Funghi pat
- 1. FUNGHI PATOGENI PER L’UOMO
- 2. La Classificazione dei Funghi I Funghi o miceti sono eucarioti, uno dei 3 Domini (procarioti, archea ed eucarioti) in cui sono stati suddivisi gli esseri viventi. I funghi sono microorganismi evolutivamente più complessi dei procarioti e degli archea. Sono classificati come eucarioti diploidi con il DNA organizzato in cromosomi lineari localizzati in un nucleo delimitato da una doppia membrana che contiene steroli. Contengono inoltre mitocondri e altri organelli. Sono aerobi, mesofili e/o psicrotofici (basse T), e producono spore. I funghi non sono in grado di fotosintetizzare non avendo la clorofilla e i cloroplasti. Si nutrono necessariamente dei composti organici sintetizzati da altri esseri viventi: sono quindi organismi eterotrofi. La maggiore complessità nell'organizzazione genica permette loro di avere anche una maggiore diversificazione morfologica rispetto ai procarioti e agli archea. In genere si nutrono dei tessuti di organismi morti, ma alcune specie sono in grado di parassitare anche esseri viventi nel qual caso possono causare numerose malattie anche per l'uomo.
- 3. Licheni
- 4. I funghi Il numero delle specie di funghi oggi viventi è sconosciuto. Una stima conservativa fa ritenere che oggi siano presenti sulla Terra almeno 700 000 specie, anche se si è arrivati a proporre un numero di 1,5 milioni. Di questi solo una minima parte sono state descritte almeno morfologicamente. A oggi meno di 200 specie sono patogene per l’uomo. •20 di queste causano infezioni sistemiche e •circa 20 infezioni cutanee. •Solo una decina causano infezioni subcutanee gravi.
- 5. I funghi • A causa delle morfologie molto semplici e variabili che si sono evolute a secondo delle strategie ecologiche adottate, è difficile determinare le loro diversità e le loro relazioni filogenetiche. • Originariamente, la determinazione tassonomica delle specie fungine era basata, come per gli altri microorganismi, su criteri morfologici, ultrastrutturali, fisiologici e immunologici, insieme con il riconoscimento, generico e descrittivo, effettuato al microscopio ottico in campo chiaro. • Negli ultimi vent’anni tecniche di biologia molecolare (PCR, RFLP, analisi di sequenze di tRNA, sequenziamento di genomi, etc.) hanno consentito una più sicura determinazione dell’identità dei funghi studiati e del grado di relazione filogenetica esistente tra i membri dei vari raggruppamenti tassonomici. • Con la crescente disponibilità di alberi filogenetici generati da un numero alto di geni è stato possibile ricostruire una classificazione filogenetica basata sulle similitudini delle sequenze nucleotidiche e proteiche. • Nel 2007 è stata proposta una nuova classificazione filogenetica dei funghi basata sulle recenti analisi genetiche e molecolari.
- 6. I funghi • I funghi possono essere divisi in 2 forme morfologiche distinte, i lieviti e le ife. I lieviti sono funghi unicellulari che si riproducono asessualmente per gemmazione (budding, per es. Saccharomyces spp.) o per scissione (per es. Schizosaccharomyces spp.). Le ife sono funghi pluricellulari dal diametro normalmente compreso tra i 4 e i 10 µm che si riproducono asessualmente e/o sessualmente. Il micelio (ossia l'apparato vegetativo, il “corpo”, dei funghi) costituisce l'intreccio delle ife. L’ifa può essere settata uninucleata o multinucleata, o cenocitica (non-settata). Le ife pluricellulari sono dette settate quando le cellule che le compongono sono separate da setti porosi (uno o più pori) che consentono il passaggio di materiale e, in alcuni casi, persino di organelli tra una cellula e l'altra. Le ife non settate sono invece costituite da un'unica cellula plurinucleata. Ifa settata con setto poroso al microscopio elettronico È anche visibile il passaggio di organelli.
- 7. I funghi Molti miceli (muffe) sono in grado di crescere o tollerare ambienti con bassa umidità (xenofili), con alto contenuto di sali o zuccheri (osmofili e osmotolleranti) e con basso pH (acidofili e acidotolleranti). Le ife possono essere distinte in vegetative, preposte a compiti nutrizionali, e aeree con funzioni riproduttive. In quest'ultimo caso l’ifa si estende nell’aria e produce esospore libere (conidi) o corpi fruttiferi (sporangi). In generale, la spora germina producendo l’ifa che cresce e si ramifica nella struttura complessa che rappresenta il micelio.
