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La práctica describe métodos para determinar el contenido de humedad, cenizas, grasas y aceites en muestras de alimentos. Se explican procedimientos para medir el porcentaje de humedad mediante secado en estufa al aire y al vacío, y para medir el porcentaje de cenizas mediante incineración en mufla. También se detallan métodos para extraer lípidos de alimentos usando solventes orgánicos y medir índices químicos como el índice de acidez.
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- 1. PRÁCTICA N° 8y 9 Determinación del contenido de Humedad y Cenizas En muestras de alimentos. 8.1.- Objetivos: Determinar el porcentaje de humedad en muestras alimentos mediante la evaporación del contenido de agua por el método de estufa al aire y estufa al vacío. Determinar el porcentaje de cenizas en los alimentos por medio de la incineración en la mufla. Realizar los cálculos característicos y referirlos a la cantidad de muestra utilizada. 8.2.- Materiales y Reactivos Materiales: Balanza analítica, plancha de calentamiento, estufa, mufla, cápsulas de evaporación, vidrios de reloj, cuchillo, pinzas de madera y metálicas. 8.3.- Introducción. El componente más abundante y el único que esta presente en todos los alimentos es el agua. La determinación del contenido de humedad de los alimentos es una de las más importantes aplicaciones en el análisis de alimentos, ampliamente usadas en el proceso y control de los alimentos, ya que la cantidad de agua presente en una muestra de alimento puede indicarnos a parte de la cantidad de agua presente en los alimentos nos indica la posibilidad de crecimiento microbiano a la cual esta expuesto dicho alimento, puesto que es el agua el principal factor favorable para el desarrollo de microorganismos, la cantidad de humedad nos indica, de igual manera, la cantidad de agua involucrada en la composición de los mismos. El contenido de humedad se expresa generalmente como porcentaje, las cifras varían entre 60-95% en los alimentos naturales. En los tejidos vegetales y animales existe dos formas generales en las que podemos encontrar el agua: agua libre y agua ligada, como soluto o como solvente; en forma libre, formando hidratos o como agua adsorbida. La determinación de humedad se realiza en la mayoría de los alimentos por la determinación de la perdida de masa que sufre un alimento cuando se somete a una combinación tiempo – temperatura adecuada. El residuo que se obtiene se conoce como sólidos totales o materia seca. Las cenizas de un alimento son un termino analítico equivalente al residuo inorgánico que queda después de quemar la materia orgánica; representan el contenido mineral, es decir, el conjunto de nutrientes elementales que están presentes en determinada muestra de alimentos. El análisis de las cenizas se lleva a cabo por incineración total de la muestra a temperaturas elevadas y la determinación de su masa. 8.4.- Determinación De Humedad Tome una muestra del alimento que se le indique, córtelo o tritúrelo finamente hasta homogeneizarlo y pese entre 5 y 7 gramos en una cápsula de evaporación previamente tarada. Reporte la pesada con cuatro cifras significativas. Si el alimento es liquido coloque la cápsula en la plancha de calentamiento hasta secar completamente, SIN QUEMARLO. Luego lleve la cápsula a la estufa por un tiempo de 3 hrs. , a una temperatura de 98-100 ºC. Transcurrido el tiempo indicado retire la cápsula de
- 2. la estufa, deje enfriar y pese de nuevo. Realice pesadas sucesivas hasta que el peso sea constante en tres ocasiones. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Tabla 1. Valores experimentales en la determinación de humedad Cálculos Típicos: Ec. 1 g H2O evaporada x 100 Masa de muestra (g) Donde: g. de H2O evaporada = P3 _ - P2 Masa de muestra = P2 _ - P1 sustituyendo en Ec. 1 P3 _ - P2 x 100 P2 _ - P1 8.5 Determinación de humedad mediante vacío: Tome el peso de una capsula de petri vacía, Pese entre 2 y 3gr aproximadamente de la muestra de alimento indicada por su profesor en la capsula de petri, registre su peso exacto, lleve la muestra a la estufa de vacío, encienda la bomba de vacío regule al entrada del vacío proporcionado por la bomba en: Vacío: 34 cmHg y Presión: 5psi ó 0,5Kg/cm3 , una vez calibrada la entra da de vacío y presión a la estufa, cada 30 min., saque la muestra de la estufa apagando previamente la bomba de vacío, deje en reposo la muestra por 10 min. en el desecador y posteriormente realice la pesada, repita este procedimiento hasta alcanzar peso constante. Para determinar el porcentaje de humedad de la muestra aplique la misma formula del experimento 1 8.6.-Determinación De Cenizas. Tome una muestra del alimento que se le indique, tritúrelo hasta conseguir un tamaño de partícula pequeño y pese entre 2 y 3 gramos en una crisol de porcelana previamente tarada. Si el alimento es líquido pese entre 2 y 3 ml de la muestra. Reporte la pesada con cuatro cifras significativas. Coloque el crisol en la plancha de calentamiento hasta sequedad. Luego lleve la cápsula a la mufla por un tiempo de 6-12 hrs., a una temperatura de 550-600 ºC. Transcurrido el tiempo indicado retire la crisol de la mufla, deje enfriar en un desecador y pese de nuevo. Realice pesadas sucesivas hasta que el peso sea constante en tres ocasiones. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Muestra Peso cápsula Vacía (g) P1 Peso cápsula + muestra antes de secado (g) P2 Peso cápsula + muestra después de secado (g) P3 % Humedad % H= % H=
