Práctica 7 y 8 Bioelementos
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Este documento describe los protocolos para siete prácticas de laboratorio destinadas a identificar los principales bioelementos y biomoléculas en organismos vivos. Las prácticas incluyen pruebas para detectar la presencia de carbohidratos como azúcares y almidón, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos en muestras biológicas mediante reacciones químicas simples. Además, se proporcionan instrucciones detalladas sobre los materiales y procedimientos requeridos para cada práctica.
Práctica 7 y 8 Bioelementos
- 1. PRÁCTICAS 7 Y 8 BIOELEMENTOS I Y II: COMPOSICIÓN DE LOS ORGANISMOS VIVIENTES I. INTRODUCCIÓN: Los bioelementos, aquellos elementos que mayoritariamente están presentes en la materia viva son: carbono (C), oxígeno (O), hidrógeno (H), nitrógeno (N), y en menor medida, fósforo (P), azufre (S), magnesio (Mg), calcio (Ca), sodio, (Na), potasio (K), y cloro (Cl). Los cuatro más abundante, C,H,O, y N constituyen un 95 % de las estructuras biológicas. Los restantes forman el 4.9%, en tanto que el 0.1 % restante está compuesto por los denominados oligoelementos, como hierro (Fe), manganeso (Mn), cobre (Cu), zinc (Zn), flúor (F) e yodo (I). Todos se encuentran en los organismos en forma de moléculas más o menos complejas que, desde el punto de vista químico se clasifican en orgánicas e inorgánicas. Todos las biomoléculas contienen carbono. Algunas pruebas simples de laboratorio permiten identificar la presencia de compuestos orgánicos específicos. Antes de comenzar con los trabajos de experimentación, se deben tener en cuenta las siguientes pautas: 1. Es conveniente que cada experimento ponga a prueba uno solo de los factores explicativos. 2. De acuerdo con lo anterior, si los experimentos son varios, cada uno debe diferir en un solo aspecto, mientras que el resto de las condiciones permanecerá constante. 3. Los experimentos deben incluir por lo menos un testigo, que es el ensayo donde el factor explicativo que se pone a prueba no varía. De este modo, se puede realizar una comparación entre los resultados obtenidos en el ensayo experimental y en el testigo. 4. En algunos experimentos químicos, se incluyen testigos que permiten asegurarse que los reactivos y /o el procedimiento usados son los adecuados. II. OBJETIVOS: · Adquirir destreza en el manejo y cuidado del material de laboratorio · Determinar la presencia de compuestos carbono en materiales biológicos, que importancia tienen, donde están y que función vital cumplen las diferentes biomoléculas (macromoléculas) · Determinar algunas propiedades de las macromoléculas y las moléculas que las forman. CONOCIMIENTOS TEORICOS: Biomoléculas (macromoléculas) de los seres vivos. Estructura y función de carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos. 1
- 2. MATERIALES NECESARIOS Guantes descartables. Tubos de ensayo. Gradillas. Pinza de madera. Mechero. Papel madera. Vaso de precipitado. Pipetas. Varillas de vidrio. Mortero. Erlenmeyer. Hidróxido de amonio. Azúcar Ácido nítrico Varilla fina Colador o centrífuga Tubo de ensayo Iodo. Hidróxido de sodio. HCl . AgNO3. Almidón o fécula. Miel. Grasa o aceite. Clara de huevo cocida. Soluciones A y B de Fehling. Granos de trigo. Alcohol. Carne de pescado Agua destilada Sal de mesa Bicarbonato de sodio Detergente Alcohol isoamilico a 0 C Batidora Hielera Carne molida III. TÉCNICAS CARBOHIDRATOS Los carbohidratos comprenden azúcares simples (monosacáridos), sus polímeros (oligo y polisacáridos) y otros derivados azúcares (RNA, DNA, etc.). Distribuidos ampliamente en la naturaleza, los carbohidratos representan, sobre la base de masa, la clase más abundante de biomoléculas orgánicas sobre la Tierra. La mayor parte de ellos se acumulan como resultado de la fotosíntesis. Desempeñan varios papeles cruciales en los organismos vivos. 2. Prueba para la detección de azúcares simples reductores. Una de las propiedades más destacadas de los monosacáridos en general (glucosa, fructosa, etc.) y de algunos disacáridos (lactosa, etc.) es el poder reductor que les confiere el grupo aldehído o cetona de sus moléculas. Esta propiedad de los azúcares se pone de manifiesto frente a sales de cobre II. El reactivo de Fehling es utilizado para detectar la presencia de azúcares con capacidad reductora, tiene dos soluciones separadas (A y B), que se mezclan en partes iguales en el momento de utilizarlo. La mezcla de las soluciones A y B de Fehling es de color azul intenso. La formación de un precipitado rojo ladrillo de Cu2O con la solución de Fehling es el resultado positivo de la presencia de un azúcar reductor. La reacción que ocurre es de tipo oxido-reducción, en la cual el grupo funcional aldehido o cetona del azúcar reductor se oxida a ácido y el Cu II se reduce a Cu I Procedimiento: 1. Coloque unas gotas de miel en un tubo de ensayo y llene un tercio o una mitad del tubo con solución de Fehling A y B. Caliente el tubo, cuidando alejar del rostro el extremo del tubo y no apuntar a sus compañeros. Describa lo sucedido e indique el resultado. 2