- 8. I funghi I lieviti sono funghi unicellulari di forma ovale o sferica di 3-15 µm che si moltiplicano prevalentemente per gemmazione. Dalla cellula madre viene prodotta una protuberanza chiamata gemma (gemmazione) che, quando raggiunge circa le stesse dimensioni della cellula madre, forma la parete trasversale e si separa dalla cellula madre. Nel punto di distacco si forma sulla cellula madre una cicatrice permanente (cicatrice di gemmazione, scar) sulla quale non si avrà più gemmazione, e sulla cellula figlia una cicatrice permanente detta cicatrice di distacco. L’intero processo richiede circa 30 minuti e ogni cellula, nella sua vita genera in media 24 cellule figlie. Una caratteristica importante della gemmazione è che tutto il materiale di nuova sintesi (parete, membrane, nucleo etc.) andrà a formare la cellula figlia, a differenza del processo di scissione binaria in cui il materiale di nuova sintesi è distribuito equamente tra cellula madre e cellula figlia. Il lievito Saccharomyces cerevisiae in gemmazione. Sono visibili 4 cicatrici di gemmazione.
- 9. I funghi La scoperta del ruolo dei lieviti nei processi fermentativi risale alla metà dell''800 quando il fisiologo tedesco Theodor Schwann e il francese Cagnard de Latour identificarono e descrissero con precisione le cellule fungine come organismi viventi presenti nel mosto d'uva. A secondo delle condizioni presenti nell'ambiente (per esempio, la temperatura), alcuni funghi hanno la capacità di crescere sia come lieviti sia come miceli. Questo dimorfismo è una caratteristica molto importante per alcuni dei principali funghi patogeni per l'uomo in quanto solo una delle due forme causa la malattia. I funghi possiedono una parete cellulare una struttura rigida che conferisce stabilità morfologica alla cellula e permette le interazioni con l’ambiente esterno e i contatti con l’ospite infetto. Come nelle piante, quindi, anche nei funghi si osserva in genere la presenza, intorno alla membrana, di una rigida parete cellulare. La parete cellulare di Saccharomyces cerevisiae (× 72 000). Sono visibili anche il nucleo, un vacuolo, mitocondri e il reticolo endoplasmatico.
- 10. I funghi A differenza della parete delle cellule vegetali, costituita in prevalenza da cellulosa, quella dei funghi è composta soprattutto da chitina. La chitina è costituita da polisaccaridi complessi, proteine e glicoproteine. I polisaccaridi, che rappresentano circa l’80% della parete cellulare, sono polimeri di zuccheri semplici ed includono: la chitina, costituita da residui di N-acetilglucosammina legati tra loro da legami β-1,4- glicosidici simili ai residui di glucosio della cellulosa; un glucano, costituito da residui di D-glucosio legati con legami β-1,6 e con diramazioni β-1,3 e un mannano, un polimero del D-mannosio unito da legami α- 1,6 e con diramazioni α-1,2 e α-1,3. Nella parete sono inoltre presenti alcune glicoproteine, che sono importanti determinanti antigenici. La chitina è un lungo polimero di N-acetilglucosammina (un derivato del glucosio) presente nella parete cellulare dei funghi e nell’esoscheletro di crostacei, insetti, e nei molluschi e nei cefalopodi.
