Control calidad en el Laboratorio de ensayos..ppt

Control de calidad en los análisis microbiológicos de
alimentos
Nicaragua, Managua; Julio 21-25, 2009
Dr. Javier Castro Rosas

Contenido de la capacitación
• Conceptos de control de calidad y sobre la norma ISO.
• Importancia del control de calidad en el laboratorio de
microbiología.
• Medidas básicas de control de calidad y de seguridad
dentro del laboratorio de microbiología.
• Factores que afectan los análisis microbiológicos de
alimentos
• Control de calidad y buenas practicas de laboratorio
durante los análisis microbiológicos de alimentos.
– Salmonella y algunos indicadores

Contenido de la capacitación
• Control de calidad de medios de cultivo y reactivos.
• Evaluación de la productividad y selectividad de medios
de cultivo.
• Pruebas de toxicidad del agua y medios de cultivo.
• Prueba de residuos de inhibidores en materiales de vidrio
y plástico.
• Ensayos inter e intralaboratorio

Instructor
• Dr. Javier Castro Rosas
– Texas A&M University
– Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo
– Currículum vitae
Presentación

Fundamentos de Calidad y Normalización
Importancia del control de calidad durante
el análisis microbiológico de los alimentos

Normalización
•Regularizar o poner en orden lo que no
estaba.
•Ajustar varias cosas semejantes a un
tipo o norma común.

Normalización
Proceso de formular y aplicar reglas con
el propósito de establecer un orden en
una actividad específica para beneficio, y
con la cooperación de todos los
interesados y en particular para la
obtención de una economía optima de
conjunto, respetando las exigencias
funcionales y de seguridad.

ISO
• Acrónimo
•IOS (International Organization of Standardization)
•Palabra griega, ISO que significa igual,
uniforme, norma
–Por ejemplo
• Isósceles
• Isobárico
• Isotérmico

International Organization of
Standardization
• “ISO” fue adoptado para expresar la
intención de la organización de buscar
uniformidad de criterios al difundir la
Normalización a nivel internacional

ISO
• Federación mundial de organismos
nacionales de estandarización
• Carácter no gubernamental
• Creada en 1947
• 130 países asociados
• Sede en Ginebra

ISO/IEC
• IEC: Comisión Electrotécnica Internacional
• Clasificada así desde 1983
• Aplicación particular a organizaciones que
necesitan comprobar competencia técnica

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Competencia
técnica
Personal Capacitado

Algunas definiciones
ISO
• Es una red global que identifica los estándares
internacionales que son requeridos en los negocios,
empresas, gobierno y la sociedad para transparentar los
procedimientos y realizarlos de la misma forma en todo
el mundo

Calidad (ISO 8402: 1994)
• Las características que debe cumplir un producto o
servicio relacionadas con la satisfacción de las
necesidades del cliente indicadas o implícitas
Control de calidad (ISO 9000/2000)
• Administración de la calidad dirigida a la ejecución de las exigencias
de la calidad.
Aseguramiento de la calidad (QA) (ISO 9000/2000)
• Todas las actividades planeadas y sistemáticas que son la parte de
los sistemas de gestión de calidad. Esto establece procedimientos
de organización y estándares para la calidad.
Calidad + Evaluación QA
Algunas definiciones

ISO 9000
• Una variedad estándares internacionales para la
gestión de la calidad
• Se aplican a una variedad de organizaciones desde las
fabricas hasta la administración en los gobiernos
• ISO 9001 aplicable a organizaciones que diseñan,
desarrollan o mantienen productos
• ISO 9001 un modelo genérico del proceso de calidad
que debe ser implementado para cada organización
que usa el estándar

Familia de estándares ISO
9000:2000
Estándares y directrices Propósito
ISO 9000:2000, Sistemas de gestión de la
calidad – Fundamentos y vocabulario
Establece un punto de partida para entender las
normas y define los términos fundamentales y
definiciones usadas en la ISO 9000, familia que
usted necesita para evitar malentendidos en su
uso.in their use.
calidad – Requerimentos
Éste es el estándar que usted puede usar para
evaluar su capacidad de conocer al cliente y los
requerimientos regulatorios aplicables para así
lograr la satisfacción de cliente.
Este es por ahora el único estándar en la familia
ISO 9000 por medio del cual la certificación aun
tercero puede ser llevada .
calidad - Directrices para mejoras de
funcionamiento
Este estándar proporciona las directrices para la
mejora continua de su sistema de gestión de
calidad para beneficiar todas las partes
manteniendo la completa satisfacción de cliente.
ISO 19011, Directrices sobre Calidad y/o
Auditoria de sistemas de gestión ambiental
(comúnmente en desarrollo)
Le provee directrices para verificar la
funcionalidad del sistema para alcanzar objetivos
de calidad definidos. Usted puede usar este
estándar internamente o para auditar a sus
proveedores.

Implementando su sistema de gestión de
Calidad ISO 9001:2000
1. Identifique los objetivos que usted quiere alcanzar.
2. Identifique que esperan de usted.
3. Obtenga información sobre la familia ISO 9000.
4. Aplique los estándares de la familia ISO 9000 en su sistema
de gestión.
5. Obtenga las directrices sobre tópicos específicos dentro del
Sistema de Gestión de la Calidad (SGC).
6. Establezca su situación actual, determine las necesidades
de su SGC con respecto a los requerimientos del ISO
9001:2000.

7. Determine los procesos que son necesarios para
suministrar productos a sus clientes.
8. Desarrolle un plan para satisfacer las necesidades del
paso 6 y desarrolle los procesos en el paso 7.
9. Realice su plan.
10. Realice periódicamente evaluaciones internas.
11. ¿Tiene usted que demostrar la conformidad? Si es así,
paso 12. Si No, Paso 13.
12. Sométase a una auditoria por un organismo independiente.
13. Siga mejorando su negocio.

ISO 9000 vs ISO 17025
• Los laboratorios de pruebas que cumplen
con la ISO 17025 también funcionan bajo
los principios de la ISO 9000.
• Sin embargo, la certificación con respecto
a la ISO 9000 no demuestra la capacidad
del laboratorio de producir datos y
resultados técnicamente válidos.

Relación - ISO 9000 vs ISO
17025
EMPRESA
-Sistema de calidad (ISO 9000)
-productos
-personal
LABORATORIO
(ISO 17025)
CUERPOS DE
CERTIFICACIÓN
CUERPO DE
ACREDITACIÓN (ISO 17011)
Acreditación de
laboratorios
Acreditación de
cuerpos de
certificación para la
certificación de
productos, sistemas
de calidad y personal

ISO/IEC 17025 Requerimientos de gestión
• Organización y
• gestión
• Sistema de calidad
• Control de documentos
• Revisión de . . . Contractos
• Sub-contración de pruebas
•
• Compras de materiales
• Servicio al cliente
• Reclamaciones
• Control de pruebas de no
conformidad o de calibración
• Acciones correctivas
• Acciones preventivas
• Control de registros
• Auditorias internas
• Revisiones de gestión

ISO/IEC 17025 Requerimientos técnicos
• General
• Personal
• Instalaciones y Condiciones
Ambientales
• Métodos de
ensayo/Calibración y
métodos de validación
• Equipo
• Trazabilidad de las mediciones
• Muestreo
• Manejo de prueba y artículos
de calibración
• Aseguramiento de calidad de
los resultados de los ensayos
y de la calibración
• Reporte de los resultados

POLITICAS
EL LABORATORIO
SISTEMA DE CALIDAD
DOCUMENTACION
PROGRAMAS
SISTEMAS
INSTRUCTIVOS
PROCEDIMIENTOS
EL PERSONAL
debe establecer , implementar y mantener un
registrado en una
debe ser informado, disponer,
comprender e implementar el S de C
RESULTADOS
DE ENSAY/OCALIB.
Con la extensión
necesaria para asegurar los
de su

PROCEDIMIENTOS
CONTROLAR
DOCUMENTOS
Normas
Métodos de
ensayo
Métodos de
calibración
Diagramas
Software
Especificaciones
Instrucciones
Manuales
SISTEMA DE
CALIDAD
debe establecer y mantener
Con el fin de
que hacen parte del

Organizaciones Internacionales de
Acreditación
ILAC (International Laboratories
Accreditation Cooperation). Integra
organismos de acreditación de laboratorios
de 47 países.
IAF (International Accreditation Forum).
Integra organismos de acreditación de
entidades de certificación de 42 países.
ISO (International Organization for
Standardization). Desarrolla normas
internacionales.
IEC (International Electrotechnical
Commission). Normaliza en el campo
electrotécnico.

