Hay un ADN en mi quesadilla

http://www.ei.udelar.edu.uy

Conjunto de acciones, medidas y
procedimientos técnicos que permite
identificar y registrar cada producto
desde su nacimiento hasta el final de la
cadena de comercialización.
Trazabilidad
D. Posik, 2012

¿Qué es la Trazabilidad Alimentaria?
‘‘Es la habilidad para trazar y seguir un
animal, un alimento o un ingrediente a
través de todos las etapas de producción
y distribución’’ [Regulación Europea (ER)
178/2002].
“Se define como la capacidad de establecer la historia
de los procesos de origen de un producto, su uso y
procedencia mediante referencia a un registro escrito’’
(Normas ISO 8402).
D. Posik, 2012

Por qué la Trazabilidad Alimentaria?
Protección al consumidor
Cumplimiento de normas legales
Fraudes Alimentarios
Competencia desleal
Seguridad alimentaria
Cambios socio-económicos
Desarrollo de nuevas normas

Seguridad alimentaria
Priones: BSE (Bovine spongiform encephalopathy)
Virus: influenza aviar
Contaminación bacteriana E. coli 0157:H7
Salmonela
Listeria
Clostridium
Contaminantes medioambientales:
dioxinas, fenoles, PCBs , metales, etc.
Organismos genéticamente modificados (OGMs)
D. Posik, 2012

Cambios socio-económicos
demanda de productos de calidad
buena higiene alimentaria
rechazo al consumo de OGMs
globalización del mercado
mayor demanda de productos orgánicos
reducción en las características organolépticas
(gusto, terneza)
mayor preocupación por sistemas eco-sustentables
dificultad del consumidor de controlar los procesos
de procesamiento de alimentos
D. Posik, 2012

Control de
calidad
Legal y
comercial
Trazabilida
d
Genética
Biología
Molecular Zootecnia y
fitotecnia
Informática
Tecnología de
los alimentos
Leyes
Algunas áreas de trazabilidadAlgunas áreas de trazabilidad
D. Posik, 2012

Trazabilidad convencional
Diferentes métodos de identificación han sido
utilizados: caravanas, bolos ruminales, documentación
de cada animal, código de barras, packaging, etc. El
sistema debe estar asociado a una gran base de datos
precisa, accesible y mantenida por un largo período de
tiempo.
D. Posik, 2012

Métodos Analíticos
Convencionales (no basados en el ADN)
• Espectroscopías
• Espectroscopía IR (infra–rojo) - Fourier
transform IR (FTIR) | Mid-infrared IR
(MIR) | Near-infrared IR (NIR)-
• Espectroscopía NMR - Low resolution
NMR & High resolution NMR (e.g., site
specific natural isotope fractionation
(SNIF)-
• Técnicas Espectrofotométricas (UV, IR)
• Espectroscopías Atómicas
• Espectroscopía de Absorción Atómica
(AAS)
• Espectroscopía de Emisión Atómica (AES)

• Espectrometría de Masas
• Espectrometría de masas isotópica (IRMS)
• Espectrometría de masas inductivamente
acoplada de plasma (ICP-MS)
• Espectrometría de masas de reacción de
transferencia de protones (PTR-MS)
• Espectrometría de masas acoplada a
cromatografía en fase gaseosa (GC-MS)
An overview of analytical methods for determining
the geographical origin of food products.
D.M.A.M. Luykx, S.M. van Ruth / Food Chemistry 107 (2008) 897–911

•Espectrometría de masas isotópica (IRMS)
D. Posik, 2012

Trazabilidad Geográfica
Identificar el origen geográfico de un producto a través
del estudio de ‘‘track elements’’ (componentes volátiles,
flora microbiana, isótopos estables y espectroscopia
infrarroja).
D. Posik, 2012

Medición de la relación de isótopos estables mediante un
espectrómetro de relación de masa isotópica (IRMS)
D. Posik, 2012

• Separaciones
• Métodos Cromatográficos (GC, LC, TLC,
HPLC) - High performance liquid
chromatography (HPLC) | Gas
chromatography (GC) | Capillary
electrophoresis (CE)

Convencionales (no basados en el ADN)
• Otros
• Métodos enzimáticos
• Inmunoensayos enzimáticos

No - Convencionales (basados en el ADN)
 Se basa en la identificación de los organismos y
sus productos a través del estudio del ADN.
 Es inalterable a lo largo de la vida del organismo.
 Esta presente en todas las células.
 Es estable a los diferentes tratamientos (de
procesamientos) de los alimentos.

La aplicación de las innovaciones
tanto genéticas como bioinformáticas en
los análisis de la trazabilidad
puede abordarse desde dos perspectivas:
(1)Trazabilidad de un alimento desde su origen,
muy utilizada en el caso de productos de
calidad con denominación de origen,
la identificación del animal vivo
y el control de genealogías.
(2) Autentificación de una especie, variedad
o del origen geográfico de un alimento.

ANTECEDENTES
• El análisis por PCR permite hallar e identificar
remanentes de ADN en matrices complejas como lo son
los alimentos procesados.
• Esto permite identificar las distintas especies
vegetales o animales, declaradas o no, que forman parte
de un producto alimenticio cuya composición escapa a la
sensibilidad de nuestros sentidos.
• La robustez de esta técnica radica en que si bien la
cocción, el pH y la presencia de agentes químicos
pueden degradar el ADN y alterar la estructura,
ninguno de estos procesos puede alterar la secuencia de
bases nitrogenadas, la cual en ciertas regiones génicas
hace única a cada especie.

