Practica de laboratorio.docx
- 1. OBJETIVOS • Identificar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo con su reactividad en presencia de reactivos específicos. • Identificar algunos parámetros importantes en grasas como el índice de yodo y de acidez. • Identificar de manera cualitativa la presencia de proteínas y los factores que pueden causar su desnaturalización. INTRODUCCIÓN Las biomoléculas son las moléculas constituyentes de los seres vivos. Los cuatro elementos químicos o bioelementos más abundantes en estos son el carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, representando alrededor del 99% de la masa de la mayoría de las células, con ellos se crean todo tipos de sustancias o biomoléculas. Estas son sintetizadas por los seres vivos, participan en todos los procesos celulares de comunicación, son clave en el metabolismos, además que son de gran importancia en la nutrición y en tecnología alimentaria no solo por su valor nutricional, aporta calórico sino también por su participación dentro de la formación de estructura, textura, sabor, apariencia, así como en otros aspectos sensoriales. Las biomoléculas orgánicas pueden agruparse en cinco grandes tipos: carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y vitaminas. En esta práctica de laboratorio se realizarán diferentes pruebas para el reconocimiento de carbohidratos, lípidos y proteínas. MATERIALES Tubos de ensayo Pinzas para tubo de ensayo Gradillas Vasos de precipitados Mechero, trípode y malla Pipetas graduadas Baño María Bureta Soporte Universal
- 2. REACTIVOS Lugol Reactivo de Molisch Reactivo de Fehling Solución de glucosa 0,1 M Solución de sacarosa 0,1 M Solución de almidón 0,1 M Solución de Maltosa 0,1 M Zumo de cualquier fruta o un jugo de caja KOH 0,05 N Fenolftaleina Aceite vegetal Manteca o mantequilla Solución de Yodo en cloroformo (I2/CHCl3) Colesterol Cloroformo Ácido sulfúrico Anhídrido acético Reactivo de Biuret Gelatina Albúmina de huevo (clara de huevo) Hidróxido de sodio 1,0 M Etanol PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Realice los ensayos que se describen a continuación en tubos de ensayos limpios y secos, con las soluciones patrón de los carbohidratos que se indican en cada caso y las diferentes muestras. Ensayo de Molisch: Soluciones patrón de carbohidratos (sacarosa y glucosa). Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de la solución del carbohidrato y agregue 0.5 mL de reactivo de Molisch, posteriormente adicione 1 mL de H2SO4 concentrado por las paredes del tubo muy lentamente. Observe y explique lo ocurrido. (Esta
- 3. prueba se debe hacer en la campana de extracción y con ayuda del auxiliar de laboratorio) Ensayo de Lugol Soluciones patrón de carbohidratos: Almidón. Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de la solución del carbohidrato y agregue 0.2 mL de Lugol, mezcle y observe la formación de los colores rojo para glicógeno, azul-violeta para almidón como pruebas positivas. Ensayo de Benedict Soluciones patrón de carbohidratos: Glucosa, maltosa y sacarosa. Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de solución de carbohidrato y agregue 0.1 mL del reactivo de Benedict y caliente al baño maría. La formación de un precipitado amarillo o rojizo es indicativo de carbohidratos reductores. Ensayo de Fehling Se toman 3 ml de la muestra que se quiera analizar Glucosa, maltosa y sacarosa, y de las muestras de zumo de fruta. Añadir 1 ml del reactivo Fehling A y 1 ml del reactivo Fehling B El líquido del tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul. Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero de Laboratorio La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo y aparece un precipitado. La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso RECONOCIMIENTO DE LIPIDOS PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL • Índice de acidez: tome 1.0 ml de aceite y 1g de manteca, cada uno en un Erlenmeyer y disuélvalo con 10 mL de etanol; adicione 2 gotas de fenolftaleína y titule con una solución de KOH 0.05 N (el punto de equivalencia se observa cuando la solución toma un color rosado pálido persistente por 30 segundos) Anote el volumen gastado en la titulación y calcule el índice de acidez aplicando la fórmula siguiente: Índice de acidez = 0.56 VKOH • Adición de yodo a ácidos grasos: En cuatro tubos de ensayo agregue 20 gotas de cloroformo y adicione a cada uno de ellos Tubo 1: 0.1 gramos de ácido palmítico o esteárico, Tubo 2: 5 gotas del aceite vegetal, Tubo 4: 0.1 gramos de manteca agite
