![La microbiología
Son considerados microbios todos los seres vivos microscópicos, estos
pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como
pequeños agregados celulares formados por células equivalentes (sin
diferenciación celular); estos pueden ser eucariotas (células con núcleo) tales
como hongos y protistas, procariotas (células sin núcleo definido) como las
bacterias].
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- 1. Curso de MICROBIOLOGIA Q.F. Luis Fernandez
- 2. La microbiología Es la rama de la biología encargada del estudio de los microorganismos, seres vivos pequeños (de origen griego mikros "pequeño“, bios, "vida" y logía, “tratado”), también conocidos como microbios o Microorganismos. Es la ciencia de la biología dedicada a estudiar los organismos que son sólo visibles a través del microscopio: organismos procariotas y eucariotas simples.
- 4. La microbiología Definiciones Anticuerpo • Un anticuerpo, también llamado inmunoglobulina, es una proteína producida por el sistema inmunitario como respuesta a la detección de la presencia de una sustancia percibida como ajena al organismo. Comensal • El término comensalismo hace referencia a un tipo de relación entre dos organismos diferentes que «comparten mesa». En este tipo de relación, ninguna de las partes saca provecho de la otra ni se provocan perjuicio mutuo alguno. Se trata por tanto de una relación neutra. Disbiosis • También denominada disbacteriosis, hace referencia a un desequilibrio en el número o tipo de colonias microbianas que han colonizado al hombre. Se da más en el tracto digestivo, pero puede producirse en cualquier parte en la que haya una superficie expuesta o una membrana mucosa. La disbiosis pude afectar a la digestión, absorción de nutrientes, producción de vitaminas y control de microorganismos dañinos.
- 5. La microbiología Definiciones Enterotipo • La comunidad microbiana asentada en nuestro intestino es una combinación única de diferentes tipos y cantidades de bacterias. No se trata de una mezcla bacteriana permanente, sino de un conjunto en constante evolución que puede verse influenciado por nuestra dieta, factores ambientales, tratamientos farmacológicos, etc. Fermentación • Se trata de un proceso químico por el cual un organismo convierte el azúcar y los carbohidratos presentes en los alimentos en ácido o alcohol. Flora intestinal • Nombre que recibían antiguamente las comunidades bacterianas alojadas en nuestro intestino. Los investigadores prefieren emplear el término de microbiota intestinal, ya que las bacterias no pertenecen al mundo vegetal.
- 6. La microbiología Definiciones Probiótico • Según la definición del 2001 de la OMS y la FAO, los probióticos son «microorganismos vivos que, cuando se administran en la cantidad adecuada, confieren beneficios de salud al huésped.» Normalmente, se consumen en alimentos fermentados como los yogures. Prebiotico • Los prebióticos son componentes funcionales no digeribles de los alimentos (como algunos tipos de fibras) que estimulan la actividad y el crecimiento de ciertos grupos específicos de bacterias, como las bifidobacterias y las bacterias lácticas. Simbiosis • Se llama simbiosis a la relación establecida entre dos organismos que se necesitan mutuamente para sobrevivir. Las bacterias tienen una larga historia de simbiosis. Han evolucionado conjuntamente en simbiosis con otros microbios y con sus huéspedes.
- 7. La microbiología Principios Básicos de Rotulación y Almacenamiento • Cancerígenos y Teratogénicos • Mutagénicos • Corrosivos e Inflamables Nivel de Riesgo • Envases de Plástico • Rotulación de Corrosivo • Ubicación en los Estantes Bajos Almacena miento de Álcalis • Envases de Vidrio • Rotulación de corrosivo • Ubicación en los estantes bajos Almacena miento de Ácidos
- 8. La microbiología Principios de Bioseguridad Se considerara todas las muestras que ingresen al laboratorio como de alto riesgo contaminante Se informara por escrito al profesional a cargo del laboratorio de cualquier accidente o exposición por mas leve que sea Se informara al personal del laboratorio sobre las reglas para trabajar con agentes patógenos y los riesgos que implica su mala praxis De ser factible se realizara la inmunización del personal que labore en dicha institucion
- 9. La microbiología BPL El acceso a los laboratorios debe ser restringido Para la manipulación de cepas se deberá utilizar guantes de un solo uso Se debe proveer al personal indumentaria adecuada para su trabajo como mandiles, tocas, lentes de seguridad, mascarillas o mascaras adecuadas entre otros No utilizar zapatos abiertos, sandalias, tacones u otro similar No esta permitido bebes, comer, fumar o masticar en las instalaciones del laboratorio Prohibido pipetear con la boca, siempre se deberá usar propipeta Siempre se deberá trabajar con alcohol de 70° y para limpieza de ambientes solución de hipoclorito de sodio En todos los sectores deberá haber bolsas de determinado color (por ejemplo negras) para el descarte de residuos comunes, recipientes con la etiqueta de riesgo biológico y bolsas de otro color (por ejemplo, rojas)
- 10. La microbiología Se debe disponer de cámaras de bioseguridad biológica mínimo de clase II en las áreas de procesamiento de materiales, estudios microbiológicos, micobacterias, procesamiento de cultivos, entre otros procesos críticos Cámara de Bioseguridad
- 12. La microbiología • El revólver no está girado totalmente • El diafragma del condensador está totalmente cerrado o totalmente descentrado Queda el campo oscuro o con muy poca luz • El cubreobjetos está hacia abajo. • El cubreobjetos es muy grueso para un objetivo de gran aumento No se puede enfocar la muestra preparada • La lente frontal del objetivo está mojada o sucia. • La lente superior del ocular está húmeda o sucia La imagen aparece velada y no se puede enfocar bien • El diafragma del condensador está totalmente abierto. Cerrar hasta que pasen 2/3 o 1/4 del haz de luz Aunque el microscopio está enfocado, no se observan detalles Errores en Microscopia
- 13. La microbiología • Hay que abrir más el diafragma de la lámpara • Con objetivo de poco aumento: Hay que quitar la lente frontal del condensador El campo visual no está iluminado completamente • El diafragma del condensador está demasiado cerrado y se enfocan rayas o suciedades del cubre y del portaobjetos • Las lentes del ocular están sucias. Al girar el ocular, las manchas también se desplazan. En la imagen aparecen manchas. • Ha llegado a su posición tope. Hay que llevarlo al medio y mover el macro • La grasa se ha endurecido El movimiento del micrométrico no sigue más Errores en Microscopia
- 14. La microbiología Bioseguridad, Toma de Muestra Consideraciones Generales Se deberá evitar la contaminación del material obtenido con la microbiota del paciente El material recogido debe ser representativo del proceso infeccioso El paciente deberá cumplir con los requerimientos previos para la toma de muestra Consideraciones Generales
- 15. La microbiología Muestras Aerobias •Frasco Estéril •Tapa Rosca •Medio Aerobio (Atmosfera convencional) Muestras Anaerobias •Frasco Estéril •Tapa Rosca •Medio Anaerobio (Medio TAB) Consideraciones de Muestreo Dejar a temperatura ambiente el menor tiempo posible
- 16. La microbiología Muestra de Abscesos (Pus) • El muestreo se realiza mediante la punción y según el caso, con la muestra obtenida se inocula un frasco de transporte anaeróbico o se transfiere en un tubo seco estéril de tapa rosca. Muestra de Punción y aspiración de heridas • Se efectúa la punción del borde externo de la herida y, según el caso, por piel sana, se inocula un volumen mínimo de solución fisiológica estéril y con el líquido de lavado obtenido se inocula un frasco de transporte anaeróbico o se transfiere en un tubo seco estéril de tapa rosca.