Marcadores Genéticos
Cualquier característica física o molecular
heredada que difiere entre individuos y es
fácilmente detectable en el laboratorio como
potencial marcador genético.
Los marcadores para ser útiles en mapeo deben
ser polimórficos (deben existir formas
alternativas entre individuos de forma tal que se
puedan diferenciar entre los diferentes
miembros de las familias en estudio)
Trazabilidad genética individual
Trazabilidad genética de raza o cultivar
Trazabilidad genética especie específica
D. Posik, 2012

Microsatélites
Regiones variables
(polimórficas) del ADN
nuclear que consta de
repeticiones de 1 a 6
nucleótidos que se ubican
uno tras otro. La
variación en el número de
repeticiones crea
diferentes variantes
(alelos) los cuales se
distinguen entre sí por la
longitud total del
fragmento.
D. Posik, 2012

campo faena góndola
87
86.2
89
88.2
91
90.2
93
92.2
95
94.1
97
96.2
99
98.2
G01 060224_CTD_DogRun01 CTD7
0
100
200
300
400
500
227
232.0
229
233.8
231
235.6
233
237.6
235
239.4
237
241.2
239
243.2
241
245.2
243
247.2
245
249.0
B02 060309_CT_DOG CT2
0
100
200
300
400
500
600
235
245
192
191.4
194
193.1
196
195.1
198
197.1
200
199.2
202
201.2
204
203.3
206
205.2
208
207.1
210
209.3
212
211.6
D01 060309_CT_DOG CT15
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
199
201
220
223.5
222
225.4
224
227.5
226
229.5
228
231.6
230
233.7
232
235.9
234
237.9
236
239.9
238
241.8
240
243.6
E02 060228_TC_EqDogRun01 CTD18
0
1000
2000
3000
229 239
87
86.2
89
88.2
91
90.2
93
92.2
95
94.1
97
96.2
99
98.2
0
100
200
300
400
500
227
232.0
229
233.8
231
235.6
233
237.6
235
239.4
237
241.2
239
243.2
241
245.2
243
247.2
245
249.0
B02 060309_CT_DOG CT2
0
100
200
300
400
500
600
235
245
192
191.4
194
193.1
196
195.1
198
197.1
200
199.2
202
201.2
204
203.3
206
205.2
208
207.1
210
209.3
212
211.6
D01 060309_CT_DOG CT15
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
199
201
220
223.5
222
225.4
224
227.5
226
229.5
228
231.6
230
233.7
232
235.9
234
237.9
236
239.9
238
241.8
240
243.6
0
1000
2000
3000
229 239
87
86.2
89
88.2
91
90.2
93
92.2
95
94.1
97
96.2
99
98.2
0
100
200
300
400
500
227
232.0
229
233.8
231
235.6
233
237.6
235
239.4
237
241.2
239
243.2
241
245.2
243
247.2
245
249.0
B02 060309_CT_DOG CT2
0
100
200
300
400
500
600
235
245
192
191.4
194
193.1
196
195.1
198
197.1
200
199.2
202
201.2
204
203.3
206
205.2
208
207.1
210
209.3
212
211.6
D01 060309_CT_DOG CT15
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
199
201
220
223.5
222
225.4
224
227.5
226
229.5
228
231.6
230
233.7
232
235.9
234
237.9
236
239.9
238
241.8
240
243.6
0
1000
2000
3000
229 239
D. Posik, 2012

SNP
(Single nucleotide
polymorphism = snips)
Es una variación en la
secuencia de ADN que
afecta a una sola base de
una secuencia del genoma.
Estos cambios pueden ser
responsables de causar una
enfermedad o afectar la
respuesta de los individuos a
bacterias, virus, productos
químicos, fármacos, etc.
D. Posik, 2012

El ADN de las muestras a analizar, marcado de diferentes
maneras, se incuba sobre el panel de sondas permitiendo la
hibridación de los fragmentos homólogos. Donde hubo
hibridación podrá verse y cuantificarse la señal emitida por
la marca.
Microarrays de ADN, chips de ADN
D. Posik, 2012

Microarrays = chips de DNA
D. Posik, 2012

Identificación Especie Específica
....|....|....|....|....|....|....|....|
....|....|....|....|....|....|....|....|
10 20 30 40
Especie 1 GCTATCAACAGACTAGCAACTGTGGGTTCAAGCTGGTTAA
Especie 2 GCTATCAACAGACTAGCACAGGCGGGTTCAAGCTGGTTAT
Especie 3 GCTATCAACAGACTAGCAAGTGTGGATTCAAGCTCGTTAA
Especie 4 GCTATCAACAGACTAGCAAGTGCGGATGTAGGCTGGGTAA
Especie 5 GCTATCAACAGACTAGCAAGTGTGGATTTAAGCTGGTTAA
****************** * ** * * *** * **
50 60 70 80
Especie 1 AGAACAGTTTGAATGTCTACGCGGTGGACTTGATTTACTA
Especie 2 AGAACAGTTTGAATGTCTCCGCGGGGGACTTGATTTACTA
Especie 3 AGAGCTTGTTGAATGTCTTCGTGGTGGCCTTGATTTACTA
Especie 4 GGAGCATGTCGAGTGTCTACGCGGTGGACTTGATTTACTA
Especie 5 GGAGCGTGTCGAGTGACTACGCGGTGGACTTGATTTACTA
* * * ** ** ** ** ** ************

¿Qué es el Barcoding?
Es un método estandarizado para identificar animales
y plantas a partir de secuencias de ADN.
www.barcoding.com/
www.barcodinglife.org/
En animales ADNmt, región COI.
En vegetales rbcL, matK, trnH-psbA, atpF-H

¿POR QUÉ ADNmt?
 Único para cada especie animal y vegetal.
 Alto número de copias por célula.
 Grandes diferencias entre especies.
 Pocas diferencias dentro de la misma especie.
 Ausencia de intrones.
 Las distintas especies comparten el mismo conjunto de genes.