- 3. Tabla 2. Valores experimentales en la determinación de cenizas Cálculos Típicos: Ec. 2 g cenizas x 100 Masa de muestra (g) Donde: g cenizas = P3 _ - P1 Masa de muestra = P2 _ - P1 sustituyendo en Ec. 2 P3 _ - P1 x 100 P2 _ - P1 Determine el % de humedad y cenizas de cada muestra y reporte sus resultados en % p/p. Haga comparaciones en función de los valores teóricos la muestra utilizada. Datos bibliográficos Badui, S. 1986. Química de los Alimentos. Edit. Alhambra. México, D.F. Belitz, H.; Grosch, W. 1985. Química de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. Hart, L y Fisher H. 1971. Análisis Moderno de Alimentos. Editorial Acribia. Zaragoza, España Lees, R. Análisis de los alimentos Tscheuschner, H. 2001. Fundamentos de Tecnología de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. Muestra Peso crisol Vacía (g) P1 Peso crisol + muestra antes de incinerar (g) P2 Peso crisol + muestra después de incinerar (g) P3 % Cenizas % Ce= % Ce=
- 4. PRÁCTICA N° 11 DETERMINACIÓN DE GRASAS Y ACEITES 1.- Objetivos Identificar características básicas de los lípidos. Extraer los lípidos de un alimento con solventes orgánicos. Determinar algunos índices de calidad de grasas y aceites. 2.- Materiales y Reactivos Materiales: Embudo de separación, balanza analítica, beakers, cilindros graduados, bureta, pipetas, fiolas, plancha de calentamiento, mantas de calentamiento, extrator Solexht Reactivos: Acetona, etanol, acetona, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio, fenolftaleína al 1 %, mezcla de ácido acético glacial y cloroformo (1,5:1), hexano, solución saturada de yoduro de potasio, tiosulfato de sodio 0,1 N, almidón al 1%, Éter de Petróleo 3.- Introducción Los lípidos desde el punto de vista químico, se pueden definir como esteres de alcoholes y de ácidos grasos , o también como esteres de ácidos grasos de peso molecular elevado. Tiene la propiedad de ser solubles en solventes orgánicos (metanol, etanol, éter, cloroformo, acetona, entre otros). Se les llama sustancias “ hidrófobas” por su insolubilidad o poca solubilidad en agua. Las propiedades de un aceite o grasa varían dentro de ciertos limites a estas propiedades se les denominan constantes, números, valores o índices. Entre las constantes analíticas más importantes podemos nombrar: Físicas Químicas Índice de Refracción Punto de Fusión Índice de Acidez Índice de Saponificación
- 5. Punto de Solidificación Punto de Solubilidad Índice de Yodo Índice de Peroxido Residuo de Materia Insaponificable Índice de acidez: Se define como el número de mg de KOH o NaOH necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres de 1 gr. de aceite o grasa. Se fundamenta en el hecho de que el extremo carboxílico de los lípidos es neutralizado por los hidroxilos de un álcali, pudiendo determinarse cuantitativamente esta reacción por medio de una valoración ácido- base. Índice de peróxido: Se define como el número de milimoles o miliequivalentes de oxígeno fijado bajo forma peroxídica (oxígeno activo) por 1000 gr. de materia grasa. El oxígeno peroxídico, en medio ácido, oxida al yoduro de potasio con liberación de yodo, el cual es valorado con tiosulfato de sodio. CARACTERÍSTICAS FÍSICO QUÍMICAS Su insolubilidad en el agua condiciona la existencia de numerosas emulsiones alimentarías. Su punto de fusión, bajo en la mayoría de los casos, implica el ablandamiento o licuefacción después de un calentamiento moderado. El punto de fusión de un triglicérido depende de varios parámetros. La presencia de ácidos grasos de cadena corta, o ácidos grasos no saturados, tiende a bajar el punto de fusión de la molécula y por lo tanto a hacerla líquida a temperatura ambiente. Esto explica que los aceites contengan menos triglicéridos de ácidos grasos saturados que las grasas. La plasticidad de muchos lípidos a la temperatura ordinaria explica la mayoría de las propiedades funcionales que pueden conferir a los alimentos. Proporcionan textura suave y untuosa y aumentan la viscosidad de las mezclas alimentarías. DETERIORO DE LOS LÍPIDOS (AUTOOXIDACIÓN) En general estas reacciones provocan un descenso de la calidad de las grasas, produciendo colores oscuros y olores desagradables o diferentes a los normales (ejemplo: aparición de olor a pescado en aceites vegetales). La autooxidación puede ser inhibida por medio de la exclusión de oxígeno, el almacenamiento a bajas temperaturas y la adición de antioxidantes.