Importancia del control de calidad durante
el análisis microbiológico de los alimentos

Importancia del control de calidad durante el
análisis microbiológico de los alimentos

Practicas de Seguridad
• Dosis infectante
• Aerosoles
• Durante el manejo de este microorganismos es
obligatorio el uso de bata de laboratorio y guantes.
• Todas las superficies de trabajo deben desinfectarse
antes e inmediatamente después de su uso.
• Se recomienda usar una cabina de flujo laminar con
nivel de bioseguridad clase II

• El personal de laboratorio debe cumplir con las directrices de
seguridad del CDC para manipular agentes patógenos con un
nivel de bioseguridad clase II.
• Buenas practicas de laboratorio
• Precaución extrema durante la manipulación de agujas y otros
instrumentos afilados (sub-muestreo de alimentos).
• Acceso restringido al laboratorio.
• Control del flujo de aire.

Ejemplo de la planta de laboratorio
1) Balanza
2) Campana de flujo laminar o cabina de seguridad
3) Microscopio
4) Estufa de cultivo
5) Heladera con congelador
6) Congelador para mantenimiento de cepas de referencia a -70º Celsius.
7) Estufa de esterilización
8) Autoclave de descontaminación
9) Autoclave de esterilización
10) Estufa de secado
Sala de
lavado
Almacen Oficina
2
Sala de
preparación
de muestras
Sala de
preparación
de material
3 4
5 7
10.2
1
9
Sala de
siembra
Area de
acceso
restringido
8
6
10

• Cualquier trabajo que puede producir aerosoles de materiales
infecciosos debe hacerse dentro de un gabinete de seguridad
biológica.
• Materiales de desecho infecciosos deben ser
descontaminados (con desinfectantes químicos o por
autoclave).
• Uso de material automático (pipetas automáticas,
dispensadores, etc)
• Mínima manipulación de materiales punzo cortantes.
• Reglamento de acceso al laboratorio

• Manual de bioseguridad.
• Acceso de personal “necesario”.
• Agente patógeno se limita
normalmente a la cabina de
bioseguridad, refrigerador,
incubadora o congelador.
• Programar la entrada cuando no
hay trabajo activo con el agente
patógeno.
• Recipientes para material
peligroso.
Fuente: CDC

• Registro de derrames y accidentes (es importante
documentar).
• Programa de mantenimiento de las cabinas de seguridad.
• Desinfección externa del material que entrara a la cabina
de seguridad con alcohol al 70 % (contaminación
cruzada).
• Evitar generar corrientes de aire cercanas a la cabina de
seguridad.
• Cuidar de no bloquear o interferir con el flujo de aire de
través de la parte delantera o trasera rejillas.

MONITOREO AMBIENTAL
En el laboratorio de microbiología se debe evaluar:
• La calidad microbiológica del aire.
• La calidad microbiológica de las superficies.

Responsabilidades
• El supervisor de un laboratorio con nivel de bioseguridad
II debe ser un científico o profesionista competente que
tenga una comprensión técnica de los riesgos asociados
con los agentes microbiológicos en uso.
• El personal del laboratorio debe ser consciente de los
riesgos potenciales asociados con el trabajo y debe ser
competentes en las practicas especificada y en los
procedimientos

Factores que afectan los análisis
microbiológicos
• El personal
• Equipos
• Técnicas o procedimientos
• Materiales, medios de cultivo, reactivos,
estándares.
• Instalaciones y facilidades
• Muestreo
• Transporte
• Almacenamiento de las muestras
• Sub-muestreo

Operaciones críticas
• Las operaciones importantes a considerar en
microbiología son:
a) La preparación de los medios de cultivo y su esterilización
b) El procedimiento de siembra e incubación (incluye aquí la
temperatura como parámetro crítico)
c) Control de la calidad de los medios de cultivo.
d) Personal capacitado para la realización de cada actividad.
e) Lectura de placas
f) Validación de los métodos de ensayo.
g) Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo.
h) Monitoreo ambiental.

Factores que determinan la exactitud y
confiabilidad de los ensayos
• Los factores que determinan la exactitud y confiabilidad de los ensayos
realizados en el laboratorio se detallan a continuación:
– Factores humanos.
– Relativo a las instalaciones y condiciones ambientales.
– De los métodos de ensayo y validación de los métodos.
– De los equipos.
– De la trazabilidad de las mediciones.
– Del muestreo.
– Del manipulación de las muestras.
Estos factores contribuirán en diferente grado a la incertidumbre total de la
medición.
El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al desarrollar los métodos y
procedimientos del ensayo, en la capacitación y calificación del personal, así
como en la selección y calibración de equipos utilizados.

Personal
Calificación básica
Descripción de actividades y responsabilidades
CAPACITACION:
•Identificación de las
necesidades de formación
•Planificación de la formación.
•Realización de la formación
•Documentación.
PERSONAL DE
CONDUCCIÓN
PERSONAL
TÉCNICO
PERSONAL
TÉCNICO DE APOYO
Supervisión
adecuada
Relación de dependencia
LABORATORIO
COMPETENCIA TECNICA

Instalaciones y condiciones ambientales
LABORATORIO
Limpieza y orden
Separación de
áreas donde
se realizan
ensayos incompatibles
Plan de higiene
Monitoreo ambiental
Equipamiento necesario
Reglas de acceso
y utilización
de las áreas

Control de datos
• Adecuada revisión de los cálculos
y de la transmisión de datos.
• Trazabilidad
• Procedimientos para proteger los
datos
• Validación de los datos
informatizados.
• Almacenamiento de los datos
informatizados.

Equipos
LABORATORIO
Existencia de los equipos necesarios para la correcta ejecución del ensayo
Instrucciones de uso disponible
Programa de calibración, verificación
y mantenimiento
Procedimiento:
Identificación de equipos
Procedimiento:
Manejo de equipos no conformes
Una Carpeta para cada equipo
con los certificados de calibración
e historial del equipo
registros

Equipos en Microbiología
• Material de uso general: Material de vidrio o plástico
(Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.),
instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc.
• Estufas, autoclaves, baños termostáticos, heladeras,
congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de
filtración, etc.
• Equipos volumétricos como pipetas, distribuidores
automáticos, sembradores en espiral, etc.
• Instrumentos de medida: termómetros, cronómetros,
balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc.

Equipos
Deben estar:
• Mantenidos correctamente
• Inequívocamente identificados
• Calibrados
• Rotulados en cuanto a su estado de
calibración.

Microorganismos en
alimentos
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Microorganismos en
alimentos
50
250
1500
800 5000
20
10000

Probabilidad de aceptar un lote según porciento
de defectuosos
% 3 5 10 15 20 30 60 100
2 0 . 94 0 . 90 0 . 82 0 . 74 0 . 67 0 . 55 0 . 30 0 . 13
5 0 . 86 0 . 77 0 . 60 0 . 46 0 . 36 0 . 21 0 . 05 0 . 01
10 0 . 73 0 . 59 0 . 35 0 . 21 0 . 12 0 . 04  
20 0 . 51 0 . 33 0 . 11 0 . 04 0 . 01 
30 0 . 34 0 . 17 0 . 03  

Es necesario contar con un
PLAN DE MUESTREO para
incrementar la sensibilidad,
representatividad y confiabilidad
de los resultados

Plan de muestreo incluye:
• Definición del alimento a analiza
• Por que analizar el producto
• Selección de muestras
representativas
• Tipo de microorganismos a detectar
• Formulación del plan de muestreo.