REGIÓN COI
 Amplicón: 648 pb.
 Fácil de recuperar desde taxas variados, utilizando
un set limitado de primers.
 Efectivo en distinguir en especies animales
relacionadas desde un phylum de vertebrados e
invertebrados.
 Fácilmente alineable para comparación de secuencias.

VOLVIENDO A LOS VEGETALES
 Tasa de sustitución nucleotídica
mitocondrial es mucho menor que en
animales.
 Hibridización presente para este grupo es
un problema a la hora de encontrar un locus
único para barcoding.
Propuesta: loci multiples.
rbcL, matK,trnH-psbA, atpF-H

PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
(USA, n. 1944, PN 1993)
Single Cycle

Secuenciación
(Fred Sanger, n. 1918, PN 1958 y 1980)

Escaneado electrónico de
secuencias de ADN de
cualquier organismo viviente.

Estrategias TraMa
Búsquedas
Antecedentes bibliográficos
Google, scholar.google,
www.google.com/patents
GenBank, BLAST
Alineamientos
Diseño experimental
Diseño cebadores (primers)

TRAZABILIDAD MOLECULAR ALIMENTARIA
… ADNS QUEDAN
LaTraMa ::: Laboratorio de Trazabiliad Molecular Alimentaria
P Abete, F Alfonso, M Amilibia, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández,
A Miller, E Miquel, F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez Debat
Sección Bioquímica, Instituto de Biología,
Facultad de Ciencias, Universidad de la República.
Montevideo. Uruguay.

Detección de:
Secuencias específicas (transgénesis, OGMs)
Especies animales (MeDeA)
Especies vegetales (DeVa)
Alergenos
Detección de gluten (TACC)
Etc.

Algunos resultados de extracciones de ADN…
Embutidos..

Extracción de ADN para quesos
(método Dellaporta modificado)
El ADN de cabra que se utilizó como control se extrajo a partir de sangre de cabra
QIAGEN BLOOD & TISSUE Kit

Harinas de maíz, “Polentas”

Extracción ADN
Protocolo de extracción con CTAB (Doyle
& Doyle 1987) modificado (PTB).
ADNs de salsas de tomate
Volumen: 100 uL
J Pereyra / M Arleo

Extracción y purificación del ADN a partir de matrices alimentarias
Etapas del trabajo
Amplificación mediante PCR
Cuantificación y Control de Calidad del ADN

Análisis de componentes animales en alimentos
MeDeA ::: Método de Determinación de Especies
Animales

Ejemplo: Detección de adulteraciones
de quesos de cabra con leche de vaca,
mediante técnicas moleculares
MeDeA
A Miller/ M Amilibia / J Correa

Estrategias analíticas
• Discriminar vaca y cabra por
diferencias en la secuencia de
citocromo b (cytb) de ambas especies
mediante:
• Ensayos de PCR con primers reversos
específicos para cada especie
(Matsunaga et al Meat Science 51 (1999) 143±148)
• RFLP´s de un fragmento de cytb,
producto de PCR con primers
universales.
(Bravi et al. Legal Medicine 6 (2004) 246–251)

RFLPs
• Se utilizaron primers universales para obtener
una banda de 358 pb, y luego mediante el
corte con enzimas (Alu I y Hinf I) lograr una
diferenciación entre especies y ver su
desempeño a la hora de comprobar la
presencia de leche de vaca en quesos de
cabra

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Capra Hircus CCATCAAACA TCTCATCATG ATGAAACTTT GGATCCCTCC TAGGAATTTG
L14816 CCATCCAACA TCTCAGCATG ATGAA----- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Capra Hircus CCTAATCTTA CAAATCCTGA CAGGCCTATT CCTAGCAATA CACTATACAT
L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Capra Hircus CCGACACAAT AACAGCATTT TCCTCTGTAA CTCACATTTG TCGAGATGTA
L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Capra Hircus AATTATGGCT GAATCATCCG ATACATACAC GCAAACGGAG CATCAATATT
L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Capra Hircus CTTTATCTGC CTATTCATAC ATATCGGACG AGGTCTATAT TATGGATCAT
L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Capra Hircus ATACCTTTCT AGAAACATGA AACATTGGAG TAATCCTCCT GCTCGCAACA
L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
H15149 ---------- ---------- ---------- ---TGAGGAC AAATATCATT
Capra Hircus ATGGCCACAG CATTCATAGG CTATGTTTTA CCATGAGGAC AAATATCATT
L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|...
H15149 CTGAGGGG
Capra Hircus TTGAGGGG
L14816 --------
Sitio de corte para Hinf I
Sitio de corte para Alu I
RFLPs

