o sistema
nervoso.

Descrição do experimento
• Depois de gravar uma taxa estável de disparos para cada eletrodo,
0,1 micro-Mol de Ghrelin (um hormônio produzido pela parede do
estômago e pelo hipotálamo, que estimula o apetite) foi adicionado
à fatia de tecido.
• No intervalo entre 24 e 40 segundos alguns eletrodos registraram
um aumento na taxa de disparo e outros diminuíram sua taxa de
disparo em função da aplicação do hormônio.
• Após a fatia ser lavada (para remover o hormônio) a taxa de disparo
novamente se estabiliza. Na Figura anterior observa-se que os
eletrodos que registraram aumento no número de spikes entre 24 e
40 s são dos eletrodos que se encontram nas regiões B, C, E e F,
região justamente onde foi aplicado o hormônio.
• Os eletrodos localizados nas regiões A e D, mais distantes do ponto
de aplicação do hormônio, tiveram significativa redução do número
de spikes/segundo.

Equipamento usado para registro de
sinais elétricos em MEA
1) Soquete que estabelece a conexão elétrica entre a MEA e o
amplificador;
2) Amplificador de sinais;
3) Conversor analógico/digital integrado à placa de aquisição de
dados, contendo o multiplexador;
4) Computador PC com grande espaço para armazenamento de
dados;
5) Software específico para aquisição de dados;
Opcionalmente, podem ser incluídos:
6) Gerador de Sinais com a mesma conformação da MEA (MEA Signal
Generator), que serve para testar todo o sistema sem necessidade
de se fazer a cultura de células;
7) Estimulador elétrico para produzir estímulos elétricos na MEA e
registrar assim a resposta ao potencial evocado.

Equipamento para Aquisição e Registro de
dados

Softwares para Aquisição de Dados

MC Rack, de MultiChannel Systems

Softwares para Aquisição e Registro de Dados
Moebius de MED64.

NeuroRigther
(Freeware), escrito
porJohn Rolston, Potter
e colaboradores.

Posição do “pad” de terra no padrão
MultiChannell (MCS)

fr

O eletrodo de terra (GND) é o de número 15 na MEA padrão
MCS (MultiChannell Systems)

Gerador de Estímulos Evocados

fr

RAC System, gerador de estímulos proposto por Daniel Wagenaar, 2004.

Visão Global do Projeto Proposto

fr

Parte do sistema implementado para
efeitos da presente dissertação
a) Soquete MEA padrão completo;
b) Pré-amplificador (2 canais);
c) Filtros (2 canais);
d) Amplificador (2 canais);
e) MUX1 (2 canais);
f) Conversor AD (2 canais);
g) Versão inicial do software escrito em MATLAB (para registro
de 2 canais);
h) Lay-out final para implementar os 60 canais do amplificador,
MUX1 e MUX2, ADC1 e ADC2 e conversor USB.

Distribuição dos terminais do Soquete
de MEA padrão

Implementação do Soquete Elétrico

Pré-amplificador
• Baseado no Amplificador de Instrumentação Texas INA333

Simulação computacional de densidade de
ruído – INA333, simulador TINA-TI

Filtro Passa-Altas

Filtro Butterworth de 2 Ordem com frequencia de corte 0,16Hz

Filtro Passa-baixas

Filtro passa-baixas Butterworth de 2 ordem com frequencia de corte 159Hz

Os dois filtros juntos, formando um filtro
passa-banda

Simulação da tensão e corrente de ruído
para os filtros propostos

Diagrama Final do pré-amplificador e filtro
implementado, 1 canal
-5V

7805 TLE2425
3

IN

OUT

+5V

1

Fambrini & Saito MEA Amplifier - 1 channel

C7 10n
V1 12

Test Point 1

2

COM

C8 100n

C4 33n

R6 1k

3

C6 10n

R1 2,2k
2

C3 1u

V+
R2 1M

Saida

1
3

+

+

4

U2 TL074

R7 1M

+

R9 15k

-5V

-

+
4

Ref

+

R8 10k

1
3

+5V

RG

-

C1 1u
Out

+

Entrada Sinal 1

R4 4,7k

RG

U1 INA333

V-

11

2

-

R3 2,2k

R10 100k

-5V

V3 2,5

7905 TLE2425

R11 8,2k

R5 100k

11

OUT IN

C2 1n

C10 100n

COM
1

G=13

U3 TLC074
+5V

V2 12

G=6 ate 101
Ganho -Ajuste 20k

C5 220n

2

C9 100n

V4 2,5
1 polo - Fc=0,16Hz - Passa-Altas
HeadStage Amplifier - G=1+ 100K/Rg

Passa-Baixas - 3 ordem

Subsistema de Amplificação, Conversão AD
e Transmissão de Sinais

Subsistema de Amplificação (buffer)

