Diagnóstico de ebola
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El documento describe dos técnicas de diagnóstico de Ebola: RT-PCR y ELISA. RT-PCR consiste en la amplificación de un segmento específico del ARN del virus mediante la transcripción reversa del ARN a ADN complementario, seguido de la replicación del ADN a través de múltiples ciclos de desnaturalización, alineamiento y elongación. ELISA detecta la presencia de antígenos o anticuerpos mediante la unión enzimática de un complejo anticuerpo-antígeno a una superficie, revelando la reacci
Diagnóstico de ebola
- 1. Diagnóstico de Ebola Your Logo Camila Sacristán Universidad de Chile Departamento de Tecnología Médica Fotografía Médica
- 2. RT-PCR Generalidades: - La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa, consiste en la amplificación de un segmento especifico del ARN del virus con una enzima polimerasa, previo a la amplificación se utiliza una enzima llamada transcriptasa reversa que copia este ARN a un ADN complementario o copia (ADNc) ya que la polimerasa solo amplifica ADN. - La reacción después de la formación del ADNc consta de tres etapas: desnaturalización de la hebra, alineación o hibridación y elongación, las cuales se repiten aproximadamente 30 veces dentro de un termociclador Imagen sin licencia comercial
- 3. RT-PCR Los reactivos necesarios para esta técnica son: - Primers o partidores, que establecen el marco de la amplificación - Nucleótidos: Adenina (A), Citocina (C), Guanina (G) y Timina (T), estos son los componentes básicos de la cadena de ADN - Inhibidores de la ARNasas, ya que estas enzimas degradan el ARN que se intenta amplificar - Enzima polimerasa, que el la que amplifica el ADN - Buffer o solución tamponada para mantener el pH de la reacción - Sales de Magnesio, que sirven como cofactor de la polimerasa - Agua Imagen sin licencia comercial
- 4. Técnica RT-PCR Antes de iniciar la amplificación, la transcriptasa inversa transcribe el ARN viral extraído de la muestra a ADNc Primera etapa: Desnaturalización de la hebra - Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde. Imagen sin licencia comercial, modificada en su tono (-180) y saturación (+100). Imagen original (arriba) e imagen modificada (abajo) Imagen sin licencia comercial
- 5. Técnica RT-PCR Segunda etapa: alineación -Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria. Imagen sin licencia comercial Imagen sin licencia comercial, modificada en su luminosidad (+66) y saturación (+15).Imagen original (frente) e imagen modificada (fondo)
- 6. Técnica RT-PCR Tercera etapa: Elongación Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la enzima ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble Imagen sin licencia comercial Imagen sin licencia comercial, modificación de contraste (+100) y aplicación de filtro artístico Bordes añadidos. Imágenes originales (superiores) y modificadas (inferiores)
- 7. Técnica ELISA ELISA: Ensayo por Inmunoabsorción ligado a enzimas Generalidades: -Es la reacción de un complejo anticuerpo-enzima con un antígeno o anticuerpo que está fijado a una superficie solida. Para detectar la reacción se añade un sustrato a la enzima para que genere un producto coloreado, lo que indicará la presencia del antígeno o anticuerpo buscado. - Hay diferentes tipos de ELISA, como por ejemplo el directo, indirecto, el tipo sandwich, competitivo, etc Imagen sin licencia comercial, modificada en sus niveles de color: +45 hacia el rojo y -100 hacia el amarillo. Imagen original (derecha) e imagen modificada (izquierda)
- 8. Técnica ELISA ELISA tipo sandwich: -Se fija un anticuerpo a la superficie del soporte o pocillo, al cual se unirá una zona especifica del antígeno (epítope) que se sospecha está en la muestra. -Se agrega la muestra a estudiar -Lavar para eliminar los antígenos que no se han unido a los anticuerpos fijados en el pocillo. Imagen sin licencia comercial modificada en su brillo (-66) y contraste (+62). Imagen Original (arriba) e imagen modificada (abajo)
- 9. Técnica ELISA - Luego se agrega un anticuerpo ligado a una enzima que se unirá a otro epítope del mismo antígeno - Lavar para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado - Si se produce la unión la enzima estará presente en el pocillo después de los lavados, y al agregar el sustrato se formará un producto coloreado. Imagen sin licencia comercial modificada en su brillo (-66) y contraste (+62). Imagen Original (arriba) e imagen modificada (abajo)
- 10. Técnica ELISA Lectura. -Se puede realizar de forma visual para saber cualitativamente la presencia o ausencia del antígeno o anticuerpo buscado, esto se puede hacer en los ensayos que no requieren cuantificacion y no se presenten abundantes casos dudosos. -También se puede realizar con la ayuda de un lector de ELISA. Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final alcanzada. Imagen sin licencia comercial modificada en su tono (-38), saturación (+15) y luminosidad (+12). Imagen original (izquierda) y modificada (derecha)
- 11. Bibliografía http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas_2.h tm FAO: Manual de procedimientos para el diagnostico molecular de la Influenza aviar de alta patogenicidad, capítulo 3: generalidades de la técnica RT-PCR. Cultek: Fundamentos y tipos de ELISA
- 12. FIN FIN