(Matsunaga et al Meat Science 51 (1999) 143-148)

1-Marcador de peso molecular 50pb, 2- Control + mezcla de 1ul ADN G (cabra)100ng/ul y 1ul ADN
K(vaca)100ng/ul,3-Muestra de queso 29, 4- Muestra de queso 30, 5- Muestra de queso 31, 6-
Muestra de queso 36, 7- Marcador de peso molecular 50pb, 8-Blanco de extracción, 9- Blanco de
PCR
A Miller

Marca Muestra Especies
declaradas
Especies
encontradas
(datos
congruentes
con ambas
estrategias)
La Chacra (Uy) LCH Cabra Vaca / Cabra
La Pataia (Uy) LP Cabra Vaca / Cabra
Caprino Alto (Uy) CA Cabra Vaca / Cabra
A (Mx) CB Cabra Vaca / Cabra
Queso Tierno
(España)
QT Cabra, Vaca y
Oveja
Vaca / Cabra
B (Mx) QTB Cabra Vaca / Cabra
Queso untable
Conaprole Magretto
(Uy)
UN Vaca Vaca
J Correa

Resultado de la identificación de especies animales y vegetales en quesos y hamburguesas de carne.
No se realizó la detección de especies vegetales en quesos.
PRODUCTO ORIGEN ESPECIES ANIMALES
DECLARADAS
ESPECIES ANIMALES
ENCONTRADAS
ESPECIES VEGETALES
DECLARADAS
ESPECIES VEGETALES
ENCONTRADAS
Queso (1) Uruguay Cabra Cabra
Queso (3) Uruguay Cabra y vaca Cabra y vaca
Queso (4) Uruguay Cabra Cabra y vaca
Hamburguesa de carne (1) Uruguay Vaca Vaca proteína vegetal y especias soja
Hamburguesa de carne (2) Uruguay Vaca Vaca s/declaración -
Hamburguesa de carne (3) s/información s/información Vaca, Pollo s/información soja
Hamburguesa de carne (4) s/información s/información Vaca s/información -
Hamburguesa de carne (5) Uruguay Vaca Vaca proteína de soja, pimienta soja
Hamburguesa de carne (8) Uruguay Vaca Vaca s/declaración -A Miller / M Amilibia /J Correa / F San Martín / M Arleo

Descripción del problema
• Adulteración con Manzana (Malus
domestica) en matrices alimentarias
altamente procesadas. Ejemplo: Pulpa de
tomate (Solanum lycopersicum) envasada.
Lic. José Pereyra
DeVas
Determinación de
Especies
Vegetales en
Alimentos

Objetivo
• Identificación de ADN de Manzana en
Pulpas de tomate envasada

Etapas
• Extracción de ADN
– Protocolo de extracción con CTAB (Doyle & Doyle
1987) modificado (PTB)
• Busqueda de secuencias en GenBank
– Refseq
– Resto de bases de datos
• Analisis de secuencias
– Blastn,
– Mega 4.0 (clustalW)
– Webcutter, GeneRunner
• Amplificación de ADN por PCR
• Geles, secuenciación, enzimas de restricción

RESULTADOS
Electroforesis en gel donde se observa los resultados obtenidos para la PCR realizada con
cabadores Tab G-H sobre las muestras. Carril 1 al 6: muestras; 7: Tomate(T); 8: Soja (S); 9:T/S;
10: MPM 50 pb; 11: C(-) sin ADN
Pulpa de Tomate

RESULTADOS
Resultado de Blastn de las secuencias obtenidas contra las presentes en el GenBank
El análisis por Blastn de las secuencias “extrañas” empató con
secuencias de Soja presentes en el GenBank con alto puntaje y
un e-value de 3 x 10 -79.

CONCLUSIONES
Pulpa de tomate
Estrategias Analíticas de Identificación de Especies
 Esta metodología permitió determinar que algunas
pulpas de tomate contienen de forma enmascarada
otros vegetales que no son declarados como parte de
sus componentes
 De las seis pulpas analizadas 2 resultaron positivas
para Soja

Identificación de especies vegetales en dulce
de membrillo mediante análisis por PCR
OBJETIVOS
• Desarrollar un procedimiento eficaz para extraer ADN a partir de una matriz
compleja como el dulce de membrillo.
• Utilizar métodos rápidos para la identificación de distintas especies
vegetales en el material extraído. (PCR, restricción con enzimas).
• Ampliar el estudio utilizando métodos de cuantificación de especies
(Real Time-PCR).
Lic. Fabiana Ruibal y
Mailén Arleo

MATERIALES Y METODOS
 Extracción de ADN
• Las muestras de dulces se disuelven en buffer TEN (Tris 10mM, EDTA
10mM, NaCl 0.1 M) a 60ºC, se homogenizan y se filtran a través de filtro
tipo Blutex con bomba de vacío.
• Las extracciones de ADN se realizan partiendo de 100-200 mg del filtrado,
utilizando distintos métodos.

