Clase de imprinting 2013
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El documento describe el fenómeno de la impronta genómica, donde la expresión de un gen depende del progenitor que transmitió ese alelo. Explica que ocurre en mamíferos y plantas, y que involucra genes que escapan a la desmetilación en el desarrollo embrionario temprano. También describe síndromes como Prader-Willi y Angelman, causados por alteraciones en la impronta de genes en el cromosoma 15, y explica modelos moleculares de cómo se establece y mantiene la impronta genómica.
![Ejemplo 3
INACTIVACION DEL CROMOSOMA X
en células XX de mamíferos
antecedentes:
Mary F. Lyon, UK (1925-)
descubrió en 1966 que:
corpúsculo de (Murray) Barr (1949), es debido a un X como
heterocromatina en células somáticas XX en interfase
sexado en las Olimpíadas (para detectar transexuales XY): the presence of
Barr bodies indicates femaleness whereas their absence indicates maleness. This test was previously
used in the International Olympic Committee Medical Commission in 1968. This test
later was replaced by PCR (Y chromosome).
• cuerpo XY (par XY como heterocromatina [hay recombinación homóloga entre
ellos en cortas regiones]) en células germinales masculinas durante el
inicio de la meiosis; luego se separan en la primera división, pero el X
sigue heterocromatinizado en las gametas](https://image.slidesharecdn.com/clasedeimprinting2013-140916223207-phpapp01/85/Clase-de-imprinting-2013-19-320.jpg)
Clase de imprinting 2013
- 1. IMPRONTA GENOMICA (“IMPRINTING”) Conocimientos requeridos: clases previas de Cromatina y Epigenética Definición: “marca” que determina la expresión de 1 solo alelo de un cierto locus dependiendo del sexo del progenitor que transmitió ese alelo (parent of origin) ocurre en mamíferos y en plantas en genes que escapan a la oleada de metilación y desmetilación que ocurre en el desarrollo embrionario temprano
- 2. concepto relativamente moderno Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto biológico (de comportamiento): Klopfer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1964) 52: 911–914. Maternal “Imprinting” In Goats Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto genético bien definido: Rastan et al. Nature (1983) 303: 635-637. Interaction between the Xce (X-controlling element) locus and imprinting of the paternal X chromosome in mouse yolk-sac endoderm.
- 3. Modelo sencillo de expresión mono-alélica de genes sujetos a imprinting se mantienen las marcas que vinieron de los progenitores. no importa el sexo del individuo hijo (el sexo va a importar después a la hora de transmitir los alelos a su progenie) Erasure = borrón y cuenta nueva “resetting” del imprinting epigenéticamente iguales epigenéticamente iguales las marcas se establecen de nuevo de acuerdo a si son gametas masculinas o femeninas origen: P M origen: P M
- 4. ERASURE “borrón y cuenta nueva” Andy Bell y Vince Clarke.)
- 6. marcas epigenéticas de futura expresión “resetting”: se borra el viejo imprinting y se establece nuevo imprinting marcas epigenéticas de futura no-expresión
- 7. Lista de genes “imprinteados” en: a census of mammalian imprinting. Morison et al., Trends Genet. 21: 457-65 (2005 ) Ejemplos: cromosoma expresión SNRPN UBE3A 15 paterna materna IGF2 H19 11 paterna materna Xist Tsix X paterna* materna* 1 2 3 * Solamente en embrión antes de implantación; después es al azar
- 8. Ejemplo 1: cromosoma 15q11-q13 (brazo largo) son genes que se expresan en sistema nervioso central IC SNRPN _______otros genes _________UBE3A ←-----------------------------------36 Kb--------------------------------------→ expr. paterna expr: materna IC: “imprinting center”: region que controla el imprinting de toda la región SNRPN y UBE3A son de expresión excluyente en cis, es decir: si se expresa SNRPN, no se expresa UB3A en el mismo alelo, y viceversa
