Биофизика2011-10
- 1. Немцева Елена Владимировна Биология клетки: биофизика Сибирский федеральный университет Институт фундаментальной биологии и биотехнологии 2011 10
- 2. Лекция 10 Методы исследования динамики биологических макромолекул
- 3. химия Естествознание пользуется двумя главными способами изучения строения атомов и молекул Расшифровывает первичную структуру оптика Устанавливает пространственную структуру Методы исследования атомов и молекул Методы исследования динамики макромолекул 1
- 4. Часть спектра электромагнитного излучения, используемая для исследований в области биологической физики Методы исследования: оптика Методы исследования динамики макромолекул 2
- 5. Методы исследования: оптика Методы исследования динамики макромолекул 3
- 6. Методы радиоспектроскопии – электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) Парамагнетики — вещества, которые намагничиваются во внешнем магнитном поле в направлении внешнего магнитного поля. Парамагнетики относятся к слабомагнитным веществам, магнитная проницаемость незначительно отличается от единицы μ>1. ЭПР: основы метода При отсутствии внешнего магнитного поля энергия свободного атома не зависит от ориентации спина. При включении внешнего магнитного поля энергия электроны с разнонаправленными спинами имеют разную энергию m – магнитное спиновое квантовое число Н 0 – напряженность внешнего магнитного поля - магнетон Бора (константа) g – g -фактор (равен 2 для спиновых маг. моментов) Блюменфельд Л.А., Тихонов А.Н. ЭПР (http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9709_091.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 4
- 7. Блюменфельд Л.А., Тихонов А.Н. ЭПР (http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9709_091.pdf ) ЭПР: основы метода Если подать переменное электромагнитное излучение, то его магнитная компонента будет индуцировать переходы между уровнями. Методы исследования динамики макромолекул 5
- 8. Условие резонанса: Наблюдение резонанса: изменять частоту при постоянстве Н изменять Н при постоянной частоте Чаще применяют второй метод ЭПР: основы метода Энергия электромагнитного излучения: E=h Методы исследования динамики макромолекул 6
- 9. ЭПР: устройство прибора Блюменфельд Л.А., Тихонов А.Н. ЭПР (http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9709_091.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 7
- 10. ЭПР: параметры сигналов Амплитуда сигнала ( в отн.ед., например, мм) Чем больше концентрация парамагнитных частиц – тем больше амплитуда Ширина сигнала (в Гс или мТл) Зависит от спин-спинового и спин-решеточного взаимодействия T 1 – время спин-решеточной релаксации T 2 – время спин-спиновой релаксации Спин-решеточная релаксация – безызлучательные переходы между двумя состояниями спинов, сопровождающие взаимодействие с окружением (напр. с кристаллической решеткой). Спин-спиновое взаимодействие – диполь-дипольное взаимодействие между неспаренными электронами, приводящее к возникновению локального магнитного поля ( Н лок ) и нарушению условия резонанса. Методы исследования динамики макромолекул 8
- 11. ЭПР: сверхтонкая структура спектров Магнитные моменты ядер, входящих в состав радикальной частицы, создают локальные поля, которые складываются с внешним полем и тем самым влияют на спектры ЭПР, вызывая их расщепление с появлением сверхтонкой структуры (СТС) . Методы исследования динамики макромолекул 9
- 12. В подавляющем большинстве случаев – стабильные нитроксильные радикалы, содержащие фрагмент ЭПР: спиновые метки Многие белки, нуклеиновые кислоты, липиды не обладают собственным сигналом ЭПР. В этом случае в систему вводят «искусственные» парамагнитные частицы – спиновые метки и спиновые зонды . Методы исследования динамики макромолекул 10
- 13. При изменении вязкости спектр трансформируется: ЭПР: спиновые метки Можно оценить подвижность спиновой метки - посчитать ее время корреляции c (т.е. время поворота на 90 ) По времени корреляции можно оценить «вязкость» микроокружения метки: молекулярный радиус метки температура Методы исследования динамики макромолекул 11
- 14. При изменении вязкости спектр трансформируется ЭПР: спиновые метки Методы исследования динамики макромолекул 12
- 15. При изменении вязкости спектр трансформируется ЭПР: спиновые метки Методы исследования динамики макромолекул 13
- 16. ЭПР: применение Тихонов А. Н. ЭПР в биологии ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9711_008.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 14
- 17. ЭПР: применение Тихонов А. Н. ЭПР в биологии ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9711_008.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 15
- 18. ЭПР: применение ЭПР сыграл решающую роль в обнаружении NO в клетках и тканях различных животных и микроорганизмов. Тихонов А. Н. ЭПР в биологии ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9711_008.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 16