Muestreo para Salmonella
(Agricultura)
• Planes de Muestreo.
• Determinado por la normativa interna.
• Determinado por la normativa del país
importador, depende del tipo de alimento
(carne, pollo, huevo, frutas y verduras)
• Muestreo en planta; por lo menos 12
contenedores y no mas de 32
• Muestreo a detalle?

Muestreo para Salmonella (FDA)
• Envases originales.
•Condiciones asépticas y material estéril.
•Incluir controles.
•Recolectar al menos 100 g por muestra.
• Transportar en refrigeración (0-4ºC) en
hielo o en equipo refrigerante
• Las muestras congeladas deben
transportarse bajo congelación.

Muestreo para Salmonella
(FDA)
• Mantener alimentos fríos, no mas de 36 h
bajo refrigeración.
•Bivalvos máximo 6 h en refrigeración.
•Cuantas muestras?
•Unidad de muestra?
•El numero de unidades de muestra
depende de la categoría del alimento
(FDA)

Categoría de alimentos (FDA)
• Alimentos Categoría I. - Alimentos que
normalmente no se someten a un proceso letal para
Salmonella, entre el momento de la toma de muestras y
el consumo y son alimentos destinados para el consumo
de los ancianos, los enfermos, y los lactantes.
•Alimentos Categoría II. - Alimentos que
normalmente no se someten a un proceso letal para
el consumo.
•Alimentos Categoría III. Alimentos que
normalmente SI se someten a un proceso letal para
el consumo.

Numero de muestras a
recolectar según Categoría de
alimentos
• Alimentos Categoría I: 60 unidades de
Muestra.
•Alimentos Categoría II. 30 unidades de
Muestra.
•Alimentos Categoría III. 15 unidades de
Muestra.

Análisis de Unidades de
Muestra
• De cada unidad de muestra (UM) se
analizarán en el laboratorio 25 g, así el
tamaño de muestra a analizar según
categoría será: 1500, 750 o 375 g para la
categoría I, II o III, respectivamente.
UM consiste en un mínimo de 100 g.
• Ejemplo:
•Numero y peso de las UM es correcto: Alimentos clase III,
15 unidades de muestra han llegado al laboratorio; de cada
una se toma 25 g para el análisis de Salmonella

Consideraciones
• Transporte.
• Equipo y material.
• Recepción de muestras.
• Descongelación.
• Mezclado.
• Pesado.
• Mezcla y dilución de muestras que requieren el
recuento de microorganismos.

Diagrama de flujo de manipulación de las muestras
Muestreo
Transporte
Conformidad de las
condiciones de recepción
de las muestras
Apertura de PE
Si
No
Recepción e identificación de las muestras
Acuerdo de
procesamiento
de las muestras
Si
No
Comunicarse con el cliente
Rechazo de la muestra
Almacenamiento
Realización del ensayo
Emisión del informe de ensayo
Disposición final de las
muestras

Incorporación de agar*
Recolección y transporte de muestra
Preparación y análisis de muestra
Conteo de colonias
Inoculación en cajas
Indicadores
Preparación de alícuotas
Bioquímicas
Serología
Aislamiento en medios selectivos
Preenriquecimiento
Enriquecimiento
Procedimiento general para microorganismos
indicadores y patógenos
Patógenos

Algunos microorganismo Indicadores
de Higiene en Alimentos
• Bacterias Mesófilas Aerobias (BMA)
• Organismos Coliformes Totales (OC)
• Organismos Coliformes Fecales (CF)
• Staphylococcus aureus
• Familia Enterobacteriaceae

Preparación y análisis de la muestra
Distribución del material de análisis

obtención de la alícuota de dilución

Agitación de tubos

inoculación de las cajas de cultivo

Adición del medio de cultivo

Factores a considerar respecto al
medio de cultivo
• Temperatura del medio de cultivo (42-46°C).
• Baño de agua para mantenimiento.
• Tiempo de estancia en baño de agua.

Conteo de colonias

Coliformes

Otros microorganismos
Escherichia coli Staphylococcus aureus

Carne cruda USDA/FSIS MLG
4.03
25 g carne + 225 mLAPB
10 mL Caldo mRV 10 mL Caldo Tetrationato (CT)
100 μL 500 μL
22-24 h / 42° ± 0.5 °C
DMLIA o XLT4 y BGS
TSI, LIA
18-24 h / 35° ± 2 °C
Antisueros polivalente O, específicos (A-I), H
Stomacher
20-24 h / 35° ± 2 °C
Bioquímicas: Vitex, API-20E, Edwards y Ewing's , etc

Análisis de alimentos procesados
Bacteriological analytical manual (BAM)
Pre-enriquecimiento: variación del caldo
usado según grupo o tipo de alimento
*ASB, XLD, HE
TSI, LIA y Urea
18-24 h / 35° ± 2 °C
Antisueros polivalentes (A-I), específicos
Preparación de la muestra:
varia según grupo o tipo de alimento
Caldo CT y RV: RV debe prepararse
a partir de ingredientes
Goma arábiga
CSC
Preparar un día antes
y a tem ambiente
en la oscuridad
43° y 42° ± 0.2 °C

Métodos de aislamiento
Colonias típicas sobre medios selectivos
• Pruebas bioquímicas
• Exámenes Serológicos
–Polivalente O
–Serogrupo y serotípos

Control de calidad
MEDIOS DE CULTIVO Y
REACTIVOS

Control
• 1. Preparación de medios de cultivo y
reactivos.
• 2. Control de esterilidad de los medios de
cultivo y diluyentes.
• 3. Evaluación de la calidad de los medios
de cultivo:
• Norma ISO/TS 11133-2:2000

REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los medios de cultivo
y reactivos sea
apropiada
para los ensayos realizados.
Este es un punto crítico.
¿Cómo se asegura su calidad?

¿Qué necesita un
microorganismo para crecer?
• 1. Medios de cultivo:
• Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la
• reproducción y la identificación de los microorganismos.
• ☺Contienen sustancias nutritivas
• ☺pH adecuado
• ☺Deben estar estériles.
• 2. Incubación:
• Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.
• ☺La atmósfera empleada.(aerobio, microaerofílico,
• anaerobio)
• ☺Tiempo.
• ☺Temperatura.

Medios de cultivos
Clasificación de medios de cultivo:
• 1.Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos.
• 2.Según su finalidad en microbiología:
• 􀀩No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para
soportar
• el crecimiento de gran variedad de microorganismos.
• 􀀩Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de
• microorganismo.
• 􀀩Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega
sustancias
• como ser sangre, suero, albúmina, etc... Para microorganismos
exigentes.
• 􀀩Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer
• diferencias entre diferentes tipos microorganismos.

Medios de cultivo
Los requerimientos de los medios de cultivo
son específicos de :
• La muestra que se analiza.
• De los microorganismos a ser detectados.

Los medios de cultivo se preparan:
1. En el laboratorio a partir de sus diferentes
componentes.
2. A partir de productos en polvo deshidratados
comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.
Se puede tomar como base el documento
ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding
stuff-General rules for microbiological examinations para:
-La preparación y esterilización de medios.
-Tiempos de almacenamiento recomendados.

Requisitos de los medio de cultivo
provistos por el fabricante:
• Los lotes de medios deben estar
debidamente identificados.
• Cada lote recibido debe ir acompañado de
evidencias del cumplimiento de las
especificaciones de calidad.

REQUISITO:
• El fabricante en el momento de la
entrega de medio de cultivo debe
proveer información acerca de las
especificaciones de calidad, como
mínimo debe incluir lo siguiente:
• Nombre del medio y lista de
componentes, incluido cualquier
suplemento.
• Fecha de vencimiento del medio.
• Condiciones de almacenamiento.
• Control de esterilidad.
• Control del crecimiento de los
microorganismos de interés (target) y
de los microorganismos no deseados
(no target) y criterios de aceptabilidad.
• Controles físicos y criterios de
aceptabilidad aplicados.
• Fecha de emisión de las
especificaciones

Manejo de los medios de cultivo:
• 1. El laboratorio debe registrar la fecha:
– de recepción
– de apertura del envase.
– de caducidad
• 2. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones apropiadas.
– Envases: deben estar herméticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)
– No deben utilizarse medios deshidratados que
– presenten apelmazamiento o un cambio de color.