- 17. La microbiología Hisopados nasales • Tomar muestra de ambos orificios de la nariz, introduciendo un hisopo estéril y rotándolo. Este hisopo, luego, se debe introducir en un tubo con solución fisiológica. Hisopados axilares, perianales o rectales • Tomar muestra rotando un hisopo estéril por ambas axilas, por el margen anal-piel (perianal) o en el caso de hisopados rectales introducirlo en el recto. Este hisopo, luego, se debe introducir en un tubo con solución fisiológica o medio de transporte si fuera el caso
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- 19. La microbiología
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- 21. La microbiología Son considerados microbios todos los seres vivos microscópicos, estos pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños agregados celulares formados por células equivalentes (sin diferenciación celular); estos pueden ser eucariotas (células con núcleo) tales como hongos y protistas, procariotas (células sin núcleo definido) como las bacterias]. PROCARIOTA EUCARIOTA
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- 23. La microbiología Bacilos Gram negativos Dentro de los bacilos gram negativos anaerobios facultativos fermentadores de glucosa, están comprendidas las siguientes familias patógenas para el ser Humano Enterobacteriaceae Vibrionaceae Aeromonadaceae
- 24. La microbiología Enterobacterias ALGUNAS CARACTERISTICAS PRINCIPALES Los miembros de esta familia son bacilos gram negativos, de longitud variable. Son móviles por flagelos peritricos (Ejm: Proteus mirabilis) o no móviles (Ejm: Klebsiella, Shigella). No son exigentes en sus requerimientos nutricionales y desarrollan en medios con extracto de carne o peptona, sin necesidad de la adición de NaCl u otros suplementos y crecen bien en agar Mac Conkey. Son aerobios y anaerobios facultativos por lo que crecen bien en aero y anaerobiosis.
- 25. La microbiología Enterobacterias HABITAD NATURAL Esta familia se encuentra ampliamente distribuidos en la naturaleza, en plantas y suelo, agua e intestino de humanos y animales. Algunas especies ocupan un nicho ecológico muy limitado: por ejemplo, Salmonella entérica serovar Typhi se encuentra en aguas y causa fiebre tifoidea sólo en humanos. Otras causan enfermedades humanas de distinto tipo. Pueden colonizar asintomáticamente el intestino. Pero también producen infecciones urinarias, del tracto respiratorio, septicemia, entre otros.
- 26. La microbiología Enterobacterias Patologías Humanas Abscesos Neumonías Meningitis Septicemias Infecciones en heridas Tracto Urinario Tracto Digestivo Muchos de estos también son componentes importantes de la microbiota intestinal normal
- 27. La microbiología Bacilos Gram negativos - Enterobacterias Enterobacterias–Problemas Gastrointestinales Enterobacterias – Problemas en otros sitios
- 28. La microbiología Bacilos Gram negativos - Enterobacterias Enterobacterias – Problemas Gastrointestinales Enterobacterias – Problemas en otros sitios
- 29. La microbiología Sin embargo la microbiología tradicional se ha ocupado especialmente de los microorganismos patógenos entre bacterias, virus y hongos, dejando a otros microorganismos en manos de la parasitología y otras categorías de la biología. Escherichia coli
- 30. La microbiología - Escherichia coli Escherichia coli coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se considera de flora normal Existen descritos seis grupos de E. coli productora de diarrea: 1. enterotoxigénica (ETEC) 2. Enterohemorrágica (EHEC) 3. Enteroinvasiva (EIEC) 4. Enteropatógena (EPEC) 5. Enteroagregativa (EAEC) 6. Enteroadherente (DAEC). La bacteria se puede aislar e identificar tradicionalmente con base en sus características bioquímicas o serológicas, pero también se pueden estudiar sus mecanismos de patogenicidad mediante ensayos en cultivos celulares o modelos animales
- 31. La microbiología - Escherichia coli E. coli Bacilo gram negativo Anaerobio facultativo Familia de las Enterobacterias
- 32. La microbiología - Escherichia coli
- 33. La microbiología - Escherichia coli
- 34. La microbiología - Escherichia coli E. coli enterotoxigénica Las ETEC colonizan la mucosa del intestino delgado por medio de pilis o fimbrias que tienen diversas formas denominadas CFA (colonization factor antigens), siendo su principal mecanismo de patogenicidad la síntesis de alguna o ambas enterotoxinas llamadas toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST).