- 11. La riproduzione dei funghi La riproduzione dei funghi può avvenire per via sessuata (teleomorfi) – attraverso la fusione di due o più nuclei con un diverso patrimonio genetico – o asessuata (anamorfi), con cicli vitali che possono essere semplici, ma anche molto complessi. La riproduzione passa nella maggior parte dei casi attraverso la produzione di spore, cellule riproduttive specializzate che sviluppandosi danno origine a un nuovo fungo. I funghi dei quali non sono ancora state riscontrate le corrispondenti forme sessuate di proliferazione sono chiamati funghi imperfetti o deuteromiceti. La riproduzione asessuata comprende la riproduzione di lieviti e ife. La proliferazione vegetativa, in particolare, si può avere per: scissione Meccanismo diffuso nei lieviti (ascomiceti) e in genere nei funghi unicellulari, consiste nella divisione per mitosi della cellula madre in due cellule figlie uguali. gemmazione Un sistema riproduttivo diffuso soprattutto tra i lieviti, attraverso il quale le cellule figlie compaiono come protuberanze (gemme); sporulazione attraverso un processo mitotico vengono prodotte, all'interno di particolari strutture a forma di “sacchetto globoso” chiamate sporocisti, delle spore (mitospore) capaci di generare un nuovo individuo. Le mitospore, protette da una spessa parete, possono essere flagellate, quindi mobili (zoospore), oppure no (aplanospore). Le spore asessuate (conidi) possono essere localizzate agli apici e ai lati delle ife nei conidiofori, o all’interno di esse (sporangi) e sono chiamate sporagiospore. Le artrospore si formano per frammentazione delle ife. Le spore presentano anche più nuclei, morfologia variabile e caratteristiche che possono essere importanti per la loro identificazione;
- 12. La riproduzione dei funghi La riproduzione sessuata è subordinata alla produzione di spore maschili e femminili a seguito di una meiosi dopo una fase transitoria diploide all'interno di strutture del fungo specializzate per la riproduzione, chiamate ascospore. Tali spore, prodotte a milioni da ciascun individuo, vengono diffuse attraverso il vento, l'acqua o gli insetti. In numerose specie appartenenti ad esempio ai phyla Oomicota, Zigomicota e Ascomicota le spore maschili e femminili si uniscono formando un'unica struttura polinucleata che in seguito alla fusione dei nuclei entra in meiosi producendo spore aploidi, le quali non appena trovate le condizioni adatte germinano formando nuovi miceli. Nelle specie appartenenti al phylum dei Basidiomicota la spora di una determinata polarità sessuale, una volta raggiunto il terreno o il substrato più adatto, nelle condizioni più favorevoli di umidità e temperatura, germina formando ife (micelio primario). Per poter completare il ciclo biologico e organizzare le strutture riproduttive, dal micelio primario il fungo passa al micelio secondario, attraverso l’unione di due miceli primari (maschile e femminile), fenomeno noto come somatogamia: Il micelio secondario genererà il frutto (carpoforo) che porta nuovamente spore. (a) Scissione trasversale. (b) Frammentazione delle ife da cui si formano artroconidi (artrospore) e (c) clamidospore. (d) Sporangiospore in uno sporangio. (e) Conidiospore strutturate in catene all’estremità di un conidioforo. (f) Si formano le blastospore dalle gemme delle cellule parentali.
- 13. La riproduzione sessuale: mating types Durante la fase sessuale avviene la fusione dei gameti aploidi generando cellule diploidi. La fase sessuale richiede l'espressione coordinata di numerosi geni coinvolti in importanti processi molecolari e genetici come la riduzione del numero di cromosomi durante la meiosi e la formazione di gameti aploidi, la ripartizione dei cromosomi durante la meiosi, la regolazione dei geni coinvolti nel ciclo cellulare, etc.
- 14. Dimorfismo Diversi funghi possono assumere in risposta alle variazioni ambientali due diverse morfologie (filamentosa- miceli e unicellulare-lieviti). Questo processo è definito dimorfismo ed è una delle caratteristiche principali di diversi funghi patogeni per l'uomo (Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis). I pazienti infettati con questi funghi dimorfici presentano nei loro tessuti cellule nella fase lievito che è la sola forma virulenta. Al contrario, nell'ambiente vengono trovati i miceli che rappresentano la forma saprofitica. In condizioni di laboratorio è possibile crescere in forma pura entrambe le forme modificando la temperatura di crescita: 25°C per i miceli e 37°C per i lieviti È possibile quindi trasformare lieviti in miceli e viceversa semplicemente modificando la temperatura di incubazione. Poiché nei funghi dimorfici vi è una precisa correlazione tra la forma presente nei tessuti umani (lieviti) e la malattia fa ritenere che il processo di differenziamento sia strettamente collegato alla capacità di indurre l’infezione. Va in ogni caso tenuto presente che la transizione di fase micelio ↔ lievito indotta dalla temperatura in assenza dell'ospite umano è a sua volta collegata alla capacità di questi funghi di adattarsi a due ambienti diversi indipendentemente dalla presenza di un ospite.
