Teste elisa
- 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA Técnicas em Biologia Molecular
- 2. Técnicas em Biologia Molecular No final da década de 50 os cientistas aprenderam a caracterizar, manipular e isolar os componentes moleculares (DNA, RNA, proteínas) de células e microorganismos.
- 3. Técnicas em Biologia Molecular •Clonagem •ELISA •PCR •Probind and Blotting (Western blotting) •Arrays •Oligonucleotídeos específicos
- 4. ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
- 5. ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção de imunoglobulinas.
- 6. APLICAÇÕ ES • Doenç as infecciosas (HIV...) • Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...) •Identificaç ão de antígenos (hormô nio da gravides, alergia a drogas...) • Doenç as auto-imunes •Concentraç ão sé rica de anticorpos
- 7. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS 1Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura. 2Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades mínimas de uma substância em particular e com grande confiabilidade. 3Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados.
- 8. Componentes •Anticorpo ou Ag ligado •Enzima ativa •Substrato •Produtos solúveis 2 Enzyme-linked Ab Serum Ab Antigen
- 9. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS 1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas. 2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo. http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
- 11. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS 1Elementos necessários para a realização: 2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac) 3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag) 4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos 5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos 6Amostras a serem testadas 7Placa de poliestireno 8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes 9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima 10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor 11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO)
- 14. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS •Vantagens •Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos. •Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos. •Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo. •Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
- 15. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS •Desvantagens •Necessidade de mão de obra especializada. •Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas. •Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
- 16. PRINCIPAIS TIPOS •INDIRETO: detecta principalmente Ac •DIRETO: detecta principalmente Ag •COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes) •CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide)
- 17. 1. ELISA INDIRETO 1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços 2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços 3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags 4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags 5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs 6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre 7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
- 18. ELISA INDIRETO 1Interpretação dos resultados: 2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da amostra pesquisada. 3Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio. Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os negativos. O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida. www.labimuno.org.br
- 19. ELISA INDIRETO 1Aplicações na medicina humana e veterinária: 2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa. 3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS. 4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite Caseosa e da Leishmaniose. 5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator reumatóide.
- 21. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE 1Interpretação dos resultados: 2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ag da amostra pesquisada. 3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
- 22. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE •Aplicações na medicina humana e veterinária: •Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g. •Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro). •Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos alimentos).
- 24. Gerações do ELISA HIV Terceira geraç ão só detectavam a presenç a de anticorpos ( IgG e IgM) trê ou s quatro semanas apó s o contato. Quarta geraç ão já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV (a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela imunoló gica, podendo chegar a apenas duas semanas. Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por outros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detecta proteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.
- 25. Os exames de anticorpos sã relatados como positivos ou negativos. o O desempenho destes exames é descrito em termos de: ■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serão positivos quando o HIV estiver presente. ■especificidade — a percentagem dos resultados que serão negativos quando o HIV nã estiver presente. o Todos os exames de diagnó stico tê limitaç õ e, algumas vezes, o m es, seu uso pode produzir resultados errô neos ou questioná veis. ■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente, quando, na verdade, nã está o . ■falso negativo — os resultados nã identificam o HIV, que está o presente.
Notas do Editor
- #11: O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foramEm seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse. secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse.
- #21: O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.