Chip escolhido:Texas TLC2274, amplificador
operacional quádruplo

Conversor AD de 60 canais
•

•
•

•
•
•

Possível escolha: DSPIC33FJ256GP710 (Microchip) oferece 32 entradas analógicas
multiplexadas em 2 conversores AD internos (cada entrada possui um MUX de 16
entradas).
Taxa de amostragem (sample rate) máxima = 1,1 Msps (1,1 milhões de amostras
por segundo) divididas entre os 32 canais (Microchip, 2013).
Hardware interno dedicado a DMA (Direct Memory Acess) o que aumenta a
velocidade de armazenamento e transferência dos dados, permitindo guardar
dados na memória sem a interferência do processador.
A resolução dos conversores A/D é de 16 bits ou de 12 bits, podendo tal resolução
ser escolhida através do firmware.
São necessários dois chips para se atingir os 60 canais necessários.
Com resolução de 16 bits e fonte de referência interna em 3.3 volts, a menor
tensão que pode ser amostrada é:

Conversor AD projetado (32 canais)

Lay-out da Placa de Circuito Impresso

Conversor AD implementado
•

•

Devido às limitações de tempo e de recursos financeiros, foi implementado até o
momento um conversor AD mais simples, com apenas 2 canais, com a finalidade
de testar o conceito.
Baseado no microcontrolador PIC18F4520 (Microchip), com resolução de 10 bits
em cada canal, a menor tensão que pode ser amostrada é dada por:

Firmware responsável pela leitura do
conversor AD
SETUP_ADC(ADC_CLOCK_INTERNAL | VSS_VDD);
set_adc_channel (0);
delay_us(2);
// aguarda 2 us
READ_ADC(ADC_START_AND_READ);
M = read_adc();
// demora cerca de 8 us
printf ("D%srn",M);
//demora cerca de 100 us
O caractere ‘D’ é usado como caractere de sincronismo.
Uma amostragem a cada 10 us, mas a instrução printf demora cerca de
100us.

Limitações na Taxa de Amostragem
• O conversor AD é capaz de efetuar até 100 mil conversões por
segundo. Entretanto, as demais instruções consomem algum tempo
de processamento.
• A instrução printf por exemplo, demora cerca 100 µs. O tempo
total de execução da rotina de aquisição de dados é da ordem de
110 µs.
• Assim, a máxima taxa teórica de amostragem seria 9091 amostras
por segundo. Isso coloca a frequência de amostragem no valor de 9
kHz. De acordo com o Teorema da Amostragem, a máxima
frequência teórica que pode ser amostrada seria igual a 4,5kHz.
• Mas existe também o problema da velocidade do software que é
executado no computador. De fato, scripts em MATLAB são de
execução bastante lenta

Conversor AD implementado, baseado
em PIC18F4520

Foto do Sistema implementado em testes

Conversor USB
• Baseado no chip PL2303HX da Prolific, velcoidade máxima de
transferência de dados de 12 Mbps.

Software de Registro de Sinais de Neurônios in
vitro em MEA
Comunicação serial USB em MATLAB:
N=1000;
% fixa o tamanho em 1000 amostras
s = serial ('COM5','BaudRate',460800,'DataBits',8,'Parity','none','FlowControl','none');
fopen(s);
seq = 1:N;
y = zeros(1,N);
for i=1:N
fprintf( s, '%s', ‘D');
y(i) = str2num( fscanf(s,'%s') );
end
fclose(s);
plot(seq,y);
% plota o gráfico com as informações da porta USB
xlabel('registro');
ylabel('Tensao (mV)');

Imagens plotadas pelo MATLAB, em tempo real

FFT do sinal Amostrado
figure(2)
L=length(y);
NFFT = 2^nextpow2(L);
Y = fft(y,NFFT)/L;
f = Fs/2*linspace(0,1,NFFT/2+1);
plot(f,2*abs(Y(1:NFFT/2+1)))
title('Espectro de Amplitude ')
xlabel('Frequencia (Hz)')
ylabel('|Y(f)|')

Filtro Notch: para rejeitar interferências de
60Hz da rede elétrica
% Filtra em 60 Hz - notch filter
(MATLAB)
Wo = 60/(Fs/2); BW = Wo/35;
[b,a] = iirnotch(Wo,BW);
y = filter(b,a,m);
A e B determinam a largura de
banda do filtro. Trata-se de um
filtro digital recursivo do tipo IIR
(Infinit Impulse Response)

Software de Aquisição de dados escrito na
linguagem Processing
•

Scripts em MATLAB são lentos porque são interpretados. A Linguagem Processing
(baseada em JAVA) é gratuita e permite o uso de recursos gráficos de OpenGL, sendo
muito rápida para processamento de gráficos em tempo real.