• Ensayo de inhibición
1-Marcador de peso molecular 50pb
2- (-)
3- D. de membrillo de composición
conocida (100% Mb)
4- D. de membrillo de composición
conocida (50% Mb-50%Mz)
5- D. de membrillo problema (I)
6- D. de membrillo problema (II)
7- D. de membrillo problema (III)
8- Blanco de extracción
9- Control+ de vaca
10- (-)
11- control negativo de PCR.
- Amplificación con primers para vaca sobre dulces conteniendo ADN de vaca
- Estrategias para reducir la inhibición:
• Diluir la muestra
• Purificar la muestra mediante kits específicos.
• Modificar el protocolo de extracción inicial o proceder a utilizar uno

• Método Mat-k
- Amplificación con primers A1F-A3R + digestión con EcoRI
1-Marcador de peso molecular 50pb, 2- Dulce de membrillo de composición conocida (50% Mb-
50%Mz) digerido con EcoRI, 3-D. de membrillo (50%-50%) sin digerir, 4- D. de membrillo problema
(I) digerido, 5- D. de membrillo problema (I) sin digerir, 6- D. de membrillo problema (II) digerido ,
7- D. de membrillo problema (II) sin digerir, 8- Control+ de manzana digerido, 9- Control+ de
manzana sin digerir, 10- Control+ de membrillo digerido, 11- Control+ de membrillo sin digerir, 12-
Control negativo de PCR sin digerir

74
Métodos de Detección,
Identificación y Cuantificación
de OGMs
M Arleo, F Alfonso, J Correa, R Fernández, M Fernández,
F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez Debat

Transgénesis en plantas
 Incorporación estable y expresión de genes foráneos en una planta.
 Evento transgénico: Recombinación o inserción particular de ADN
ocurrida en una célula vegetal a partir de la cual se originó la planta
transgénica.
Los eventos de transformación son únicos.
Difieren unos de otros en :
 los elementos de regulación y genes
insertados (cassette).
 los sitios de inserción en el genoma de la
planta.
 el número de copias del inserto.
 los patrones y niveles de expresión de las
proteínas de interés.

Alimento transgénico
El término “alimento transgénico” hace referencia a aquel que contiene,
está compuesto, o ha sido producido a partir de OGMs.
Un alimento puede ser “transgénico” porque:
está formado por materiales derivados de un OGM (harina de maíz GM),
en su fabricación se emplearon microorganismos GM (yogurt)
contiene ingredientes que provienen de OGM (aceites, aminoácidos, ácidos
orgánicos, enzimas)

Fuente: http://www.mgap.gub.uy/portal/hgxpp001.aspx?7,1,144,O,S,0,MNU;E;2;2;12;5;MNU

Situación legal de los OGMs en Uruguay:
“Coexistencia Regulada”
Decreto 353/008: el etiquetado de los alimentos
que contienen OGMs es “voluntario "GM" o "no
GM", aplicable a aquellos alimentos en los que
se pueda comprobar mediante análisis del
producto final la presencia de ADN o
proteínas genéticamente modificados”

Nuevo marco regulatorio referente a OGMs
…”los alimentos que han sido manipulados genéticamente o que contienen
uno o más ingredientes provenientes de éstos que superen el 1% de los
componentes individualmente considerados, deberán ser etiquetados”…
 Alcance: Alimentos conformados por materiales derivados de OGMs
x Excluidos: Alimentos producidos a partir de microorganismos GM, o que contienen
aditivos producidos por OGM.
 Umbral 1%: presencia accidental o técnicamente inevitable
de transgénicos (contaminación en la producción, transporte
o almacenamiento).
Decreto Departamental N° 34.901 (Montevideo)

Solicitudes tramitadas (Actualizado a Marzo 2013)
Fuente: http://www.mgap.gub.uy/portal/hgxpp001.aspx?7,1,144,O,S,0,MNU;E;2;2;12;5;MNU;,

Construcciones génicas de distintos
eventos de maíz aprobados en Uruguay
p-35S Intrón hsp70 cry 1 A (b)
t-Noscry 1 A (b) patp-35S p-35S intrón 1 adh t-Nosintrón 6 adh
p-1 ract intrón 1 ract CP4 EPSPS t-Nos
OTP
MaízMON810
MaízNK603
MaízGA21
MaízTC1507
p-ubiq mz intrón 1 ubq cry 1 F t-ORF 25 p-35S pat t-35Sexón 1 ubq
p-ract1 intrón 1 ract CTP2 CP4 EPSPS t-Nos intrón hsp70 CP4 EPSPS t-Nosp-35S CTP2
MaízBt11
MaízMon89034
p-e35S intrón 1 ractL-Cab Cry 1A.105 t-HSP17 intrón hsp70 Cry 2Ab2 t-Nosp-FMV TS-SSU
MaízMir162
p-ubiq mz T-35S p-ubiq mz pmi t-Nosvip3Aa20 intrón 9 PEPC

84
Proyectos en curso
Detección, Identificación
y Cuantificación de OGMs
F Alfonso, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández,
F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez
Detección e Identificación de OGMs
en alimentos de consumo masivo (Apoya I.M.)
Interpolinización entre cultivos de maíz transgénico
y no transgénico comerciales en Uruguay
(Apoya REDES-AT, CSIC-UdelaR)

2011-2013: “Flujo de Transgenes entre
Cultivos Comerciales de Maíz en Uruguay”

En 3 de 6 situaciones se detectó presencia del
transgen en la progenie de cultivos no OGM.
El evento detectado corresponde al del
presunto origen de contaminación
Se detectó interpolinización a distancias de 20,
100 y 330m

