Caracterización de la flora bacteriana de pimentón e inhibición por compuestos antibacterianos extraídos de algas
- 1. CARACTERIZACIÓN DE LA FLORA BACTERIANA DE PIMENTÓN E INHIBICIÓN POR COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS EXTRAÍDOS DE ALGAS. Rubio, L.; 1 Ezziyyani, M.; 2 Hegazi, M.; 1 1 1 Candela, M. E. y 3 Requena, A. Dpto. de Biología Vegetal, Fac. de Biología, Univ. de Murcia, Campus de Espinardo, 30100, Espinardo, Murcia. 2 Dpto. Ciencias Marinas. Fac. Ciencias. Universidad del Canal de Suez, Ismailia, Egipto. 3 Dpto. de Química-Física, Fac. de Químicas, Universidad de Murcia. INTRODUCCIÓN El pimentón es un producto clasificado dentro del grupo de las especias, es el resultado del secado y molido del pimiento rojo (Capsicum annuum); es usado como colorante alimentario por su alto contenido en Carotenoides, aportando a la vez su aroma característico. Tanto la normativa española como la internacional son muy exigentes en lo que se refiere a los métodos de esterilización y al número máximo de microorganismos permitido para su comercialización. Actualmente hay procesos de esterilización que han quedado prohibidos (óxido de etileno), siendo el más efectivo el calor húmedo, si bien presenta el inconveniente de la pérdida de propiedades organolépticas, aroma y poder colorante, característica fundamental del valor comercial de este producto. En los últimos años se ha desarrollado un importante estudio sobre compuestos biológicamente activos extraídos de algas marinas, siendo la mayoría de ellos efectivos frente a patógenos humanos y vegetales, constituyendo así una importante fuente de compuestos que puedan servir para el control de enfermedades. El objeto de este trabajo es, por una parte la caracterización de la flora fúngica y bacteriana presente en pimentón, y por otra la obtención de compuestos activos extraídos de algas marinas para ser usados como desinfectantes y agentes protectores durante el proceso de obtención del pimentón. MATERIAL Y MÉTODOS MUESTRA PARA AISLAMIENTO Se usó cáscara de pimiento para pimentón, ésta fue troceada y molida para obtener el pimentón (fig. 1). Cinco gramos del molido se disolvieron en 45 ml. de medio de cultivo líquido “ Caldo de triptona- soja”, a partir del cual se hicieron diluciones seriadas hasta el orden de 10 -6. Cada uno de los tubos con las diferentes diluciones se incubaron a 37 ºC durante 24 hrs. para el preenriquecimiento y recuperación de la flora microbiana de la muestra. Fig. 1.- Muestra de pimentón para el aislamiento Fig. 2.- Material vegetal: Caulerpa prolifera. RESULTADOS AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN A partir de los tubos en los que hubo crecimiento (caracterizados por el cambio de transparencia del medio), se tomaron alícuotas de 1 ml. que fueron sembradas en placas de Petri, sobre ellas se vertieron diferentes medios sólidos selectivos y diferenciales. Las placas sobre las que hubo crecimiento se usaron para el aislamiento de los contaminantes en cultivo puro (fig. 3), para lo cual, las colonias aisladas de los diferentes microorganismos se sembraron en Erlenmeyer conteniendo 25 ml. del medio Caldo triptona-soja, y se mantuvieron en agitación a Tª ambiente. Fig. 3.- Bacterias aisladas: Enterococcus faecalis (izq.) y Pseudomonas pyocyanea (dcha.) MATERIAL VEGETAL Y EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS Se recolectó en el Mar Menor (Murcia) como especie de mayor interés el alga verde Caulerpa prolifera (Chlorophyceae), por ser abundante en cuanto a biomasa y periodicidad estacional (fig. 2). En la Fig. 5 se muestra el bioensayo de actividad antibacteriana frente a E. faecalis. En la banda cromatográfica situada a la izquierda se observa el crecimiento de la bacteria en toda la placa excepto sobre las bandas de los compuestos antibacterianos Rf= 0,12 y 0,19. El crecimiento de la bacteria provoca un cambio de color (a rojo) del medio, lo que facilita la visualización del ensayo y la localización de las bandas con actividad antimicrobiana. En la derecha se observa el control sin crecimiento bacteriano. El material se lavó con agua dulce para retirar la arena y los organismos epífitos, y se dejó secar durante tres días a Tª ambiente. El extracto se obtuvo en un extractor tipo Soxhlet, usando 20 gr. de material vegetal y éter de petróleo como disolvente. El proceso de extracción se realizó de manera continua durante 36 hr. El extracto obtenido se concentró en Rotavapor hasta sequedad y a continuación se resuspendió en el mismo extractante hasta un volumen final de 50 ml., finalmente se conservó en frío hasta su uso. En la Fig. 6 se muestra el bioensayo de actividad antibacteriana frente a P. pyocyanea. El extracto del alga analizado sólo tiene un componente activo, el de Rf= 0,12 (flecha) contra esta bacteria. SEPARACIÓN Los diferentes compuestos del extracto obtenido fueron separados mediante Cromatografía en capa fina (TLC) sobre gel de Sílice, la fase móvil empleada para ello fue Hexano: Diclorometano (4:6 v/v) y el tiempo de recorrido fueron 2 hrs. Los compuestos de interés son visibles bajo luz U.V. (fig. 4), por lo que para su visualización y cálculo de recorrido fueron expuestos a una luz de dichas características. BIOENSAYOS Con el fin de conocer la presencia o ausencia de actividad antimicrobiana de los diferentes compuestos separados se realizó el siguiente ensayo. Se recogió 1 ml. de cultivo puro de cada bacteria aislada e identificada, que se inoculó sobre 9 ml. de medio a 45 ºC (sin solidificar) y se agitó para la homogeneización del inóculo. Los medios inoculados fueron vertidos con pipetas Pasteur estériles sobre tiras de 2.5 cm. de ancho recortadas de la cromatoplaca, tras solidificar, fueron introducidas en cámaras de vidrio ésteriles e incubadas a 37 ºC durante 24 hr. Fig. 4.- Separación cromatográfica bajo luz ultravioleta λ=360nm. Se observan dos bandas con fluorescencia naranjarojiza de Rf= 0,12 en la zona de inhibición. Fig. 5 Fig. 6 CONCLUSIONES 1- Se ha optimizado un método cromatográfico por TLC que separa correctamente los compuestos que absorben en luz UV responsables de la actividad antibacteriana. La fase móvil empleada es hexano:diclorometano (4:6 v/v) y el soporte es Silicagel. 2- Se ha puesto a punto una técnica para realizar los bioensayos de inhibición de crecimiento microbiano, directamente sobre la cromatoplaca. Este sistema es rápido y concluyente, permitiendo probar un gran número de extractos frente a un amplio número de microorganismos. 3- Se han encontrado dos compuestos con actividad antibacteriana (Rf= 0,12 y 0,19) frente a los microorganismos ensayados. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado en parte por los proyectos PB 98-03776 CYCIT y por FIT-020100-2001-564 (PROFIT) del MCYT. Luis Rubio está incorporado al Programa Torres Quevedo del Ministerio de Ciencia y Tecnología en Ramón Sabater, S. A. XI Congreso Sociedad Española de Fitopatología (SEF) Almería, 14 al 18 de Octubre , 2002