Manual micro avanzada 2012

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS
ESCUELA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA AVANZADA

NOVENO SEMESTRE
(BIOTECNOLOGÍA)

INDICE DE PRÁCTICAS
NÚMERO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

TÍTULO
Comunidades microbianas
Caracterización bioquímica de microorganismos
Manejo y conservación de microorganismos
Adhesión bacteriana
Sinergismo bacteriano
Plásmidos
Detección de genes de virulencia bacteriana
mediante PCR
Células microbianas competentes
Transformación bacteriana
Cuantificación de proteínas
Análisis de proteínas bacterianas mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida
Bacterias lácticas

PÁGINA
1
3
7
9
12
14
18
22
24
26
28
40

ii

INDICACIONES PARA EL REPORTE ESCRITO
 GENERALES. Usar hojas blancas, tamaño carta. Escribir con letra arial número doce y margen izquierdo
de 3 cm, los otros de 2.5 cm, espacio entre líneas de 1.5 cm. Entregar en carpeta con broche baco. El
docente podrá señalar otra(s) forma(s) de elaborar el reporte. La entrega se realizará ocho días después de
haberla concluido.
 PORTADA. Deberá anotar el nombre de la asignatura, el número de la práctica y nombre de la misma,
número de equipo e integrantes, lugar y fecha.
 INTRODUCCIÓN. Deberá ser breve, no mayor de dos cuartillas y deberá anotar las citas bibliográficas
respectivas.
 PROPÓSITO(S) [OBJETIVO(S)]
 MÉTODO. Describa de forma detallada la forma en que se realizó la práctica.
 RESULTADOS. Es la parte medular del reporte. Describa y analice sus resultados, aquí anote los cuadros
comparativos que realizó junto con su(s) compañero(s). Es conveniente anexar tablas, gráficas, dibujos,
fotografías o esquemas de lo que observó durante la práctica. Si existen dibujos, éstos deberán estar
entintados y coloreados cuando corresponda.
 DISCUSIÓN. Esta es la parte más difícil de escribir, pero la más importante. Aquí se deben señalar las
diferencias y similitudes que se reportan en la literatura y comparar con los resultados de trabajos
similares o referencias documentales. Puedes utilizar cuadros comparativos u otra herramienta que te sea
útil para presentar la información.
 CONCLUSIONES. Redactar con relación al o los propósito(s) [objetivo(s)] y a los resultados obtenidos.
 CUESTIONARIO. Deberá contestar las preguntas que se encuentren al final de cada práctica, citará la
bibliografía empleada.
 REFERENCIAS DOCUMENTALES. Debe citar SIEMPRE la fuente de donde obtuvo la información, ya
sea escrita o visual. Utilice revistas especializadas, libros y páginas de Internet especializadas.

iii

PRACTICA No 1

“COMUNIDADES MICROBIANAS”

INTRODUCCION
Las comunidades microbianas se conforman por la asociación de microorganismos, por lo general mixtas y
que comprenden a las bacterias, hongos, algas y protozoos. Las comunidades pueden establecerse en una
amplia gama de hábitats naturales tales como el agua, el suelo, la superficie de plantas, el hombre y otros
animales. Las relaciones que establecen los miembros de una comunidad microbiana pueden ir desde
aquellas en las que los microorganismos se benefician, o bien, tener que rivalizar entre ellos.

OBJETIVO
Establecer una sucesión de comunidades microbianas mediante un sistema construido en el laboratorio,
denominado columna de Winogradsky.

MÉTODO
1. Construir una columna transparente de plástico usando una botella.
2. Añadir una fuente de celulosa (papel, hierba, lechuga, etc.). Permitir que la fuente de celulosa
permanezca en el fondo o en la zona intermedia, pero no en la superficie de la columna.
3. Añadir a la columna un volumen de barro del fondo de un río, mezclado con una fuente de azufre (p.
ej. un huevo).
4. Presionar el material hasta obtener una capa de alrededor de 10 cm. Procurar que salga lo más que se
pueda de burbujas de aire.
5. Añadir agua de río hasta casi llenar la columna (dejar unos 5 cm) y cubrir con una película de papel
parafilm.
6. Dejar en reposo la columna en una zona fresca e iluminada.
7. Examinar la columna durante 4 semanas,m anotando cambios de color y grosor de las capas
diferentes.
8. Tomar muestras de las capas para observar las comunidades microbianas.
9. Registre sus observaciones y trate de identificar los microorganismos. Para apoyarse puede consultar
las
ligas
http://www.microscope-microscope.org/gallery/mark-simmons/index.htm,
http://www.microbelibrary.org/library/parasite/3196-conjugation-in-paramecium-spp
y
http://www.microbelibrary.org/library/resources/3165-an-environmental-sample-which-showsciliates-preying-on-diatoms.

CUESTIONARIO
1. ¿Dónde se localizan los metanógenos y porqué?
2. Desarrolle una secuencia de etapas que puedan sucederse en el microcosmos de la columna,
partiendo de la fermentación de los azúcares derivados de la degradación de celulosa.
3. Luego de ver la animación sobre la columna de Winogradsky en la liga
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html ¿Qué tipo de
bacterias es la que degrada la celulosa y en qué nivel de la columna se encuentran? Cómo
4. ¿Cuál es la importancia de las bacterias del género Beggiatoa?
5. Mencione un ejemplo de relaciones microbianas que se establecen en la columna de
Wynogradsky.
1

REFERENCIAS DOCUMENTALES
 Gamazo C, López-Goñi I, R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología. 3ra. ed. Elsevier Masson.
231 pp.
 Singleton P. 1999. Bacterias en biología, biotecnología y medicina. 5ta ed. John Wiley & Sons.
España. pp. 515

2

PRACTICA No 2

“CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE
MICROORGANISMOS”

INTRODUCCION
La clasificación e identificación de microorganismos se basa principalmente en la determinación de la presencia o
ausencia de enzimas codificadas en el cromosoma bacteriano. Dichas enzimas dirigen el metabolismo microbiano
a través de diversas vías que pueden detectarse mediante medios de cultivo especiales. Los sustratos sobre los
cuales tales enzimas actúan, son generalmente incorporados a los medios de cultivo, además de un indicador que
detecte directamente la degradación del sustrato o bien la presencia de un subproducto metabólico.
OBJETIVO
Caracterizar aspectos de algunos microorganismos como su morfología macroscópica, microscópica, así
como rasgos bioquímicos que coadyuvan en su identificación.
PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Dependiendo de las cepas proporcionadas o de los materiales para sembrar, preparar placas Petri con
medios de cultivo selectivos/diferenciales como: agar de sal y manitol, agar EMB, agar de MacConkey,
agar nutritivo, así como tubos de ensayo de 13 x 100 mm con agar de hierro y triple azúcar (TSI), agar de
hierro y lisina (LIA), medio de movilidad, indol y ornitina (MIO), agar Citrato de Simmons y agar OF de
Hugh y Leifson. Considerar un volumen de 4 ml para el agar TSI, LIA y Citrato de Simmons, y 3 ml para
el medio MIO y el medio OF. Para el caso de los medios en placa Petri, considerar un volumen aprox. de
20 ml por caja.
2. Preparar también placas Petri con agar almidón y agar gelatina (ver anexo) para identificar actividad
enzimática en cepas de Bacillus ambientales que puedan aislarse.
3. Luego de la esterilización y gelificación adecuados, conservar los medios de cultivo en refrigeración y
cubiertos con papel de estraza (en el caso de las placas Petri).
4. A partir de las cepas conservadas en caldo LB-glicerol y con técnica aséptica, reactivar tomando escarchas
congeladas con el asa y sembrar por estría cruzada en agar nutritivo. Incubar las placas a 37º C durante 24
h. Mantener los viales en hielo cuando estén fuera del congelador.
2DA. SESIÓN
1. Luego de la incubación, corroborar la viabilidad de las cepas sembradas en agar nutritivo, efectuar
descripciones de las colonias y seleccionar dos colonias aisladas para su resiembra.
2. De manera alternativa, pueden sembrarse materiales diversos en las placas de Petri con el propósito de
aislar cepas de enterobacterias, bacterias de la piel, ambientales, hongos fitopatógenos, etc. Incubar en
condiciones adecuadas.
3. De las colonias seleccionadas, clasificar el tipo de bacteria según la tinción de Gram (puede consultar la
liga sobre la técnica de esta tinción en http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2833-gramstain), resembrar en los medios selectivos y/o diferenciales, así como en los medios en tubo para estudiar
su comportamiento bioquímico (sembrar como se indica en el cuadro 1).
4. Incubar a 37oC durante 24 h.
3RA. SESIÓN
1. Efectuar la lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas de las cepas estudiadas, con base en los
cuadros 2 al 7.