- 35. La microbiología - Escherichia coli E. coli enterotoxigénica Las cepas ETEC son una causa frecuente de diarrea en lactantes de países en desarrollo, así como la causa mas común de diarrea en individuos de países industrializados que viajan a zonas menos desarrolladas del mundo. Epidemiología Presenta de 8 a 12 evacuaciones al día por un periodo de 4 a 5 días. Las cepas de ETEC son una causa importante de diarrea en niños menores de 5 años de edad y la causa mas frecuencia de diarrea del viajero. Cuadro Clínico
- 36. La microbiología - Escherichia coli - enterotoxigénica Diagnostico Se usan equipos comerciales para detección de la toxina LT. Las colonias sospechosas de E. coli se suspenden en una solución extractiva por 30 minutos a 37ºC y luego se le realiza una prueba de coaglutinación para detectar la toxina
- 37. La microbiología - Escherichia coli La capacidad toxigénica de las cepas es necesaria para que el paciente desarrolle colitis hemorrágica y diarrea con sangre, ya que la citotoxina STX es el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su síntesis está relacionada con la presencia del bacteriófago STX, que está insertado en el genoma. E. coli enterohemorrágica
- 38. La microbiología - Escherichia coli E. coli enterohemorrágica Se da en países de clima templado como USA, Canadá, Inglaterra, Argentina y Japón. Los serotipos involucrados mas comúnmente son: O26, O111, O121, O145 y O157 Epidemiología Colitis hemorrágica: Diarrea de inicio brusco con dolor abdominal. Las evacuaciones líquidas se acompañan de una descarga hemorrágica. Síndrome urémico hemolítico. Cuadro Clínico
- 39. La microbiología - Escherichia coli - enterohemorrágica Diagnostico El serotipo más frecuente es el O157:H7. Las bacterias de este serotipo no fermentan el sorbitol, o lo hacen lentamente, y por ello se las identifica en el agar MacConkey sorbitol. Por el contrario, la mayoría de las bacterias que se encuentran en heces, fermentan el sorbitol, mientras que EHEC O157:H7 no lo hace A las colonias incoloras en este medio se les realizan pruebas bioquímicas confirmatorias de E. coli (TSI, LIA, SIM) y se les efectúa serología para detectar el antígeno O 157 Si la serología es positiva, se completa la marcha con ODC, citrato, ß-glucuronidasa y se efectúa la detección del antígeno H7. Si la serología es negativa y las pruebas bioquímicas corresponden a Escherichia coli, se realiza la prueba de ß-glucuronidasa, para descartar la presencia de una EHEC
- 40. La microbiología - Escherichia coli - Enteropatógena EPEC fue el primer grupo que se identificó serológicamente y se asoció con casos de diarrea en infantes, siendo la adherencia su principal factor de patogenicidad. El proceso de adherencia íntima entre la bacteria y la membrana de las células del epitelio intestinal, seguida de la destrucción de la microvellosidad, con polimerización de actina, que lleva a la alteración del citoesqueleto en el sitio de la unión de la bacteria, debido al aumento de los niveles de calcio intracelular y de proteína cinasa C, ha sido denominado adherencia y esfacelamiento
- 41. La microbiología - Escherichia coli E. coli Enteropatógena Se presenta como una enfermedad de niños menores de 2 años. En México, Brasil y África del sur entre el 30 y 40% de las diarreas son producidas por EPEC. Epidemiología Afecta la mucosa intestinal. Perdida de disacaridasas. Produce diarrea secretora y se puede asociar con fiebre y sino se controla conduce a deshidratación y finalmente la muerte. Cuadro Clínico
- 42. La microbiología - Escherichia coli - Enteropatógena Diagnostico La investigación se realiza en casos muy puntuales: neonatos, lactantes menores de un año, cardiópatas, brotes intrahospitalarios o diarreas crónicas severas, como por ejemplo, en los pacientes con SIDA. Comprenden un grupo de 21 serotipos de E. coli. Se utilizan primero antisueros polivalentes y luego los monovalentes.
- 43. La microbiología - Escherichia coli - Enteroinvasiva El grupo EIEC y Shigella spp están relacionados genética y bioquímicamente ya que son descarboxilasa negativas, no móviles y lactosa negativas. El mecanismo de patogenicidad de EIEC es la invasión del epitelio del colon; para ello el primer paso es la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la mucosa requiriendo de mucinasa y adhesinas, para después entrar por endocitosis a la célula, y posterior multiplicación de la EIEC dentro de la célula y diseminación a células sanas adyacentes
- 44. La microbiología - Escherichia coli E. coli Enteroinvasiva Las cepas EIEC se asocian más con brotes que con casos aislados, en los cuales la transmisión puede ser de persona a persona, por ingestión de alimentos y agua contaminada, convirtiéndose en un patógeno importante en niños mayores de seis meses Epidemiología Los síntomas característicos en personas infectadas por EIEC son diarrea acuosa, con sangre y moco, pero algunos casos sólo presentan diarrea, ésta en ocasiones es indiferenciable de la que produce ETEC. Cuadro Clínico
- 45. La microbiología - Escherichia coli - Enteroinvasiva Diagnostico El diagnóstico de EIEC se hace por prueba in vivo como la de Sereny, que es la inoculación de un cultivo puro de la bacteria en un ojo de un cobayo en el cual después de 24 a 96 h se produce una ulceración en el ojo, pero también hay métodos inmunológicos y moleculares Estas cepas pertenecen a unos 11 serotipos. Dan negativa la prueba de la lisina y son generalmente inmóviles, poco sacarolíticas y agasógenas. Algunas veces pueden dar reacción cruzada de aglutinación con el antígeno O de Shigella Recientemente, se ha propuesto una prueba de enzimoinmunoensayo, para detectar las proteínas de membrana externa responsables de la invasión y el empleo de sondas, para detectar los genes que las codifican
- 47. La microbiología - Tipos SHIGELLA Boydii Dysenteriae Flexneri Sonnei SEROGRUPO A SEROGRUPO B SEROGRUPO C SEROGRUPO D Shigella
- 48. La microbiología - Habitad El intestino humano es reconocido como el hábitat y reservorio natural de Shigella spp También se ha aislado de primates, como monos y chimpancés. Shigella se transmite en forma directa por vía fecal-oral en condiciones higiénicas deficientes y la infección puede adquirirse por ingesta de agua o alimentos contaminados con heces humanas Shigella
- 49. La microbiología – Dosis Infectiva La dosis infectiva es muy baja, ya que 10 a 100 microorganismos son suficientes para causar enfermedad Distintos estudios postularon que esto podría atribuirse parcialmente a la presencia de sistemas de resistencia al ácido que permiten la supervivencia en el ambiente del estómago Se ha demostrado que Shigella spp. es capaz de inhibir la expresión de péptidos antimicrobianos, que se producen constantemente en la mucosa del tracto intestina Shigella
- 50. La microbiología - Morbilidad y Mortalidad La morbilidad y mortalidad asociadas a las infecciones por Shigella spp. son un problema importante de salud en el mundo, especialmente en países en desarrollo, donde las condiciones sanitarias son inadecuadas Shigella
- 51. La microbiología - Patogenia Puede atravesar el epitelio intestinal Puede evadir la degradación por macrófagos Puede diseminarse a las células intestinales adyacentes Shigella
- 52. La microbiología - Patogenesis La infección por S. flexneri es un proceso de múltiples etapas. La bacteria atraviesa el epitelio intestinal, no a través de la membrana apical de los enterocitos, sino causando su propia internalización por parte de las células M. Desde allí es translocada a la mucosa intestinal, donde es capturada por los macrófagos. Las células M son células especializadas que continuamente toman partículas del lumen y las translocan a la mucosa, donde se dispara la respuesta inmune
- 53. La microbiología - Patogenesis Dentro de los macrófagos, Shigella spp. evade la degradación induciendo un mecanismo similar a la apoptosis, que desencadena señales proinflamatorias Las bacterias libres invaden las células epiteliales desde la membrana basolateral, se mueven en el citoplasma por polimerización de la actina y se desplazan a células vecinas. Las señales proinflamatorias activan la respuesta inmune innata con células “natural killers” y atracción de polimorfonucleares (PNM). El influjo de PMN desintegra el epitelio facilitando la invasión de un mayor número de bacterias. Finalmente los PMN fagocitan y matan a las bacterias patógenas, contribuyendo a la resolución de la infección
- 54. La microbiología - Virulencia Los determinantes de patogénesis de Shigella spp. están codificados en el cromosoma de la bacteria y en un gran plásmido de virulencia. El plásmido lleva la información genética para la síntesis de la maquinaria molecular necesaria para la invasión de tejidos y para la supervivencia intracelular41, 42. El elemento principal de esta maquinaria es un sistema de secreción tipo III (T3SS), que le permite a la bacteria translocar un grupo de aproximadamente 25 proteínas efectoras desde su citoplasma a la célula eucariota, donde interfieren con varios procesos de las células del hospedero
- 55. La microbiología - Clínica Edad de la Persona Estado Nutricional Dosis Infectante Serotipo del Microorganismo
- 56. La microbiología - Sintomatología Diarrea Fiebre Dolores Abdominales Disentería Se han descrito cuadros con convulsiones en niños menores de 2 años con fiebre alta Algunas personas pueden ser portadoras asintomáticas de Shigella spp. y transmitir la bacteria a otros pacientes susceptibles
- 59. La microbiología - Tipos Flagelos
- 60. La microbiología - Tipos SALMONELLA Entérica Bongori S.Typhi / S. Paratyphifico S. Salamae / S. Arizonae
- 61. La microbiología - Habitad El intestino humano es reconocido como el hábitat para la Salmonella spp El reservorio de las Salmonella (S. Typhimurium y Enteritidis) está constituido por animales domésticos y algunos salvajes, entre los cuales están las aves de corral, ganado porcino y bovino, algunos roedores y mascotas como las tortugas, perros y gatos. La Salmonella se transmite en forma directa por vía fecal-oral en condiciones higiénicas malas y la infección puede adquirirse por ingesta de agua o alimentos contaminados.
