Clase 03 Tecnología del ADN Recombinante

Edgar Fernando Salcedo, M.Sc
TECNOLOGÍA DEL DNA
RECOMBINANTE
Fernando Salcedo
Biólogo, M.Sc.
e-mail: fsalcedo@unilibrebaq.edu.co

Aplicación en medicina
• La biotecnología tiene diversas aplicaciones: en la alimentación, la prevención de enfermedades
hereditarias, la terapia génica y la producción de sustancias terapéuticas y la elaboración de
vacunas.
• A partir del cultivo de microorganismos, se obtienen importantes sustancias como la penicilina
(extraída de un hongo), la insulina (extraída de bacterias-1982)).
• Se han obtenido a través de plantas y animales transgénicos, el factor VIII, que interviene en la
coagulación de la sangre.
• Producción de hormonas humanas para tratar muchas enfermedades carenciales, como el
enanismo por déficit de hormona del crecimiento.
• Las vacunas se obtienen cultivando virus en células vivas en el laboratorio, los cuales se matan o
se debilitan para preparar vacunas contra la hepatitis B, contra el sida y el paludismo.

La ingeniería genética
Comprende un conjunto de técnicas biotecnológicas entre las que se
destacan:
• La tecnología del ADN recombinante: que permite aislar y manipular un fragmento
de ADN de un organismo para introducirlo en otro.
• Secuenciación del ADN: permite conocer secuencia de los nucleótidos que forman
parte de un gen.
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): permite aumentar el número de
copias de un fragmento determinado de ADN, a partir de una mínima cantidad de
muestra.

TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE
q Es un término que agrupa una gran variedad de técnicas empleadas en el
laboratorio para manipular las moléculas de ADN con el fin de estudiarlas.
q Consiste en la introducción de genes extraños en el material genético de otra
célula.
q Requiere de cultivos celulares, enzimas de restricción, vectores de
clonación, laboratorios equipados y personal bien entrenado.
Esta tecnología es muy
i m p o r t a n t e p a r a l a
investigación en biología
celular y molecular.

Cultivo celular
• Proceso mediante el cual, células procariotas o eucariotas, pueden
cultivarse en condiciones controladas.
• Los "cultivos celulares" hacen referencia a la siembra de células aisladas de
eucariotas pluricelulares, especialmente células animales., para cultivo de órganos
y tejidos.
Cultivo de células
humanas en medios
enriquecidos con
aminoácidos, vitaminas y
factores de crecimiento
Medios de cultivo
sólidos para
siembra de las
células
(Variedad de agares)
Procesamiento de cultivo de células
madre

5 pasos de la tecnología del ADN
recombinante
Vector de
clonación
Selección del
ADN con el
gen de interés
Corte con enzima
de restricción
Plásmido
recombinado Cromosoma
bacteriano
Plásmido dentro
de la bacteria
cultivo de bacteria
recombinada
Ø Corte del ADN en posiciones
precisas (secuencias palíndromes)
con endonucleasas de restricción,
Ø Unión de fragmentos por la
ADNligasa,
Ø Selección de un fragmento de ADN
capáz de autoreplicarse,
Ø Insertar los vectores de clonación a
células específicas que contienen
toda la maquinaria genética para la
expresión de la información contenida
en el vector.
Ø Selección o identificación de las
células que contienen al ADN
recombinante.

Manipulación del ADN
" Las 2 moléculas de ADN
son digeridas con la
misma endonucleasa de
restricción,
" La enzima corta extremos
complementarios que se
aparean,
" La ligasa repara hebras
cortadas de ADN y rehace
las nuevas bicatenarias.

Enzimas de restricción
v Catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodíester de los ácidos nucleicos y son
capaces de cortar ambas hebras del DNA en sitios específicos.
v Ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos,
a menos que los ácidos nucleícos presenten metilación (adición de grupos metilo)
en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

Corte de hebras por enzimas restrictivas
extremo o adhesivo
o pegajoso
Secuencia palíndrome se
lee igual en ambos
sentidos

Vectores de clonación
Son moléculas que transportan y replican fragmentos de ADN que
llevan insertados.
Bacteriófagos: son virus
que sirven de portadores de
Material genético a bacterias.
Plásmidos son
moléculas de ADN
extra cromosómico
de forma circular en
bacterias.
Cósmidos son
vectores sintéticos que
combinan
características del fago
lambda que posee
extremos cohesivos o
regiones cos.