3

Cuadro 1. Método de inoculación de los tubos con medios para estudiar reacciones bioquímicas.
TIPO
DE
MEDIO DE CULTIVO
INOCULACIÓN
TSI
LIA
MIO
Citrato de Medio OF
Simmons
Estría
X
X
Picadura
X
X
Picadura + estría X
Cuadro 2. Interpretación del comportamiento bioquímico en agar de hierro y triple azúcar (TSI).
REACCIONES EN AGAR HIERRO DE KLIGER
Superficie
Fondo
Fermentación de glucosa
Alcalino –K- (rojo)
Acido –A-(amarillo)
Fermentación de glucosa
y lactosa
Producción de gas
Con burbujas
Producción de H2S
Precipitado negro

Para consultar el fundamento teórico del agar de hierro y triple azúcar, se recomienda consultar la liga
http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2842-triple-sugar-iron-agar-protocols y para observar
reacciones típicas en este medio de cultivo, consulte la liga http://www.microbelibrary.org/library/laboratorytest/2982-reactions-in-tsi-agar-slants.
Cuadro 3. Interpretación del comportamiento bioquímico en agar de hierro y lisina (LIA).
REACCIONES EN AGAR DE HIERRO LISINA
Superficie
Fondo
Utilización de lisina
Alcalino –K- (morado)
No utilización de lisina
Acido –A- (amarillo)
Cuadro 4. Interpretación del comportamiento bioquímico en el medio de movilidad, indol y ornitina (MIO).
REACCIONES EN EL MEDIO MIO
PRUEBA NEGATIVA
PRUEBA POSITIVA
Movilidad
Sin turbidez alrededor del sitio de Con turbidez en todo el medio
la picadura
Indol
Anillo amarillo
Anillo rojo
Descarboxilación de la ornitina
Fondo amarillo (reacción ácida)
Fondo morado o gris (reacción alcalina)
Cuadro 5. Patrones de reacción en la prueba de Oxidación-Fermentación (OF).
Resultado en:
Tubo abierto (sin aceite)
Tubo cerrado (con aceite)
Metabolismo
Ácido (amarillo)
Alcalino (verde)
Oxidativo
Ácido (amarillo)
Ácido (amarillo)
Fermentativo
Alcalino (verde)
Alcalino (verde)
No sacarolítico

Para consultar el fundamento y reacciones típicas en el medio OF se recomienda la liga
http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3151-oxidative-fermentative-test-protocol
Cuadro 6. Pruebas para detectar producción de H 2S, indol y utilización de citrato.
PRUEBA
MEDIO DE
REACTIVO EN
PRUEBA
CULTIVO
(ml) LUEGO DE
NEGATIVA
INCUBAR
Acido sulfhídrico
TSI o Kliger
Sin cambio
(picadura)
Indol
MIO o SIM
0.5 ml de reactivo
Anillo amarillo
de Kovacs o Erlich
Utilización de
Citrato de Simmons
Sin cambio
citrato
(estría); Citrato de
Christensen
(picadura y estría)

PRUEBA POSITIVA

Precipitado negro
Anillo rojo
Azul de Prusia

Puede consultar resultados de E. coli en cuanto a las pruebas de indol, consulte la liga
http://www.microbelibrary.org/library/2-associated-figure-resource/2573-escherichia-coli-and-klebsiella-pneumoniae-

4

on-sim-medium y para las pruebas de rojo de metilo, voges-proskauer y
http://www.microbelibrary.org/library/2-associated-figure-resource/2557-imvic-tests-of-e-coli
Cuadro 7. Pruebas para detectar actividad enzimática sobre almidón y gelatina.
MEDIO DE CULTIVO
REVELADOR
Agar almidón
Solución de yodo-lugol (Gram)

Agar gelatina

Solución de HgCl2 al 12.5%

citrato

en

la

liga

RESULTADO/INTERPRETACIÓN
Presencia de halo transparente alrededor
de la colonia; resto del medio se tiñe de
azul-morado:
ACTIVIDAD
AMILOLÍTICA
Ausencia de halo transparente alrededor
de la colonia, resto del medio se tiñe de
azul-morado:
NO
ACTIVIDAD
AMILOLÍTICA
Presencia de halo transparente alrededor
de la colonia; resto del medio aparece un
precipitado
blanco:
ACTIVIDAD
PROTEOLÍTICA
Ausencia de halo transparente alrededor
de la colonia, resto del medio aparece un
precipitado blanco: NO ACTIVIDAD
PROTEOLÍTICA

Para observar reacciones típicas de la degradación de estas biomoléculas, se recomienda la liga
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Tipo de desechos
Cultivos microbianos

Como descartarlos
Esterilice en autoclave de
acuerdo a las instrucciones del
docente

Tipo de contenedor
El señalado por el técnico del
laboratorio

CUESTIONARIO
1. Explique el fundamento de la técnica de Gram.
2. Según la información contenida en la liga http://www.microbelibrary.org/library/bacteria/3184degradation-of-biological-macromolecules-by-bacillus-species ¿Cuál es la utilidad de las pruebas
para detectar actividad amilolítica y proteolítica en Bacillus spp.?
3. ¿Cuál es el fundamento para la detección del metabolismo oxidativo y fermentativo en el medio OF?
4. Mencione como se clasifican los microorganismos con base en su requerimiento de oxígeno.
5. Investigue que métodos automatizados existen para identificar microorganismos con base en su
comportamiento bioquímico.
 Brock, T.D., & M.T. Madigan. Microbiología. 1991. Prentice-Hall hispanoamericana. México. D.F.
 Forbes, B.A., Sahm, D.F., and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scott´s Diagnostic microbiology. 11th
ed. Mosby. U.S.A. 1069 pp.
 Gutiérrez Jiménez, J., Luna Cazáres, L.M. 2009. Estampas del mundo microbiano. Colección Jaguar
UNICACH. 53 pp.
 Koneman, E.W., Allen, S.D., Dowell, V.R., Janda, W.M., Sommers, H.M., and W.C. Winn. 1988.
Diagnóstico microbiológico. 3ra. Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 909
pp.
 Mac Faddin, JF. 1990. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.
Edit. Médica Panamericana. México, D.F.
5

ANEXOS.
Agar almidón.
Caldo nutritivo deshidratado
Almidón soluble
Agar bacteriológico
Agua, aforar a
pH final: 6.8-7.2

8.0 g
5.0 g
15.0 g
1000 ml

Disolver el agar y el caldo nutritivo en el agua, añadir el almidón y calentar a ebullición. Esterilizar en autoclave antes de
envasar a cajas Petri.
Agar gelatina.
Caldo nutritivo deshidratado
Gelatina
Agar bacteriológico
Agua, aforar a
pH final: 7.0

8.0 g
30.0 g
7.5 g
1000 ml

Hidratar la gelatina en el agua destilada de 10 a 15 min, calentar a 50º C y añadir el caldo nutritivo, ajustar el pH.
Agregar el agar, calentar para disolver y esterilizar en autoclave. Envasar en cajas Petri.
HgCl2 al 12.5%
HgCl2
HCl concentrado
Agua destilada

15.0 g
20.0 ml
100.0 ml

6

“MANEJO Y CONSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS”

PRACTICA No 3

INTRODUCCIÓN
La conservación de los microorganismos es de capital importancia para estudios ulteriores como su caracterización
biológica. Los procedimientos que implican dicha conservación constituyen el punto de partida de todo estudio
biológico, dado que se preservan los elementos genotípicos y genotípicos. Asimismo, el uso apropiado de
criopreservadores protege la viabilidad microbiana, la cual se conserva a bajas temperaturas. Otro procedimiento
como la liofilización es también un método aceptable, sin embargo es más costoso y reduce el porcentaje de
viabilidad microbiana.
OBJETIVO
Que el alumno aprenda algunas técnicas básicas para la conservación de microorganismos, con la finalidad de
preservar rasgos fenotípicos y genotípicos.
NORMAS DE SEGURIDAD
Tipo de riesgo
Quemadura por vapor de agua

Como evitarlo
Protegerse con la bata de manga
larga. No abrir la válvula de
escape de vapor abruptamente,
sobre todo si hay personas cerca
del autoclave

Como proceder en caso de
accidente
Sumergir de inmediato en agua
fría la parte afectada. Aplicar una
crema con algún antibiótico como
sulfadiacina de plata y luego cubrir
con una gasa para proteger del
polvo y otras lesiones.

PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Preparar la cantidad necesaria de caldo Luria-Bertani (LB) más glicerol al 20%. Distribuir en alícuotas de
1.5 ml en tubos de polipropileno (tipo eppendorf o bien viales con tapón de rosca).
2. Asimismo, preparar cajas Petri con agar LB (considerar aprox. 20 ml/caja).
3. Preparar caldo papa dextrosa para la conservación de hongos fitopatógenos. Cortar 200 g de papas en
trozos y colocar en 500 ml de agua destilada, dejarlos coser. Colectar el líquido hervido y filtrar a través
de algodón con gasa en un matraz Erlenmeyer; agregar 10 g de dextrosa. Esterilizar en autoclave a 121º C
por 15 min. Se recomienda que al enfriarse se añadan 0.5 g de estreptomicina para evitar la contaminación
bacteriana. Si se requiere preparar agar papa dextrosa, agregar agar bacteriológico al 1.5%.
4. Preparación de la arena. Tamizar arena común para quitar piedras u otro tipo de material. Agregar agua
corriente y quitar el exceso. Hacer este lavado por otra ocasión. Extender la arena húmeda sobre un
plástico negro, permitir que se seque a temperatura ambiente y de preferencia a la luz natural. Una vez
seca, colocar en bolsas de alta densidad y esterilizar en autoclave a 121º C por 20 min. Dejar 1 día y
transferir la arena a tubos de 15 x 150 mm con tapón de rosca; volver a esterilizar bajo las condiciones
mencionadas arriba. Guardar los tubos en refrigeración hasta su uso.
5. Preparar y esterilizar hisopos con algodón.
6. Considerar que si un microorganismo requiere de algún antibiótico para su crecimiento, añadir al medio
LB estéril y enfriado a 40-50º C a la concentración requerida. Algunos antibióticos (como la ampicilina)
necesitan de esterilización previa por filtración.
7. Luego de preparar los medios de cultivo (en viales, cajas) conservar a 4oC hasta su uso.
7