- 15. Dimorfismo Lieviti Queste cellule contengono una parete cellulare ricoperta da microfibrille alle quali sono associati diversi enzimi. I lieviti di B. dermatitidis e di P. brasiliensis sono multinucleati, mentre quelli di H.capsulatum contengono un solo nucleo. All'interno del lievito sono presenti diversi organelli ed inclusioni, tra cui il reticolo endoplasmatico che comunica con la membrana nucleare e i vacuoli che hanno funzioni lisosomiali. I lieviti si riproducono per gemmazione. Ife Nel citoplasma delle ife sono presenti gli stessi organelli e i diversi tipi di inclusioni identificati nei lieviti. I miceli di B. dermatitidis e di H.capsulatum sono costituiti da ife settate. Le parti terminali delle ife, che contengono dei corpi che possono aggregare fra di loro, possono contenere uno o due nuclei. In prossimità dei pori tra due cellule possono essere presenti i cosiddetti corpi di Woronin.Transizione lievito ↔ ifa Le cellule di lievito cresciute a 37°C si trasformano, in condizioni di laboratorio, in ife quando la temperatura di incubazione viene ridotta a 25°C (o almeno meno di 30 °C). Da un punto di vista morfologico le modalità di questa transizione di fase sono molto simili fra tutti i funghi dimorfici. In condizioni ottimali, tale transizioni morfologiche avvengono in genere tra i 3 e i 5 giorni. Transizione ifa ↔ lievito I cambiamenti morfologici da micelio a lievito richiedono un tempo maggiore, 6-8 giorni, quando la temperatura di crescita passa da 25°C a 37°C. Nel caso di miceli giovani, virtualmente tutte le ife si trasformano in lieviti mentre miceli che sono cresciuti per periodi lunghi di tempo a 25°C richiedono anche 15 - 20 giorni per trasformarsi in lieviti. In questo caso, solo le parti terminali delle ife (la parte vegetativa) si trasformano in lieviti, mentre le regioni più interne delle ife del micelio hanno scarsa vitalità o sono morte. Lo studio molecolare della transizione ifa ↔ lievito è particolarmente importante in quanto l'infezione in natura viene contratta inalando le spore prodotte dalle ife o frammenti delle stesse ife che una volta penetrate nell'organismo umano (polmoni) germinano e si trasformano in lieviti patogeni. Parete cellulare Membrana plasmatica Ammassi di microfilamenti Nucleo Parete cellulare Microtubuli Citoplasma Gruppo di ribosomi Cicatrice di gemmazione polare Cromosoma Reticolo endoplassmatico liscio Membrana plasmatica Mitocondri Membrana nucleare Reticolo endoplasmatico ruvido Mitocondrio Apparatodi Golgi Apparato di golgi Membrana plasmatica Invaginazioni della membrana plasmatica
- 16. Micosi sistemiche Le infezioni sistemiche causate da funghi sono divise in due categorie: •infezioni causate da funghi patogeni che possiedono la capacità intrinseca di causare, con un inoculo sufficiente, una malattia in un ospite sano: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensisinfezioni causate da organismi opportunisti, funghi la cui capacità di determinare una malattia dipende dalle diminuite capacità immunologiche dell'ospite:Aspergillus fumigatus, Candida spp., Cryptococcus neoformans e RhizopusTranne C. immitis, gli altri funghi intrinsecamente patogeni sono tutti dimorfici. La patogenicità non è una caratteristica essenziale di questi funghi in quanto la loro disseminazione non dipende dalla presenza di un ospite. Infatti, infezioni uomo - uomo non sono state descritte e la transizione reversibile micelio (saprofita) ↔ lievito (patogeno) può avvenire al di fuori dell'ospite modificando semplicemente le condizioni di crescita e di temperatura. La forma lievito isolata nei tessuti di pazienti infetti non necessita la presenza dell'ospite umano per svilupparsi. Questo suggerisce che i geni lievito-specifici non sono necessariamente responsabili nella patogenicità e che gli stessi sono mantenuti in questi organissmi in assenza di una pressione selettiva esercitata dall'ospite. È quindi ragionevole ritenere che i prodotti dei geni coinvolti nel mantenimento della fase lievito e nella transizione micelio ↔ lievito sono utilizzati anche durante la crescita nell'ambiente in assenza di tessuti umani.
- 17. Micosi sistemiche Questi organismi non sono intrinsecamente molto virulenti, e in genere circa il 90% delle infezioni sono asintomatiche, con un quadro clinico lieve e autolimitante. Negli ultimi decenni però l'incidenza di infezioni causate da questi funghi è significativamente aumentata con la diffusione dell'AIDS e in generale per l'incremento di pazienti con uno stato immunologico depresso. I funghi che causano malattie sistemiche hanno la caratteristica di essere presenti in particolari aree geografiche le cui condizioni ecologiche ne favoriscono la diffusione in quel particolare ambiente. Per esempio, H. capsulatum è endemico negli stati centrali e nel Sud degli Stati Uniti ma non è presente in Europa, anche se negli ultimi anni è stato isolato in pazienti immunodepressi che avevano vissuto o visitato queste regioni. In ogni caso, tale fungo non è stato mai isolato dall'ambiente in Europa. Nel Midwest degli USA circa il 90% degli individui è positivo quando viene inoculata sottocute l'histoplasmina, indicando che hanno contratto una infezione primaria. Al contrario, funghi come Candida e Aspergillus sono ubiquitari. Un'altra caratteristica dei funghi patogeni opportunisti è quella di non indurre un'immunità specifica e una successiva infezione può avvenire se le difese immunologiche sono di nuovo ridotte.