- 4. bien hasta disolución completa y adiciones a cada tubo, 5 gotas de I2/CHCl3; caliente los tubos al baño maría a 50 oC. Observe en cuales tubos ocurre decoloración de la solución de yodo. • Prueba de Liebermann-Burchard: En tres tubos de ensayo coloque respectivamente: Tubo 1: 10 gotas de solución de colesterol al 0.1 % en cloroformo Tubo 2: 5 gotas de aceite vegetal Tubo 3: 0.1 gramos de manteca A los tubos 2 y 3 adicione 20 gotas de cloroformo y agite hasta disolución. Luego agregue a los tres tubos, 5 gotas de anhídrido acético seguidas por unas gotas de ácido sulfúrico concentrado. Una coloración azul verdosa es positiva para esteroides (p.e: colesterol) y una coloración rojiza es indicativa de compuestos de naturaleza terpénica. (Esta prueba se debe hacer en la campana de extracción y con ayuda del auxiliar de laboratorio) RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS Prueba de Biuret Albúmina de huevo, gelatina. Reactivos: Reactivo de Biuret, Hidróxido de sodio 1,0 M A 0,5 mL de muestra agregue 1 mL de reactivo de Biuret; mezcle vigorosamente y observe los cambios de color. Desnaturalización de proteínas Proteínas: Albúmina de huevo, gelatina. Tomar una de las proteínas problema y realizar el siguiente procedimiento: Acción del Calor: Calentar la parte superior de un tubo de ensayo que contenga 5mL de albumina hasta que hierva, comparar con la parte inferior del tubo. Acción del alcohol: Agregar 5mL de alcohol desnaturalizado a 5 ml de albumina de huevo, observar los resultados. Acción del pH: Agregar a 5mL de solución de albumina o de cualquiera de las proteínas con las que se cuente, y por las paredes del tubo, 4 gotas de HCl concentrado
- 5. PREGUNTAS 1. Consulte el fundamento de cada de cada una de las pruebas que se van a realizar PRUEBA DE MOLISH La reacción de Molisch es una reacción que tiñe cualquier carbohidrato presente en una disolución. Todos los carbohidratos tanto los monosacáridos como los disacáridos y -naftol, en presencia de ácido sulfúrico para formar sustancias complejas coloreadas. Esta reacción se utiliza para la identificación en general de los carbohidratos. El proceso se fundamenta en la deshidratación que experimentan los carbohidratos en presencia de ácidos minerales fuertes, como el ácido sulfúrico. Después de haber deshidratado el carbohidrato se forma el complejo coloreado, porque el grupo carbonilo, del carbohidrato se polariza produciendo un carbocatión que se estabiliza con los pares electrónico - naftol. Todos los glúcidos por acción del ácido sulfúrico concentrado se deshidratan formando compuestos furfúricos. Estos furfurales se condensan con el reactivo de Molish, Dando un producto Violeta. PRUEBA DE BENEDICT La reacción o prueba de Benedict identifica azúcares. El reactivo de Benedict está constituido por una disolución de sulfato de cobre II, citrato de sodio y carbonato de sodio. Al tratar el azúcar con estos reactivos, experimentan una reacción de oxidación. El fundamento de esta reacción radica en que, en un medio alcalino, el ion Cu2+ (otorgado por el sulfato cúprico), de color azul, es capaz de reducirse por efecto del grupo Aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+, el cual precipita como oxido de cobre I, Cu2O, de color rojo. El medio alcalino facilita que el azúcar esté de forma lineal, puesto que el azúcar en solución forma un anillo de piranósico
- 6. o furanósico. Una vez que el azúcar está lineal, su grupo aldehído puede reaccionar con el ion cúprico en solución PRUEBA DE LUGOL Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es, por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta. PRUEBA DE FEHLING El reactivo de Fehling se utiliza para la detección de sustancias reductoras, particularmente azúcares reductores. PRUEBA DE BIURET El Reactivo de Biuret indica la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico y sulfato cúprico, junto con tartrato de sodio y potasio. ACCION DEL CALOR En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. ACCION DEL PH El pH óptimo define el valor de la velocidad máxima de la reacción en esas condiciones
- 7. 2. ¿Qué explicación y aplicación práctica tiene el índice de acidez? La acidez tiene importancia tanto para aceites comestibles como para los lubricantes, porque ni unos ni otros pueden contener ácidos grasos libres más allá de un límite dado. Se considera como impureza en las grasas. La acidez puede expresarse en varias formas. El índice de acidez nos da la cantidad de hidróxido de potasio (KOH) necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres; un índice de acidez alto indica la presencia de una cantidad elevada de ácidos libres y estos son los causantes del evento del acenranciamiite. 3. ¿Qué indica el índice de yodo y que importancia biológica tiene su determinación? La aplicación más importante del valor del yodo es determinar la cantidad de insaturación contenida en los ácidos grasos. Esta insaturación está en forma de enlaces dobles que reaccionan con compuestos de yodo. Cuanto mayor es el valor de yodo, más enlaces de ácidos grasos insaturados están presentes en una grasa. Su determinación es útil para caracterizar diferentes grasas, y para descubrir si están o no mezcladas. Los aceites de pescado, sardina, bacalao, tienen IY muy elevados (pasan de 120). Los aceites de oliva, almendras tienen IY inferiores a 100. Las grasa animales tienen IY. 4. ¿Pierde valor nutricional una proteína cuando se pone a calor excesivo? Explique. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.