- 9. ¿En qué células se establece (se “resetea”) el imprinting del gen SNRPN? metodología: medición de status de metilación en islas CpG (entre ellas, las del IC=Imprinting Center) mediante la técnica del bisulfito Geuns et al., Hum. Mol. Genet. 12: 2873-9 (2003) embrión temprano línea germinal femenina línea germinal masculina muy metilada nada metilada
- 10. Síndrome de Prader Willi (PWS) Causa 1: deleción en el alelo SNRPN de origen paterno (70% de los casos) Expresión NO NO de la región
- 11. Síndrome de Prader Willi (PWS) causa 2: Disomía* Maternal (25% de los casos) Expresión: NO NO *Disomía uniparental en general puede surgir por: 1) error en meiosis dando gametas con cromosomas duplicados provenientes de un mismo progenitor y posterior pérdida en cigoto del cromosoma heredado por el otro progenitor 2) o por recombinación entre cromosomas homólogos en mitosis en embrión temprano
- 12. Síndrome de Prader Willi (PWS) causa 3: Defecto en el IC 3’ (PWS-IC) , que (si bien causa insensibilidad a marcas epigenéticas inactivadoras), tampoco permite que actúen las marcas activadoras (5% de los casos) Expresión: NO NO
- 13. Página de PWS association http://www.pwsausa.org/index.html Síntomas • Neonatal hypotonia • Feeding problems in infancy • Excessive weight gain • Facial features • Hypogonadism • Developmental delay • Hyperphagia • Hypopigmentation • Small hands and/or feet • Eye abnormalities • Thick viscous saliva • Articulation defects problemas de comportamiento • Sleep disturbance
- 14. Síndrome de Angelman (AS) Causa similar pero la deleción es en la región que se expresa a partir del alelo de origen materno: gen UBE3A • Angelman Syndrome Foundation • http://www.angelman.org/angel/
- 15. Síndrome de Angelman (AS) Síntomas • developmental delay • mental retardation • gross and fine motor difficulties • suck/swallowing disorder • wide-spaced teeth • hypopigmentation Problemas de comportamiento • speech disorder (in most cases, lack of speech) • hypermotoric behavior • easily excitable personality • frequently happy demeanor.
- 16. Modelo molecular sencillo para explicar expresión mono-alélica (paterna) de los genes de la región (excepto de UBE3A, que tiene patrón de expresión opuesto en cis) _____ _____ factores específ de línea germ fem metilación → inactivo IC = Imprinting Center; región regulatoria bipartita: parte 5’ (AS-IC): promueve la acción de metilasas; parte 3’ (PWS-IC): isla CG receptora de esas metilasas no hay factores sin metilar → activo ● : alelos que no se expresan ○ : alelos que se expresan IC = Imprinting Center p
- 17. ¿Por qué la expresión excluyente en cis entre SNRPN y UBE3A? No hay un modelo molecular convincente, pero probablemente se deba a un aislante transcripcional influido por una DMR (región diferencialmente metilada) que actúa a distancia,de modo similar a lo indicado en el ejemplo 2 (BWS)
- 18. - Ejemplo 2: Beckwith–Wiedemann syndrome (BWS): - macroglosia - hepatomegalia - tumor de Wilms región en cromosoma 11p15: genes IGF2 y H19 regulados por el mismo enhancer atípico ubicado 3’ se transmite por vía materna CTCF es un aislante transcripcional que se ubica en la DMR (región diferencialmente metilada) cuando no está metilada; e impide la acción a distancia del enhancer sobre IGF2 (CTCF no tiene efecto sobre H19) enhancer Normalmente el alelo materno no está metilado → CTCF se pega → IGF2 no se expresa En BWS, el alelo materno tiene una deleción en DMR → CTCF no se pega → IGF2 se expresa, lo cual explica el tumor de Wilms (sobre-expresión de IGF2 a partir de ambos alelos) ● CTC F CTC F Normalmente el alelo paterno está metilado → CTCF no se pega → IGF2 se expresa Si hay deleción similar eenn aalleelloo ppaatteerrnnoo,, nnoo ccaauussaa ccaammbbiiooss eenn llaa eexxpprreessiióónn ddee IIGGFF22 ppoorrqquuee ddeessaappaarreeccee llaa ppllaattaaffoorrmmaa ppaarraa eell ppeeggaaddoo ddee CCTTCCFF,, qquuee iigguuaall nnoorrmmaallmmeennttee eess iinneeffeeccttiivvaa ddeebbiiddoo aa mmeettiillaacciioonn
