1 [compatibility mode]
- 1. COOMBS’ TEST Robiul Fuadi dr Pembimbing: Siti Rochmatoen dr, Sp.PK (K) 1
- 2. Pendahuluan Gambar 1. Carlo Moreschi Gambar 2. Dr. R. R. A. Coombs (http://nfs.unipv.it/nfs/minf/dispense/immunology/morpr (http://medbiography.blogspot.com/2008/04/robin- i.html) coombs-incl-foto-photo.html) • Coombs’ test = Antiglobulin test 2
- 3. Prinsip • Molekul antibodi (Imunoglobulin G) dan komponen komplemen (C3b,C3d) adalah human globulin. • Hewan yang disuntik dengan human globulin, akan terstimulasi untuk memproduksi antibodi terhadap human globulin, yang disebut antihuman globulin (AHG) • Sel darah merah (SDM) yang telah terlekati oleh human globulin akan diaglutinasi oleh AHG. 3
- 4. Gambar 3. Skema hubungan hemaglutinasi dengan ukuran IgM dan IgG (Modern Blood Banking) 4
- 5. Antibodi • Dalam media salin Imunoglobulin M (IgM) lebih efisien 750 kali dibanding Imunoglobulin G (IgG) dalam mengaglutinasi SDM • Molekul IgM mudah menjembatani jarak antara dua SDM karena lebih lebar dibanding molekul IgG • IgM memiliki potensi mengikat 10 antigen,sedangkan IgG hanya dua 5
- 6. • untuk mendeteksi adanya IgG dibutuhkan tambahan teknis khusus: * Dengan antihuman globulin * penggunaan media yang mengurangi zeta potential dari membran SDM 6
- 7. Komplemen • Selama aktivasi komplemen, C3 terbagi 2 komponen, yaitu C3a dan C3b • C3b melekat pada SDM, sedangkan C3a mengikuti fase cair. • C3b yang telah melekat membran melepaskan C3c, dan menyisakan C3d tetap melekat pada membran SDM. 7
- 8. Antihuman Globulin (AHG) • Dapat dihasilkan dari: 1. Menyuntikkan human globulin, baik antibodi atau komponen komplemen pada hewan laboratorium. Selanjutnya serum hewan tersebut dimurnikan. 2. Teknik hibridoma • Jenis AHG: 1. Monospesifik 2. Polispesifik 8
- 9. • Antiglobulin test: 1. Direct Antiglobulin Test (DAT) 2. Indirect Antiglobulin Test (IDAT) 9
- 10. DAT • Untuk mendeteksi adanya antibodi atau komplemen yang melapisi SDM secara in vivo. Gambar 4. DAT (http://www.uic.edu/com/mcpd/residency/n_n_rotation/Clinical/NN-- Hyperbilirubinemia%204-9-08ph.htm) 10
- 11. Manfaat DAT • Autoimmune hemolytic anemia • Hemolytic disease of the newborn • Drug-induced hemolytic anemia • Reaksi tranfusi hemolitik 11
- 12. Cara Kerja • Spesimen Darah vena dengan antikoagulan EDTA • Bahan dan Alat 1.Tabung tes (10 x 75 mm) 2.Pipet Pasteur 3.Salin isotonik 4.Reagen Antihuman globulin (AHG) 5.6% albumin sebagai kontrol 6.Sel Coomb’s control SDM grup O Rh (+) yang tercoated dengan Ig anti Rh 12
- 13. Prosedur DAT Tambahkan 2 tetes AHG 1 tetes •Cuci dengan pada tabung tes, dan suspensi SDM salin 3-4X albumin 6% pada kontrol pasien 2-4% • Supernatan negatif,inkubasi 5 mnt dibuang pada suhu ruang Tes Kontrol Tes kontrol negatif negatif 13
- 14. Tabung kontrol, harus Periksa Campur dan sentrifus tidak ada aglutinasi, aglutinasi dengan kecepatan 3400 bila ada aglutinasi rpm selama 15” harus diulang Positif, Tabung tes bila tentukan positif, tentukan Periksa derajat derajatnya, Bila aglutinasi aglutinasi negatif, inkubasi lagi 5 mnt pada t kamar, lalu sentrifus lagi negatif 14