Virus bacteriófagos
q Partículas infectantes de bacterias,
q Algunos (Lambda y M13) han sido utilizados por biólogos moleculares, que
han modificado oportunamente sus genomas.
q Pueden tener efecto lìtico o lisogènico en las bacterias.

Actividad de los virus bacteriófagos

Clonación molecular
• CLON significa copia exacta de una célula o molécula de ADN,
• Las secuencias a clonar se introducen en células bacterianas por
medio de vectores.
• Los plásmidos, los virus bacteriofagos y los cósmidos se usan como
vectores;
• Para clonar genes específicos se elaboran bibliotecas génicas que
son colecciones de fragmentos de ADN genómicos, clonados en
vectores (plásmidos, bacteriófagos o cósmidos), que representan el
genoma entero del organismo.
• Los cósmidos son son vectores artificiales obtenidos de levaduras y
de bacterias.
• Las bibliotecas de cDNA representan la colección completa de
los mRNA que se sintetizan en un momento en una célula dada.

Manipulación de células humanas

Utilidad de la biotecnología
bacteriófagos)
Utiliza
microorganismos
modificados
geneticamente, asi
como plantas y
animales
transgénicos para
elaboración de
antibióticos,
hormonas y variedad
de sustancias de
utilidad para el
hombre.

Como se aplica la tecnología
• Aislamiento del ADN de las 2 fuentes diferentes.
• Tomar en cuenta la complementariedad de bases
púricas y pirimídicas para la formación de puentes de
hidrógeno.
• Aplicar enzimas de restricción, para el corte del ADN e
inserción de nuevo ADN.
• Utilización de plásmidos para la clonación.
• La hibridación molecular entre ADN-ADN y ADN-ARN.
• En la transcripción inversa que permite la síntesis de
ADN a partir de ARN para obtener cADN (ADN
complementario).
• La necesidad de primers o cebadores para la síntesis de
las nuevas cadenas.
·
• ·

Utilidad en la medicina
El desarrollo de la Genómica y
la Proteómica, así como la
aplicación de la Biotecnología a
la Medicina, ha permitido
identificar genes alterados
productores de enfermedades y
elaborar fármacos para reducir
la incidencia de patologías
La investigación biotecnológica genéticas.
permitió antes de 2010, conocer
la predisposión que tiene cada
individuo a padecer un tipo de
cáncer y detectar tumores antes
de que existan, por la posibilidad
de examinar los mas de 30.000
genes que tiene cada ser
humano.

HIBRIDACION MOLECULAR
• Técnica que permite la formación de cadenas
complementarias de ADN-ARN.
• Se basa en cambios de temperatura
para desnaturalizar el ADN y separar las cadenas.
• Si baja la temperatura se vuelven a aparear las
cadenas complementarias. Algunas se aparean con
ARN (hibridación).

HIBRIDACION MOLECULAR
Técnica que permite la formación
de cadenas complementarias de
ADN-ARN
Utiliza altas temperaturas para
desnaturalizar el ADN y separar las
cadenas.
Si baja la temperatura se vuelven a
a p a r e a r l a s c a d e n a s
complementarias. Algunas se
aparean con ARN y se produce la
hibridación.
ADN
ARN
Hibrido ADN-ARN

Hibridación in situ
Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización
precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de
secuencia complementaria a las sondas utilizadas.
En esta categoría destaca el
FISH, técnica de hibridación in
situ, donde las sondas son
secuencias de ADN marcadas
que se unen a secuencias de
ADN conocidas dentro del
cromosoma.

Hibridación celular
En biotecnología la hibridación
somática es el proceso por el cual se
obtienen plantas híbridas a partir de la
f u s i ó n d e c é l u l a s o d e
protoplastos derivados de células
somáticas .
Esta técnica surgió hace unos 30 años
como una herramienta muy promisoria
para sortear problemas de
incompatibilidad precigótica
Esta técnica demostró ser útil en la mejora genética de plantas,
principalmente por permitir la introducción limitada de genes de
especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo,
cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o
tolerancia a estreses.