2DA. SESIÓN
1. A partir de un crecimiento axénico de un hongo (Fusarium, Penicillium), obtener 3 fragmentos con un
sacabocados y transferir con una pinza de disección a tubos con caldo papa dextrosa. Incubar hasta por 7
días según lo requiera el hongo. Si no se tiene un cultivo axénico de hongos, aislar uno a partir de alguna
fruta con indicios de contaminación por hongos; sembrar un fragmento afectado de la fruta en agar papa
dextrosa. Efectuar una tinción con azul de metileno y diurex del micelio fúngico, observar con el objetivo
seco débil y fuerte.
2. A partir de cultivos axénicos bacterianos proporcionados por el profesor o bien aislados de la práctica 2,
inocular los caldos LB con una colonia aislada. Incubar durante 2 h a 37oC.
3. Posteriormente, embeber un hisopo estéril con el cultivo líquido bacteriano recién sembrado y estriar de
forma masiva la superficie de un agar LB.
4. Incubar a 37oC durante 24 h.
3RA. SESIÓN
1. Si se observa crecimiento de los hongos en el caldo papa-dextrosa, tomar 1 ml y depositar en el tubo con
arena estéril. Dejar en posición vertical y verificar si se sedimentó el material. Si esto no ocurrió al día
siguiente, añadir otros 500 l. Incubar los tubos con el hongo a temperatura ambiente o refrigeración para
una mayor duración.
2. Etiquetar los tubos con caldo LB-glicerol con el nombre de las cepas bacterianas a conservar.
3. Sacar las placas de Petri y seleccionar aquellas con crecimiento confluente y cosechar bajo condiciones
asépticas y de forma exhaustiva con ayuda de un asa bacteriológica.
4. Colectar el material en los viales, depositando desde el fondo del vial. Homogenizar rotando el asa dentro
del caldo.
5. Conservar a -20oC (mantenimiento a corto plazo) aunque preferentemente a -70oC para mantenimiento a
largo plazo.
Tipo de desechos

Como descartarlos
docente

Tipo de contenedor
laboratorio

CUESTIONARIO
1. Defina los términos clona y cepa. ¿a qué se define como cepa silvestre?
2. ¿Qué sustancias se pueden emplear como preservadores durante la conservación de microorganismos?
3. ¿Qué otras técnicas hay para la conservación de microorganismos?
4. Investigue como se pueden conservar hongos microscópicos y protozoarios.
5. Qué estrategia utilizaría para recuperar por separado un conjunto de microorganismos que coexisten en
una muestra de agua encharcada, para luego conservarlos.
 Suslov, T.V., and M.N. Schroth. 1981. Bacterial culture preservation in frozen and dry-film
methylcellulose. Appl. Environ. Microbiol. 42:872-77.
 Vargas-Flores, ME. 2003. Caracterización de tres cepas de Beauveria brogniartii (Sacardo) Petch y su
virulencia en Phthorimaea operculella (Zeller) y Symmetrischema tangolias (Gyen). Tesis de
Licenciatura. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Perú.
 http://biowww.net/forum/reagents.php
8

PRACTICA No 4

“ADHESIÓN BACTERIANA”

INTRODUCCION
La adherencia es una estrategia primordial que utilizan algunos microorganismos con el propósito de colonizar
tejidos de un huésped. Tal evento es facilitado por estructuras microbianas especializadas denominadas adhesinas,
las cuales pueden ser de naturaleza fimbrial o no. La adherencia facilita el establecimiento y persistencia de dichos
organismos en aquellos nichos ecológicos, dado que la unión sitio específica que median, les permite a los
microorganismos resistir mecanismos de defensa innatos que poseen los hospederos evitar la colonización por
gérmenes invasores. Además, la expresión de dichas estructuras no solo permite el establecimiento de
microorganismos en seres vivos, sino que también la colonización de la materia inanimada.
OBJETIVO
Analizar uno de los eventos que implican ventajas en algunos microorganismos como su capacidad de adhesión a
sustratos inanimados como el cristal.

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NORMAS DE SEGURIDAD
PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN.
1. Preparar tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca con 3 ml de caldo soya tripticaseína (TSB) que
contengan 0, 0.25, 1 y 2.5% de glucosa.
2. Preparar cajas Petri con agar soya tripticaseína (TSA) que contengan 0, 0.25, 1 y 2.5% de glucosa.
3. Dejar en prueba de esterilidad a 37º C por 24 h. Si los medios no están contaminados, conservar en
refrigeración con el medio hacia arriba.
2DA. SESIÓN.
1. Sembrar por estría cruzada las cepas de E. coli ATCC 25922, E. coli 042 y Staphylococcus aureus en
cada una de las concentraciones de TSA-glucosa. Incubar a 37º C por 24 h. A partir de estos cultivos,
resembrar una colonia axénica de cada cepa en caldos TSB – glucosa a la concentración de glucosa
que corresponda. Incubar. Incubar toda la noche a 37º C
3RA. SESIÓN.
1. Remover el contenido de cada tubo, desechar en un contenedor con cloro al 1%.
2. Añadir 2 ml de Safranina de Gram, dejar reposar durante 2 min.
3. Decantar el colorante en el contenedor de desechos y dejar secar los tubos toda la noche colocándolos
boca abajo sobre papel absorbente.
4. Efectuar la lectura de las pruebas, considerando una prueba positiva cuando se aprecie una capa
adherente de material teñido en la superficie interna del tubo. Estimar la adherencia como: ausente
(0), débil (+), moderada (++) o fuerte (+++). No considerar la prueba positiva si observa la presencia
de material teñido en la interfase líquido-aire. de la siguiente manera:
5. Construir una tabla conjuntando los resultados de todos los equipos.
6. Construir un gráfico para observar la capacidad de adherencia de cada cepa.
Tipo de desechos

Como descartarlos
docente

Tipo de contenedor
laboratorio

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.

¿Qué estructuras bacterianas favorecen la adhesión?
¿Cuál es la importancia de la adhesión bacteriana?
¿Qué estrategias utilizaría para bloquear la adhesión bacteriana?
¿Cuáles fueron las ventajas y desventajas al comparar las técnicas de adhesión en tubo y la del
ensayo en microplaca? Apoyarse en la referencia J. Microbiol. Meth. 40:175-179.
5. ¿Qué son las biopelículas y cómo se relacionan con la adherencia?

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 Cravioto A., Cross R.J., Scotland S.M., Rowe B. 1979. An adhesive factor found in strains of
Escherichia coli belonging to the traditional infantile enteropathogenic serotypes. Curr. Microbiol. 3:
95:99.
 Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, Savic B, and M. Svabic-Vlahovic. 2000. A modified microtiterplate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Meth. 40:175-179.
 Watnick, P., and R. Kolter. 2000. Biofilm, city of microbes. J. Bacteriol. 182:2675-9.

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PRACTICA No 5

“SINERGISMO BACTERIANO”

INTRODUCCION
El fenómeno lítico entre Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae fue originalmente observado en
durante un brote de escarlatina en cultivos de leche para la búsqueda de Streptococcus hemolíticos. Las colonias
de Streptococcus estaban rodeadas de zonas de hemólisis completa cuando crecían en proximidad a colonias de
Staphylococcus beta-hemolítocos. Así, la beta-lisina de S. aureus actúa sinérgicamente con el factor CAMP
producido por Streptococcus agalactiae hemolíticos o no. Dicha reacción sinérgica resulta en una zona de
hemólisis grande y fácilmente visible en la región próxima a los dos cultivos.
OBJETIVO
Observar la acción sinérgica entre la lisina producida por ciertas cepas de Staphylococcus aureus con un factor
proteico (factor CAMP) secretado por cepas hemolíticas o no de Streptococcus agalactiae.
PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Sembrar por estría cruzada cepas de Staphylococcus aureus (secretora de beta-lisina), Streptococcus
agalactiae y Escherichia coli en agar nutritivo.
2DA. SESIÓN
1. En una placa de agar sangre de carnero, inocular la cepa de S. aureus mediante una estría central
recta.
2. Inocular las cepas prueba, es decir S. agalactiae y E. coli también mediante una estría simple recta,
aunque en ángulo de 90º con respecto a la estría del S. aureus (fig. 3ª). Las estrías de los organismos
prueba no debe tener contacto con la estría de S. aureus, procurar dejar un espacio de aprox. 2 mm.
3. Incubar las placas a 37º C durante 24 h.
3RA. SESIÓN
1. La presencia de una zona amplia de hemólisis en forma de “media luna” o “punta de flecha” en la
vecindad de estrías de S. aureus y S. agalactiae se considera como una prueba positiva. Si no aparece
tal zona de hemólisis la prueba se considera negativa.