- 62. La microbiología - Dosis Infectiva La dosis Infectiva es de 10x10(5) a 10x10(8) UFC/g, pero puede ser tan baja como 1 UFC/g dependiendo de la edad, la salud del huésped y características de la cepa Las salmonellas son sensibles al calor, pueden sobrevivir en superficies como cerámica, vidrio y acero inoxidable Se calcula que la inoculación debe ser superior a un millón de gérmenes El patógeno tiene la capacidad de resistir el pH del estómago, sales biliares y el peristaltismo, por lo que coloniza el intestino delgado e invade los ganglios linfáticos mesentéricos, provocando una infección localizada; la Salmonella evade las defensas intracelulares de las células intestinales sin ser destruida y comienza a dividirse dentro de fagocitos que se ubiquen en esa zona.
- 63. La microbiología Morbilidad y Mortalidad La salmonelosis puede afectar a personas de todas las edades, pero la incidencia y la gravedad de la enfermedad es mayor en niños pequeños, ancianos y personas inmunodeprimidas o que padecen enfermedades debilitantes. Los niños menores de 10 años y las personas inmunodeprimidas parecen tener mayor riesgo de contraer enfermedades graves de los reptiles. En países desarrollados como Estados Unidos, se registran aproximadamente entre 500 y 600 casos mortales de salmonelosis por año. El índice de mortalidad general para la mayoría de las formas de salmonelosis es inferior al 1%; no obstante, algunas serovariedades o síndromes son más propensos a causar la muerte. Durante los brotes, aproximadamente el 10% de todos los casos y el 18% de los casos en ancianos terminan en enfermedades invasivas
- 64. La microbiología - Patogenia Inicio de la invasión, donde se da la adherencia a células epiteliales del íleon y células M, esto permite una migración transepitelial hasta llegar al sitio donde se encuentran los fagocitos. Posterior a esto se induce la fagocitosis tanto por parte de los fagocitos profesionales, como por aquellos no profesionales, esto se consigue a través de la expresión de las islas de patogenicidad a Salmonella Continua con la diseminación del patógeno, siendo posible que la Salmonella ingrese a vasos linfáticos o sanguíneos, lo que le permite distribuirse en sangre y linfonodos mesentéricos, desde donde pueden llegar a medula ósea, hígado o bazo; además se sabe que La Inflamación, aca los neutrófilos cumplen un papel de importancia tanto en el proceso inflamatorio, como en la diarrea. Las células infectadas producen citoquinas que atraen células polimorfonucleares (PMN) que liberan prostaglandinas capaces de elevar los niveles de cAMP, estas producen como efecto final una interrupción de la absorción de Na+ y el incremento de la secreción de Cl-, y esto lleva a una pérdida de agua por parte de la célula 1 2 3
- 65. La microbiología - Patogenia S. entérica puede permanecer de forma crónica en las células del sistema mononuclear fagocitario hasta por un año, posterior a la primoinfección La enteropatogénesis ocasionada por el Salmonella y la diarrea que se manifiesta a partir de ella se ha atribuido a la expresión de las proteínas SipA y SipC, que se manifiestan mientras el patógeno se encuentra en las células M y en enterocitos, lo cual ocurre posterior a 15 minutos de la inoculación; este fenómeno precipita el inicio del proceso inflamatorio que luego de una hora a logrado atraer suficientes PMN, favoreciendo el que estos activen vías apoptoticas en las células del epitelio intestinal, en un tiempo que oscila entre una hora y tres horas; siendo este el gatillo para el inicio del proceso diarreico
- 66. La microbiología - Virulencia El antígeno Vi parece no actuar como un prerrequisito de invasión a las células epiteliales, sino más bien como un factor protector de los antígenos O contra la acción de los anticuerpos o el complemento Por otra parte, se ha demostrado que el antígeno O aumenta la virulencia de la bacteria cuando la infección ocurre por una ruta en la cual éstas son expuestas a macrófagos capaces de matar a la Salmonella. En varias especies de Salmonella se ha demostrado que existe un plásanido necesario para causar la infección más allá de las placas de Peyer del intestino, en los nódulos linfáticos mesentéricos y en el bazo han propuesto que los plásmidos de virulencia están involucrados en la adherencia e invasión de las células de mamíferos, y que estos plásmidos pueden integrarse en el cromosoma bacteriano, lo que evita la expresión del fenotipo de virulencia.