CONCLUSIONES
En Uruguay existe contaminación de
cultivos no OGM por interpolinización con
cultivos OGM.
La distancia reglamentaria (250 m) no
evita este tipo de contaminación
En cultivos comerciales no se respeta
ésta distancia.
Financiación: Fundación Boell
Programa Uruguay Sustentable – REDES AT
CSIC-UdelaR

Resultado de detección e identificación de eventos transgénicos para 20 muestras de harina de maíz (código M1 – M20)
que se encuentran en el mercado nacional. De las 20 muestras 18 arrojaron resultados positivos en cuanto a la
presencia del promotor 35S indicando presencia de maíz GM. Estas 18 muestras son variables en cuanto al contenido
de eventos particulares encontrándose todas las combinaciones posibles (solo Bt11, solo Mon810 o mezcla de ambas). Cabe
destacar que las muestras que dieron resultado negativo para 35S se mantuvieron coherentes para el análisis de eventos.

PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE MAÍZ PRESENCIA DE
TRANSGENICOS
EVENTO
Endógeno de maíz
(HMGA)
35S t-NOS MON810 BT11 GA21 TC150
7
Cheetos Torciditos México Maíz + + - + - - -
Topitos queso México Maíz + - - - - - -
Tortillas naturales
(tlayudas)
México Maíz + - - - - - -
Tortillas naturales
(tlayudas)
México Maíz + - - - - - -
Doritos recargados México Maíz 100% natural + + + + + + +
Crujitos queso y chile México Maíz + + - + - - -
Rancheritos México Maíz 100% natural + + + + + + +
Fritos chile y limón México Maíz 100% natural + + + + + + +
Doritos pizzerolas México Maíz 100% natural + + + + + + +
Doritos Francia Maíz + - - - - - -
Tortillas chili Francia Maíz + - - - - - -
3D Francia Maíz + - - - - - -
Tortillas de Maíz Francia Maíz + - - - - - -
Nachitas USA Maíz + + - + - - +
3D barbacoa Argentina Maíz + + - + - - -
Fritos España Maíz + - - - - - -
Mix Bugles 3D´s España Maíz + - - - - - -
Mix Cheetos España Maíz + - - - - - -
Mix Doritos España Maíz + - - - - - -
Mix cheetos 2 España Maíz + - - - - - -
Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación de los eventos Mon810, BT11, GA21, TC1507
para las 20 muestras de alimentos a base de maíz (snacks). El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.
De las 20 muestras analizadas, ocho resultaron positivas para la presencia de transgénicos, con distinto perfil en el contenido de eventos.

Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación del evento MON40-3-2
para las hamburguesas de carne (con presencia de soja), hamburguesas y milanesas de soja.
El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.
PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE
SOJA
PRESENCIA DE
TRANSGÉNICOS
EVENTO
ENDOGENO DE
SOJA
35S t-NOS MON40-3-2
Hamburguesa de
carne (1)
Uruguay proteína vegetal + + + +
Hamburguesa de
carne (3)
s/declaración sin declaración + + + +
Hamburguesa de
carne (5)
Uruguay proteína de soja + + + +
Hamburguesa de
carne (6)
Uruguay proteína de soja + - - -
Hamburguesa de
carne (7)
Uruguay proteína de soja + + + +
Hamburguesa de soja
(1)
Uruguay soja certificada no
transgénica
+ + + +
Hamburguesa de soja
(2)
s/declaración sin declaración + + + +
Milanesa de soja (3) Uruguay soja certificada no
transgénica
+ - - -
Milanesa de soja (4) Argentina soja + + + +
Milanesa de soja (5) s/declaración sin declaración + + + +
Tofu (6) s/declaración sin declaración + + + +
Panchos de soja (7) Uruguay proteína de soja + - - -

Sistema de detección de OGMs
Detectar el DNA transgénico
insertado.
Detectar la nueva proteína
expresada.
Detectar el producto de una
reacción enzimática.
 Fin: Garantizar la trazabilidad de los productos GM y el cumplimiento
de las normas de etiquetado.
 Estrategia: Explotar las diferencias entre el organismo transgénico y la
variedad no modificada.

Métodos cualitativos
Determinan la presencia o ausencia de material transgénico en
materias primas o alimentos procesados.
Detección de proteínas
(Elisa, Strips)
Detección de ADN
(PCR, microarreglos)

Técnicas Inmunológicas
Tiras reactivas (Strip)ELISA
 Rápidos, sencillos.
 Requieren poco equipamiento.
Sirven únicamente como rastreo primario de OGMs, no son específicos de
evento.
 No son apropiados para utilizar en alimentos con alto grado de procesamiento.

Microarreglos
Se basa en la
hibridación del ADN
de la muestra, sobre
un gran número de
sondas fluorescentes
adheridas en una
matriz sólida.
 Permite el rastreo simultáneo de un gran número de fragmentos de ADN
diferentes en una mezcla.
 Incrementa la facilidad y velocidad del análisis.
 Actualmente en desarrollo.

