![Diff
Stokes-Einstein
Diff
xy
iD
2
4
wxy = 0.17 µm
s= wz/wxy = 5
2
1
11
)(
s
N
G
DD
D
kT
r
r
kT
D h
h 66
T [°C]
D [PEG 20]
[cm2
/s]
D [PEG 40]
[cm2
/s]
rh [PEG 20]
[nm]
rh [PEG 40]
[nm]
23 4,53± 0,01 E-07 3,46± 0,01 E-07 5,1 ± 0,1 6,7 ± 0,1
37 5,42 ± 0,01 E-07 4,38 ± 0,01 E-07 6,0 ± 0,1 7,5 ± 0,1
45 6,94 ± 0,03 E-07 4,97 ± 0,03 E-07 5,6 ± 0,5 7,9 ± 0,5
Misure del PEG 20 E 40kDa a differenti temperature
RISULTATI Misure in soluzione](https://image.slidesharecdn.com/evaluationofananfluiddevicefortheseparationofconfinedmacromoleculesonanentropicbasis-150422084922-conversion-gate01/85/Evaluation-of-a-nanfluid-device-for-the-separation-of-confined-macromolecules-on-an-entropic-basis-11-320.jpg)
Evaluation of a nanfluid device for the separation of confined macromolecules on an entropic basis
- 1. Università degli studi di Napoli Federico II Corso di laurea in Scienza e Ingegneria dei Materiali Tesi di laurea triennale VALUTAZIONE DI UN DISPOSITIVO NANOFLUIDICO PER LA SEPARAZIONE SU BASE ENTROPICA DI MACROMOLECOLE CONFINATE Relatore: Ch.mo Prof. Paolo A. Netti Correlatore: Dott.ssa Ing. Ilaria De Santo Candidato: Emanuele Zappia Matr. 539/212 ANNO ACCADEMICO 2011/2012
- 2. La nanofluidica si occupa del comportamento, della manipolazione e del controllo dei fluidi confinati in strutture nanometriche Ingegnerizzando l’architettura di materiali nanostrutturati e studiando le dinamiche delle molecole all’interno di tali strutture, si può virtualmente ottenere qualsiasi interazione desiderata L’utilizzo di dispositivi nanofluidici, aventi dimensioni paragonabili a quelle delle biomolecole, è vantaggioso per molte applicazioni biomedicali NANOFLUIDICA
- 3. SEPARAZIONE MOLECOLARE IN DISPOSITIVI NANOSTRUTTURATI • Nella moderna biologia e nell'ingegneria biomedica la capacità di separare ed identificare biomolecole da campioni biologici complessi, in maniera accurata ed efficiente, è rilevante per lo sviluppo di molte applicazioni • In questo campo la capacità di influenzare il trasporto delle molecole è di primaria importanza Dispositivo di separazione Forza di trasporto Meccanismo di separazione Campione molecolare Proprietà fisiche Array di trappole entropiche Campo elettrico Intrappolamento entropico DNA Dimensione, carica Array di nanocolonne Campo elettrico pulsante Stretching elettroforetico DNA Dimensione, carica Strutture anisotrope ANA (Anisotropic nanofilter array) Campo elettrico Separazione di Ogston – intrappolamento entropico DNA, proteine Dimensione, carica Ostacoli asimmetrici Campo elettrico Movimenti Browniani rettilficati DNA Dimensione, carica SISTEMI NANOSTRUTTURATI DALLA LETTERATURA Allo stato attuale i dispositivi nanostrutturati di separazione molecolare: • Necessitano della presenza di un campo elettrico o di un flusso imposto • Funzionano esclusivamente con molecole cariche
- 4. MECCANISMI DI SEPARAZIONE • Le proprietà di biomolecole attraverso un struttura filtrante sono determinate da complesse interazioni tra le dinamiche molecolari e la fisica dei sistemi nanofluidici • Questi sistemi mimano i meccanismi di trasporto delle matrici gel coniugando ad essi la possibilità di progettare in maniera controllata la struttura filtrante SEPARAZIONE MOLECOLARE IN DISPOSITIVI NANOSTRUTTURATI FENOMENI ALLA BASE DELLA SEPARAZIONE • Diffusività in ambiente nanoconfinato • Risposta a un campo elettrico imposto in ambiente nanoconfinato • I meccanismi di trasporto molecolare all’interno di strutture nanometriche sono molto rilevanti, possiamo influenzare tali meccanismi modulando le dimensioni caratteristiche del sistema • Abbiamo bisogno di un modello che tenga conto della flessibilità delle molecole