- 18. Histoplasma capsulatum Da un punto di vista biochimico e molecolare H. capsulatum è tra i funghi dimorfici maggiormente studiati. L’Histoplasma esiste in due fasi di crescita, una parassitica, il lievito, 1-3 µm di diametro, ed una saprofita, il micelio di circa 1,2 - 1,5 µm di diametro. I lieviti sono la forma virulenta che si localizza nei macrofagi e nel reticolo endoteliale e, in condizioni di laboratorio, a 37°C in terreni di coltura liquidi. I lieviti hanno un singolo nucleo e si riproducono per gemmazione. Il tempo di duplicazione dei lieviti in un terreno ricco è di circa 6 ore. Le ife crescono più lentamente dei lieviti: miceli giovani raddoppiano il peso secco in 24 ore e producono in particolari condizioni macro- e micro-conidi. Quest'ultimi, con dimensioni di 5 µm, se inalati germinano negli alveoli polmonari dove si trasformano in lieviti causando l'histoplasmosi. Microconidio Macrofago Macroconidio Lievito in gemmazione Micelio Vacuolo La fase sessuale di H.capsulatum è stata chiamata Ajellomyces capsulatum. Tale forma genera due mating types (+) e (-) che in un mezzo di sporulazione produce dei corpi macroscopi fruttiferi che contengono gli asci.
- 19. Histoplasma capsulatum dimorfismo
- 20. Histoplasma capsulatum dimorfismo I macrofagi sono delle cellule fagocitiche che hanno un ruolo fondamentale nel controllo delle infezioni da patogeni. Sebbene H. capsulatum non sia un patogeno intracellulare obbligato la sua fagocitosi da parte dei macrofagi è un evento importante per lo sviluppo della malattia. Il fungo è infatti capace di sopravvivere all'attacco dei macrofagi e di moltiplicarsi al loro interno. Una volta penetrato in un fagocita Histoplasma si localizza all'interno di fagosoma che si fonde con un lisosoma generando un fagolisosoma. Tale processo (fusione fagosoma- lisosoma) è un importante meccanismo generale che viene utilizzato dai macrofagi per difendere l'organismo dalla presenza di patogeni (e non). All'interno di un fagolisosoma l'ambiente è molto acido con un valore di pH inferiore a 4 e insieme con enzimi degradativi contribuisce all'eliminazione dell'organismo che è stato fagocitato.
- 21. Histoplasma capsulatum dimorfismo e HSPs Le HSP come antigeni - vaccini Sintesi di HSP e virulenza HSP70 e 82 - splicing
- 22. Histoplasma capsulatum stato fisico della membrana Δ9-desaturasi Schema generale di desaturazione di fosfolipidi saturi (SFA) in insaturi (UFA) da parte di diverse desaturasi. Il grado di insaturazione e la posizione in cui avviene l’introduzione del doppio legame influenza in maniera diversa il livello di stato fluido della membrana (MPS) in cui sono presenti gli UFA. Il diverso livello di MPS é determinato dal rapporto SFA/UFA che è regolato a sua volta da una diminuzione di temperatura che attiva trascrizionalmente i geni che codificano per questi enzimi.
- 23. Histoplasma capsulatum stato fisico della membrana Schema dello stato fluido della membrana in condizioni di stress termico. A. La membrana a temperatura fisiologica. B. In condizioni di moderato incremento della temperatura i complessi lipidi/proteine delle membrane sono in grado di mantenere funzionali le proprietà della membrana. C. In condizioni di aumento repentino della temperatura fra i 5 °C e i 7 °C le proprietà fisiologiche delle proteine di membrana sono alterate. Al tempo stesso l’aumento della fluidità attiva un sensore (forse una proteina G2) che attiva il fattore di trascrizione HSF inducendo la sintesi delle proteine da stress con il compito di proteggere il folding delle proteine e compensare la fluidità a valori simili a quelli esistenti prima dello shock termico.La sovra-espressione della Δ9-desaturasi causa un aumento della fluidità di membrana a temperatura fisiologica e uno stato iperfluido che impedisce l ’ attivazione del sensore a temperature che normalmente inducono le HSP.(37 °C ).
- 24. Histoplasma capsulatum stato fisico della membrana - virulenza - vaccini