- 8. 5. ¿A qué se refiere el valor biológico de una proteína? El valor biológico de una proteína depende de la composición de aminoácidos y de las proporciones entre ellos y es máximo cuando estas proporciones son las necesarias para satisfacer las demandas de nitrógeno para el crecimiento, la síntesis, y reparación tisular. Resumiendo mucho, el valor biológico de la proteína se mide según la cantidad de nitrógeno procedente del alimento que podemos absorber. El valor biológico de las proteínas, que se define como la proporción de la proteína que es absorbida y por tanto utilizada por el organismo. Es una forma de medir la calidad de las proteínas. Para que una proteína sea de alto valor biológico, debe tener todos los aminoácidos esenciales y en las proporciones necesarias para el organismo. Si por el contrario tiene menos proporción de un aminoácido esta proteína será de menor calidad y por tanto menos valor biológico, al aminoácido que está en menor cantidad se le denomina aminoácido limitante. 6. ¿Qué es saponificación? Qué importancia tiene este proceso. La saponificación consiste en una hidrólisis alcalina de la preparación lipídica (con KOH o NaOH). Los lípidos derivados de ácidos grasos (ácidos monocarboxílicos de cadena larga) dan lugar a sales alcalinas (jabones) y alcohol, que son fácilmente extraíbles en medio acuoso. Sin embargo, no todos los lípidos presentes en una muestra biológica dan lugar a este tipo de reacción. Se distinguen por tanto dos tipos de lípidos: Lípidos saponificables y no saponificables Los lípidos saponificables agrupan a los derivados por esterificación u otras modificaciones de ácidos grasos, y se sintetizan en los organismos a partir de la aposición sucesiva de unidades de dos átomos de carbono. En este grupo se incluyen: ácidos grasos y sus derivados, eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos), lípidos neutros (acilgliceroles y ceras) y lípidos anfipáticos (glicerolípidos y esfingolípidos). Los lípidos insaponificables son derivados por aposición varias unidades isoprénicas, y se sintetizan a partir de una unidad básica de 5 átomos de carbono: el isopreno (figura de la derecha). En este grupo de lípidos se incluyen:
- 9. Terpenos: retinoides, carotenoides, tocoferoles, naftoquinonas, dolicoles. Esteroides: esteroles, sales y ácidos biliares, hormonas esteroideas. La saponificación tiene una gran importancia en la industria de los productos de cuidado personal, ya que gracias a este proceso químico el cuerpo graso que se une con agua, acaba formando una especie de pasta base que se acaba “empastillando” para darle forma al jabón. 7. ¿Qué importancia tiene el conocer si un alimento contiene o no azúcares reductores? Cuando se trata de alimentos lo mejor siempre es consultar y probar qué tan saludable o útil es para nuestra dieta sea cual sea el tipo de comida, por lo que informarse sobre para qué sirve que la comida contenga azúcares reductores debería ser básico para cualquier consumidor racional, puesto que hay azúcares no reductores como sacarosa, trehalosa, en donde la intolerancia a estos azúcares produce diarrea por la presencia de hidratos de carbono no absorbidos en la luz intestinal, que aumenta la osmolaridad dentro del intestino. O el caso de la lactosa (azúcar reductor) que es responsable de trastornos en niños que son incapaces de desdoblar la molécula de lactosa en 2 monosacáridos (glucosa, galactosa) en la luz intestinal, y conseguir su correcta absorción.