- 67. La microbiología - Virulencia – Control de la Capacidad Infectante Alimentos sanitizados Contaminación Cruzada de Alimentos Higiene de Materiales Alimentos cocidos superior a 70 °C
- 68. La microbiología - Clínica Edad de la Persona – Niños y Ancianos Pacientes Inmunocomprometidos Dosis Infectante Características de la Cepa
- 69. La microbiología - Clinica Importante Gastroenteritis: Casi todos los serotipos de salmonella del grupo I pueden producir la gastroenteritis, siendo los más frecuentemente aislados la S. typhimurium, S. enteritidis. El sindrome inicia 48 horas posteriores al consumo de alimentos contaminados; en la mayoría de las personas inmunocomprometidas el cuadro dura entre 4-8 días, en inmunosupresion o aquellos que presenten alguna condición concomitante la clínica se vuelve más severa. Después de la resolución de la condición el promedio de tiempo como portador es de 4 a 5 semanas; en el caso de neonatos se ha visto que el tiempo como portador es de hasta 6 meses. Los principales síntomas asociados a esta condición son: dolor abdominal intenso, diarrea, fiebre de 38,5 °C, náuseas y vómito
- 70. La microbiología - Clinica Importante Bacteremia: Esta es ocasionada principalmente por Salmonella del grupo I, y se consideran altamente invasoras la S. choleraesuis y la S. dublin, además muy próximas a estas están todas las S.typhimurium y S. enteritidis. La Salmonella parece tener especial afinidad por los tejidos endoteliales, por lo que la infección de la aorta asociada a la fístula aorto-duodenal es una condición bien conocida; la infección por salmonella de los grandes vasos lleva a la formación de aneurismas micóticos
- 71. La microbiología - Clinica Importante Fiebre entérica: Dentro de las fiebres entéricas, la fiebre tifoidea es la más conocida y la más severa, esta es producida por la Salmonella typhi. Otros síndromes menos severos son conocidos como fiebre paratifoidea, y se asocian a S. paratyphi A y C Existe un período de incubación de 21 días (10 en promedio) y las manifestaciones clínicas en pacientes no tratados se dividen en semanas de acuerdo a su evolución. Durante la primera semana se observa fiebre progresiva y escalonada, asociada a cefalea intensa, anorexia y astenia; entre la semana 2 y 3 la fiebre se estabiliza y se vuelve continua, la cefalea es persistente y el estado de conciencia se altera, el paciente entra en un estado de sopor (tiphus), aparecen síntomas meníngeos, lesiones en la piel del tronco de tipo maculo papulosa de color salmón (manchas rosadas), en cerca del 50 % de los casos se presenta hepatoesplenomegalia
- 72. La microbiología - Sintomatología Diarrea Fiebre y Dolor de cabeza Dolores Abdominales Nauseas y Vómitos comienzan entre 6 y 72 horas después de la exposición y duran de 4 a 7 días, dependiendo de factores del huésped
- 74. La microbiología - Streptococcus pyogenes Bacteria gram +, con presencia de una capa de peptidoglucanos alrededor de su membrana citoplasmática. Entre sus principales características se encuentran la forma de coco esférico, de 1 a 2 μm de diámetro, está ordenado en cadenas cortas, no es móvil, no produce esporas, es anaerobio facultativo
- 75. La microbiología - Streptococcus pyogenes
- 76. La microbiología Estreptococo Esféricas u Ovoides Gram Positivos No Esporas Inmóviles Streptococcus pyogenes Patógeno
- 77. La microbiología - Tipos Los estreptococos se dividen en diversos grupos según su apariencia en los cultivos de laboratorio y sus diferentes componentes químicos. Estreptococos Grupo A Grupo B Grupo D Viridians
- 78. La microbiología - Habitad Los únicos reservorios conocidos en la naturaleza de S. pyogenes son la piel y las membranas mucosas del ser humano. La portación asintomática es mayor en niños (15%-26%) que en adultos (5%). S. pyogenes es claramente un patógeno humano. La infección natural en animales es muy rara (prácticamente inexistente) y la infección experimental requiere de inóculos extremadamente elevados. En institutos que atienden pacientes crónicos la colonización puede a llegar al 17% La bacteria puede encontrarse en el aire y en objetos inanimados, como polvo, ropa, muebles en sitios donde hay pacientes infectados con S. pyogenes. Puede sobrevivir en objetos inanimados hasta 4 semanas.
- 79. La microbiología Morbilidad y Mortalidad Las personas que se encuentran mayormente afectadas son aquellas que se encuentran inmunocomprometidas (diabetes mellitus, VIH/Sida, entre otros). Como también las que tienen alguna vía de entrada por trauma, quemadura y que se encuentran en edades en rangos menores de 5 años y/o mayores de 60 años Porque la diabetes mellitus genera inmunosupresión a través de diversos mecanismos: Disminución de síntesis y liberación de interleucina 1 e interleucina 6 (IL-1, IL-6) por monocitos y macrófagos en respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos. Disminuye la quimiotaxis y la capacidad fagocítica de las células polimorfonucleares (PMN). Disminuye los niveles del complemento, especialmente C4 Es importante mencionar que la DM retarda la cicatrización, lo que permite la entrada a un mayor número de patógenos, por lo que cualquier herida puede representar una vía de entrada para
- 80. La microbiología - Patogenia Una vez dentro de la célula y al haber inhibido al sistema inmune del huésped continúa el proceso de patogénesis mediante la secreción de sus toxinas y otras enzimas entre las cuales cabe resaltar: la estreptocinasa, enzima proteolítica que transforma el plasminógeno a plasmina; de esta forma, propicia un estado anticoagulante. La hialuronidasa, que degrada el ácido hialurónico del tejido conectivo. La estreptolisina O que es una citolisina dependiente de colesterol, la cual forma poros en las membranas celulares e inhibe la maduración de los autofagosomas y con ello la fagocitosis.
- 81. La microbiología - Patogenia La estreptolisina S que es una toxina reconocida como una de las principales claves de la patogenia cutánea, ya que no sólo produce la beta hemólisis de los eritrocitos, si no también en el rompimiento de las uniones intracelulares en la piel, además de provocar apoptosis de los macrófagos, neutrófilos y en últimos estudios se ha demostrado que también está involucrada en la necrosis de los queratinocitos. En este estudio se encontró que esta toxina acelera la apoptosis de los queratinocitos después de 6 horas de infección epitelial. Los queratinocitos son las células principales de la piel presentes desde la capa basal hasta la capa cornea, por lo que su destrucción representa una importante entrada para infecciones más profundas y aparición de bacteremias.
- 82. La microbiología - Virulencia estreptoquinasa (lisis de coágulos de fibrina) hialuronidasa estreptolisina O (lábil al oxígeno) estreptolisina S (estable al oxígeno) exotoxina pirogénica estreptocócica (Spe) S. pyogenes secreta factores de virulencia al medio extracelular como:
- 83. La microbiología - Virulencia estreptoquinasa (lisis de coágulos de fibrina) hialuronidasa estreptolisina O (lábil al oxígeno) estreptolisina S (estable al oxígeno) exotoxina pirogénica estreptocócica (Spe)
- 84. La microbiología - Virulencia Los estreptococos pueden evadir la fagocitosis inhibiendo la opsonización al destruir o inactivar quimiorreceptores derivados del complemento y opsoninas por parte de la C5a peptidasa La proteína M, en ausencia de anticuerpos específicos de tipo es capaz de inhibir la fagocitosis por parte de polimorfonucleares y monocitos. También la cápsula de ácido hialurónico presente en algunas cepas mucoides es un factor antifagocítico
- 85. La microbiología - Virulencia La estreptolisina O es una citolisina lábil al oxígeno que se une al colesterol de las membranas celulares de las células eucarióticas (entre ellas los fagocitos) contribuyendo a su lisis por un mecanismo osmótico. En el huésped carente de inmunidad, la estreptolisina O, la exotoxina A, y otros componentes estimulan a las células humanas para producir el factor de necrosis tumoral y la interleuquina 1. Estas citoquinas inducen la hipotensión y estimulan la leucostasis y así dan lugar al shock, que se caracteriza por daño microvascular, falla multiorgánica y en algunos casos conduce a la muerte.