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Organismo de prueba
(Streptococcus
agalactiae, E. coli)

Fig. 3ª. Patrón de inoculación para la prueba de CAMP.
Tipo de desechos

Como descartarlos
docente

Tipo de contenedor
laboratorio

CUESTIONARIO
1. Explique los tipos de relaciones biológicas que existen y ejemplifique.
2. ¿Cuál es la utilidad de la prueba CAMP para Streptococcus agalactiae? Consulte la liga
http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3086-camp-test-protocols
3. ¿Qué otros organismos pueden estudiarse aprovechando la acción sinérgica evaluada en la prueba de
CAMP?
4. ¿Cuál es la importancia de la competencia bacteriana cuando ciertos organismos se encuentran
colonizando tejidos de hospederos?
5. ¿Cuál es el papel de metabolitos bacterianos como las bacteriocinas en la competencia microbiana?
 Gutiérrez Jiménez J & Luna Cazáres LM. 2009. Estampas del mundo microbiano. Colección Jaguar.
UNICACH. 53 pp.
 Koneman, E.W., Allen, S.D., Dowell, V.R., Janda, W.M., Sommers, H.M., and W.C. Winn. 1988.
Diagnóstico microbiológico. 3ra. Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 909
pp.
13

“PLÁSMIDOS”

PRACTICA No 6

INTRODUCCION
Los plásmidos bacterianos constituyen un tipo de elemento genético extracromosomal con replicación autónoma
que si bien no codifica funciones vitales para la célula bacteriana, provee ventajas ecológicas al microorganismo
como: codificación de resistencia a antibióticos, metales pesados, detergentes, adhesión, toxinas, etc. Dichos
elementos génicos son frecuentemente usados como “acarreadores de información génica” y pueden ser
construidos en el laboratorio para diversos fines.
OBJETIVO
Efectuar la extracción de plásmidos bacterianos mediante la técnica de lisis alcalina, y visualizar el material génico
obtenido mediante electroforesis en agarosa.
NORMAS DE SEGURIDAD
Tipo de riesgo

Como evitarlo

Efecto mutagénico por exposición
a la solución de bromuro de etidio

Usar guantes y careta durante el su
manejo. No añadir bromuro de
etidio a la cámara de electroforesis
o alguna de sus partes. Contener la
solución en un recipiente
exclusivo.

Fenol: corrosivo a la piel, fatal si
se ingiere, inhala o absorbe a
través de la piel

Usar guantes apropiados, gafas y
careta, bata y mandil en campana
de extracción.

accidente
Ojos, piel: lavar con abundante
agua durante al menos 15 min. en
la ducha de seguridad. Desechar
ropa y zapatos contaminados. Para
derrames, use un absorbente para
secar el bromuro de etidio. Limpiar
también cualquier traza de esta
sustancia en estado sólido con
mucha precaución e intentando no
crear polvo. Elimínar la sustancia
en un contenedor hermético y
tírese dentro de un cubo etiquetado
Si se ingiere y está consciente, dar
carbón activado en agua, aceite de
oliva o margarina. Provocar el
vómito. Si se inhala, sacar al aire
fresco. Si no respira, administre
respiración artificial. Si cuesta
trabajo respirar, administre
oxígeno. Si hay contacto con la
piel, lave inmediatamente con
abundante agua. Limpie la piel con
torundas embebidas en glicerol o
polietilénglicol por 10 min. Llevar
a un lugar con equipos de
resucitación.

14

PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Siembre en agar LB las cepas: E. coli HB101, E. coli 042, E. coli HB101/pPic1 y E. coli
HB101/pCEFN1. Incube a 37º C durante 24 h.
2DA. SESIÓN
2. Transfiera una sola colonia del microorganismo en estudio en 2 ml de caldo LB con el antibiótico
apropiado (si es el caso). Incubar toda la noche a 37º C con agitación vigorosa.
3. Coloque 1.5 ml del cultivo en un tubo tipo eppendorf y centrifugue a 12,000  g durante 10 min a 8º
C.
4. Remover el medio por aspiración.
5. Resuspender el paquete bacteriano en 100 l de solución 1 fría y agite vigorosamente.
Solución 1 (GTE).
Glucosa
50 mM
Tris-Cl
25 mM (pH 8.0)
EDTA
10 mM (pH 8.0)
La solución 1 puede prepararse en fracciones de 100 ml, autoclavear por 15 min. y almacenar a 4 oC. Hay que
asegurarse de que el paquete bacteriano esté completamente disuelto en solución, lo cual puede lograrse agitando en
vórtex.
6. Añadir 200 l de solución 2 recién preparada y mezcle por inversión rápidamente durante 5 veces. No
use el vórtex y almacene el tubo en hielo durante 5 min.

Solución 2.
NaOH 0.2 N, no refrigerar (diluido recientemente de un stock a 10 N)
SDS 1%
7. Añadir 350 l de solución 3 fría, agitar en vórtex y dejar 5 min en hielo
Solución 3.
Acetato de potasio 5 M
60 ml
Ácido acético glacial
11.5 ml
H2O
28.5 ml
La solución resultante es 3 M con respecto al potasio y 5 M con respecto al acetato.
8. Cierre el tubo y agite en vórtex generosamente en posición invertida durante 10 s para dispensar la
solución a través del material viscoso bacteriano. Almacene el tubo en hielo durante 5 min.
9. Centrifugue a 12,000  g durante 10 min. a 8oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco.
10. Hacer extracción vol/vol con fenol: cloroformo (300 l de fenol + 300 l de cloroformo) y mezcle en
vórtex. Centrifugue a 12,000  g por 5 min a 8º C, y transfiera el sobrenadante a un tubo fresco.
11. Precipite el DNA con 2 volúmenes de etanol (500 l) o 1 volumen de isopropanol, mezcle por
inversión y deje toda la noche a –20º C.
12. Centrifugue a 12,000  g durante 10 min a 8º C.
15

13. Remueva el sobrenadante cuidadosamente por aspiración. Coloque el tubo en posición invertida sobre
papel secante y permita que el exceso de líquido drene.
14. Enjuague el paquete con 1 ml de etanol al 70% frío. Remueva el sobrenadante como se describió
anteriormente y permita que el paquete de ácido nucleico se seque a temperatura ambiente sobre
papel secante.
15. Resuspenda el paquete en 30-50 l de agua desionizada estéril. Se puede resuspender en 50 l de TE
(pH 8.0) que contenga RNasa pancreática (20 g/ml). Conservar a –20º C.
16. Agite en vórtex brevemente y almacene a –20º C.
17. Construya un gel de agarosa al 1% con regulador TBE (Tris-ácido bórico-EDTA) y cargue en los
carriles alícuotas del plásmido obtenido. Mezcle previamente con un regulador de corrimiento y
efectúe el corrimiento a 100 V en una cámara de electroforesis horizontal.
18. Tiña el gel en una solución de bromuro de etidio (10 g/mL) durante 15 min. y luego transfiera a un
recipiente con agua destilada.
19. Coloque el gel en un transiluminador y analice el gel en busca de bandas de ADN plasmídico luego
de su exposición a luz ultravioleta.
20. Documente la imagen con ayuda de una cámara digital en el modo de blanco y negro.
Tipo de desechos
Como descartarlos
Tipo de contenedor
Solución de bromuro de etidio
Descontaminar las soluciones
De plástico con tapa hermética
(BrEt)
concentradas de BrEt mediante: i)
añadir suficiente agua para diluir
y reducir la concentración de
BrEt, ii) añadir un volumen de
KMNO4 0.5 M, mezclar y añadir
1 volumen de HCl 2.5 N, mezclar
y dejar en reposo durante 18 h,
iii) añadir 1 volumen de NaOH
2.5 N, mezclar y desechar la
solución.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las conformaciones que pueden adoptar los plásmidos bacterianos? Consulte la
liga http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=77&sim=314&cnt=2128 (debe registrarse para
tener acceso gratuito a la animación y otros recursos virtuales)
2. ¿Cuál es la utilidad de los plásmidos?
3. ¿Qué es el SDS (dodecil sulfato de sodio) y de qué manera participa en la técnica para la
extracción de un plásmido?
4. La solución III usada en el protocolo de lisis alcalina es
a. Solución de lisis
b. Solución de resuspensión
c. Solución neutralizante
d. Solución desnaturalizante
5. ¿Cómo se puede “curar” una bacteria de un plásmido?

16

 Eslava, C., Navarro-García, F., Czeczulin, J.R., Henderson, I.A., Cravioto, A., and J.P. Nataro. 1998.
Pet, an autotransporter enterotoxin from enteroaggregative Escherichia coli. Infect. Immun. 66:315563.
 Henderson, I.R., J. Czeczulin, C. Eslava, F. Noriega, and J.P. Nataro. 1999a. Characterization of pic,
a secreted protease of Shigella flexneri and enteroaggregative Escherichia coli. Infect. Immun.
67:5587-96.
 Sambrook, J., MacCallum, P., and D. Russell. 2006. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed.
CSHL Press.
 http://biowww.net/forum/reagents.php

17

“DETECCIÓN DE GENES DE VIRULENCIA
BACTERIANA MEDIANTE PCR”

PRACTICA No 7

INTRODUCCION
En 1984, Kary B. Mullis y un grupo de científicos en la compañía biotecnológica Cetus Corporation, desarrollaron
la técnica conocida como reacción en cadena de la polimerasa o PCR. Esta técnica consiste en amplificar el ADN
mediante un proceso in vitro; de esta manera se pueden obtener grandes cantidades de un fragmento de ADN
específico a partir de un molde de ADN complejo en una reacción enzimática simple. Para la técnica se emplea una
ADN polimerasa termoestable y dos oligonucleótidos que sirven como iniciadores para sintetizar una fragmento de
ADN específico a partir de un ADN molde monocatenario. Esta prueba tiene diversas utilidades, tal como la
investigación de genes que codifican factores de virulencia en bacterias, que con la sensibilidad y rapidez se
pueden identificar el mismo día un patógeno bacteriano comparado con los días que toma la identificación con
métodos fenotípicos.
OBJETIVO
Que el alumno sea capaz de amplificar genes que codifican factores de virulencia bacteriano mediante la PCR.
NORMAS DE SEGURIDAD
Tipo de riesgo

Como evitarlo

Efecto mutagénico por exposición
a la solución de bromuro de etidio

Usar guantes y careta durante el su
manejo. No añadir bromuro de
etidio a la cámara de electroforesis
o alguna de sus partes. Contener la
solución en un recipiente
exclusivo.