Control de calidad del agua
destilada
• Controles periódicos:
• Requisitos del agua destilada:
– Conductividad.
– pH
– Contaminación microbiana
– Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes.
– Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
Para la preparación de medios, soluciones y tampones,
debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles periódicos que aseguren su calidad.

Calidad del agua destilada
(siembre y cuando sea el mismo lote de agua)
• Examen diario (o previo a su uso):
– Resistencia a 25ºC: >1.0 megohms-cm ó Conductividad a 25°C:
<1.0 microSiemens-cm.
• Examen mensual:
– Cloro residual total: < 0.1 mg/l
– Bacterias Mesofila aerobias < 1,000 UFC/mL
• Examen anual:
– Metales pesados (Cd, Cr, Cu, Ni, Pb y Zn): < 0.05 mg/L de cada
metal
– Metales pesados totales: < 1.0 mg/L
– Examen de toxicidad: negativo

Procedimiento para preparación de medios
de cultivo, diluyentes y reactivos
• En dicho procedimiento debe haber una descripción del
equipamiento necesario.
• El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificación y
otros datos en los medios de cultivo y reactivos.
• Debe haber un registro de preparación de medios de cultivo y
reactivos.
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben
prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un
procedimiento documentado.

Almacenamiento de los medios de cultivo y
diluyentes preparados:
En general los medios preparados se guardan:
• En refrigeración no más de tres meses
• A temperatura ambiente no más de un mes en
condiciones que impidan que su composición sea
modificada.
Observar cambio del color, evaporación, la deshidratación
ó el crecimiento microbiano.
Debe determinarse y verificarse
el período de validez de los medios preparados
en las condiciones de conservación especificadas.

REQUISITOS
Medios preparados por el laboratorio:
• Recuperación o supervivencia de los microorganismos de
interés.(Productividad)
• Inhibición o supresión de los microorganismos no deseados.(Selectividad)
• Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
• Propiedades físicas (por ejemplo, pH, volumen).
• Sea estéril.
Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los
medios de cultivo y diluyentes preparados por el
laboratorio tengan las características adecuadas con
respecto a:

Medio de cultivo:
Parámetros a tener en cuenta para obtener un
buen resultado.
• Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser inerte.
• pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M NaOH o 1M
CLH
• fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.
• 15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.
• Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo laminar.
• Incubación: las pilas de platos < 6.

Medios listos para su uso:
• La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
• La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene
que ser cuantitativa.
• Los atributos (por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas).
Parte de esa validación es provista por las especificaciones de calidad
del proveedor.
Todos los medios y diluyentes que se suministren en una
forma directamente utilizable o parcialmente completa
deben ser validados antes de su utilización.
Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto
a:

Reactivos
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.
Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioquímicas
Realizo controles positivo y negativo utilizando
microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas

Control de las pérdidas de volumen
durante la esterilización:
Debe verificarse que no haya pérdidas significativas de
volumen de los diluyentes volumen de los diluyentes durante
el proceso de durante el proceso de esterilización en
autoclave.
Este punto es especialmente importante en métodos
cuantitativos.
El laboratorio debe tener :
• Un procedimiento documentado.
• Registro de datos obtenidos realizados en forma periódica.
El laboratorio determina el intervalo
en el que se efectúan estos controles.

Control de las pérdidas de volumen
durante la esterilización
Para la evaluación de la pérdida de volumen de los
diluyentes:
– Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo o
frascos de dilución.
– Medir el peso o volumen antes y después del proceso de
esterilización en autoclave.
– Con los datos obtenidos, se efectúa el cálculo y la inferencia
estadística.

LAVADO DE MATERIAL:
Pasos:
• Descontaminación material de vidrio.
• Enjuague y se lavado con agua caliente y extran neutro
(diluido al 2%)
• Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un nº
de veces con agua destilada. Eliminar el detergente
• El material se seca en estufa y se acondiciona para ser
esterilizado
Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto
lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un instructivo instructivo
para esta tarea

Eliminación de los reactivos:
Si bien la eliminación adecuada de los reactivos no es
un problema que afecte directamente a la calidad.
DEBE REALIZARSE DE ACUERDO CON LA
NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA DE MEDIO
AMBIENTE, SALUD Y SEGURIDAD.
Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo
sustancias tóxicas se especificarán claramente en cada
caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Control de esterilidad
de los medios de cultivo y diluyentes:
• La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba se
corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo.
• Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del
comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o distribuir
los medios o diluyentes.
• Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un
lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se esteriliza
por filtración.
¿ Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios
de cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.

Datos a registrar:
• Fecha de realización del control
• Medio de cultivo o diluyente
• Indicación del proceso de
esterilización (Ejemplo N º
correlativo de proceso en
autoclave o filtración)
• Tiempo de incubación (en
horas)
• Temperatura de incubación (º C)
• Resultado
• Conforme (SI o NO)
• Firma del personal responsable de
la realización del control.
Registro control de
esterilidad de
medios de cultivo y
reactivos

Resumen parcial
• La preparación y esterilización de medios de cultivo y diluyentes
• La preparación de reactivos
• Control de calidad del agua destilada.
• Lavado de material
• Control de las pérdidas de volumen de los diluyentes durante la
esterilización en especial para métodos cuantitativos.
En microbiología se le da especial énfasis a la calidad de los medios de cultivo
y reactivos, tal que aquella sea apropiada para los ensayos realizados.
La preparación y esterilización constituyen pasos críticos en el logro de este
objetivo.
El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo debe proveer
información acerca de las especificaciones de calidad.
El laboratorio debe contar con Procedimientos o Instructivos documentados e
implementado para:

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Productividad:
Definición:
Rendimiento, recuperación, crecimiento de un
microorganismo que se espera que desarrolle en el
medio de cultivo.
Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad (ver anexo
B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

Selectividad:
Definición:
La supresión del crecimiento de un microorganismo
que se espera sea inhibido en el medio de cultivo.
Según el medio se usa una cepa apropiada de referencia
no-target para evaluar la selectividad (ver anexo B de la
norma ISO/TS 11133-2:2000).

En medios selectivos y/o diferenciales
se evalúa:
• El crecimiento de las cepas target (CONTROL
POSITIVO)
• La apariencia, tamaño y morfología de las
colonias (especificidad)
• El crecimiento de las cepas no-target
(CONTROL NEGATIVO) debe estar en parte o
completamente inhibido.

MEDIO DE CULTIVO PARA EVALUAR CADA LOTE DE
según Norma ISO/TS 11133-2:2000
SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MÉTODOS:
• a) Pruebas cuantitativas
• b) Pruebas semi-cuantitativas
• c) Pruebas cualitativas

Uso de cepas de referencia
Empleo de cepas de referencia durante la
realización del ensayo como:
– Control positivo, negativo.
– Muestras inoculadas para control.
– Control de productividad y selectividad de los medios
de cultivos usados.
– El uso de materiales de referencia (incluidos los
materiales utilizados en Ensayos de aptitud)

Control de calidad de medios de cultivo
• Productividad
• Selectividad

Métodos para evaluar
Productividad/selectividad
de medios de cultivo
• Cuantitativos
• Semi-cuantitativos
• Cualitativos

Productividad. Cuantitativo (Vertido en placa)
Cepa de trabajo (target)
CST 35°C/18- 24 h
Ns:Total tal de bacterias en el medio problema
No: total de bacterias en el medio de referencia
PR= ≥0.7 No selectivos y de ≥ 0.1 selectivos
Medio de referencia
PR=
Diluciones decimales: 102 UFC/mL
Medio de prueba
Ns
NO
1 mL 1 mL
Adición de medio de cultivo
Incubación
PR

Productividad Oxford Cuantitativo (Vertido en placa)
L. monocytogenes ATCC 19111
CST 35°C/18- 24 h
PR= ≥0.5
Oxford
PR=
AST
Ns
NO
1 mL 1 mL
Incubación
PR

Productividad. Cuantitativo (Siembra en superficie)
Cepa de trabajo (target)
CST 35°C/18- 24 h
PR= ≥0.7 No selectivos y de ≥ 0.1 selectivos
Medio de referencia
PR=
Medio de prueba
Ns
NO
0.1 mL 0.1 mL
Incubación
PR