- 3. 2. Repita la experiencia utilizando ahora azúcar de mesa (que está presente en el azúcar de caña y remolacha). Indique el resultado. 3. Repita el ensayo utilizando manzana (cortar en pequeños trozos y aplastar con un mortero, llevar al tubo de ensayo y agregar una parte igual de agua). 3. Prueba para la detección de almidón. El almidón es un polisacárido, fuente importante de energía en toda dieta bien balanceada. Los polisacáridos son las biomoléculas más abundantes de reserva en la tierra. En las células vegetales el almidón se encuentra como una mezcla de amilopectina (80-90 %) y amilosa (10-20%). Esta última se colorea de azul violeta en presencia de una solución de yodo, debido a una reacción física (no química) de adsorción. La molécula de I2, se introducen en la estructura helicoidal de la molécula de almidón dando como resultado el color violáceo. Procedimiento: 1. Coloque una pequeña porción de almidón en un tubo de ensayo y agregue un tercio de la capacidad del tubo con agua. Caliente el tubo de ensayo hasta que el agua hierva. Enfriar y agregar unas pocas gotas de solución de Lugol (I2 - I-). 2. Indique los cambios producidos y el resultado del test. 3. Repita la experimentación utilizando papa, cortar en rebanada, y raspar su superficie. Llevar el raspado al tubo de ensayo y agregar una parte igual de agua. LÍPIDOS A diferencia de los carbohidratos y proteínas, los lípidos tienen diversas estructuras y funciones, pero sus características de solubilidad son semejantes. Se definen operacionalmente, como compuestos orgánicos insolubles en agua o ligeramente solubles, que se encuentran en los sistemas biológicos. Los lípidos son hidrofóbicos (no polares) o anfipáticos (que tienen sustituyentes polares y no polares). 4. Prueba para la detección y el reconocimiento de algunas propiedades de los lípidos. Las moléculas que presentan polaridad eléctrica se denominan sustancias polares y tienden a disolverse en solventes polares, como el agua, mientras que las sustancias no polares lo hacen en solventes no polares, como n-hexano o éter de petróleo. Establezca una hipótesis acerca de la polaridad de lípidos, mediante la siguiente experiencia: Coloque en dos tubos de ensayo aceite. En uno agregue agua, y en el otro, n-hexano o éter de petróleo. Agite vigorosamente cada uno de los tubos. Observe y discuta los resultados. El papel madera, por otra parte, es una prueba sencilla que permite detectar la presencia de grasas y aceites. El papel madera se torna translúcido cuando se frota sobre él grasa o aceite. Esto ocurre porque la parte hidrofílica de la molécula de lípido se une a la parte hidrofílica de la celulosa del papel. Procedimiento: 1. Distribuya una pequeña cantidad de aceite o grasa en papel madera. Coloque el papel al trasluz. Observe y describa los cambios. 2. Realice la misma prueba con homogenado de músculo de pescado, y con músculo de vaca (carne molida). Discuta los resultados. 3
- 4. 3. Las grasas se colorean selectivamente de rojo anaranjado en presencia del colorante Sudán III o Sudán IV. El colorante es soluble en aceite y difundirá en gotas de aceite, tornándolas rosadas - anaranjadas. 4. Coloque un trozo del homogenado de músculo que utilizó anteriormente en un tubo de ensayo seco, en otro tubo aceite de mesa y agregue a ambos unas gotas de Sudán. Espere 30 minutos. Observe y concluya acerca de los resultados obtenidos. PROTEÍNAS Las proteínas constituyen el componente principal de todo sistema biológico. Ninguna parte viva de cualquier organismo (y por ende de cualquier célula) carece de proteínas. Son polímeros de aminoácidos, y cumplen funciones, sin las cuales no habría vida en la forma conocida. Las funciones son: estructurales, enzimáticas, de transporte y hormonales. 5. Prueba para la detección de proteínas. Una de las reacciones más utilizadas para la identificación de proteínas es la de Biuret, característica de proteínas y péptidos, pero no de los aminoácidos libres, ya que indica específicamente la presencia de enlaces peptídicos. Todas las proteínas reaccionan en medio alcalino cuando se agrega CuSO4 dando colores que varían del violeta al rosado. El color depende del grado de hidrólisis alcanzado. Los péptidos más pequeños y los aminoácidos libres no dan color. Por lo tanto, este ensayo se utiliza para seguir la hidrólisis de una proteína. Procedimiento: 1. En un tubo de ensayo añadir 2 ml de una solución de albúmina al 30 % (testigo positivo). Agregar 2 ml de OHNa al 10%. Añadir 3 gotas de CuSO4 al 2 % (Fehling A) y agitar. Realice el mismo ensayo con leche. Discuta los resultados. 2. El ácido nítrico también es utilizado para determinar la presencia de proteínas. 3. Un color amarillo indica la presencia de proteína. 