PCR
 La PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro que permite
amplificar un fragmento específico de ADN, situado entre dos regiones de
secuencia conocida.
 Usa ciclos sucesivos de calentamiento y enfriamiento de las muestras para
producir copias de la molécula de ADN blanco.

reacción de PCR
1era
etapa – Desnaturalización del ADN molde
Temperatura = 92- 97 ºC Temperatura = De acuerdo a la composición
de las bases del par de cebadores (55-65°C)
2da
etapa – Apareamiento de los cebador
5´
5´3´
3´
OH
OH
ADN pol
ADN pol
dNTPs
dNTPs
Temperatura = 68 - 72 ºC
(depende de la enzima)
3era
etapa – Extensión

Ciclado
 Muy sensible, permite la detección de secuencias transgénicas a nivel de
trazas.
 Específica, capaz de detectar la secuencia blanco de ADN dentro de una
mezcla compleja.
 Apropiados para detectar e identificar eventos de transformación.
CICLADO – genera una
amplificación exponencial
del fragmento de ADN
deseado

PlantaPlanta PromotorPromotor PotenciadorPotenciador Gen de interésGen de interés TerminadorTerminador PlantaPlanta
RastreoRastreo
Específica de genEspecífica de gen
RastreoRastreo
Específica de construcciónEspecífica de construcción
Estrategias de Detección
e Identificación de transgenes
por PCR
Existen cuatro niveles de especificidad para los análisis de transgénesis por PCR,
dependiendo del blanco al cual estén dirigidos los cebadores. (De arriba hacia abajo va
aumentando el nivel de especificidad).
Específica de eventoEspecífica de evento Específica de eventoEspecífica de evento

Normas Internacionales
y protocolos validados
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/
ISO 17025

Materiales de Referencia Certificados (MRC)
 Herramienta indispensable para asegurar la calidad de los métodos de
análisis.
 Elementos con propiedades estables y uniformes autenticadas por una
institución reconocida especializada.
 Cada uno se certifica en relación a la fracción másica o la cantidad de
copias de ADN de un evento específico (expresado en porcentaje GM).
 Material homogéneo con cigosidad conocida.

Flujo de trabajo
Medidas para evitar la contaminación
1. Organización física del laboratorio y flujo de trabajo

Control de la contaminación
2. Buenas prácticas de laboratorio
 Descontaminar el área de trabajo con hipoclorito 10%, EtOH 70% y H20mq.
 Usar túnica y guantes sin talco.
 Realizar alícuotas de los reactivos de PCR.
 Usar materiales descartables.
 Usar puntas con filtro para evitar dispersión de aerosoles.
3. Uso de medidas específicas para la
descontaminación
 Radiación Ultravioleta.

Procedimiento general para
la detección de OGMs
Muestra de ADN
negativo
positivo
Si No
>1% GM
Requiere etiquetado
< 1% GM
No requiere etiquetado
Detección / screening
Identificación
Evento autorizado?
Cuantificación
Materia prima o
alimento
Homogenización
Extracción ADN
Cuantificación
SiNo
Prueba de inhibición
Amplificación de un gen
endógeno de la especie
*
*

Muestreo
Toma de
muestra en el
campo
Manejo de
la muestra
Homogenización
Toma de sub-muestra
Extracción de ADN
Amplificación por PCR
DETECCIÓN
Toma de sub-
muestra
Como asegurar la certeza de los resultados:
Obtener muestras representativas y homogéneas
del material para realizar la detección.
Optimizar los métodos de extracción de ADN.
Optimizar los protocolos de amplificación por
PCR.
Establecer y optimizar los límites de detección.

Extracción de ADN
 Protocolos validados
1.Lisis en presencia de detergentes y sales (CTAB, NaCl, EDTA, temperaturas elevadas)
2. Separación de proteínas y lípidos (Extracción con solventes orgánicos, centrifugación)
3. Precipitación del ADN (etanol 100%)
4. Lavado del ADN (EtOH 70%)
5. Disolución (H20mq)
 Kits comerciales
 Basados en la absorción de ADN a matrices de sílica
Doyle J. J., and Doyle J. L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11–15.

Cuantificación del ADN extraído
 Análisis espectrofotométrico del ADN (Absorbancia a 260nm)
Espectrofotometría de miscrovolúmenes (Nanodrop)
100ng ADNg.
PCR convencional
50ng ADNg.
qPCR

Amplificación por PCR
Es necesario utilizar controles en todos los análisis:
 Control Interno positivo (CIP): Este control permite verificar que se ha extraído
correctamente el ADN de la muestra y que no hubo inhibición. Generalmente se
utiliza un gen endógeno de la especie.
 Control positivo GM: Consiste en una muestra (o control) que contiene la secuencia
diana buscada. Confirma que la PCR funcionó correctamente.
 Control negativo de PCR : Consiste en un tubo que contiene H20 en lugar de
muestra. Permite detectar la presencia de contaminantes en los reactivos.
 Control Negativo (no-GM): Reacción que se lleva a cabo sobre ADN extraído de un
organismo vegetal, no GM. Permite detectar la existencia de falsos positivos.
Utilizado generalmente como control de contaminación de la extracción de ADN.