Productividad Baird Parker Cuantitativo
S. aureus ATCC 6538
CST 35°C/18- 24 h
PR= ≥0.5
Baird Parker
PR=
AST
Ns
NO
Incubación
PR
0.1 mL 0.1 mL

Selectividad. Cuantitativo (Siembra en superficie)
Cepa de trabajo (No-target)
CST 35°C/18- 24 h
Do: es la mayor dilución que muestra el crecimiento de al menos 10 colonias en el medio de referencia
Ds: es la mayor dilución que muestra el crecimiento comparable en el medio de ensayo
SF= ≥2
Medio de referencia
SF= Do – Ds (valor en Log10)
Diluciones decimales: 105 -107 UFC/mL
Medio de prueba
0.1 mL 0.1 mL
Incubación
SF

Selectividad. Cualitativo (Siembra en superficie)
Cepa de trabajo (No-target)
CST 35°C/18- 24 h
Diluciones decimales: 105 -107 UFC/mL
Medio de prueba
0.1 mL
Incubación
No desarrollo

Semi-cuantitativo (ecométrico)
1
2
3
4
5
6
7
8
A
B
C
12
11
10
9
D
16
14
1
3
15
3
1
Estriar con asa calibrada (1μL)
Cepa de trabajo (target oNo-
target) CST 35°C/18- 24 h
Diluciones decimales:
106 UFC/mL
30°
20°

Cálculos
• Después de la incubación, se evalúa la apariencia y tamaño de las colonias
y la intensidad de crecimiento. Y se calcula el índice de crecimiento (GI).
Cada línea o estría que presenta crecimiento se califica con 1.
• La puntuación máxima por cada caja de cultivo es de 16.
• Se da un valor de 0.5 cuando el crecimiento sólo se produce en la mitad de
la línea o estría.
• Un escaso crecimiento en la línea (menos de la mitad de la longitud) o no
crecimiento de colonias, se califica como 0.
• Los resultados se suman para obtener el GI. Por ejemplo, si el crecimiento
se obtuvo en los sectores A y B y en la mitad del sector C, la GI será de 10
A= 4; B=4; C=2
G1=4+4+2= 10

Límites
Productividad
• Medios no selectivos y Selectivos con cepas target:
GI ≥ 6
Selectividad
• Medios selectivos; cepas No target:
Parcial o completamente inhibida

Cualitativo
106 UFC/mL

Cualitativo
106 UFC/mL
0 corresponde a uno desarrollo
1 corresponde a un débil crecimiento
2 corresponde a un buen crecimiento.
Cepas target =2; apariencia, tamaño y morfología. Colonia típica.
Cepas No targer= 0 o 1; desarrollo parcial o totalmente inhibido

Medios líquidos
• Cuantitativos
• Semi-cuantitativo
• Cualitativo

Productividad (Cuantitativo)
Cepa de trabajo (CST 35°C/18- 24h)
Ns: total en el medio problema
PR= ≥ 0.7 No selectivos y de ≥ 0.1 selectivos
Medio de cst
PR
Cepa de trabajo
Medio de prueba
Incubación. Si hay estándar lo que marca el estándar
y si no 45 min a 22-25°C

Productividad (Cuantitativo) Caldos no selectivos
Cepa de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)
PR0. ≥ 7 No selectivos
Medio de referencia
Incubación. Si hay estándar lo que marca el estándar
Cepa target
Diluciones decimales: 102-103 UFC/mL
Medio de prueba
10 mL 10 mL
1 mL 1 mL

Productividad (Cuantitativo). Caldos selectivos. Cultivo
mixto.
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)
Medio de referencia
Cepa target y No target
Diluciones decimales: target 103 UFC y No target >104 UFC/mL
Medio de prueba
10 mL 10 mL
Mezcla de las dos cepa
1 mL 1 mL
Incubación Si hay estándar lo que marca el estándar
Recuento en medio de cultivo: Medio selectivo
Mayor concentración de la targer

Productividad (Cuantitativo). Diluyentes y medios de
transporte (MT)
Medio de referencia
Incubar: Diluyente 45 min; MT en de trabajo
Target y No target
Diluciones decimales; Target: 1000 UFC/mL. No targer >104 UFC/mL
Medio de prueba
10 mL 10 mL
1 mL 1 mL
Recuento en medio de cultivo: Medio no selectivo
Diferencia máxima 50%

Selectividad (Cuantitativo). Caldos selectivos
Medio de referencia
Cepa No target
Diluciones decimales: >104 UFC/mL
Medio de prueba
10 mL 10 mL
1 mL 1 mL
SF = 2
Incubación Si hay estándar lo que marca el estándar

Medios líquidos
• Evaluación Semi-cuantitativa

Productividad (Semi-cuantitativo)
Medio de prueba
10 mL
Incubación
Cepa target
Diluciones decimales: 103 UFC
Lectura de los tubos
1 mL

Productividad (Semi-cuantitativo). Caldo EC
10 mL
44.5° / 24-48 h
E. coli ATCC 25922
Diluciones decimales: 103 UFC
Producción de gas y turbidez
Caldo EC
1 mL

Caldo Fraser. Evaluación Semi-cuantitativa
10 mL
37°C/48 h
L. monocytogenes
Siembra en Oxford
por estría
Caldo Fraser
1 mL
Productividad
E. coli ATCC 25922
10 μL
>10 UFC típicas
Caldo Fraser
10 mL
1 mL
37°C/48 h
Siembra en AST
por estría
10 μL
Completa inhibición ó < 10 UFC
Selectividad

Caldo Rappaport. Semi-cuantitativa
10 mL
42°C/24 h
S. Typhimurium ATCC14028
Siembra en Agar Verde
Brillante por estría
Caldo Rappaport
1 mL
Productividad
E. coli ATCC 25922
10 μL
>10 UFC típicas
Caldo Rappaport
10 mL
1 mL
42°C/24 h
Siembra en AST
por estría
10 μL
Completa inhibición ó < 10 UFC
Selectividad

Medios líquidos
• Evaluación Cualitativa

Evaluación Cualitativa
10 mL
Incubar
target
Asada (1 μL)
Turbidez:
- no turbidez: 0
-escasa turbidez: 1
-Alta turbidez: 2
Caldo a evaluar
Productividad
No target
Turbidez: 1 a 2
Caldo a evaluar
10 mL
Incubar
No turbidez
Selectividad
Asada (1 μL)

Evaluación Cualitativa. Productividad
Caldo BHI
10 mL
37°C / 24 h
S. aureus ATCC 25923
Asada (1 μL)
BHI
Turbidez: 1 a 2

Evaluación cualitativa. Selectividad
Caldo EC
Caldo EC
10 mL
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24h)
Pseudomonas aeruginosas ATCC 27853
No turbidez ni gas
Un solo tubo
44.5° / 24-48 h
Asada (1 μL)

Evaluación de antimicrobianos en
materiales de vidrio y plástico y control de
calidad de medios de cultivo

Toxicidad o residuos antimicrobianos en
materiales
Cajas de cultivo
6 cajas
“Normalmente” lavadas
A
6 cajas
normalmente lavadas
y con 12 enjuagues
B
6 cajas
Lavadas con agua de
detergente y dejar secar
C
6 cajas
De Plástico desechables
D
Esterilizar
3 cajas con102 y 3 con 103 UFC/caja
Medio de cultivo Incubación

Interpretación de los resultados
• Si no hay efecto tóxicos o inhibitorio, la diferencia entre
los promedios de los conteos de las cajas de los grupos
A-D debe ser inferior al 15%.
• La diferencia en el conteo promedio menor al 15% entre
los grupos A y B, pero superior al 15% entre los grupos
B y C indican que el detergente de limpieza tiene
propiedades inhibidoras que se eliminan con el lavado
de rutina.
• Una diferencia entre B y D superior al 15% indican la
presencia de un residuo inhibidor.

¿Y el procedimiento para determinar
toxicidad del agua destilada?