- 6. Rancidez oxidativa: Los triglicéridos son sustancias neutras, los grupos ácidos (carboxilos) de los ácidos grasos están neutralizados en el enlace éster. La acidez de las grasas y aceites es consecuencia de su degradación por hidrólisis que originan grupos carboxilos libres en los ácidos grasos liberados. Este proceso constituye un factor de rancidez, ya que los ácidos grasos liberados producen un olor característico. La degradación de las grasas puede originarse por: A.- Hidrólisis Enzimática: donde actúan las enzimas lipolíticas (lipasas) B.- Oxidación por oxigeno Atmosférico. Ambas reacciones son afectadas por el calor, presión, luz, entre otros. Experimento Nº 1. Extracción de lípidos con solventes 1.- Pese aproximadamente 2 a 3 gr de una muestra sólida suministrada por su profesor, en un beaker de 100 mL. 2.- Adicione 10 mL. De mezcla de solvente 1:1 alcohol – hexano. Agite con una varilla de vidrio hasta disolver. 3.- Viértala en embudo de separación. 4.- Seguidamente adicione 10 mL. de la mezcla 1:1 de alcohol - hexano; al beaker para arrastrar restos de la muestra. y repita el paso 3. 5.- Tape y agite el embudo por 2 minutos, luego invierta el embudo apuntando la llave hacia un lugar despejado y abra lentamente la llave para liberar la presión. PRECAUCION: NO APUNTE A SUS COMPAÑEROS O A USTED MISMO AL ABRIR LA LLAVE, ALEJE LO MÁS POSIBLE EL EMBUDO DE USTED. Deje reposar el embudo por 2 minutos en el soporte. 6.- Repita el paso anterior por tres veces. 7.- Cuando se observe la separación de la fase acuosa y la orgánica (solventes) deje salir cuidadosamente la fase inferior y agregue 5 mL más de la mezcla solvente, deje reposar por 5 minutos y recoja la fase orgánica en un beaker previamente pesado. Lave la tapa del embudo y las paredes interiores con 5 mL adicionales de la mezcla solvente y déjelos caer en el beaker.
- 7. 8.- Lleve a la estufa a una temperatura de 98-100 ºC por 15 minutos para evaporar todo el solvente. 9.- Observe y anote el aspecto de la muestra. 10.- Pese el beaker y calcule el peso de la materia grasa por diferencia. EXPERIMENTO 2: ÍNDICES QUÍMICOS DE LAS GRASAS Experimento 2.1: Índice de acidez 1.- Pese en una fiola entre 2-5 g. de dos muestras de aceite vegetal facilitada por su profesor. 2.- Agregue 10 mL de mezcla solvente utilizada en la experiencia anterior y titule con KOH 0,1 N utilizando fenolftaleina al 1% como indicador. La aparición de un color rosado pálido indica el fin de la titulación (Punto Final). 3.- Calcule el índice de Acidez de acuerdo a la siguiente formula: I.A = (A x N x 0,056) x 100 P I.A índice de acidez N= normalidad del KOH A= mL de KOH gastados en la titulación. 0,056= p equivalente del KOH P= Peso de la muestra de aceite La acidez puede también ser expresada como los gramos de ácidos grasos libres por cada 100 gramos de muestra; en el caso del ácido oleico sería: Gramos de ácido oleico por 100 g de muestra con la siguiente ecuación: Acidez = (A x N x 0,282) x 100 P Experimento 2.2: Índice de peroxido.
