Mantenimenti e adesione cellulare a diversi substrati
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La ricerca si concentra sull'adesione e il mantenimento dei fibroblasti (nih-3t3) su diversi substrati, come il polidimetilsilossano (PDMS) e la chitina, per identificare i materiali più adatti alla loro crescita. I risultati indicano che i fibroblasti non hanno aderito al PDMS e che la chitina, non trattata, mostra una adesione cellulare ridotta, mentre la chitina trattata con fibrina ha migliorato l'adesione e la proliferazione cellulare. Strumenti come il microscopio ottico e il microscopio a scansione elettronica (SEM) sono stati utilizzati per osservare le cellule e valutare il loro comportamento sui diversi substrati.
Mantenimenti e adesione cellulare a diversi substrati
- 1. Mantenimenti e adesione cellulare a diversi substrati SperimEstate 2014 Marta Malavolta Elisa Mannini Greta Novelli ISIT BASSI BURGATTI
- 2. Obiettivo L’obiettivo della nostra ricerca sui mantenimenti era quello di studiare quali fossero i substrati più adatti alla crescita di fibroblasti (NIH3T3). I substrati migliori erano quelli dove le cellule aderivano meglio e in maggior numero.
- 3. Indice 1. Fibroblasti 2. Mantenimento cellulare - Split e conta - Fissazione 3. Substrati - Polidimetilsilossano (PDMS) - Chitina 4. Semina su substrati 5. Osservazione dei risultati - Microscopio ottico - Microscopio a fluorescenza - Microscopio a scansione elettronica (SEM)
- 4. Fibroblasti • I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di sintetizzare i componenti della matrice extracellulare. • I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti citoplasmatici che arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore. • I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse embryonic fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere osservati al microscopio a fluorescenza. Fibroblasto in divisione
- 5. Fibroblasti • I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di sintetizzare i componenti della matrice extracellulare. • I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti citoplasmatici che arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore. • I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse embryonic fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere osservati al microscopio a fluorescenza. Fibroblasto in divisione
- 6. Mantenimento cellulare • Il mantenimento di cellule in vitro serve per studiare fenomeni biologici come la crescita e l’adesione delle cellule su un determinato substrato. • Le cellule crescono all’interno di fiasche contenenti il mezzo cellulare specifico per il tipo di cellula. • Le cellule che abbiamo coltivato sono cresciute in incubatore a 37°C con una concentrazione del 5 % di CO2. • Durante la coltura cellulare sono necessarie alcune procedure atte a mantenere condizioni ottimali alla crescita cellulare, come il cambio medium e lo split. • Per quanto riguarda l’osservazione delle cellule al microscopio fluorescente o al SEM, è prima necessaria una fissazione.
- 7. • Quando le cellule arrivano a confluenza (ovvero quando il numero di cellule diventa elevato e si perdono le condizioni ideali per la coltura cellulare) occorre eseguire lo split. • Essendo cellule adese, è necessario rompere i contatti focali che hanno col substrato, tramite l’enzima tripsina, in modo da poter risospendere le cellule e trasferirle nella camera di conta. • Per stimare il numero di cellule presenti nel campione si esegue la conta con la camera di Burker. Split e conta Camera di Burker al microscopio ottico
- 8. Fissazione • La fissazione ha la funzione di mantenere inalterata la morfologia dei campioni biologici al fine di osservarli ed impedire l’avanzamento dei processi putrefattivi. • A seconda del tipo di campione e delle tecniche che si intendono utilizzare, si può ricorrere a differenti modalità di fissazione con mezzi chimici (paraformaldeide, glutaraldeide, etc.) o fisici.
- 9. Substrati • I substrati sono materiali che vengono utilizzati per l’adesione cellulare. • Ogni substrato presenta caratteristiche differenti che possono permettere o meno l’adesione cellulare. Quelli da noi studiati sono stati: il PDMS e la chitina. PDMS Chitina
- 10. PDMS • Il PDMS è un polimero composto da silicone e un agente curante. • È biocompatibile e perfettamente trasparente ma non è biodegradabile. • È facilmente lavorabile grazie alla sua flessibilità. • È utilizzato per la costruzione di chip microfluidici, come additivo alimentare e dall’industria cosmetica.