4. El fundamento de la reacción es el siguiente: el ácido nítrico desnaturaliza la proteína, exponiendo sus aminoácidos, y reacciona con los anillos de tipo bencénico presentes en aminoácidos como la fenilalanina o la histidina, dando un color amarillo. 5. Coloque una porción de clara de huevo cocida en un tubo de ensayo y cúbrala con ácido nítrico (PRECAUCIÓN: utilizar guantes descartables durante el manipuleo del ácido, aunque para su seguridad debe emplearlos durante todos los T.P . Entibie el ácido (Cuidado con los vapores que se generan, utilice la campana de gases si es posible) durante uno o dos minutos en baño María, pero NO HERVIR. Vuelque cuidadosamente el ácido y enjuague la clara con agua. Describa los cambios sucedidos. ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucléicos son biopolímeros compuestos por unidades repetitivas, llamadas nucleótidos. Se encuentran en toda célula, y la secuencia de estas unidades codifica la estructura de la enorme variedad de moléculas de proteínas que se encuentran en los organismos. Existe una compleja relación entre la secuencia de bases nitrogenadas del ADN, de los distintos ARNs y de la secuencia de aminoácidos de las proteínas. De alguna manera, los ácidos nucléicos, constituyen los centros de información y control de la toda célula. La información genética, que se trasmite de generación en generación en el proceso de división celular, reside en el material genético o genoma de un organismo. El genoma está compuesto de ácido desoxirribonucleico (DNA) en los organismos vivos, sin embargo algunos genomas virales están compuestos de ácido ribonucleico (RNA). 5. Extracción de ácidos nucléicos. Se proponer dos protocolos: 4
- 5. A) 1. Colocar en un Erlenmeyer 10 g de levadura y agregar 10 ml de solución de NaOH al 40%. Dejar en contacto durante 30 minutos, calentando a B.M. y agitando periódicamente. 2. Agregar luego 20 ml de agua destilada calentada a 50-60 ºC. 3. Filtrar por un trozo de gasa y colocar el residuo en un vaso de precipitado y agregarle 15 ml de agua destilada (50-60 ºC) 4. Filtrar nuevamente por gasa recogiendo sobre el filtrado anterior. Agregar al filtrado HCl concentrado hasta débil reacción ácida al tornasol. 5. Verter sobre el líquido igual volumen de alcohol (etanol). Recoger el precipitado de ácido nucleico sobre papel de filtro en un Buchner o separarlo por centrifugación. Lavarlo con pequeñas porciones de alcohol. 6. Si se desea caracterizar los constituyentes del ácido nucléico se debe colocar el precipitado en un erlenmeyer, agregarle 30 ml de SO4H2 al 10 % y calentar a B:M 30 min. En caso de mucha evaporación agregue agua. 7. Para caracterizar las bases púricas: A 3 ml de la solución agregarle NH4OH hasta reacción alcalina y luego, gota a gota, solución de AgNO3 al 10 %. Observar el resultado. B) La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una solución tampón o buffer en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el buffer contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de buffer y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico, probablemente el único reactivo de esta práctica que no suele haber en una cocina. Procedimiento: 1. Preparar la solución buffer o tampón con los siguientes ingredientes y mantener en refrigeración o en un baño de hielo triturado: o 120 ml de agua destilada. o 1,5 g de sal de mesa, preferentemente pura. o 5 g de bicarbonato sódico. o 5 ml de detergente líquido o champú. 2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos. 3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente. 5
- 6. 4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del buffer frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por una coladera lo más fina posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante. 5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el buffer. 6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el buffer. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado. El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN. Resultados de la determinación de macromoléculas y las moléculas que las forman en distintos materiales biológicos analizados en estas prácticas. Complete la tabla con los resultados que obtuvo en los ensayos utilizados para identificar la composición de los distintos materiales biológicos. Indique con (+) o con (-), si el resultado es positivo o negativo, respectivamente. Material analizado Compuesto orgánico ( macromoléculas y moléculas que las forman) Mono o disacárido Polisacárido Lípido Proteína Ác. nucleico 6
- 7. Preguntas para el reporte de práctica: Complete las siguientes preguntas: 1.- ¿En qué parte de la célula se localiza el Ácido desoxirribonucleico? Respuesta: 2.- ¿Por qué moléculas están formadas las proteínas? Respuesta: 3.- ¿Las paredes celulares de los vegetales contienen un polisacárido cual es? Respuesta: 4.- ¿Qué tipo de molécula es la glucosa? Respuesta: 5.- Las membranas celulares contienen lípidos un tipo particular de ellos tiene dos colas y se orienta para ser impermeable este tipo de moléculas se llama: Respuesta: 7