- 15. Terjadi aglutinasi (positif), berarti true negative Tambahkan 1 tts Coomb’s control cells dan sentrifus Negatif, perlu diulang ,tidak valid 15
- 16. IDAT • Mendeteksi antibodi (IgG) bebas dalam serum. • Pada pemeriksaan ini, sel darah merah tes disensitisasi dulu dengan serum penderita yang mengandung antibodi secara in vitro Gambar 5. IDAT (http://www.uic.edu/com/mcpd/residency/n_n_rotation/Clinical/NN- 16 -Hyperbilirubinemia%204-9-08ph.htm)
- 17. Sampel Serum pasien Indikasi • Mendeteksi dan mengidentifikasi antibodi yang tidak diharapkan • Reaksi silang • Mendeteksi fenotip SDM menggunakan antisera yang telah diketahui. • Titrasi antibodi 17
- 18. Prosedur IDAT 1 tetes suspensi Tambahkan 2 tetes AHG •Cuci dengan SDM (sesuai ABO pada tabung tes, dan salin 3-4X atau sel O) 2-5% albumin 6% pada kontrol • Supernatan dalam salin negatif,inkubasi 5 mnt dibuang ditambahkan 2 tts pada suhu ruang serum penderita dan inkubasi 30 mnt pada 37oC Kontrol kontrol Tes Tes negatif negatif 18
- 19. Tabung kontrol, harus Periksa Campur dan sentrifus tidak ada aglutinasi, aglutinasi dengan kecepatan 3400rpm bila ada aglutinasi selama 15” harus diulang Positif, Tabung tes bila tentukan positif, tentukan Periksa derajat derajatnya, Bila aglutinasi aglutinasi negatif, inkubasi lagi 5 mnt pada t kamar, lalu sentrifus lagi negatif 19
- 20. Terjadi aglutinasi (positif), berarti true negative Tambahkan 1 tts Coomb’s control cells dan sentrifus Negatif, perlu diulang tidak valid 20
- 21. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi IDAT • Proporsi serum dalam SDM Reaktivitas antibodi yang lemah dapat ditingkatkan dengan menambahkan serum, tetapi membutuhkan masa inkubasi yang lebih panjang • Media untuk SDM tes dapat dipakai salin, albumin, atau Low Ionic Strength Solution (LISS) • Waktu inkubasi : Dalam salin atau albumin, masa inkubasi 30-60 menit Dalam LISS, hanya 10-15 menit, 21
- 22. Sumber kesalahan Negatif palsu • Lupa menambahkan serum AHG • Pencucian SDM tidak adekuat • Tes tertunda atau terhenti • Aktifitas AHG menurun • Waktu dan suhu inkubasi tidak adekuat • Lupa menambah serum (IDAT) • Sentrifus tidak adekuat (terlalu cepat/pelan) • Suspensi SDM terlalu banyak/sedikit • Kelemahan /kekurangan teknik pembacaan 22
- 23. Sumber kesalahan Positif Palsu • Aglutinasi SDM sebelum pencucian • Salin terkontaminasi bakteri, logam berat, partikel silika • Alat-alat yang tidak bersih : debu, deterjen, sehingga SDM agregasi • Sentrifus berlebihan • AGM terkontaminasi antibodi 23
- 24. Modifikasi dan Otomatisasi • Media fase solid • Micro tube • Cairan LISS 24
- 25. TERIMA KASIH 25
- 26. 26
- 27. Pembuatan Coombs Control Cell SDM grup O Rh (+) yang tercoated dengan Ig anti Rh. Metode: • Cuci SDM 3 kali dalam salin lalu ditambah anti Rh : 1 IU/ml (volume sama) • Inkubasi 37oC 30 menit • Cuci 4 kali dalam salin • Buat 5% suspensi dalam salin • Simpan 4oC 27
- 28. 28
- 29. 29
- 30. 30
- 31. 31