- 19. Ejemplo 3 INACTIVACION DEL CROMOSOMA X en células XX de mamíferos antecedentes: Mary F. Lyon, UK (1925-) descubrió en 1966 que: corpúsculo de (Murray) Barr (1949), es debido a un X como heterocromatina en células somáticas XX en interfase sexado en las Olimpíadas (para detectar transexuales XY): the presence of Barr bodies indicates femaleness whereas their absence indicates maleness. This test was previously used in the International Olympic Committee Medical Commission in 1968. This test later was replaced by PCR (Y chromosome). • cuerpo XY (par XY como heterocromatina [hay recombinación homóloga entre ellos en cortas regiones]) en células germinales masculinas durante el inicio de la meiosis; luego se separan en la primera división, pero el X sigue heterocromatinizado en las gametas
- 20. Ejemplo 3 INACTIVACION DEL CROMOSOMA X en células XX de mamíferos • Placentarios (euterianos) debida a imprinting hasta el momento de la implantación (estadío blastocisto). Después el imprinting es borrado (excepto en trofoblasto → placenta) y la inactivación es al azar por un mecanismo de conteo o dosaje → tejidos mosaico • No placentarios (metaterianos) p. ej. canguros hay imprinting de todo el X paterno a lo largo de toda la embriogénesis, que continua en la vida adulta
- 21. Genes Xist y Tsix Jeannie Lee et al., Harvard Medical School Nature Genetics 21, 400 - 404 (1999) los genes responsables están localizados en el XIC (X-inactivation Center), locus definido por genética clásica RNA: el verdadero inactivador en cis RNA anti-sense: el verdadero activador en cis hibridización in situ de RNA (RNA-FISH) El RNA Xist recubre a todo el X del cual provino, y lo inactiva El RNA Tsix impide que se sintetice RNA Xist
- 22. ¿Qué marcas epigenéticas adquieren los X como consecuencia del RNA Xist? RNA los clásicos Chang et al., Frontiers in Bioscience 11, 852-866, 2006
- 23. OK, la inactivación de uno de los dos X es debida a genes del XIC…. pero ¿cuál X es el que se inactiva?¿Es al azar o es parent of origin? Experimento: mirar expresión de genes Xist y Tsix por RT-PCR sobre RNA de blastocistos pre-impl. de dos cepas de ratón distintas (para aprovechar polimorfismos de longitud en RNA Xist) en hembras: el RNA Xist es igual que el del padre !!! machos no tienen RNA Xist el RNA Tsix es el de la madre !!! Conclusión: en blastocistos XX pre-implantados, el X inactivo es el de origen paterno Madre Padre M P F1
- 24. ¿Qué le pasa a la progenie de una madre sin Tsix? (KO para Tsix, en región que no afecta al DNA Xist) *aparece el RNA Xist de la madre!!! * Jeannie Lee, Harvard M P M PP FF11
- 25. Mirando los blastocistos pre-implantación wt y KO detección de RNA Xist mediante RNA-FISH ¿consecuencias de este KO en la vida de los ratones? estos embriones mutantes knock out tienen problemas de superviviencia: se les inactiva el XM que tendría que estar activo !! en los pocos embriones XX que sobreviven, después de la implantación y borrón y cuenta nueva: se inactiva 1 solo X, pero no al azar: preferentemente es en el X mutado (y en machos sobrevivientes, el único X no se inactiva?) Jeannie Lee, Harvard Cell 103, 17–27 (2000) En cambio los mutantes XM XPΔ no tienen problemas porque de todos modos XP estaría inactivo en estas ratonas, después de la implantación, la inactivación del X no es al azar: preferentemente es el X mutado
- 26. Modelo sencillo de inactivación del cromosoma X muestra que el imprinting de todo el X (antes de la implantación) se deberia al imprinting de Tsix (en su IC) metilación? borrón y cuenta nueva IC = Imprinting Center femenino Modelo consistente con el cuerpo XY en células germinales masculinas
- 27. modelo integrador que muestra asociación entre RNAs Xist/Tsix y marcas epigenéticas conocidas Navarro et al. GENES & DEVELOPMENT (2005) 19:1474-1484 Tsix induces efficient H3-K4 methylation ○ over the entire Xist/Tsix unit. RNA Xist origen Paterno RNA Tsix / / / RNA Xist RNA Xist borrón y cuenta nueva Ojo!!!: metilación en K4H3 al azar es marca activadora