- 86. La microbiología - Factores de Virulencia Streptococcus pyogenes
- 87. La microbiología - Clínica Edad de la Persona – Niños y Ancianos Pacientes Inmunocomprometidos Diabetes Mellitus Serotipo
- 88. La microbiología - Clinica Importante Las principales lesiones cutáneas generados por S. pyogenes son: La celulitis, la erisipela y la fascitis necrotizante La erisipela Forma de infección superficial donde la infección por S. pyogenes se limita a las capas superficiales de la epidermis y la dermis. Las manifestaciones clínicas (zona eritematosa limitada, con lesiones de aspecto circular y brillante por edema) estarían generadas por el inicio de la respuesta innata, donde el patógeno ya ha sido detectado con la consecuente respuesta inflamatoria y secreción de citocinas, además de toxinas y enzimas, como la hialuronidasa generadas por el S. pyogenes
- 89. La microbiología - Sintomatología La erisipela se caracteriza por manifestarse como: 1. Una placa eritematoedematosa, brillante y dolorosa 2. Fiebre y síntomas generales. 3. Puede aparecer en cualquier zona del cuerpo donde se encuentre la lesión o herida que permite la entrada a la piel lesionada. Los sitios de mayor afección son las piernas, dorso de los pies y cara; en algunos casos, 4. la persona puede presentar fiebre de 38ºC a 40ºC antes de que aparezca la lesión cutánea y ésta se puede diferenciar de una celulitis gracias a las siguientes características: a. Las lesiones toman un aspecto circular alrededor del foco de la lesión. b. Bordes limitados. c. Tienen un aspecto brillante edematoso y eritematoso.
- 90. La microbiología
- 91. La microbiología - Clínica Importante Celulitis: Al igual que la erisipela, la celulitis puede manifestar síntomas generales antes de que se den las lesiones cutáneas. También puede aparecer en cualquier parte del cuerpo con predominio en piernas y cara, el área afectada se manifiesta como una zona eritemato-edematosa, dolorosa y caliente; el área de la lesión no tiene límites definidos y no posee un aspecto circular de la lesión
- 92. La microbiología - Clínica Importante Fascitis necrotizante: La fascitis necrotizante suele ser, en mayor medida, una infección polimicrobiana, pero también puede darse el caso de una infección monomicrobiana, resaltando entre las bacterias involucradas a S. pyogenes. La lesión se caracteriza por una rápida necrosis del tejido subcutáneo y la fascia, con una mortalidad que varía desde el 20% hasta el 60%, siendo la DM el principal factor de mortalidad. La lesión comienza con una zona eritematosa con hiperalgesia cutánea, pudiéndose confundir con una celulitis infecciosa; sin embargo, el dolor de la fascitis necrotizante es desproporcional con la herida en cuestión siendo el motivo principal por el que las personas acuden a recibir atención médica.
- 93. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM La tinción de células es una metodología importante generalmente utilizada en el área de la biología. Una de las tinciones más conocidas en microbiología es la desarrollada en 1884 por Hans Christian Gram, bacteriólogo danés, quien buscaba diferenciar entre dos bacterias que causaban neumonía. Este método ha permitido hacer una clasificación de las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas, dependiendo de la capacidad que tengan para retener el colorante cristal violeta usado en la tinción. El método es ampliamente utilizado en los laboratorios de microbiología, por ejemplo, en el diagnóstico clínico permitiendo elegir al médico el antibiótico a usar.
- 94. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
- 95. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM GRAM + GRAM -
- 96. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
- 97. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM Durante la tinción, las bacterias Gram positivas se tiñen de morado, mientras que las bacterias Gram negativas toman una coloración roja. Esto es debido principalmente a las diferencias estructurales que presentan en su pared. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante cristal violeta con mayor facilidad que las Gram positivas. Las células que han perdido el cristal violeta se tiñen de color rojo con la safranina que actúa como colorante de contraste. Existen algunos cultivos que darán un resultado negativo en la tinción Gram cuando el cultivo va envejeciendo, esto es particularmente común en cultivos de Bacillus y Clostridium.
- 98. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM GRAM +
- 99. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM GRAM -
- 100. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM – PREPARACION DE REACTIVOS • Solución A: Cristal Violeta, 2 g; etanol 95% (v/v), 20 mL • Solución B: Oxalato de amonio, 0.8 g; agua destilada, 80 mL • Mezclar A y B para obtener el reactivo de tinción Cristal Violeta. La solución se deja reposar durante 24 h y se filtra con papel Cristal Violeta • Yodo, 1.0 g; yoduro de potasio, 2.0 g; agua destilada, 300 mL • Pulverizar el yodo y el yoduro de potasio en un mortero y agregar agua lentamente hasta que el yodo se disuelva. Guardar en botellas ámbar, para protegerlo de la luz. Lugol • Solución madre: Safranina 2.5 g; etanol 95% (v/v) 100 mL • Solución de trabajo: solución madre 10 mL; agua destilada 90 mL Safranina
- 101. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM – PREPARACION DE REACTIVOS • Etanol (95%, v/v), 500 mL; acetona, 300 mL Etanol / Acetona
- 102. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM La primera etapa es la preparación de un frotis bacteriano. Un frotis es la extensión de una muestra o cultivo sobre un portaobjetos para separar lo más posible los microorganismos, lo cual permitirá obtener una mejor imagen de la morfología y agrupamiento celular. La muestra extendida es posteriormente fijada al portaobjeto por calor para evitar que sea arrastrada por las soluciones de colorantes y lavados sucesivos.
- 103. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM Cubrir la preparación del frotis con unas gotas de cristal de violeta durante un minuto. Enjuagar suavemente rociando un pequeño chorro de agua sobre la parte superior del portaobjetos, procurando no desprender la preparación, por presión del agua. Después aplique Lugol durante un minuto, lave suavemente con agua. El yodo es corrosivo evite el contacto con la piel. Decolorar por 10 segundos con una mezcla de alcohol y acetona (1:1), y enjuagar rápidamente con agua. Si no se retira rápidamente el decolorante desteñirá tanto a Gram positivas como Gram negativas. Posteriormente contrastar con safranina durante 45 segundos, y finalmente enjuagar con agua.
- 104. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM Observar al microscopio con el objetivo 100x, agregando aceite de inmersión para lograr una buena resolución. Nunca Olvidar que para llegar al objetivo de Recuerde que primero tendrán 100x primero se deberá utilizar alguno de los objetivos de menor aumento.
- 105. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM BACTERIAS GRAM + BACTERIAS GRAM -
- 106. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
- 107. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM / GRAM + • Responsable de abscesos, dermatitis, infecciones localizadas y posibles gastroenteritis. Staphylococcus aureus • Causante de infecciones supurativas en el trayecto respiratorio, así como de fiebre reumática. Streptococcus pyogenes. • Frecuente en casos de meningitis neonatal, endometritis y neumonía. Streptococcus aglactiae.