Quemadura por Luz ultravioleta
(U.V.)

No exponer el rostro o la piel
directamente, usar bata blanca de
manga larga. Protegerse mediante
caretas de plástico.

accidente
Ojos, piel: lavar con abundante
agua durante al menos 15 min. en
la ducha de seguridad. Desechar
ropa y zapatos contaminados. Para
derrames, use un absorbente para
secar el bromuro de etidio. Limpiar
también cualquier traza de esta
sustancia en estado sólido con
mucha precaución e intentando no
crear polvo. Elimínar la sustancia
en un contenedor hermético y
tírese dentro de un cubo etiquetado
Aplicar compresas de agua fría o
ungüentos sin anestésicos sobre la
piel afectada. Los comprimidos
con corticosteroides pueden ayudar
a aliviar el dolor e inflamación

18

PROCEDIMIENTO
1RA SESIÓN
Reactivar las cepas de referencia en agar LB: a) E. coli ATCC 25922 (control negativo), b) E. coli 042 (prototipo
de E. coli enteroagregativa).
Reactivar las cepas de E. coli silvestres que se hayan aislado de alguna fuente y se hayan mantenido conservadas a
-20º C.
2DA. SESIÓN
Obtención del ADN bacteriano.
 Tomar una colonia de cada cepa y diluirla en 1 ml de agua destilada estéril en un tubo de
polipropileno tipo eppendorf, someter a ebullición durante 1 minuto.
Preparación de la mezcla maestra (Master Mix) conforme a lo siguiente y según Cerna et al. (2003):
 Para una sola muestra se debe realizar la mezcla a las concentraciones y en el orden siguiente:
Componente
Volumen (µl)
Agua desmineralizada o MilliQ
13.8
Regulador 10X
2.5
Solución de MgCl2 50 mM
1
dNTP´s 2.5 mM
2
a
3.5
Mezcla de iniciadores 10 M
0.2
Taq polimerasa 5 U/l











Multiplicar cada uno de los volúmenes citados en la tabla por el número de muestras + 1/3 que se
analizarán por PCR.
Todos los reactivos deberán mantenerse en hielo y la Taq polimerasa deberá mantenerse a -20º C y
sacar únicamente al momento de usarse, procurando mantenerla el menor tiempo posible fuera del
congelador.
Homogeneizar el Master Mix en un agitador tipo vórtex y enseguida distribuir 23 µL a sendos tubos
para PCR, según el número de muestras.
Agregar 2 µL del ADN de la muestra (a partir del sobrenadante del tubo donde se hirvió la colonia
bacteriana) a cada tubo conteniendo la mezcla Master Mix. Luego de este paso, las concentraciones
finales en cada tubo de reacción quedan de la siguiente manera: Tris-HCl (pH 8.3), 10 mM; KCl, 50
mM; MgCl2, 2 mM; gelatina, 100 µg/mL; glicerol, 5% (vol/vol); dATP, dCTP, dGTP y dTTP 200
µM cada uno; Taq polimerasa 1 U/25 µL.
Centrifugar cada tubo durante unos segundos.
Agregar aproximadamente dos gotas de aceite mineral estéril a cada tubo.
Tapar los tubos y colocar en el termociclador (el usado en la Facultad de Ciencias Biológicas es un
termociclador eppendorf Mastercycler gradient) bajo las siguientes condiciones: 50°C (2 min, 1
ciclo); 95°C (5 min, 1 ciclo); 95,55 y 72 °C (45 segundos a cada temperatura, 40 ciclos) y un paso de
extensión final (10 min, 72 °C).
Dejar el producto de PCR a 4°C hasta su manipulación (el termociclador usualmente se programa
para que al término de la reacción se mantenga a 4º C).

19

3RA. SESIÓN
Análisis de los productos de PCR mediante electroforesis en agarosa.
 Preparar un gel de agarosa al 2.5 % (usar amortiguador TAE 1X como disolvente).
 Mezclar 4 µl de cada muestra con 1-2 µl de regulador para corrimiento.
 Depositar cada muestra en un carril, incluir un marcador de peso molecular (para este caso específico
usar 1 µl de una escalera de 100 pb).
 Correr la electroforesis a 100 Volts durante aproximadamente 50 min.
 Teñir el gel mediante una tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) durante 30 min o con el colorante
Sybr Green (Invitrogen Cat. S33102) durante 3 h (diluido 1X).
 Fotografiar el gel con una cámara digital inmediatamente y luego de exponer brevemente el gel a la
luz UV en un transiluminador.
 Interpretar con base a lo reportado por Cerna et al. (2003).
 Desechar el gel y todo lo que haya estado en contacto con el BrEt en una bolsa; remitir al almacén de
RPBI o bien descontaminar como se indica en las normas de bioseguridad.
a
Los iniciadores usados en la práctica se detallan a continuación:
INICIADOR
AAPROBE Forward + Reverse
(F-R)
AggR F-R
AAP F-R

CONCENTRACIÓN
10 µM

VOLUMEN PARA LA MEZCLA
500 µl

10 µM
10 µM

332 µl
168 µl

Tipo de desechos
Solución de bromuro de etidio
(BrEt)

Como descartarlos
Tipo de contenedor
Descontaminar las soluciones
De plástico con tapa hermética
concentradas de BrEt mediante: i)
añadir suficiente agua para diluir
y reducir la concentración de
BrEt, ii) añadir un volumen de
KMNO4 0.5 M, mezclar y añadir
1 volumen de HCl 2.5 N, mezclar
y dejar en reposo durante 18 h,
iii) añadir 1 volumen de NaOH
2.5 N, mezclar y desechar la
solución.

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.

Investigue como se diseñaron los iniciadores empleados en esta práctica para la PCR.
¿Cuál es la importancia de detectar estos genes en Escherichia coli?
Investigue otros genes de virulencia en E. coli que puedan detectarse mediante PCR.
Explique cómo puede cuantificarse el ADN de un gen que se amplifica por PCR. Apoyarse en la
lectura de la liga http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3656-polymerase-chainreaction
5. ¿Cuáles son las ventajas y/o desventajas de una PCR de punto final vs una PCR multiplex?
20

 Arnheim N. 1992. Polymerase chain reaction strategy. Annu. Rev. Biochem. 61:131-156.
 Cerna JF, Nataro JP, and Estrada García T. 2003. Multiplex PCR for detection of three plasmid-borne
genes of Enteroaggregative Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 41:2138-2140.

21

PRACTICA No 8

“CÉLULAS MICROBIANAS COMPETENTES”

INTRODUCCION
La capacidad de un microorganismo para unir e incorporar ADN exógeno se denomina competencia. Esta
capacidad puede ser natural o químicamente inducida. El descubrimiento de tal fenómeno fue hecho por Grifith en
1928, con experimentos en los que empleó cepas de neumococo (Stretpcococcus pneumoniae), una bacteria
naturalmente competente. Poco después en 1944, Avery, MacLeod y McCarty demostraron que el factor
transformante estaba constituido de ADN. La adquisición natural entre organismos diferentes ha favorecido la
transferencia horizontal, en tanto que la artificial es una técnica básica en la ingeniería genética.
OBJETIVO
Inducir en la célula bacteriana la capacidad de captar ADN exógeno con la finalidad de que pueda
adquirir elementos genéticos adicionales para su transformación genotípica y fenotípica.
PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Siembre la cepa de E. coli ATCC 25922 en 3 ml de caldo LB e incubar a 37 ºC durante 16 h a 150
rpm.
2DA. SESIÓN
2. Tomar de dicho cultivo 300 µl e inocularlos en un tubo con 10 ml de caldo LB, incubar bajo las
mismas condiciones durante 90 min (fase log tardía. Opcionalmente se distribuyen los 10 ml del
cultivo en sendos tubos eppendorf de 1.5 ml (aprox 7 tubos).
3. Centrifugar los tubos a 7000 rpm durante 10 min a 4º C, decantar el sobrenadante y resuspender la
pastilla obtenida en 4 ml (400 µl) de MgCl2 0.1 M frío. Mantener los tubos en hielo durante 10 min.
4. Centrifugar bajo las condiciones citadas arriba, decantar el sobrenadante y resuspender en 4 ml (400
µl) de CaCl2 0.1 M frío, dejar reposar los tubos en hielo durante 1 h.
5. Centrifugar nuevamente en las mismas condiciones, desechar y resuspender con 4 ml (400 µl) de
CaCl2. Las células obtenidas en este paso se denominan “competentes” y se distribuyen en alícuotas
de 100 µl en tubos eppendorf de 1.5 ml (estériles). Si se desea preservar dichas células, se agrega
glicerol al 20% y se conservan a –70 ºC hasta su uso.
Tipo de desechos

Como descartarlos
docente

Tipo de contenedor
laboratorio

22

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.