Otros medios materiales a evaluar
• Medios para pruebas bioquímicas
– Metodología especificada por el productor o en los
estándares (microbiología médica)
• Antibióticos. Metodología especificada por el
productor o en los estándares (microbiología
médica)

Ensayos intralaboratorios
y
Ensayos interlaboratorios

Objetivos
• Ensayos intralaboratorios
– Ensayos microbiológicos cualitativos y cuantitativos.
– Evaluación e interpretación de los resultados.
– Utilidad de los resultados del Ensayo Intralaboratorio.
• Ensayos interlaboratorios:
– Ensayos microbiológicos cualitativos y cuantitativos.
– Evaluación e interpretación de los resultados.
– Utilidad de los resultados del Ensayo Interlaboratorio.
– Proveedores de Ensayos Interlaboratorios.
– Gráficos de control.

Aseguramiento de la calidad
de los resultados
CONTROLES DE CALIDAD: Son las actividades que se deben
realizar para todos los ensayos acreditados.
Comprenden:
1. Control de calidad interno: Un programa de controles periódicos
es necesario para demostrar que se controla la variabilidad (por
ejemplo, entre analistas y entre equipos o materiales, etc.).
• Uso de cepas de referencia.
• Participación en Ensayos Intralaboratorio.
2. Control de calidad externo:
• Participación en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (“Proficiency
Testing”)

Control de calidad interno:
• El control de calidad interno consiste en todos
los procedimientos realizados por un laboratorio
para la evaluación continua de su trabajo.
• El principal objetivo es asegurar la coherencia
de los resultados obtenidos diariamente y el
cumplimiento de los criterios establecidos.

Ensayos intralaboratorio:
Métodos cuantitativos:
Se comparan los resultados obtenidos :
• Por cada analista perteneciente al laboratorio que
realiza por duplicado el análisis de la muestra.
(repetibilidad de cada analista).
• Entre analistas del mismo laboratorio para un ensayo
(reproducibilidad entre analistas)
Son las verificaciones de calidad para evaluar el
desempeño de los analistas del laboratorio en
un ensayo.

Definiciones:
Ensayos Cuantitativos
• Es un método de análisis cuyo respuesta es el
recuento del analito medido en forma directa (la
enumeración por masa o volumen), o
indirectamente (el absorbancia del color, la
impedancia, etc.) en una cierta cantidad de
muestra.
(prEN ISO 16140:1999)

Ensayos intralaboratorio:
Métodos cualitativos:
Se comparan los resultados obtenidos :
• Entre analistas del mismo laboratorio para un
ensayo:
– Recuperación de un microorganismo a partir
de un material de referencia.

Definiciones:
Ensayos Cualitativos
• Es un método de análisis cuyo respuesta es la
presencia o ausencia del analito detectado
directamente o indirectamente en una cierta
cantidad de muestra.
( prEN ISO 16140:1999)

Participación en ensayos Intralaboratorio:
• Cualitativos: verificando que los resultados entre
analistas sean concordantes y conformes.
• Cuantitativos: determinando los parámetros de
precisión.
• Determina la Repetibilidad: El análisis por duplicado de una
misma muestra por los distintos analistas (autorizados o en
vías de autorización) que realizan el ensayo.
• Determina la Reproducibilidad:Los recuentos cruzados entre
analistas o con métodos diferentes, etc.
El laboratorio, en forma periódica, planifica, realiza, evalúa
y verifica que estén bajo control los resultados de los
ensayos:

Definición: Repetibilidad (r).
Las mismas condiciones significa resultados obtenidos:
• Con el mismo método de ensayo.
• Sobre el mismo material de ensayo.
• Bajo las mismas condiciones
(mismo operador, mismos equipos, mismo laboratorio y un
corto intervalo de tiempo).
•Grado de concordancia entre los resultados de
sucesivas mediciones del mismo mesurando
realizadas en las mismas condiciones de medición.

Definición: Reproducibilidad (R).
• Resultados obtenidos con diferentes métodos de ensayo o equipos
(reproducibilidad entre métodos)
• Resultados obtenidos con diferentes operadores o analistas
(reproducibilidad entre analistas)
• Resultados obtenidos por diferentes laboratorios (reproducibilidad entre
laboratorios)
• Resultados obtenidos en diferente tiempo.
Grado de concordancia entre los resultados de
sucesivas mediciones del mismo mesurando
realizadas en diferentes condiciones de medición.
El ensayo se realiza sobre el mismo material de ensayo
pero en diferentes condiciones.
Esto es:

Ensayos intralaboratorios
Incubación
Tiempo y temperatura según
la metodología empleada
Incubación
Tiempo y temperatura según
la metodología empleada
Resultado 1 Resultado 2
Comparar

El valor límite máximo de r y R para un
ensayo, para una matriz se pueden obtener a
partir de:
• Estudios de validación o análisis de los
resultados obtenidos en interlaboratorios,
• Norma o de la bibliografía.

Ensayos cuantitativos:
Determino la repetibilidad de cada analista y la repetibilidad del
laboratorio.
El análisis por duplicado de una misma muestra por los distintos
analistas que realizan el ensayo.
Ejemplo:
El analista A ensayó, con la metodología Z, una muestra de un
alimento por duplicado.
Los resultados obtenidos fueron:
x1= 2.0x103 ufc/g y
x2=1.5x103 ufc/g.
Los resultados se pasan a logaritmo en base 10:
log 10 x1 =3.30 log ufc/g y log 10x2=3.18 log ufc/g

Ensayos Cuantitativos (cont):
Ejemplo:
El valor de repetibilidad (r) obtenido por el analista A será:
r = │ log 10 x1 - log 10x2│
r =0.12 log ufc/g
El valor límite máximo de repetibilidad
para la metodología Z es r =0.18 log ufc/g
Lo cual quiere decir: La repetibilidad del analista A es conforme.

Registro de los datos obtenidos:
PR 8.1/4
Pág.____ de ____
Ensayos cuantitativos: Planilla individual de cada analista
Ensayos Intralaboratorio
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Ensayo:
Matriz:
Analista:
Identificación
de las
Muestras
Fecha de
análisis de
las
muestras
Metodología
Resultad
o 1
(unidade
s)
Resultado
2
(unidades)
log Resultado 1
(log 10
unidades)
log
Resultado 2
(log 10
unidades)
R del
analista
Clasificación
obtenida
Conforme
/no conforme
Firma del
responsable
Valores límites máximos establecidos para:
r (log 10 unidades):
NOTA: el valor de r se obtiene de restar “log10 Resultado 1” con el “log10 Resultado 2”.

Determinación de la reproducibilidad:
Los recuentos cruzados entre analistas o con métodos
diferentes, etc.
Ejemplo:
El analista B y C ensayaron, con la metodología Y, una
muestra de un alimento.
Los resultados obtenidos fueron:
xB= 2.4x102 NMP/g y
xC= 1.1x103 NMP/g.
Los resultados se pasan a logaritmo en base 10:
log 10 xB =2.38 log NMP/g y
log 10 xC =3.04 log NMP/g

Determinación de la
reproducibilidad (cont.):
El valor de reproducibilidad (R) obtenido entre el
analista B y C será:
El valor límite máximo de reproducibilidad
para la metodología Y es
R =0.50 log NMP/g
En este caso el responsable asignado deberá abrir una
NO CONFORMIDAD y se determinarán sus
correspondientes acciones correctivas.
R = │ log 10 xB - log 10 xC │
R =0.66 log NMP/g

Registro de los datos obtenidos:
PR 8.1/6
Pág.____ de ____
Ensayos cuantitativos: Planilla reproducibilidad entre metodologías
Ensayos Intralaboratorio
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Ensayo:
Matriz:
Identificación
de las Muestras
Fecha de
análisis de
las
muestras
Analista
Metodología
1
Metodología
2
log Resultado
Metodología 1
log Resultado
Metodología 2
R entre
Metodología
Clasificación
obtenida
Conforme
/no conforme
Firma del
responsable
Valores límites máximos establecidos para:
R (log 10 unidades):
NOTA: el valor de R se obtiene de restar “log10 Resultado Metodología 1” con el “log10
Resultado Metodología 2” para la misma muestra y el mismo analista.