- 8. 1.- Pese en una fiola seca 2 a 3 gramos de aceite y agregue 12 mL de mezcla solvente (60 % de ácido acético glacial y 40% de cloroformo), 0,5 mL de solución saturada de KI y 10 mL de HCL 0,1 N. Agite la fiola por rotación, tápela y guarde en la oscuridad por 5 minutos. 2.- Añada 10 mL de agua, 0,5 mL de solución de almidón como indicador y titule con Tíosulfato de Sodio (Na2S2O3) 0,1 N hasta la desaparición del color azul. Al aproximarse al final de la titulación se debe agitar vigorosamente la fiola para liberar todo el yodo de la capa de cloroformo. 3.- Realice un blanco de titulación con todos los reactivos menos la muestra, la cual sustituirá por agua destilada. Este volumen debe ser restado al volumen obtenido en la titulación. Calcule el índice de Peroxido de acuerdo a la siguiente formula: P xBVNxIp 1000)( −= Ip: Índice de peróxido, como miliequivalentes de O2 por 1000 gr. de muestra. N: normalidad de la solución de tíosulfato de sodio V: mL de tíosulfato consumidos en la titulación de la muestra B: mL de tíosulfato consumidos en la titulación del blanco. P: peso de la muestra Las reacciones generales que se llevan a cabo en este análisis son las siguientes: R-(O2) + 2KI + HCl R-(O) + 2KCl + H2O + I2 Luego, I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 En su reporte de datos: Incluya sus resultados y los valores teóricos para la muestra empleada. Discuta los resultados en función del método utilizado y de los valores teóricos hallados en la bibliografía. Incluya los cálculos típicos y la información adicional en el apéndice. Experimento N° 3 Extracción de grasas mediante Método Soxhlet 1.- Prenda la estufa a 90°C 2.- Pese aproximadamente 2-4gr de la muestra indicada por el profesor. Registre el peso exacto de muestra. 3.- Mida entre 20-25mL. del solvente indicado por el Profesor.
- 9. 4.- Tome el peso del balón de destilación vacío. Registre el peso exacto del balón. 5.- Coloque en el solvente la cantidad del solvente y la cantidad de muestra pesada. 6.- Encienda la manta de calentamiento hasta llevarla a su máximo nivel de transferencia de calor. 7.- Suministre agua al tubo de destilación. 8.- Deje que el proceso de destilación se lleve a cabo durante aproximadamente 1 hora. Una vez transcurrido el tiempo tome el balón y llévelo a la estufa por 30min, cuidando de él cada 10min, hasta que se haya retirado la mayor cantidad de humedad posible dentro del balón. 9.- Una vez seco el balón llévelo al desecador por 10min. Luego pese el balón de destilación y registre su peso. Tabla N° 1 (colóquele el nombre a la tabla para la presentación en su informe) Muestra Peso del Balón Vacío Peso de la Muestra Peso del Balón desp. de la destilación BIBLIOGRAFÍA A CONSULTAR Badui, S. 1986. Química de los Alimentos. Edit. Alhambra. México, D.F. Badui, S. 1988. Diccionario de Tecnología de los Alimentos. Edit. Alhambra. México, D.F. Belitz, H.; Grosch, W. 1985. Química de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. Bender, A. 1994. Diccionario de Nutrición y Tecnología de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. Cheftel, J.; Cheftel, H. 1976. Introducción a la Bioquímica y Tecnología de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. Czyhrinciw, N.; Baragaño, M.; Garcés, M. 1966. Análisis Industrial en la Fabricación de Alimentos. UCV, Caracas. De Rodríguez, B.; Martín, E. 1980. Análisis de Alimentos. Tomo I. UCV, Caracas. Dupin, H.; Cuq, J.; Malewiak M.; Leynaud-Rouaud, C.; Berthier, A. 1992. La Alimentación Humana. Edicions Bellaterra. Barcelona, España. Hart y Fisher. 1971. Análisis Moderno de los Alimentos. Acribia, Zaragoza, España.
- 10. Tscheuschner, H. 2001. Fundamentos de Tecnología de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos. Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de concentración conocida. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs µg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentración del TESTIGO es 100 µg/ml. Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (µg), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración. Cada grupo procesa una sola Muestra incógnita (A o B). Protocolo: Tubo H2O (µl) Testigo (µl) Muestra A o B (µl) Reactivo de Bradford (ml) Proteína (µg) Absorbancia a 595 nm Blanco 600 -------- ---------- 2 1 450 150 ---------- 2 2 300 300 ---------- 2 3 -------- 600 ---------- 2
- 11. Muestra A o B -------- ------- 600 2 Procedimiento: Pipetear en el orden de la tabla: - Primero el AGUA con la pipeta de 1 ml (rotulada H2O). - El TESTIGO con otra pipeta de 1 ml (rotulada T) respetando el orden de los tubos: 1,2 y 3. - Luego con otra pipeta de 1 ml (rotulada A o B según corresponda) la MUESTRA INCÓGNITA en su tubo correspondiente. -Por último, el reactivo de Bradford con la pipeta de 5 ml (rotulada R). - Mezclar el contenido de los tubos. - Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Observar el color de la curva de calibración y comparar con el color de la muestra incógnita con la curva. De esta manera estimar los valores de proteínas de la muestra incógnita. Luego leer en el fotocolorímetro tanto la curva y como la muestra incógnita. Completar la tabla con los valores de absorbancia y realizar el gráfico A595 vs µg de proteína. Interpolar en el gráfico el valor de absorbancia de las muestras incógnita en dicha curva y determinar µg de proteína de las muestras y en luego determinar su concentración µg/ml. Analizar si existe concordancia con el valor estimado visualmente.