- 5. TRASPORTO IN MATERIALI NANOSTRUTTURATI Per rg/rp<<1 è valida la teoria idrodinamica delle sfere rigide • I fenomeni diffusivi sono regolati dai coefficienti Keq KD • Questo modello non riesce a descrivere i fenomeni di trasporto molecolare in nanostrutture Per rg/rp≈1 non più vale la teoria idrodinamica delle sfere rigide • Bisogna considerare fenomeni di arrangiamento conformazionale dovuti alla flessibilità della molecola (Leggi di scala di De Gennes) • Diventano rilevanti le interazioni a corto raggio (interazioni di van der Waals, forze idrofobiche, elettrostatiche) Parametri che influenzano il trasporto delle molecole • Dimensioni delle molecole(rg, MW) • Dimensione del canale (h) • Rigidità e flessibilità della molecola • Frizione (z) • Interazione molecola/parete: repulsione e attrazione • Proprietà della superficie (proprietà chimiche, ruvidità) DeqKK D D bulk confined
- 6. SCOPO DEL LAVORO • Sfruttare il confinamento di biomolecole in un sistema nanostrutturato al fine di realizzare un dispositivo di separazione che non utilizzi campi esterni imposti né di pressione idrodinamica, né elettrici • Ipotizzare e verificare la validità del principio di separazione molecolare su base entropica, regolato dalla temperatura, su cui basare tale dispositivo MISURAZIONI PER VALUTARE L’EFFETTO DELLA TEMPERATURA • Effetto sulla dinamica diffusiva • Effetto sulla cinetica delle particelle Misurazioni di spettroscopia di correlazione di fluorescenza FCS del PEG 20kDa e 40kDa confinato in nanocanali di 10nm a 23°C, 37°C e 45°C
- 7. SCOPO DEL LAVORO MODELLO TERMODINAMICO PER POLIMERI CONFINATI PROPOSTO DA DE GENNES • Contributo entropico legato a cambi di conformazione della molecola • Contributo entalpico legato a fenomeni di adsorbimento alla parete REGOLARE LE CONDIZIONI TERMODINAMICHE DI CONFINAMENTO SPONTANEO ATTRAVERSO CAMBI DI TEMPERATURA
- 8. h = 10÷30 nm w = 5÷30 mm 500 mm FCS Sampling volume DISPOSITIVO NANFLUIDICO Abbiamo utilizzato un chip provvisto di nanocanali, di 10 nm di spessore, collegati a serbatoi micrometrici carichi di una soluzione di PEG funzionalizzato con rodamina TECNICA DI MISURA Per le misurazioni ci siamo avvalsi della tecnica di spettroscopia di correlazione di fluorescenza FCS abbinata alla microscopia confocale MATERIALI E METODI
- 9. • La diffusione browniana fa fluttuare il numero di molecole nel volume confocale illuminato nel tempo • Di conseguenza si registrano le fluttuazioni del segnale di intensità di fluorescenza t=0 t=1 t=2 N=3 N=2 N=4 O 2 I t I t G I t Dalle fluttuazioni di intensità viene calcolata la funzione di autocorrelazione MATERIALI E METODI La tecnica FCS
- 10. Modello anomalo Modello di Wirth G() 1 N 1 1 diff G() 1 N ( funbound ) 1 1 diff (1 funbound )e Des MATERIALI E METODI Procedura di fitting STUDIO DELLA DINAMICA DIFFUSIVA Attraverso procedure di fitting ricaviamo il tempo di diffusione D a diverse temperature STUDIO DELLA CINETICA Attraverso procedure di fitting ricaviamo il numero di particelle medio <N> a diverse temperature