- 108. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico • Responsable de neumonías e infecciones en las vías respiratorias, así como otitis, meningitis y peritonitis. Streptococcus pneumoniae • Bacterias responsables de los tétanos, entran al cuerpo desde el suelo por traumatismos en las extremidades. Clostridium tetani • Se trata de la conocida bacteria del ántrax, tanto en su versión cutánea como en la pulmonar. Bacillus antracis TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM / GRAM +
- 109. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico • Causante del botulismo clásico y el infantil, habita en el suelo y en los alimentos mal conservados. Clostridium botullinum • Esta bacteria segrega toxinas que destruyen la pared celular, y es responsable de las gangrenas gaseosas, la enteritis necrosante y la endometritis. Clostridium perfringes • Usual en infecciones en vías biliares y urinarias, habita en el colon humano. Streptococcus faecalis TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM / GRAM +
- 110. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico • Habitante usual del colon humano, está involucrada en las llamadas “diarreas del viajero”, así como en meningitis neonatal, sepsis e infecciones urinarias. Escherichia coli • Bacteria responsable de la enfermedad conocida como fiebre tifoidea, suele transmitirse por vía fecal-oral: contaminación de aguas, mala disposición de excretas o higiene defectuosa Salmonella Typhi • Peligrosa bacteria causante de meningitis y meningocococemias, coloniza las vías respiratorias humanas y asciende a las meninges por vía sanguínea. Neisseria meningitidis TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM / GRAM -
- 111. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico • Conocidísima por ser la causante de la gonorrea, común enfermedad de transmisión sexual. Neisseria gonorrhoeae • Suele ocasionar enterocolitis y septicemia con abscesos si llega a pasar del intestino a la sangre. Salmonella enteritidis • Bacilo usualmente aerobio, es responsable de numerosas meningitis, otitis, sinusitis, bronconeumonías, celulitis y artritis séptica. Haemophilus influenzae TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM / GRAM -
- 112. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico • Responsable de la llamada “fiebre del conejo” o tularemia, se transmite al hombre mediante vectores (ácaros u otro tipo de exoparásitos) de los conejos, ciervos y animales semejantes. Francisella tularensis. • Bacilo anaeróbico, transmitido por la mordedura de animales domésticos infectados, tales como perros y gatos. Se disemina a través de la piel e infecta el sistema respiratorio, causando también celulitis. Pasteurella multocida • Ocasiona la brucelosis, una enfermedad del ganado que se transmite al hombre por contacto con los animales o por ingesta de lácteos sin pasteurizar. Brucella abortus. TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM / GRAM -
- 113. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM - IMPORTANCIA la tinción de Gram se ha convertido en una de las tinciones diferenciales más usadas en la Microbiología, como herramienta básica para el diagnostico preliminar y presuntivo del agente infeccioso. Esta coloración diferencial clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: Grampositivas y Gram negativas con base a las diferencias estructurales de sus paredes celulares.
- 114. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM - IMPORTANCIA Las características fenotípicas que presentan algunas bacterias contribuyen a su diagnostico presuntivo: la observación de cocos grampositivos dispuestos en racimos sugieren la presencia de estafilococos; la disposición de cocos Grampositivos en cadena indica estreptococos; diplococos Grampositivos en forma de lanceta o con extremos alargados son característicos de S. pneumoniae cuando se observan en esputos, diplococos Gram negativos arriñonados o reniformes son característicos de las especies de Neisseria, bacilos Grampositivos ordenados en letras chinas o empalizadas son típicos del Corynebacterim, bacilos Gram negativos curvos en muestras de heces diarreicas indican especie de Vibrio, o si también se ven en forma de sacacorchos sugieren especies de Campylobacter
- 115. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM - IMPORTANCIA Además de proveer al microbiólogo y al clínico las características fenotípicas de la bacteria en cuanto a tamaño, forma, agrupación y características tintoriales, esta tinción es importantísima ya que en algunos casos permite la instauración del tratamiento rápido y oportuno.
- 116. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - INTRODUCCION Los medios de cultivo son conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y componentes adicionales que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es muy variable que la cantidad de medios de cultivo es enorme, no existe un medio de cultivo universal adecuado para todos los microorganismos
- 117. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - COMPONENTES • Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza. AGAR • Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de los medios de cultivo. Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de malta. EXTRACTOS
- 118. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - COMPONENTES • Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales minerales. PEPTONAS • Con frecuencia es necesario añadir a los medios de cultivo de algunos patógenos sustancias como sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo para conseguir el primer aislamiento a partir del hospedador. La sangre no puede ser esterilizada, y por tanto debe de ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano, y adicionada al medio de cultivo después de que este haya sido auto clavado. Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que también aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. FUIDOS CORPORALES
- 119. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - COMPONENTES • Para mantener el pH dentro del rango optimo del crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir algunos componentes al medio de cultivo. Debido a que la mayoría de as bacterias son neutrófilas, se suelen emplear sales del tipo de los fosfatos bisodicos ò bipotásicos u otras sustancias como las peptonas para prevenir la desviación del pH. AMORTIGUADORES • Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces añadir indicadores acido-base que nos lo indiquen. INDICADORES DE PH
- 120. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - COMPONENTES • Con el objetivo de crear en los medios de cultivo condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos ò anaerobios se añaden estos agentes reductores siendo, los mas empleados la cisteína y el tioglicolato entre otros. AGENTES REDUCTORES • La adición de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potasico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados microorganismos. AGENTES SELECTIVOS
- 121. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS TIPOS MEDIOS GENERALES MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO MEDIOS SELECTIVOS MEDIOS DIFERENCIALES
- 122. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Por lo general son medios líquidos, pudiendo ser semisólidos en algunos casos, que contienen sustancias que estimulan el crecimiento de los microorganismos y permiten el desarrollo de la población microbiana a partir de un número reducido de células de determinados gérmenes que pueden encontrarse en presencia de otros que, hallándose en condiciones favorables, pudieran frenar el desarrollo de los primeros Enriqueci miento
- 123. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS A estos medios se le adiciona sustancias para que solo crezcan ciertas bacterias y estas, al actuar sobre alguna de las sustancias adicionadas, permiten observar macroscópicamente ciertas propiedades de crecimiento que ayudan a diferenciar sus colonas de otras especies diferentes. Diferenci ales
- 124. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Toleran el crecimiento de gran variedad especies de microorganismos y a la vez facilitan la identificación de colonias de interés, de tal forma garantiza que estén los nutrientes mínimos necesarios para su desarrollo. Generales En su mayoría son sólidos, contienen sustancias que inhiben el crecimiento de determinados tipos de microorganismos, o sea, previene el crecimiento de especies acompañantes indeseables. Selectivos
- 125. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Mac Conkey Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a partir de muestras clínicas, aguas y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
- 126. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Sangre Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes y la clara visualización de reacciones de hemólisis. La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. El agregado de 5-10 % sangre ovina desfibrinada estéril promueve el desarrollo de bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales y la adecuada observación de las reacciones de hemólisis.