¿Qué características tiene las cepas microbianas destinadas para la competencia bacteriana?
Mencione ejemplos de microorganismos que son competentes naturales.
¿Qué mecanismos emplean bacterias competentes para incorporar ADN exógeno?
Explique el fundamento de la técnica empleada para obtener células competentes.
¿Qué factores pueden afectar la competencia hecha en el laboratorio?





Brock, T.D., & M.T. Madigan. Microbiología. 1991. Prentice-Hall hispanoamericana. México. D.F.
Dragui, J.A.and P.E. Turner. 2007. DNA secretion and gene-level selection in bacteria. Microbiology.
152:2683-88.
Sambrook, J., MacCallum, P., and D. Russell. 2006. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed.
CSHL Press.

23

PRACTICA No 9

“TRANSFORMACIÓN BACTERIANA”

INTRODUCCION
Algunas células microbianas son susceptibles de la adquisición de material genético adicional a su carga génica;
tales eventos pueden ser mediante transformación, mediante el cual se capta ADN del ambiente, transducción, en el
que participan virus como agentes que “inyectan” el material genético y la conjugación, proceso que implica la
interacción entre dos células microbianas para la transferencia de material genético. Tales eventos pueden
efectuarse de forma in vitro, y el desarrollo de ellas han sentado las bases de la tecnología de ADN recombinante y
poder obtener vacunas, fármacos (insulina, somatotropina).
OBJETIVO
Aprender el fundamento y un método de transformación artificial para introducir material genético y como se altera
el fenotipo de una población bacteriana.
PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Descongelar un vial de células competentes en hielo
2. En condiciones asépticas, añadir de 1-10 ng (aprox. de 2-3 l) del ADN plasmídico obtenido en una
práctica anterior.
3. Mezclar suavemente y mantener en hielo durante 40 min.
4. Inducir un choque térmico incubando los tubos a 42 ºC por 90 segundos.
5. Transferir nuevamente al hielo durante 5 min.
6. Añadir 500 µl de caldo LB e incubar a 37º C a 150 rpm por 90 min.
7. Centrifugue a 7000 rpm por 3 min, descarte el sobrenadante, dejando solamente 50 – 100 µl y
resuspenda la pastilla en dicho volumen.
8. Con una varilla de vidrio acodada esterilizada en alcohol, siembre en 1 placa de agar LB con el
antibiótico apropiado.
9. Incube a 37 ºC toda la noche.
2DA: SESIÓN.
10. Registre resultados en cuanto a la capacidad de crecimiento o no del microorganismo en el medio
seleccionado.
Tipo de desechos

Como descartarlos
docente

Tipo de contenedor
laboratorio

24

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.

¿En qué consiste la electroporación?
Explique la estructura de un vector plasmídico y las funciones que codifican dichos genes.
¿En qué consiste la técnica de apareamiento por conjungación y cómo se efectúa in vitro?
¿Qué sucede cuando se introduce al fago lambda (utilizado como vector) en una célula?
¿Cómo se dterminan las placas líticas en una placa de cultivo?

 Dragui, J.A.and P.E. Turner. 2007. DNA secretion and gene-level selection in bacteria. Microbiology.
152:2683-88.
CSHL Press.

25

“CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”

PRACTICA No 10

INTRODUCCION
El estudio de las proteínas constituye una base importante para la comprensión de la forma y función de estructuras
biológicas de naturaleza proteica. En el caso de las proteínas microbianas, su análisis permite la comprensión de la
estructura y función de muchos organelos, además de que su estudio es imperativo para confirmar estudios
genómicos como una secuencia de ADN, la síntesis de péptidos para obtención de anticuerpos específicos, etc. La
cantidad de una proteína puede en general determinarse mediante métodos colorimétricos/espectrofotométricos,
mediante el análisis de sus aminoácidos o bien mediante la comparación de la intensidad del color de bandas
proteicas obtenidas mediante SDS-PAGE.
OBJETIVO
Mediante una técnica colorimétrica, determinar la concentración de proteínas mediante la construcción de una
curva estándar.
NORMAS DE SEGURIDAD
Tipo de riesgo
Ácido fosfórico: corrosivo,
irritación severa, quemaduras

Como evitarlo

accidente
Durante la pesada o manipulación Si se ingirió, NO provoque el
del reactivo, usar guantes de látex, vómito. Si está consciente, déle
bata y mandil, lentes de seguridad agua, leche o leche de magnesia.
y campana de ventilación.
Si se inhaló, sacarlo al aire fresco.
Si no respira, administre
respiración artificial. Si le cuesta
trabajo respirar, administre
oxígeno.
Contacto directo: lavar
inmediatamente con abundante
agua por lo menos 15 min,
quitarse la ropa y calzado
contaminado.

PROCEDIMIENTO
A. Preparación del reactivo de Bradford concentrado
1. Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 ml de etanol al 95%. Usar un agitador
magnético.
2. Añadir paulatinamente 100 ml de ácido fosfórico. Mantener cubierto el matraz durante la operación para
proteger el reactivo de la acción de la luz.
3. Mantener en agitación durante toda la noche a 4º C.
4. Transferir la mezcla a un matraz volumétrico de 200 ml y aforar con agua destilada.
5. Almacenar en frasco ámbar o en uno cubierto con papel aluminio y mantener a 4º C (la estabilidad se
mantiene aproximadamente 6 meses).
26

B. Determinación de proteínas en una muestra
1. Preparar una curva estándar partiendo de una muestra que contenga 1 mg/ml de una proteína como la
albúmina sérica bovina.
2. Hacer diluciones seriadas dobles de tal manera que el volumen final en cada dilución sea de 100 l. Diluir
con PBS.
3. Para las determinaciones, diluir el reactivo de Bradford de trabajo 1:5 con agua destilada. Filtrar el
colorante si se observa una formación de precipitado.
4. Añadir a los tubos 5 ml del reactivo de Bradford de trabajo (diluído). Permitir el desarrollo de color
durante 5 min pero no más de 30 min. Al tubo usado como blanco añadir 100 l de regulador salino de
fosfatos (PBS). El colorante rojo se tornará azul luego de la unión a la proteína presente en la muestra.
5. Determinar la absorbancia a 595 nm.
6. Construir la curva de calibración graficando en el eje de las abscisas la concentración de BSA y en las
ordenadas la absorbancia a 595 nm.
7. Obtener la concentración de proteína presentes en muestras desconocidas mediante la ecuación de
regresión lineal y con ayuda del programa Excel.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué otros métodos existen para determinar proteínas en una muestra?
2. En el método de Bradford ¿Porqué no se deben considerar lecturas de absorbancia luego de 30 min de la
interacción colorante – proteína?
3. ¿Cómo verificaría si una proteína está purificada?
4. ¿Cómo se determina la secuencia de aminoácidos en una proteína?
5. Investigue ejemplos de proteínas que se obtienen mediante la tecnología de ADN recombinante.

 Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-54.
 Scopes, R.K., and J.A. Smith. 1998. Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons.
U.S.A.
 Stryer, L. 1995. Bioquímica. Vol. 1. 4ª ed. Editorial Reverté. Barcelona, España. 440 pp.

27

PRACTICA No 11

“ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
BACTERIANAS MEDIANTE ELECTROFORESIS EN
GEL DE POLIACRILAMIDA”

INTRODUCCION
Se llama precipitado a una sustancia sólida que se forma en el interior de una disolución. Existen ciertas proteínas
que cuando se encuentran en un medio ácido se produce su desnaturalización, entonces tiene lugar una reacción
química que altera su estructura, y deja de ser soluble en agua lo que provoca que precipite. Los iones H+ y OH- del
agua afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Dicha
alteración elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y provocan la precipitación.
OBJETIVO
Obtener un concentrado de proteínas bacterianas excretadas al medio externo mediante la acción precipitante del
ácido tricloroacético

28

NORMAS DE SEGURIDAD
Tipo de riesgo

Como evitarlo

Ácido tricloroacético: quemadura
en la piel por efecto cáustico

Durante la pesada o manipulación
del reactivo, usar guantes de látex
y cubrebocas. Efectuar la
operación en campana de
extracción
Manipulación del reactivo con
guantes de látex, careta y gafas,
cubrebocas y en campana de
extracción.
extracción

Acrilamida: Efecto mutagénico y/o
cancerígeno. No inhalar.

TEMED: altamente inflamable,
corrosivo. Dañino si se inhala o
por contacto con la piel. Causa
quemaduras. Mantener lejos de
llamas, no fumar.
SDS: irrita la piel, ojos y tracto
respiratorio. Puede causar
reacciones alérgicas. No respirar el
polvo.

Persulfato de amonio: Oxidante
fuerte. El contacto con otros
materiales puede ocasionar fuego.
Causa quemaduras en la piel y
ojos. Irritante del tracto
respiratorio. Puede causar
reacciones alérgicas.
2-mercaptoetanol: tóxico al
contacto con la piel. Dañino si es
inhalado o ingerido. Se absorbe
rápidamente por la piel.

extracción.

extracción.

extracción.

accidente
Piel y ojos: lavar con abundante
agua por lo menos 15 min.