Resumen Parcial
•Control de calidad interno: consiste en todos los
procedimientos realizados por un laboratorio para la
evaluación continua de su trabajo.
•El principal objetivo es asegurar la coherencia de los
resultados obtenidos diariamente y el cumplimiento de los
criterios establecidos.
•Para los ensayos Cualitativos se verifica que los resultados
entre analistas sean concordantes y conformes.
•Y para los Cuantitativos determina la Repetibilidad y la
Reproducibilidad entre analistas.
•Empleo de cepas de referencia durante la realización del
ensayo.

Aseguramiento de la calidad de los
resultados
Los controles de calidad internos no son
suficientes.
No puedo determinar mediante ellos el
Valor verdadero!!
Realizo un Control de calidad externo.

Definiciones:
•Valor verdadero : valor en consistencia con la definición
de una magnitud (concepto abstracto, no realizable).
•Valor asignado o valor de referencia: es el valor
convencionalmente verdadero.
•Exactitud de una medición: Proximidad entre el
resultado de una medición y el valor verdadero del
mensurando.

Exactitud de una medición:
Cálculo del valor de referencia o valor asignado:
Uso un material de referencia certificado.
Casi nunca son estos los casos en ensayos
microbiológicos.
Se considera que el valor medio obtenido por el
conjunto de laboratorios luego de eliminar los outliers en
el propio ejercicio puede utilizarse como valor de
referencia o valor verdadero.

Ensayos de Aptitud Interlaboratorio
(“Proficiency Testing”) :
Los programas de ensayos de aptitud organizados
externamente por un proveedor de ensayos
interlaboratorio.
Constituyen un medio independiente por el cual un
laboratorio se puede evaluar objetivamente y demostrar
la veracidad y precisión de los resultados obtenidos por
sus métodos analíticos.

Constituye una herramienta para la evaluación externa
de la calidad de los resultados de ensayo o desempeño
del laboratorio.
La participación en estos ensayos permite al
laboratorio comparar sus resultados frente a los de
otros laboratorios.
Es importante evaluar los resultados obtenidos en los
ensayos de aptitud como una manera de comprobar la
calidad de los ensayos, adoptando las medidas
oportunas, si son necesarias.

•La organización proveedora de Ensayos de Aptitud
Interlaboratorio envía muestras cuyo contenido en tipo y
número de microorganismos es desconocido por el
participante.
•El laboratorio participante las analiza y remite los
resultados obtenidos al organizador, posteriormente
recibe un informe con sus análisis y evaluaciones.
•ISO/DIS 13528 Statistical methods for use in proficiency
testing by interlaboratory comparisons.

Ensayos de
Aptitud
Interlaboratorio
Métodos
cualitativos
(“Proficiency
Testing”) :

Métodos cuantitativos (“Proficiency Testing”) :
STAPHYLOCOCCUS aureus - cereal
Z-score-2=5257ufc/g valor asignado=21000ufc/g Z-
score+2=83891ufc/g

Métodos cuantitativos (“Proficiency Testing”) :

Métodos cuantitativos (“Proficiency
Testing”):
Valor de Z-score: Clasificación
lzl<2 Satisfactorio
2 < lzl < 3 Cuestionable
lzl >3 Insatisfactorio

Ensayos interlaboratorios
•Los laboratorios deben participar regularmente en
ensayos de aptitud relacionados con el alcance de su
acreditación, dando preferencia a los programas de
ensayos de aptitud que utilicen matrices apropiadas.
•Los laboratorios no sólo deben usar la valoración de
calidad externa para evaluar el “bias” o sesgo del
laboratorio sino también para verificar la validez del
sistema de calidad entero.

(“Proficiency Testing”):
Los resultados de los laboratorios participantes de una
ronda interlaboratorio se clasifican, dependiendo del
método estadístico usado, para evaluar los resultados
en:
• Satisfactorios e insatisfactorios
(Ejemplo: ensayos cualitativos y D-score) o
•Satisfactorios, cuestionables e insatisfactorios
(Ejemplo: Z-score).

Registro Ensayos de Aptitud Interlaboratorio
Ensayos cualitativos
Ensayo:
Matriz:
Proveedor del
Ensayo
Interlaboratorio
Identificación
de las Muestras
Fecha de
análisis de
las
muestras Analista
Metodología
usada por el
laboratorio
Resultado
obtenido
por el laboratorio
Valor asignado
Clasificación
obtenida
Conforme
/no conforme
Firma del
responsable

Proveedores de Ensayos de Aptitud
Interlaboratorio (“proficiency testing”):
Lo ideal es que estén acreditados por ISO 43.
Algunos de ellos figuran a continuación:
 QM Quality Management Limited. UK
 AOAC Laboratory Proficiency Testing Program USA.
 RAEMA Réseau d´Analyses et d´Echanges en Microbiologie
des Aliments. Francia
 INTI Instituto Nacional de Tecnología Industrial. Argentina.
 SVM Foundation for the Advancement of Public and
Environmental Protection The Netherlands

Cuando los resultados de los
ensayos NO resultan dentro
del intervalo de conformidad o
se visualice una tendencia determinada
tomar respectivamente
acciones correctivas o preventivas,
siguiendo los lineamientos establecidos
en el Procedimiento
“Reclamos, sugerencias, no conformidades,
acciones correctivas y acciones preventivas”.

¿ Qué hago cuando el resultado del control de calidad
es no conforme?
• Análisis de causa: puedo usar como herramienta
“tormenta de ideas”
• En un alto % no se encuentra la causa verdadera.
Ejemplo: Si EIL no conforme Realizo una evaluación:
analizo posibles causas. Si no encuentro la causa
participo en otro interlaboratorio para volver a
demostrar la competencia.

¿ Qué hago cuando el resultado del control de calidad es
no conforme?
Hasta que no se demuestre nuevamente la competencia
técnica el laboratorio debe dejar de hacer el ensayo.

Evaluación de las tendencias
de los resultados obtenidos:
Los gráficos de control son una
herramienta de trabajo para el
control estadístico de los
resultados de ensayo y sirven
para monitorearlos.
Ejemplo:
Ensayo de Aptitud
Interlaboratorio
Matriz: Queso
Metodología: FIL-IDF 73B:1998
parte I
Ensayo: recuento de
Coliformes a 30º C (ufc/g)
Años: 2002 – 2003 y 2004

Importante!!!
Los datos obtenidos a través del programa del
aseguramiento de la calidad deben ser registrados
en forma tal que se puedan detectar las
tendencias y aplicar técnicas estadísticas para la
revisión de los resultados.

Cultivos de referencia
Las cepas de referencia son
necesarias para :
• La evaluación de la calidad de
los medios de cultivo.
• Validar métodos
• Realizar controles de calidad
interno durante la ejecución de
los ensayos

Esquema de cultivos de referencia:
CEPA DE REFERENCIA
CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS
(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)
Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento
OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA
CEPAS DE TRABAJO
(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE
LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y
CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD
*
Reconstitución
(Sólo se acepta un único repique)
*
Descongelación / reconstitución
*
Se subcultiva
una sola vez.
( * ) Deben realizarse los controles de pureza y pruebas bioquímicas de la cepa.

Conservación y mantenimiento
de cepas microbianas.

Cultivo de colección
¿Qué son de Cultivo de Colección?
-Son cultivos que son guardados por organizaciones que
principalmente se ocupan de guardar convenientemente
cepas de microorganismos, células superiores o diversos
materiales biológicos y los suministran, previa petición a
laboratorios microbiológicos o de biología celular.
- Son por lo tanto un apoyo a los trabajos de microbiología

¿Cuándo aparecieron las primeras colecciones de cultivo?
-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catálogo
-La más antigua Lobaina (Bélgica) (Hongos)
-La ATCC, en 1925. No vínculos directos con la Universidad,
es de carácter comercial (Manassas,USA).
-La CECT, nace en el CSIC (Villanueva)(1960).
-PRCC, Profesor J.L. Ramos (Pseudomonas putida)
A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional
denominada World Federation for Culture Collection (WFCC).
En Europa a su vez estan agrupadas en la “European Culture Colletion
Organization (ECCO) que se fundó en 1982.