- 11. Chitina • La chitina è il secondo polisaccaride più diffuso dopo la cellulosa. È il costituente fondamentale di crostacei, artropodi, molluschi e funghi. • È biodegradabile e biocompatibile e per questo è molto studiata per la medicina rigenerativa e trova impiego anche nel settore cosmetico.
- 12. Semina su substrati • Abbiamo seminato i fibroblasti in una multiwell da 24 pozzetti, all’interno della quale abbiamo inserito i diversi substrati da analizzare: PDMS, chitina e vetro (controllo). • La funzione del controllo è quella di verificare di aver seminato correttamente le cellule, a prescindere dai risultati ottenuti con i diversi materiali.
- 13. Osservazione dei risultati Gli strumenti che abbiamo utilizzato per l’osservazione dei campioni sono 3 microscopi di diverso tipo: Microscopio ottico Sfrutta la radiazione luminosa nella lunghezza d’onda della luce visibile. Microscopio ottico a fluorescenza Utilizzato per osservare campioni organici o inorganici, sfruttando i fenomeni della fluorescenza o della fosforescenza indotti nel campione. Microscopio a scansione elettronica (SEM) Sfrutta un fascio di elettroni che colpisce il campione e viene catturato da un rilevatore, fornendo un immagine digitale.
- 14. OSSERVAZIONE RISULTATI AL MICROSCOPIO OTTICO
- 15. Controllo al microscopio ottico Osservazione cellule del controllo su coverslip.
- 16. Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura. La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e la proliferazione cellulare. CHITINA e FIBRINA al microscopio ottico
- 17. OSSERVAZIONE RISULTATI AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
- 18. Controllo al microscopio a fluorescenza La presenza delle cellule esclude eventuali errori sistematici
- 19. PDMS al microscopio a fluorescenza Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità (indice di mancata adesione).
- 20. Pozzetto del PDMS al microscopio a fluorescenza Come ulteriore verifica della corretta semina delle cellule (oltre al vetrino di controllo) abbiamo osservato anche al microscopio il pozzetto della multiwell nel quale avevamo posto il PDMS per seminare le cellule. È chiaramente visibile il segno dell’angolo di PDMS. Nel pozzetto le cellule hanno dunque aderito senza problemi.
- 21. CHITINA al microscopio a fluorescenza Cellule sulla chitina non trattata per idrolisi alcalina. Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità (indice di mancata adesione). Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura. Il numero di cellule adese è maggiore ma ancora non siamo nelle condizioni ottimali per la crescita cellulare.
- 22. CHITINA con FIBRINA al microscopio a fluorescenza Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura. La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e la proliferazione cellulare. La colorazione è data dall’uso di un saggio di immunofluorescenza che permette di evidenziare le strutture citoplasmatiche, il nucleo e i contatti focali.
- 23. OSSERVAZIONE RISULTATI AL SEM
- 24. CHITINA al SEM Chitina trattata per idrolisi alcalina a diversi ingrandimenti SEM. Chitina tratta per idrolisi alcalina ricoperta con un gel proteico a base di fibrina.
- 25. NIH-3T3 su CHITINA al SEM 330 mm 100 mm 15 mm 3 mm
- 26. Conclusioni • Osservando (dopo 24 ore dalla semina) l’effettiva presenza di cellule nel controllo abbiamo potuto escludere eventuali errori sistematici. RISULTATI: - Le cellule non hanno aderito al PDMS - Sulla chitina non trattata rispetto a quella trattata, si è notato che l’adesione cellulare è sfavorita. - Per rendere la chitina favorevole per la crescita dei fibroblasti abbiamo ricoperto il substrato con un gel proteico a base di fibrina.
- 27. JESSAMINE M. K. NG et al. "Components for integrated poly(dimethylilosane) microfluidic system ". Electrophoresis (2002) 23:3461-3473 MORGANTI P. "Uso biomedico delle nanofibrine di chitina". Ricerca e industria clinica (2009) 4. http://www.lastampa.it/2013/02/18/scienza/benessere/medicina/ustioni-e-cicatrici- dai-crostacei-una-soluzione-efficace-per-la-cura- 9UEZNtYrgx6nrPwOjNTOoK/pagina.html http://www.elveflow.com/microfluidic-reviews-and-tutorials/the-poly-di-methyl- siloxane-pdms-and-microfluidic http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fibroblast