- 28. Comprobación experimental (in vivo) del “modelo del beso” (Jeannie Lee, Science 2006) ocurrió beso Xic, green Tsix, red. DAPI, blue para ver resto del nucleo XX ES cells in vivo luego de extraer los embriones a distintos tiempos (de distintas ratonas preñadas) : DNA FISH in vitro para ambos X (verde y rojo) RNA FISH para Xist (rojo): se ve En 1 X solamente MEFs Xic DNA, green Xist RNA, red Enriquecimiento de K27H3 en cromosoma con Xist RNA se separan
- 29. Modelos de inactivación al azar del cromosoma X en mamíferos Enjambre de factores bloqueadores de la inactivación, que quedan finalmente agregados y unidos a 1 solo X
- 30. Symmetry-Breaking Model for X-Chromosome Inactivation modelo b) del “enjambre” de la diapo anterior mediante simulación computacional Mario Nicodemi & Antonella Prisco PHYSICAL REVIEW LETTERS (2007) Variables independientes a setear:: • constante cinética de difusion "k" de Arrhenius • E = energía entre moléculas de factor de activación (valor alto = molec. “pegajosa”) • distancia entre los dos X • tiempo Variable dependiente (output): distribución de moléculas en cada X When E = 0, a random walk diffusion is found. The evolution is drastically different for E = 2.4kT, where droplets (swarm) of particles are formed, ending up in a single cluster overing just one of the two equivalent chromosomes and, thus, breaking their binding symmetry. El modelo encaja mejor cuanto menor sea la distancia entre los dos Xs, consistente con el modelo intuitivo del beso También consistente con situación artificial de 3 X y queda 1 solo activo La molécula pegajosa de este modelo bien podria ser un activador de Tsix. Channnn! un X el otro X
- 31. Y en insectos? es al revés que en mamiferos: Weake & Workman, Nature Structural & Molecular Biology 16, 801 - 803 (2009) hay un complejo proteico acetilador de histonas (HAT) en células de machos que garantiza la doble expresión de genes en el único cromosoma X para igualar el nivel de expresión en hembras que tienen dos X !!
- 32. Para tener en cuenta…. • los genes sujetos a imprinting evaden las oleadas de metilación y desmetilación que ocurren en la reprogramación epigenética en el desarrollo embrionario en mamíferos • El imprinting puede perderse en animales clonados por transferencia nuclear porque se forma un cigoto “parcialmente asexual” que no se originó a partir de ambas líneas germinales, donde normalmente se establecen las marcas de imprinting • Se ha revelado el “imprintoma” de cerebro de ratón adulto (Gregg et al, agosto 2010): cruzas de ratones endocriados de dos diferentes cepas (para aprovechar polimorfismos y así después rastrear el origen parental). En las crías F1 (heterocigotas) se hizo RNA-seq masiva (pirosecuenciación de los cDNAs). Se observó sesgo en la expresión materna o paterna de 1300 loci.
- 33. ¿Y la ventajas adaptativas del impriting? Morison et al., Trends Genet. 21: 457-65 (2005) Difíciles de explicar pues el imprinting hace perder la obvia ventaja de la diploidía 1) Hay una teoría (Ishino, Develop. Growth Diff., 2010). que sostiene que el imprinting surgió en la evolución como defensa contra retrotransposición en una de las dos líneas germinales (en ambas hubiera sido letal). Los autores la fundamentan invocando a los genes parental expressed genes (peg), sujetos a imprinting (tienen DMRs) y asociados a la formación de la placenta, con similitud de secuencia a retrotranposones 2) Hipótesis evolutiva del “Conflicto Genético” (“cierra” para IGF2, pero no para IGF2-r) En especies que muestran paternidad mútiple en 1 evento reproductivo (“poliandria”)…. • el padre privilegia su propia paternidad a través del tamaño de su descendencia, incluso a expensas de los medio-hermanos. Y lo hace transmitiendo epialelos activos de genes que promueven el crecimiento fetal, p. ej. IGF2. • un interés de la madre es distribuir equitativamente sus recursos en toda su progenie, aunque nazcan pequeños. Y lo hace transmitiendo epialelos inactivos de genes que promueven el crecimiento fetal, p. ej. IGF2. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Además, en el caso de IGF2, la ausencia de imprinting causaría su sobre-expresión y mayor propensión al tumor de Wilms