Piel y ojos: lavar con abundante
agua por lo menos 15 min.
Desechar ropa y calzado
contaminados.
Ojos: Enjuagar con abundante
agua por lo menos 15 min. y acudir
al médico. Exhibir la etiqueta del
reactivo.
Si se inhala: sacar al aire fresco, si
no respira, dar respiración
artificial. Si hay contacto con la
piel, lavar el área afectada con
abundante agua y jabón. Remover
ropa y calzado contaminados. Si se
ingiere y está consciente,
administrar agua abundante
Si se ingiere, dar abundante agua,
puede ocurrir el vómito
espontáneamente, no inducirlo. Si
hay contacto con la piel, lavar con
agua abundante y remover ropa y
calzado contaminados. Exhibir la
etiqueta del reactivo.
En caso de contacto con piel u
ojos, enjuagar con abundante agua
y llevar al médico. Exhibir la
etiqueta del reactivo.

PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Sembrar las cepas bacterianas en caldo LB e incubar a 37º C durante 24 h.
2DA. SESIÓN
1. Luego del tiempo de incubación, centrifugar para obtener el sobrenadante conteniendo las proteínas
bacterianas excretadas.
2. Preparar una solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100%. Preparar dicha solución en campana
de extracción debido a la toxicidad del TCA y hacer la pesada con guantes de látex.
29

3. Llevar al 15-20% con el sobrenadante bacteriano a precipitar (200 µl TCA 100%). Por ejemplo,
1350 µl del sobrenadante mas 150 µl de TCA 100%
4. Incubar en hielo de 1- 2 h.
5. En una centrífuga refrigerada, centrifugar a 14,000 rpm a 4º C a por 20 min.
6. Desechar el sobrenadante.
7. Efectuar 2 lavados con acetona fría (500 µl acetona) y centrifugar a 14,000 rpm a 4º C /5 min.
8. Decantar la acetona y dejar secar.
9. Reconstituir la pastilla obtenida con Tris-HCl 1M pH 8.8 (aprox. 25 µl ) y conservar a -20º C hasta su
análisis mediante elecroforesis en poliacrilamida (SDS-PAGE).
10. Añadir 5 µl de buffer de corrida. Si se va a efectuar simultáneamente SDS-PAGE y Western blot,
añadir 50 µl de Tris + 10 µl de buffer de corrida. Tomar 30 µl para el SD-PAGE y 30 µl para el
western blot.
3RA. SESIÓN
1. Analizar el precipitado bacteriano obtenido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDSPAGE) al 10%. Efectuar el SDS-PAGE de la siguiente manera:
2. Preparar las soluciones necesarias para efectuar la elecroforesis con base al anexo 4ª.
3. Montar la cámara de electroforesis con base en las indicaciones del fabricante (Anexo 4b).
4. Hacer una marca a la altura 1 cm por debajo de donde llegan los bordes del peine que se usa como
molde para hacer los carriles.
5. Verter el gel separador que se prepara de la siguiente manera:
Efectuar la mezcla A*1 (gel separador) para preparar el gel separador a una concentración del 10%:
Gel separador
Reactivo
Buffer Tris-Cl/SDS pH 8.8
Solución de acrilamida-bisacrilamida
Agua destilada
TEMED
Persulfato de amonio al 12.5%
Para preparar el persulfato de amonio (PSA), disolver
18.75 mg en 150 l de agua (1 gel) destilada o 31.25
mg en 250 l de agua destilada (2 geles).

Volumen (ml)

3.0
3.96
5.08
0.06
0.12

6. Luego de verter la mezcla A entre los cristales para hacer el gel, completar hasta el borde de los
cristales con agua desionizada y dejar en reposo durante 30 min. Luego de este tiempo, desechar el
agua por inversión y añadir la mezcla B (gel concentrador) la cual se prepara de la siguiente manera:
Gel concentrador
Reactivo
Amortiguador Tris-Cl/SDS 6.8
Acrilamida-bisacrilamida
Agua desionizada
TEMED
PSA

Volumen (ml)
1.0
1.5 ml
3.0
0.04 ml
0.08 ml

*1 Durante la preparación de este reactivo, mezclar primero el buffer 8.8 + acrilamida + agua; posteriormente añadir el TEMEd y el PSA e
inmediatamente verter ya que al añadir los agentes polimerizantes comienza la gelificación

30

7. Llenar con la mezcla del gel concentrador hasta el borde de los cristales e introducir el peine que sirve
de molde para hacer los carriles.
8. Dejar en reposo durante 30 min
9. Añadir a la cámara regulador de corrida 1X (diluir del regulador de corrida 10X).
10. Obtener mediante precipitación con ácido tricloroacético, las proteínas presentes en el sobrenadante
de un cultivo de toda la noche
11. Preparar las muestras mezclando 1 y 2 g de las proteínas bacterianas en sendos tubos eppendorf,
completar a un volumen de 10 l con PBS y añadir 3 l de regulador de corrida con mercaptoetanol.
12. Depositar en el carril 1 el marcador de peso molecular y en los carriles siguientes las muestras de
proteínas bacterianas.
13. Cerrar la cámara y conectar a la fuente de poder. Correr 30 minutos a 60 V y posteriormente aumentar
el voltaje a 100 V.
14. Dejar correr hasta que comiencen a salir las muestras y detener el corrimiento.
15. Sacar el gel y teñir con azul de Coomasie durante 20 min.
16. Desteñir con solución de metanol-ácido acético-agua hasta definir las bandas proteicas
17. Documentar en un scanner la imagen del gel colocándolo entre dos acetatos y guardar la imagen
(preferentemente con extensión jpg).
Tipo de desechos
Geles de acrilamida. La
acrilamida gelificada (no en
solución) es inocua.
Puntas de plástico
contaminadas

Como descartarlos
Depositarlos en un contenedor
como bolsa de plástico

Tipo de contenedor
Bolsa de plástico

Depositarlas en un contenedor
adecuado

Recipiente de plástico

CUESTIONARIO
1. ¿Qué peligro conlleva la solución de acrilamida-bisacrilamida?
2. ¿Cuál es la utilidad de los geles de poliacrilamida de doble dimensión?
3. ¿Qué otras técnicas de tinción de proteínas pueden emplearse para teñir las proteínas separadas en
geles de poliacrilamida?
4. ¿Qué otras técnicas existen para precipitar proteínas?
5. ¿Cuál es el efecto del ácido tricloroacético para que puedan precipitar las proteínas bacterianas?
 Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature 227:680-685.
CSHL Press.

31

Anexo 4A.
Solución de acrilamida-bisacrilamida
Acrilamida
60 g
Bis-acrilamida
1.74 g
Agua c.b.p.
200 ml
Con guantes de látex y cubrebocas, pesar los reactivos y disolver uno a uno, aforar a 200 ml con agua destilada.
Regulador de corrida 10x, pH 8.3
Glicina
144.1 g
Tris base
30.2 g
SDS grado electroforético
10.0 g
Agua c.b.p.
1000 ml
Pesar los reactivos (usando guantes y cubrebocas), se disuelven teniendo atención especial con el SDS, el cual debe
disolverse agregando poco a poco impidiendo la formación de grumos. Una vez disueltos los reactivos, se agrega el
agua (sin llegar al volumen final) y se ajusta el pH, se afora a 1000 ml ocn agua.
Regulador de muestra
Tris HCl
394 mg
SDS
1g
Azul de bromofenol
50 mg
Glicerol
6.25 ml
Agua c.b.p.
25 ml
Añadir el Tris HCl en 15 ml de agua destilada y ajustar el pH a 6.8; luego añadir los demás reactivos, aforar a 25
ml con agua destilada. Añadir -mercaptoetanol al 5% justo antes de usarse.
1425 l de regulador + 75 l de -mercaptoetanol
Amortiguador Tris-Cl/SDS 4x, pH 8.8
Tris base
18.165 g
SDS 20%
2 ml o 0.4 g
Agua
100 ml
Teniendo preparado previamente el SDS al 20% (grado electroforético), pesar el Tris base y disolver, agregar el
SDS y ajustar el pH. Aforar a 100 ml con agua y filtrar en millipore (typo GS 0.2 m). Almacenar en refrigeración.
Colorante de Fairbanks
Azul de Coomasie R-250
0.25 g
Isopropanol
125 ml
50 ml
Agua c.b.p.
500 ml
En la campana extractora y usando guantes de látex, disolver el colorante en isopropanol. Añadir el ácido acético
glacial, aforar a 500 ml con agua y filtrar a través de papel Whatman no. 1. Guardar a temperatura ambiente.
Solución desteñidora
Áciod acético glacial

70 ml
32

Metanol
Agua

50 ml
880 ml

Amortiguador Tris-Cl/SDS 4x, pH 6.8
Tris base
6.055 g
SDS 20%
2 ml o 0.4 g
Agua
100 ml
Se prepara de forma idéntica al regulador de pH 8.8.
Colorante de Fairbanks
Azul de Coomasie R-250
0.25 g
Isopropanol
125 ml
50 ml
Agua c.b.p.
500 ml
En la campana de extracción y usando guantes de látex, disolver el colorante en isopropanol. Añadir el ácido
acético, aforar a 500 ml con agua y filtrar a través de papel Whatman No. 1. Guardar a temperatura ambiente.
Solución desteñidora
Acido acético glacial (7%)
Metanol (5%)
Agua (88%)

