Confirmación de Escherichia coli y su distinción de especies de Klebsiella por formación de gas e indol a 44 y 44,5 C
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Este estudio evaluó el impacto de la prueba de producción de gas en la confirmación confiable de E. coli. Se evaluaron 547 cultivos ambientales aislados en varios medios de cultivo a 44 y 44.5°C. Los resultados mostraron que la confirmación de E. coli puede dar falsos positivos si la producción de gas no se evalúa y la confirmación se basa solo en la prueba de indol. Es importante incluir la prueba de producción de gas para evitar resultados erróneos en el análisis rutinario de E. coli.
Confirmación de Escherichia coli y su distinción de especies de Klebsiella por formación de gas e indol a 44 y 44,5 C
- 1. Confirmación de Escherichia coli y su distinción de especies de Klebsiella por formación de gas e indol a 44 y 44.5° C Carlos Alberto Orozco Julián Andrés Dorado Luís Felipe Arcos William Andrés Aponte
- 2. RESUMEN El objetivo de este estudio fue investigar el impacto del test de producción de gas en la confiabilidad para la confirmación de E. coli Métodos y Resultados -El impacto de muchos medios de cultivo en el crecimiento, formación de gas y/o indol fue evaluado a 44 y 44.5 ° C usando 547 cultivos medioambientales aislados. -Se usaron principalmente E. coli, K. pneumoninae, K. oxytoca y E. cloacae. Conclusiones -La confirmación de E. coli falso – positivo es posible si la producción de gas no es evaluada y para la confirmación esta basada solo en el test de Indol. Importancia e Impacto del Estudio Los resultados positivos erróneos en el análisis rutinario para E. coli pueden ocurrir
- 3. Introducción -Recientemente, el test de producción de gas ha sido borrado en le método Standard internacional (ISO 9308-1 2000). -En este estudio se comparan 7 diferentes medios líquidos incubados a 44 y 44.5° C para producir crecimiento, gas o formación de indol cuando se inocularon con más de 500 especies medioambientales aisladas de E. coli y Klebsiella. - Otras 250 sepas de Klebsiella de diferentes medioambientes y fuentes fecales fueron identificadas y probadas para su máxima temperatura de crecimiento, todas esas sepas fueron adicionalmente probadas para producción de gas en caldo E. coli a 44.5° C.
- 4. Materiales y Métodos -547 sepas de bacterias coliformes fueron estudiadas, dominantemente especies de E. coli y Klebsiella, 24 Enterobacter, 3 Pantoea y 2 sepas de Citrobacter. -Para estudios de Tmax un nuevo set de 250 sepas de Klebsiella fue aislado de diferentes fuentes: - 209 especimenes de recibidos de NPHIH cultivadas en agar conteniendo inositol y carbenicilina. -Muestras de agua fueron colectadas en botellas estériles 1-1 borosilicato y transportadas enfriadas al laboratorio. - Las sepas para el método de identificación fueron identificadas con API 20E o con enterotube II
- 5. Diseño experimental - las medidas se llevaron a cabo en dos laboratorios - Usaron químicos del mismo fabricante y en algunos casos reactivos de la misma botella. - termómetros fueron calibrados contra el mismo termómetro certificado. Medios para el Método de Comparación Los medio usados fueron: Caldo lactosa peptona (LP), caldo lactosa peptona con sal (LPS), caldo bromocresol púrpura lactosa (BPL), Caldo lauril triptosa manitol con triptófano (LTM), caldo triptona manitol ricinoleate (TMR), caldo triptona triptófano sal (TTS); formaci{on de indol fue registrado en EC, LTM, TMR, y TTS.
- 6. Preparación de Cultivos -Los medios fueron mantenidos toda la noche a 44° C para mirar la contaminación y falsa producción de gas. -Crecimiento y producción de gas fueron leídos luego de 22 +- 2 h y 44 +- 4 h de incubación. -La producción de gas fue medida en escala semicuantitativa -, +, ++ y +++. -Reactivo indol fue agregado solo dos días después de la incubación cuando el experimento fue terminado. - La reacción fue medida -, +, ++. Tmax Estudios - fue medida con la ayuda de un incubador gradiente- temperatura en mCF agar.
- 7. DISCUSIONES El impacto de la composición del medio en el crecimiento fue especifico para las especies, donde E. coli y K. pneumoniae crecieron bien todos los medios y Ent. cloacae mostro mayor crecimiento en LTM. Ent. Cloacae fue sensible a la temperatura de incubación y al tiempo en medios como LP, LPS, BLP y TMR. La temperatura influyo en la separación de las especies de Klebsiella. Los resultados que se presentaron en el trabajo mostraron lo sensitivo que es este test a los medios utilizados. El mejor de los medios utilizados fue LTM: 95% de E. coli y 85% de K. pneumoniae dieron una respuesta positiva en el test de gas con este medio De todas las cepas Pantoea agglomerans es la mas problemática debido a que se encuentra en mucho residuo industrial y sus cepas son indol-positivo
- 8. El indol positivo K. oxytoca no pudo crecer en un medio sólido mFC a 44°C o a temperaturas mas altas de incubación sin embargo creció en medio liquido lo cual demuestra la sensibilidad de este al medio de cultivo y a la temperatura de incubación. La determinación de E. coli no fue totalmente eficiente con la prueba de indol a alta temperatura por los falsos positivos de K. oxytoca. Para separar E. coli de las especies de Klebsiella, es necesario excluir K. pneumoniae con la prueba del indol y K. oxytoca usando la prueba de producción de gas. Todas las K. pneumoniae se excluyeron por el test negativo de la producción de indol, al mismo tiempo pruebas de producción de gas a altas temperaturas fueron utilizadas para la eliminación de falsos positivos. El método Standard internacional presente para coliformes y E. coli en el cual la producción de gas se descarta como un criterio para la confirmación de E. coli, y detección de falsos positivos de E. coli.
- 9. Es posible basar la diferenciación de E. coli en un test totalmente diferente como el de la β-glucuronidasa y el de los marcadores moleculares. Según trabajos de Shadix y Rice (1991) el medio EC a 44.5° C en un día produjo un porcentaje de 11.7% de falsos negativos en la producción de gas la cual esta cerca del 9.1% de este estudio en las mismas condiciones pero alta con respecto al 4.5% en condiciones optimas. En su estudio 4.8% de las cepas de E. coli eran anaerogénicas e incapaces de producir gas en el medio de fermentación de lactosa convencional a 35 y 44.5° C. la tasa correspondiente que se observo en este estudio fue del 3.6% en condiciones optimas. Es evidente que tanto las condiciones de incubación como la composición del medio afectan la prueba de β-glucuronidasa, por eso es necesaria la utilización de elementos traza en su dilución.
- 10. CONCLUSION La identificación de E. coli por pruebas fisiológicas no esta exenta de incertidumbre. Cada una de las pruebas de identificación y de confirmación para estas especies no es absolutamente reproducible. Los resultados de este estudio muestran como pequeñas diferencias en las condiciones de la prueba afectan significativamente los resultados de la misma. Bajo optimas condiciones, la confirmación de E. coli produjo 6 % de falsos negativos simultáneamente permitiendo un 7% de K. oxytoca dar resultados falsos positivos. Esto es comparable a la tasa de falsos negativos del 4.6% para las pruebas de β- galactosidasa y β-glucuronidasa. Shadix y Rice (1991)