- 11. Diff Stokes-Einstein Diff xy iD 2 4 wxy = 0.17 µm s= wz/wxy = 5 2 1 11 )( s N G DD D kT r r kT D h h 66 T [°C] D [PEG 20] [cm2 /s] D [PEG 40] [cm2 /s] rh [PEG 20] [nm] rh [PEG 40] [nm] 23 4,53± 0,01 E-07 3,46± 0,01 E-07 5,1 ± 0,1 6,7 ± 0,1 37 5,42 ± 0,01 E-07 4,38 ± 0,01 E-07 6,0 ± 0,1 7,5 ± 0,1 45 6,94 ± 0,03 E-07 4,97 ± 0,03 E-07 5,6 ± 0,5 7,9 ± 0,5 Misure del PEG 20 E 40kDa a differenti temperature RISULTATI Misure in soluzione
- 12. All’aumentare della temperatura diminuisce il tempo di diffusione delle molecole τdiff T diff N G 1 11 Utilizzando la procedura di fitting anomalo abbiamo osservato che non varia con la temperatura e, per il PEG 40kDa, vale ≈ 0,5 ± 0,1 RISULTATI Effetto della temperatura sul tempo di diffusione nei nanocanali - PEG 40kDa
- 13. All’aumentare della temperatura diminuisce il numero di particelle medio rilevato <N> nel nanocanale T • E’ stata osservata una cinetica di svuotamento dei nanocanali all’aumentare della temperatura • Per il PEG 40kDa si ha uno svuotamento significativo nel passaggio da 23°C a 37°C RISULTATI Effetto della temperatura sul numero di particelle medio nei nanocanali – PEG 40kDa
- 14. Anche per il PEG 20kDa all’aumentare della temperatura diminuisce il numero di particelle medio rilevato <N> nel nanocanale E’ stata osservata una cinetica di svuotamento dei nanocanali all’aumentare della temperatura anche per il PEG 20kDa ma si ha uno svuotamento significativo nel passaggio da 45°C a 45°C-14h RISULTATI Effetto della temperatura sul numero di particelle medio nei nanocanali – PEG 20kDa T
- 15. • Abbiamo osservato che le partizioni normalizzate, per il PEG 40kDa e PEG 20kDa, variano in maniera diversa nel tempo al variare della temperatura • Attraverso un meccanismo di separazione per via entropica, regolato termicamente, viene favorita l’uscita di PEG a più alto peso molecolare all’aumentare della temperatura • Il punto di massima efficienza si raggiunge a 37°C • E’ stata stimata un’efficienza di svuotamento dei canali del 38% RISULTATI Principio di separazione PUNTO DI MASSIMA EFFICIENZA
- 16. • Le condizioni energetiche di confinamento spontaneo possono essere valutate analizzando l’andamento dei contributi entropico ed entalpico in funzione del coefficiente r/D • All’aumentare della temperatura varia il punto d’instabilità termodinamica ΔG = 0 In range di confinamento più spinto, molecole a più alto peso molecolare impiegano meno tempo per uscire dal canale a causa del maggiore peso del contributo entropico nel bilancio tra richiamo entropico e diffusività Browniana RISULTATI Discussione
- 17. CONCLUSIONI • E’ stata verificata sperimentalmente la validità del principio alla base di un dispositivo nanostrutturato di separazione molecolare su base entropica, regolato dalla temperatura • Il dispositivo, non prevedendo l'imposizione di campi elettrici e flussi applicati, può essere utilizzato per separare molecole elettricamente neutre • Il dispositivo realizza una separazione massima a 37°C del 38% • Al fine di ingegnerizzare il dispositivo di separazione molecolare innovativo qui valutato, verranno effettuate ulteriori analisi su molecole di interesse applicativo