Análisis de la PCR - Electroforesis
M
uestra
G
en
endógeno
C
ontrol –
C
ontrol +
M
uestra
G
en
endógeno
C
ontrol –
C
ontrol +
POSITIVO NEGATIVO
Muestra C – (PCR) C + GM CIP C (no-GM) Resultado
+ - + + - Positivo
- - + + - Negativo
+ - + + + Inconcluso
- - + - - Inhibición
- - - - - Inconcluso

Variantes de la PCR utilizadas para la
detección de OGMs
PCR Multiplex
 Detección simultánea de varias secuencias diana (utilizado para detectar varios
eventos de transformación a la vez).
 Utiliza múltiples pares de cebadores
- Tm similar entre todos los pares
- Muy específicos
- No deben formar dímeros entre sí
 Los segmentos de ADN a amplificar, deben diferir en tamaño
para poder ser resueltos mediante electroforesis.
(PCR convencional)
PCR en Tiempo Real

Métodos Cuantitativos
Determinan la cantidad de material transgénico presente en
materias primas o alimentos procesados.
 PCR en Tiempo Real o qPCR
El fundamento de la Real Time PCR es el
mismo que el de la PCRconvencional.
Se basa en la detección del producto
amplificado ciclo a ciclo.
La PCR se acopla a la detección de un
reportero fluorescente, cuya señal aumenta
en proporción a la cantidad de producto de
PCR generado en cada ciclo.

Fundamento de la qPCR
A medida que progresa la reacción, se recogen los datos de fluorescencia (Rn) y se construye
un gráfico, respecto al tiempo de reacción (n° ciclos).
La cuantificación se realiza en la fase exponencial, donde la eficiencia es constante y existe
buena correlación entre el producto amplificado y la concentración inicial de moléculas
diana.

Cinética de amplificación
 Cuanto más bajo es el valor de Ct, mayor es la cantidad inicial de ADN genómico en la muestra
Ciclo umbral (Ct)
n° de ciclo en el cual la intensidad
de fluorescencia se eleva por
encima del ruido de la técnica y es
proporcional al número de copias
iniciales de la reacción.
Eficiencia de amplificación del 100%
Ct

Ventajas de la qPCR frente
a la PCR convencional
 Mayor precisión, y resolución.
 Mayor especificidad.
 Mayor sensibilidad (LOD =0.01% GM ~ 2-10 copias de ADN ).
 Se pueden realizar ensayos cualitativos y cuantitativos.
 No se requiere ningún proceso post-PCR
 Se ahorra tiempo y se minimiza la contaminación.
 Sistemas de detección de fluorescencia:
• Agentes intercalantes (SYBR Green)
• Sondas específicas marcadas con fluorocromos (TaqMan)

Agente intercalante SYBR Green
El colorante se une al surco menor del ADN bicatenario.
Como consecuencia de esta unión, se produce un
incremento de la señal fluorescente. A medida que
aumenta la cantidad de ADN sintetizado tras cada ciclo
del PCR, aumenta el número de moléculas de ADNdh y
así la emisión de fluorescencia.
Desventaja: No es específico de secuencia.
Debe recurrirse al análisis de la curva de
disociación

 El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de
secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de la
planta.
 Se realizan dos curvas patrón para realizar la cuantificación relativa:
Gen endógeno:
• Específico de la especie a analizar
• Presente en todas las variedades
• Copia única por genoma haploide
Secuencia transgénica
• Región común a distintas variedades (P-35S)
• Región específica (evento específico)
 Cálculo del porcentaje:
Cuantificación Relativa de OGMs
% GM = ADN GM x 100
ADN Referencia
Soja: Lectina
Maíz: Zeína, invertasa,
hmga

Interpretación y reporte de resultados
Expresión de un resultado negativo:
x Nunca debe expresarse como …. “la muestra no contiene OGM”…
Puede aparecer en el reporte …..”no se detectó la presencia la secuencia x”
“no se detectó el evento x”
Expresión de un resultado positivo:
…”Se detectó la presencia de la secuencia x”…
….”Se detectó la presencia del evento x”…
Cuantificación del contenido GM:
El contenido de OGM (especificar el OGM) según lo determinado por la detección de
(especificar la secuencia diana buscada) derivado de (especificar especie) es X ±
incertidumbre%. "(Especificar unidad utilizada.)

Etiquetado de alimentos
 Alimento que contiene <1% material GM:
No se etiqueta
 Alimento que contiene >1% material GM:
Se etiqueta
…..”Alimento genéticamente modificado”

Monitoreo de productos comercializados en Uruguay
 Fueron muestreados varios productos a base de maíz, tales
como:
Tortillas de maíz – 12 muestras
Productos de copetín (snacks) – 19 muestras
Cereales de maíz – 19 muestras
 Screening de OGMs: Promotor 35S, Terminados nos
 Identificación de eventos: Mon810, Bt11, Ga21, TC1507 y Bt176.
 Cuantificación: CAMVP-35S

Resultados
n° muestras
analizadas
presencia de CAMVP-
35S y T-nos
Contenido
GM> 1%
tortillas 12 8 4
snacks 19 16 10
cereales 19 8 4
Total 50 32 18
porcentaje 100% 64% 36%
Bt 11 Mon810 Ga21 TC1507 Bt176
positivos 24/32 21/32 10/32 4/32 0/32
porcentaje 75% 65,6% 31,2% 12,5% 0%

123
Dr. QF Claudio Martínez Debat / clau@fcien.edu.uy
LaTraMA ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria
Sección Bioquímica. Facultad de Ciencias. UdelaR.
Montevideo. Uruguay.
https://www.facebook.com/claudio.martinez.debat
Agradecimientos:
SB-FC,
CSIC,
DI.GE.GRA. (M.G.A.P.),
REDES-AT,
LB-IM,
Limay,
BePé
Andrés Carrasco (RIP)
Elena Álvarez-Buylla (UNAM)
CO del IX CCN –IBQ-UAA
Muchas gracias
por vuestra atención

Hay un ADN en mi quesadilla

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