- 19. ЭПР: применение Наряду с парамагнитными центрами естественного происхождения в биологических системах могут возникать центры, вызванные радиационными повреждениями биомолекул. Тихонов А. Н. ЭПР в биологии ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9711_008.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 17
- 20. Условие резонанса: ЯМР: основы метода ЯМР наблюдается на атомах с ненулевыми спиновыми моментами, т.е. на таких, которые имеют нечетный порядковый номер, и/или нечетный атомный вес. В. К. Воронов Ядерный магнитный резонанс ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9610_070.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 18
- 21. ЯМР-спектрометр ЯМР: прибор Методы исследования структуры биополимеров 19
- 22. 900 MHz NMR Spectrometer University of Georgia ЯМР: прибор Методы исследования структуры биополимеров 20
- 23. Движение электронов вокруг детектируемого ядра создает вторичное магнитное поле, ослабляющее внешнее магнитное поле. ЯМР: сигнал В. К. Воронов Ядерный магнитный резонанс ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9610_070.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 21
- 24. ЯМР: сигнал Методы исследования динамики макромолекул 22
- 25. ЯМР: сигнал Спин-спиновое взаимодействие: ядерный спин стремится ориентировать спины электронов, окружающих данное ядро; данные электроны ориентируют спины электронов соседних ядер; электроны соседних атомов влияют на ориентацию спина соседних ядер В. К. Воронов Ядерный магнитный резонанс ( http://www.pereplet.ru/nauka/Soros/pdf/9610_070.pdf ) Методы исследования динамики макромолекул 23
- 26. Метод изотопного обмена Явление изотопного обмена: Атомы водорода, входящие в состав макромолекул, могут вступать в обратимую реакцию обмена с атомами дейтерия и трития, находящимися в окружающем растворителе. Методы исследования динамики макромолекул 24
- 27. Метод изотопного обмена Типы водородов в составе полипептидов Методы исследования динамики макромолекул 25
- 28. Метод изотопного обмена Методы исследования динамики макромолекул 26
- 29. Метод изотопного обмена Методы исследования динамики макромолекул 27
- 30. Метод изотопного обмена Протон, потенциально способный к быстрому обмену, обменивается плохо, если он образует водородную связь. Можно использовать для определения: числа водородных связей; эффективности денатурирующих агентов; динамического состояния макромолекулы. Результаты, полученные методом 3 Н-обмена: установлено, что протоны, участвующие в образовании водородных связей двухцепочечной ДНК, обмениваются; определение числа водородных связей в тРНК; изучение кинетики перехода белков из денатурированного состояния в нативное. Методы исследования динамики макромолекул 28
- 31. Кристаллография биополимеров Принципы рентгеноструктурного анализа Рентгеновские лучи – электромагнитное излучение с длиной волны порядка 0,1 нм. Условие дифракции (отражения) задается условием Брэгга-Вульфа : Методы исследования динамики макромолекул 29
- 32. Принципы рентгеноструктурного анализа Кристаллография биополимеров Методы исследования динамики макромолекул 30
- 33. Принципы рентгеноструктурного анализа Техника регистрации: Кристаллография биополимеров Методы исследования динамики макромолекул 31
- 34. Экспериментальная процедура: Кристаллография биополимеров Freezing Liquid N 2 Crystallization Crystals Diffraction Data collection Computational Crystallography Методы исследования динамики макромолекул 32
- 35. Advanced Photon Source, Argonne Синхротронное излучение позволяет получить на порядки более интенсивные рентгеновские лучи Кристаллография биополимеров: источник излучения Методы исследования динамики макромолекул 33
- 36. Кристаллография биополимеров: где более подробно? http://www.bioclass520.ru/goriacheva22.pdf http://www.ruppweb.org/Xray/101index.html Методы исследования динамики макромолекул 34
- 37. Crystallography or NMR? NMR 1. Protein structure is in solution state 2. Needs recombinant protein isotope enriched: 13 C, 15 N 3. Mass limit < 30 kDa X-ray 1. Crystal state usually at 77K. 2. Needs a high quality single crystal > 0.1 mm dimension. Кристаллография биополимеров Методы исследования динамики макромолекул 35
- 38. 1 . Почему методы ЭПР и ЯМР относят к радиоспектроскопии? Вопросы для самоконтроля по теме 3 . Как устроена типичная спиновая метка для белковой молекулы? Как выглядит ее ЭПР-сигнал? Как он изменяется при увеличении вязкости? 4 . Что такое химический сдвиг? В чем он измеряется? 6 . Что из себя представляет рентгенограмма белковой молекулы? Как она формируется? 2 . Какие элементы биологических объектов дают сигнал ЭПР? 5 . Что можно определить методом изотопного обмена по отношению к биологическим макромолекулам? 7 . Из каких этапов состоит процедура рентгеноструктурного анализа белков? Методы исследования динамики макромолекул 36