void setup( ) {
size(640, 480);
port = new Serial(this, Serial.list( )[0], 9600);
values = new int[width];
smooth();
void draw( ){
while (port.available() >= 3) {
if (port.read() == 0xff) {
val = (port.read( ) << 8) | (port.read( )); }}
for (int i=0; i<width-1; i++)
values[i] = values[i+1];
values[width-1] = val;
background(0);
stroke(255);
for (int x=1; x<width; x++) {
line(width-x, height-1-getY(values[x-1]),
width-1-x, height-1-getY(values[x]));

Usando Processing foi possível registrar frequências
de até 3kHz, contra 100Hz usando o MATLAB

Resultados Experimentais:
1-Testes elétricos do Soquete
• a) Adição de cloreto de sódio (líquido iônico condutivo), na cavidade de
cultivo de cultura da MEA, para medir a condutividade elétrica entre
eletrodos;
• b) Verificação da ausência de curto-circuitos entre contatos adjacentes da
MEA, usando-se um multímetro;
• c) Medida da impedância dos contatos elétricos, usando-se gerador de
sinais Sim-MEA descrito neste trabalho.
• Resistência média dos contatos elétricos:
Rm =285 ohms

2-Construção do Gerador de Sinais Sim-MEA

Sim-MEA: Um Simulador de sinais
microcontrolado para teste de todo o sistema

Sim-MEA montado no Soquete, ao lado de
headstage

Nível de ruído do pré-amplificador e filtros, em função do
ganho

Resultados Experimentais: Senóide com
amplitude 50 mV p-p, T= 1000us

Onda dente-de-serra, F=100Hz, Vpp=85mV

Parte de um sinal de MEA real, simulado pelo
Sim-MEA

4-Script em MATLAB que registra 2 canais em tempo
real
ff% res = dataFromResult('P,100,0,500,0');
fprintf(s2,'a');
if s2.BytesAvailable
res = dataFromResult(fscanf(s2));
if i>1
tijd(i) = toc;
tijd(i)= tijd(i) + tijd(i-1);
end
tic
A(i,:) = res;
b=0;
for j=PLOTSENSORS
b=b+1;
subplot(length(PLOTSENSORS),1,b);
if i>timespan
plot(tijd(i-timespan+1:i),A(itimespan+1:i,j),'g','lineWidth',2);
xlim([tijd(i-timespan+1) tijd(i)]);
else
plot(tijd,A(:,j),'g','lineWidth',2);
end
ylim([ymin ymax]);
box off
title(SENSORNAMES{j});
end
i=i+1;
pause(0.02);
end

Conclusões e Trabalhos Futuros
Conclusões:
Resultados experimentais parciais (apenas 2 canais foram efetivamente implementados e
testados), funcionam adequadamente para o registro de sinais eletrofisiológicos
obtidos com o uso de MEAs, da ordem de alguns microvolts, com os níveis de ruído
compatíveis com a aplicação.
O Software de Registro de Sinais de Neurônios in vitro em MEA ainda encontra-se em fase
inicial de desenvolvimento, porém mostra resultados promissores. O pré-amplificador,
filtro, amplificador, MUX e conversor AD mostram-se efetivos com níveis de
amplificação adequados, em torno de 1000 vezes e banda passante que pode ser
ajustada se necessário substituindo alguns valores de componentes, assim como o
ganho, que pode ser ajustado através de um potenciômetro, para cada canal. Testes
reais em matriz de multieletrodos precisam ainda ser feitos para se obter a validação do
sistema em campo.
Trabalhos Futuros:
a) Conclusão da construção de um sistema SRSN completo de 60 canais;
b) Validação do Sistema em cultura biológica;
c) Construção do Gerador de Estímulos Elétricos para Potencial Evocado ;
d) Amplificador usando Ressonância Estocástica (RE);
e) Registro de Sinais de EEG;
f) Interfaces Cérebro-Máquina (BCI);
g) Estudos de Sinais para Neuroimplantes.

Ressonância Estocástica (RE)
• É um fenômeno no qual a razão sinal-ruído, de um sistema nãolinear, tem o seu máximo para um valor não-nulo de ruído.
• O sinal sozinho é indetectável e o ruído não contém nenhuma
informação, mas, quando o sinal e o ruído ocorrem juntos, para
uma dada razão ótima entre os dois, o limiar é atravessado
probabilisticamente segundo a amplitude modulada do sinal (isto é,
o limiar será mais vezes atravessado quando o nível do sinal está
mais perto do limiar), o que fornece informação sobre o sinal
(Lopes, 2010).
• Um sinal de amplitude muito pequena (indetectável) quando
misturado ao rúido branco é amplificado e pode ser detectado.

AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. José Hiroki Saito;
Aos colegas de Mestrado da Faccamp;
A todos os professores do Curso de Mestrado em
Ciência da Computação da FACCAMP;
A Texas Instruments e a Microchip inc;
A meus pais e ao Grande Arquiteto do Universo,

Meu muito OBRIGADO !
18/dezembro/2013

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