Procedimientos generales para la
conservación de cepas microbianas
Los tres objetivos para una correcta conservación:
1.- Cultivo puro.(PUREZA)
2.- Viva. (VIABILIDAD)
3.- Genéticamente estable (ESTABILIDAD)
Lapage en 1977 decía que:
a) Un cultivo inicial de una especie es una población.
b) Un sub-cultivo es una población diferente derivada de
este cultivo inicial.
c) Una cepa es una sucesión de sub-cultivos del cultivo
inicial.

¿Las características de la cepa inicial o
cultivo serán los mismos los sub-
cultivos?
•NO necesariamente porque se pueden producir
cambios en los sub-cultivos.
•Los métodos en la conservación de las cepas
microbianas tienen como objeto fundamental minimizar
estos cambios.

Conservación de cepas
microbianas
• Método de elección o de conservación a
largo plazo
– Conservación por congelación
– Conservación por liofilización
• Métodos Alternativos
– Conservación por transferencia periódica
– Conservación por suspensión en agua destilada o en
agua de mar estéril

• Métodos particulares
– Desecación en papel de filtro
– Desecación en suelos, arena silicagel, etc
– Desecación en bolitas de alginato
– Desecación en sal para halobacterias
Conservación de cepas microbianas

Conservación de
microorganismos por congelación
•La crio-conservación consiste en la conservación de los
microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados
centígrados.
•Se basa en la paralización del metabolismo celular por la
disminución del agua disponible.
Objetivos de la crio-conservación
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento (-70º,-139º)
-El estado fisiológico de la célula
- Mantenimiento de la estabilidad (fenotípica y genotípica)
- Mantenimiento de la pureza

BACTERIA
H2O
H2O
H2O
H2O
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo Hielo
Hielo
Hielo

Agentes crioprotectores
• OBJETIVOS
– Minimizar daños
durante la
congelación.
– Limitar la formación de
hielo (tasa de
congelación)
– Vitrificación del agua
• CARACTERISTICAS
– No tóxico para la
célula.
– Penetrar fácilmente en
la membrana celular.
– Unirse a los
electrolitos o a las
moléculas de agua.

Crioprotectores más comunes
• Glicerol
• Dimetilfulfóxido (DMSO)
• Ácido glutámico
• Glucosa
• Sacarosa
• Meso inositol
• Lactosa
• Leche Descremada

• Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase
logarítmica, a la temperatura óptima, en el medio más adecuado.
• Ajustar el nº de células a una concentración final de 2-6x106
cél/ml. Añadir los crioprotectores adecuados a una concentración
óptima.
• Repartir la suspensión en ampollas de congelación, cerrarlas
herméticamente y mantenerlas 30 minutos a 30º.
• Disminuir la t° lo mas rápido posible.
• A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar
rápidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado
en un baño a 37-40ºC.
Conservación de cepas microbianas

Fundamentos teóricos de la conservación de
microorganismos por liofilización
• Liofilización
– Es un método de conservación a largo
plazo.
– Se basa en la paralización del
metabolismo celular por falta de
agua:congelación y sublimación

PROCESO
Congelar el
agua libre de
las células
Eliminación del agua
Agua congelada Vapor de agua
Sublimación
1ª Fase de la
Desecación
2ª Fase de la
Desecación

PROCESO
P
R
O
T
E
C
T
O
R
Tubos marcados
Congelación
Rápida
Tª ambiente,4ºC,-196ºC
BOMBA condensador
BOMBA
Sellado al
vacio
Ampolla

Tipos de Liofilizadores
• Liofilizador con
centrifugación
– Se utilizan ampollas de
vidrio taponadas
– La suspensión se
centrifuga durante la 1ª
fase de la desecación
– Se estrechan las ampollas
y,después de conectarlas a
una bomba de vacío,se
sellan.
Ventajas:Se utiliza la centrifugación para
que el proceso de congelación sea
suave y de forma homogénea
• Liofilizador con estantes
– La suspensión se prepara
en viales y,es
precongelada a Tª muy
bajas antes de aplicar el
vacío.
– La segunda etapa de la
desecación se realiza
también en el liofilizador.
Ventajas: La Desecación es
de manera progresiva y
continuada

¿Cuándo aplicar la
Liofilización?
Es un método ampliamente utilizado para conservar distintos
Microorganismos.
SI NO
-Bacterias, Levaduras,
Hongos, Algunos virus, Algas
-Dificultad de un crecimiento
Adecuado.
-Microorganismos delicados
que no resisten el paso de
congelación.
-A tamaños de células mayores,
menos efectivo es el proceso
Protozoos, Células animales,
Células vegetales, Arqueobacterias y
bacterias delicadas
Ejemplos:Rhodospirillum,
,Azospirillum,vibrio y demás
bacterias marinas.
-Levaduras miceladas con
dificultad en la esporulación.
-Hongos con grandes conidios o
con dificultad en la esporulación.

Factores implicados en la conservación por el
proceso de liofilización
Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo
Dependerá del tipo de microorganismo y sus
requerimientos nutricionales.
Fase de crecimiento del cultivo.
Fase exponencial. Suspensiones celulares de 108-109
Células/ml en bacterias, algo inferiores en
hongos y levaduras.
Condiciones de incubación.
T°, aerobiosis, anaerobiosis, etc.

Preparación de las células para su conservación
- Composición del medio de la suspensión y adecuada densidad óptica
El medio de la suspensión deberá proteger la viabilidad de las células. Usar
el crioprotector adecuado en cada caso.
Glucosa 7,5% para Anaerobios
Glucosa 15% para Levaduras.
Glutámico 0,67M para Bacterias Lácticas.
Inositol 5% para Bacterias.
Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos.
- Tipos de ampollas, tubos y viales para la liofilización.
Dependerán del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a
liofilizar.
Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su
elevada resistencia ofrecerán muchas dificultad en su apertura.

-Temperatura durante la sublimación.
Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC.
-Grado de deshidratación alcanzado.
Lo más alto posible.
-Atmósfera de oxígeno en el tubo.
Las células liofilizadas se guardan en tubos al vacío para evitar
Rehidratación o presencia de gases (como el oxígeno) que pueden
dañar las células.
-Condiciones de almacenamiento.
La temperatura debe ser constante a 18ºC y sin bajar de los 0ºC
y, en oscuridad

Liofilización
VENTAJAS
-Reducción de la
variabilidad del
microorganismo.
-Largo tiempo de
conservación.
-Aplicabilidad para la
producción y distribución
de los lotes
DESVENTAJAS
-El alto coste inicial del
equipo.
-La preparación de forma
incorrecta de los distintos
lotes puede desembocar
en un estancamiento de
la viabilidad y/o en
pérdidas en la estabilidad
de los caracteres de los
microorganismos

Conservación por transferencia
periódica
• Es un método en el que los organismos permanecen
activos durante el proceso. Consiste en la inoculación de
microorganismos en un medio de cultivo adecuado, la
incubación a una T° adecuada para obtener crecimiento
y finalmente el almacenamiento bajo unas condiciones
adecuadas.
• El proceso es repetido a intervalos que garanticen la
obtención de un cultivo fresco antes de la pérdida del
viejo.

Para una buena resiembra periódica
• Medio de cultivo.
• Temperatura, tiempo y condiciones de
incubación.
• Intervalo entre dos resiembras
– Reducción de la temperatura de almacenamiento.
– Medios no enriquecidos, con limitación de
nutrientes.
– Restricción de la accesibilidad de aire del cultivo.

Conservación por suspensión en agua
destilada o en agua de mar esteril
Es un método alternativo muy usado y que da altos porcentajes de
viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se
quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se
puede poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del
Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace
en agua de mar diluida.

Resumen Final
El laboratorio debe llevar a cabo
periódicamente controles de calidad
interno y externo con la finalidad de
verificar que sus resultados tienen una
precisión y exactitud aceptable y
mejorar en conjunto el funcionamiento
del mismo.

Control calidad en el Laboratorio de ensayos..ppt

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