ADN complementario (ADNc)
Transcriptasas inversas son
utilizadas para obtener ADNc a
partir de ARNm
Segmentos de oligonucleótidos
contienen endonucleasas de
restrición
El ADNc es incorporado a un
vector adecuado
ADN c clonado

Reacción en cadena de la polimerasa
El ADN complementario o ADNc es
un ADN de doble cadena. Se
sintetiza a partir de una hebra simple
de ARNm maduro. Se suele utilizar
para la clonación de genes propios
d e c é l u l a s e u c a r i o t a s e n
células procariotas, debido a que,
dada la naturaleza de su síntesis,
carece de intrones

Terminología
• Acidos nucleicos: biomoléculas formadas por macropolímeros de
desoxiribonucleótidos, o ribonucleótidos.
• ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica
para transcripción, replicación o transferencia de genes.
• ADNr = ADN recombinante: molécula de ADN formado por recombinación de
fragmentos de ADN de orígenes diferentes.
• ARNHn = ARN heterogéneo nuclear = ARNm primario: localizado en el núcleo que
presenta intrones y exones.
• Biología Molecular: parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a
nivel molecular.
• Biotecnología: toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y
organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o
procesos en usos específicos.
• Células sexuales: células que al unirse forman el huevo fertilizado, en la especie
humana los gametos.
• Clones: grupo de células o de organismos de idéntica constitución genética entre
sí de ancestro común del que proceden por división binaria o por reproducción
asexual.
•

Acidos nucleicos: biomoléculas formadas por macropolímeros de
desoxiribonucleótidos, o ribonucleótidos.
ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica
para transcripción, replicación o transferencia de genes.
ADNr = ADN recombinante: molécula de ADN formado por recombinación de
fragmentos de ADN de orígenes diferentes.
ARNHn = ARN heterogéneo nuclear = ARNm primario: localizado en el núcleo que
presenta intrones y exones.
Biología Molecular: parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a nivel
molecular.
Biotecnología: toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos
vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos en usos
específicos.
Células sexuales: células que al unirse forman el huevo fertilizado, en la especie
humana los gametos.
Clones: grupo de células o de organismos de idéntica constitución genética entre sí de
ancestro común del que proceden por división binaria o por reproducción asexual.

q Hibridación: proceso de generación de una molécula, célula u organismo combinado con
material genético procedente de organismos diferentes.
q Ingeniería genética: conjunto de técnicas utilizadas para introducir un gen extraño en un
organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de expresión.
q Locus (loci): en genética, punto de un cromosoma ocupado por un gen.
q Manipulación genética: formación de nuevas combinaciones de material hereditario por
inserción de moléculas de ácido nucleico, en el interior de virus, plásmido bacteriano u otro sistema
vector fuera de la célula.
q Mapa genético: diagrama descriptivo de los genes en cada cromosoma
q Mosaico: individuo que presenta dos o mas líneas celulares genéticamente diferentes como
consecuencia de una anomalía en las primeras mitosis del cigoto.
q Mutación: cambio del material genético, en un par de bases del ADN, en un gen específico o en
la estructura cromosómica. En células somáticas la mutación constituye el origen de algunos
cánceres y de ciertos aspectos del envejecimiento.
q Palindromos: segmentos capicúas que resultan iguales vistos en uno u otro sentido, como el capicúa
alfabético anilina, anita lava la tina (Se leen igual en ambos sentidos )
q Plásmido: forma acelular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que contienen unos cuantos genes y
se encuentran en el interior de ciertas bacterias, se replican de forma in fundamental para la secuenciación del
Proyecto Genoma Humano dependiente al ADN bacteriano y pueden pasar de unas bacterias a otras. Se utilizan
como vectores en manipulación genética.
q RCP = Reacción en cadena de polimerasa: técnica de análisis del genoma mediante la
amplificación ilimitada de porciones específicas del ADN, fundamental para la secuenciación del
Proyecto Genoma Humano
q Sonda de ADN: fragmento de ADN conocido que se utiliza para averiguar si los cromosomas
investigados contienen la secuencia complementaria
q Transcripción inversa: proceso de síntesis de ADN complementario a partir del ARN genómico
de los retrovirus efectuado por la enzima transcriptasa inversa.

ADNc (complementario)
• Copia de DNA a partir de RNA
• Obtenido con Transcriptasa inversa (enzima de
retrovirus)
• Este DNA es complementario al RNA
• Este DNA se clona
• Útil para entender la estructura y función de los genes
Vector: portador, que transfiere material genético de un huésped a otro.
Ø Southern blot: método desarrollado para la detección de genes
específicos en el ADN celular.
Ø Northern blot: se utiliza para identificar las cadenas de ARN de
secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo
Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.
Ø PCR: (reacción en Cadena de la Polimerasa), utiliza un paso de hibridación
de oligonuclotidos para la secuenciación de ADN de un organismo.

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