70 ml
50 ml
880 ml

33

Anexo 4b. Montaje de la cámara de electroforesis
Desempaque.
Por favor verifique que la unidad venga completa con los siguientes componentes:


Kit de gel sencillo mini-vertical
Unidad de electroforesis mini-vertical
Cubierta de seguridad con indicadores de poder DC acoplados
ganchos blancos de presión 2ea GPC-0003
ganchos blancos de presión 3ea GPC-0002
cepillo 1ea
1 juego de vidrios
1 juego de espaciadores
1 tira de hule
 Kit de gel dual mini-vertical:
Unidad de electroforesis dual mini-vertical
Cubierta de seguridad con indicadores de poder DC acoplados
ganchos blancos de presión, 4ea GPC-0003m
ganchos blancos de presión, 6ea GPC-0002m
cepillo 2ea
2 juegos de vidrios
2 juegos de espaciadores
2 tiras de hule

Cable a la fuente de
poder

Cubierta de seguridad
gancho

peine
Placas de vidrio

espaciador

Puerto de entrada para
congelante

Puerto de salida
para congelante

Unidad de electroforesis

34

Preparación de la unidad mini-vertical
Ponga la unidad mini-vertical sobre una superficie nivelada. Si se necesita la unidad dual mini-vertical y se
requiere usar la opción de enfriamiento interno, inserte el tubo en la entrada (parte alta del puerto) y los puertos de
salida del refrigerante (puerto inferior) a la bomba. Verifique que el peine, el espaciador y el gel tengan el mismo
grosor.
Preparación y limpieza de los vidrios.
Lave ambos vidrios con un detergente como el SDS al 1%, seguido de un enjuague con H2O destilada. Seque al
aire o use un paño libre de impurezas. Rocíe las superficies internas con etanol al 95% de y seque con un paño
limpio.
Ensamble del gel mediante las juntas de hule.
Sostenga la placa de vidrio rectangular (la de esquinas redondeadas en su parte inferior), rodee el borde con el hule.
Nota: Un lado de la “U” de hule es lisa y el otro lado tiene un tubo que actuará como sujetador alrededor de los
espaciadores.

35

1. Cuando fije el hule alrededor de las esquinas redondeadas, asegúrese de que las orillas del
hule estén alineadas con las esquineros redondeados del vidrio. Una vez que el hule se ha
fijado en los bordes inferiores y las esquinas, únicamente manipule el cristal por ese lado.

2. Coloque el vidrio con el hule con el lado del tubo hacia arriba y extienda la base de la placa de
vidrio aproximadamente a ¾ de pulgada. Coloque los sujetadores a sobre el lado interno del
hule, asegúrese de que la parte final de la esquina redondeada de cada espaciador tenga la cara
hacia la base de la placa de vidrio, siguiendo su radio.

36

3. Coloque la otra placa de vidrio (de abajo hacia arriba) y verifique que los bordes del hule
estén alineados. Después, colocar pinzas en la parte inferior y a los costados.

4. Coloque las placas sujetadas sobre la superficie de trabajo, y nivele presionando las placas
hacia abajo hasta topar con la base del gancho. Asegure ambos lados con pinzas y verifique
que el hule se encuentra alineado entre las placas de vidrio para asegurarse de que están
selladas.
5. Efectúe primero una prueba con agua destilada para detectar fugas.

37

6. Añada la solución de acrilamida usando una jeringa o pipeta hasta la 2 cm por debajo de la
marca donde llega el peine. Complete con agua destilada o SDS al 1% hasta el borde para
nivelar la acrilamida. Esperar 30 min para la polimerización.

7. Luego de la polimerización, elimine el agua y agregue el gel concentrador. Inserte el peine y
deje polimerizar aprox. 20 min.

8. Retire con cuidado las pinzas y después la banda selladora de hule sin separar las placas. Si el
gel no se usa de inmediato, conserve a 4°C (el gel es estable aproximadamente un mes).
Corrimiento del gel.
1. Sujete la placa de fijación a la unidad con muescas o revestimientos más pequeños opuestos hacia el
embalse de tope superior. Si usa un gel pre-fabricado almacenado a 4 °C, deje que se alcance la
temperatura ambiente. Use abrazaderas blancas pequeñas para sujetar la placa fijada a la unidad,
sujetando cada uno de los lados del sandwich. Si se usa duplicado, repetir lo anterior.

38

2. Agregue el regulador recién preparado en la parte superior e inferior de la cámara. Usando una pipeta
o una jeringa, llene completamente por fuera de los pozos. Hierva las muestras en baño maría durante
5 min y coloque inmediatamente en hielo. Cargue las muestras. Si los carriles externos no contienen
muestra, es recomendable que se usen marcadores de peso molecular.
3. Coloque la tapa de seguridad.
4. Conecte los cables a la fuente de poder, coincidiendo los colores rojo con rojo y negro con negro.
Comiemce la separación por electroforesis, aplicando 60 V durante 30 min y luego continúe a 100 V
hasta que comience a salir el colorante.

Remoción del gel.
1. Apague la fuente de poder y desconecte los cables. Quite la tapa de seguridad de la unidad, colocando
los pulgares en los postes blancos (al lado de los conectores rojo y negro), empujando hacia abajo
mientras se levanta con los dedos. NO tirar en los cables eléctricos.
2. Quite los cables de cada lado y drene el buffer superior e inferior de la cámara. Quite el gel sandwich
y separe cuidadosamente cerciorándose de que el resto del gel quede unido a una placa. Teñir y fijar
de acuerdo al método requerido.

39

PRACTICA No 12

“BACTERIAS LÁCTICAS”

INTRODUCCION
Las bacterias lácticas se identifican como cocos o bacilos Grampositivos, no esporulados, fermentadoras de
carbohidratos con producción de ácido láctico, tolerante a los ácidos, catalasa y oxidasa negativos y
microaerofílicos. Los géneros Streptococcus, Leuconostoc y Lactobacillus conforman principalmente este grupo
microbiano; este tipo de organismos son nutricionalmente exigentes ya que requieren además de carbohidratos,
aminoácidos y factores de crecimiento. Se pueden aislar de vegetales y de varios alimentos crudos como
procesados. En los humanos estas bacterias colonizan en el intestino, cavidad oral y la vagina.
OBJETIVO
A partir de un alimento procesado, aislar e identificar morfológica y bioquímicamente a las bacterias lácticas
y resaltar su importancia.
PROCEDIMIENTO
1RA. SESIÓN
1. Preparar 4 placas con medio de APN (anexo 13).
2DA. SESIÓN
1. Pesar 10 g de una muestra de queso. Resuspender en 90 ml de agua destilada estéril.
2. Inocular 0.1 ml de la suspensión y sembrar por superficie con varilla de vidrio acodada en el medio APN.
3. Incubar a 30º C durante 72 h en atmósfera parcial de CO2 (usar el método del frasco con vela).
4. Registrar la morfología colonial, y efectuar tinción de Gram, prueba de catalasa y oxidasa a partir de las
colonias aisladas.
5. Esterilizar todo el material en autoclave. Lavar y entregar al laboratorista.
Tipo de desechos
Como descartarlos
docente

Tipo de contenedor
laboratorio

CUESTIONARIO
1. Investigue que otros medios de cultivo se pueden emplear para el aislamiento y estudio de bacterias
lácticas.
2. ¿Cuáles son los aspectos benéficos de la utilización de estos microorganismos para la elaboración de
productos como el yogurt, queso madurado, etc.?
3. ¿Qué efectos benéficos tienen estos organismos a nivel intestinal?
4. Esquematice las vías metabólicas que estos organismos utilizan para fermentar los carbohidratos.
5. ¿Qué medidas de control existen para evitar la alteración en la composición de los alimentos por este tipo
de microorganismos?
 Amador López, R., Fernández Rendón, E., y R. Rodríguez Montaño. 1993. Manual de laboratorio de
microbiología sanitaria. 2da. Ed. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico
Nacional. México, D.F.
40

 Fernández Escartín, E. 1981. Microbiología sanitaria. Agua y alimentos. Vol. 1. Universidad de
Guadalajara. ANUIES-SEP. México.
 Pham M., Lemberg, DA., and AS Day. 2008. Probiotics: sorting the evidence from the myths. Med. J.
Aust. 188:304-8.
Anexo.
Medio de APN
Peptona
10.0 g
Leche peptonizada
10.0 g
Extracto de levadura
10.0 g
Glucosa
7.5 g
MgSO4 7 H2O
0.575 g
MnSO4 4 H2O
0.05 g
Tween 80
1.0 g
Agar
15.0 g
Disolver los ingredientes en agua destilada a 50º C y ajustar el pH a 5.5 y completar el volumen a 570
ml con agua destilada. Distribuir en volúmenes de 97 ml y esterilizar en autoclave. Dejar enfriar a 50º
C y añadir a cada matraz 1 ml de cada una de las siguientes soluciones: nitrito de sodio al 6% recién
preparada y esterilizada por filtración; actidiona al 0.1% y sulfato de polimixina B al 0.03%. Mezclar
bien y utilizar.

41

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