- 127. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Chocolate Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales, por ejemplo especies de Streptococcus, Haemophilus y Neisserias patógenas. El medio de cultivo es ampliamente nutritivo por la presencia de peptona, tripteína, extracto de levadura, extracto de corazón y almidón. El agregado de sangre y suplemento con solvente aporta nutrientes, vitaminas y minerales adicionales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante
- 128. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Sabouraud Este medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras. El Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo). En el medio de cultivo, la peptona, la tripteína y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y levaduras.
- 129. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar EMB Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece el desarrollo microbiano. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de bacterias Gram positivas. El agar es el agente solidificante.
- 130. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar S-S Este Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los nutrientes para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante inhiben el desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El tiosulfato de sodio permite la formación de SH2 que se evidencia por la formación de sulfuro de hierro. El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante.
- 131. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Manitol Salado Este medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de diversas muestras. En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante.
- 132. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Manitol Salado Este medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de diversas muestras. Se trata de un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a la capacidad de fermentación del manitol por los microorganismos. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.
- 133. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico MEDIOS DE CULTIVO - TIPOS Agar Manitol Salado Este medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de diversas muestras. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura. Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria
- 134. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varia entre unos segundos hasta unas pocas horas.
- 135. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar.
- 136. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA No obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de forma rápida tras incubación de unas 2-6h; en general, se trata de reacciones enzimáticas cromogenicas o pruebas convencionales modificadas (hay discos o tabletas comercializados con substratos cromogenicas para uso individualizado).
- 137. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación preliminar, con lectura inmediata: Prueba de la Catalasa La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno gaseoso que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba es separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus spp. (negativa).
- 138. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación preliminar, con lectura inmediata: Prueba de la Catalasa
- 139. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación preliminar, con lectura inmediata: Prueba de la Oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de hidrogeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromo oxidasa solo se encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y, excepcionalmente, en alguna microaerofila (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias estrictas carecen de actividad oxidasa.
- 140. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación preliminar, con lectura inmediata: Prueba de la Oxidasa Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que esta degrada el peróxido de hidrogeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es toxica.
- 141. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación preliminar, con lectura inmediata: Prueba de la Oxidasa
- 142. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de la Hidrolisis del hipurato Demuestra la capacidad de algunas bacterias para hidrolizar el hipurato de sodio a acido benzoico y glicina por la acción de la enzima hipuricasa. Como indicador de la reacción se utiliza ninhidrina. Esta prueba se utiliza en la identificación de Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis y Streptococcus agalactiae.
- 143. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de la β-galactosidasa (ONPG) Esta prueba demuestra la presencia de la enzima βgalactosidasa. Hay bacterias que a pesar de poseer enzimas que hidrolizan la lactosa (β - galactosidasas), no pueden actuar sobre ella porque les faltan las enzimas extracelulares apropiadas (permeasas). Para conocer si un microorganismo es productor de β-galactosidasa, basta añadir el compuesto orgánico O-nitrofenil β-D-galactopiranosido (ONPG) que es incoloro. Si la bacteria posee las enzimas hidrolizantes (β -galactosidasa), el compuesto se transforma en ortonitrofenol, un derivado cromogenico de color amarillo. Todas las bacterias fermentadoras lentas de la lactosa son β -galactosidasa positivas.
- 144. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de la β-galactosidasa (ONPG)
- 145. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de la Aminopeptidasa: PYR. La L-pirrolidonil-β-naftilamida sirve como sustrato para la detección de pirrolidonil peptidasa. Se utiliza principalmente en la identificación de Streptococcus pyogenes y Enterococcus spp. También en la diferenciación de Staphylococcus lugdunensis de otros estafilocos coagulasa negativa.
- 146. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de la Ureasa. Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. La prueba también se utiliza para diferenciar Physobacter phenylpyruvicus de Moraxella spp. Helicobacter pylori y Brucella spp. también hidrolizan la urea. Esta prueba puede ayudar en la identificación de Cryptococcus spp. que produce un resultado positivo después de una incubación prolongada.
- 147. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de la Ureasa
- 148. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de Indol Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa
- 149. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 6 horas: Prueba de Indol
- 150. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de Oxido-Fermentación Mediante esta prueba se va a determinar si la utilización de los hidratos de carbono por parte de un microorganismo se realiza por vía oxidativa (proceso aeróbico, presencia de oxígeno) o por vía fermentativa (proceso anaeróbico, ausencia de oxígeno).
- 151. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de Reducción de nitratos. Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Se utiliza para asignar bacterias a la familia Enterobacteriaceae, en la diferenciación de Moraxella catarrhalis del género Neisseria y en la identificación de bacilos grampositivos aerobios.
- 152. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de Rojo de metilo El rojo de metilo es un indicador de pH. Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Mediante esta prueba se comprueba la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa por la vía de la fermentación acido mixta. Se utiliza como parte de la identificación a nivel de especie de los bacilos entéricos gramnegativos.
- 153. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba Voges-Proskauer. Permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía butanodiolica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoina) que forma un complejo de color rojizo con el α-naftol. Se usa en la identificación a nivel de especie de bacilos entéricos gramnegativos, Aeromonas spp., y Vibrio spp.
- 154. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de Agar hierro de Kligler Mediante esta prueba se puede determinar: La capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico (en este caso glucosa, lactosa o ambas) incorporado en un medio de crecimiento básico. Producción o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono. Producción de acido sulfhídrico (SH2). El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otro medio, el triple sugar iron (TSI) que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa.
- 155. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Fermentación de azucares. Las bacterias anaerobias o anaerobias facultativas a menudo fermentan carbohidratos ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH.
- 156. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de la Coagulasa Permite determinar la capacidad de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. Se utiliza para diferenciar S. aureus (coagulasa positivo) de otras especies de Staphylococcus. La prueba de la coagulasa en tubo se puede leer tras incubación de 4h, pero si es negativa debe incubarse hasta 24h.
- 157. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de la Fenilalanina-desaminasa. Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en acido fenilpiruvico por la actividad enzimática de la fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de los géneros Proteus, Providencia y Morganella por lo que se utiliza para separar estos tres géneros de otros géneros de enterobacterias.
- 158. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de ADNasa. Se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para hidrolizar enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla de mono y polinucleótidos
- 159. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de la Lipasa Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de descomponer las grasas en ácidos grasos y glicerol, por acción de la enzima lipasa
- 160. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de Utilización de citrato Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella Typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como única fuente de carbono.
- 161. Metodología de Identificación y Diagnostico Microbiológico PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA Pruebas utilizadas en la identificación con lectura en rango de 18 a 48 horas: Prueba de la Lecitinasa. La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción de dicha enzima por determinados microorganismos, capaces de actuar sobre la lecitina, sustancia orgánica nitrogenada y fosfatada, contenida principalmente en la yema de huevo.