Separaciones 12 HPLC SESION 8 2024( C EXCLUSION) (1).ppt
- 1. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÒN MOLECULAR Msc Holger Maldonado García
- 2. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR Es una cromatografía de elución liquido-solido que separa o fracciona moléculas en función de su tamaño o pero molecular, a través de una matriz que esta formada por cadenas de polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. Cromatografía de exclusión molecular Liquido -solido Gas -solido Fracciona moléculas pequeñas Cromatografía de exclusión Liq-Sol Exclusión a través de geles Exclusión a través de zeolitas inorgánicas Fracciona moléculas grandes
- 3. Las columnas se rellenan con pequeñas partículas esféricas formadas por polímeros de cadenas entrecruzados que tienen poros que deben ser del tamaño comparable al tamaño de las moléculas que se deseen separar, eluyendo en orden decreciente de peso molecular.
- 4. Las moléculas grandes que no penetren los poros del gel, son totalmente excluidos (limite de exclusión), se mueve con el eluyente entre los espacios que quedan entre esfera y esfera para seguir una ruta más corta a lo largo de la columna, donde la velocidad de la fase móvil es superior. Las moléculas que por su tamaño penetran en los poros de las esferas del gel, son totalmente incluidas (limite de inclusión)y su recorrido a lo largo de la columna se retarda en el tiempo, donde la velocidad de la fase móvil es menor.
- 5. PRINCIPIO DE EXCLUSION MOLECULAR Características: La diferencia de migración a través de los poros de las esferas del gel dependen únicamente del tamaño o peso molecular del analito. No existen fuerzas de interacción entre el analito y la fase estacionaria. Este proceso de filtración diferencial en función del tamaño o pero molecular es más complejo, e incluso no se podrían descartar eventuales procesos de adsorción o de otros tipos dentro de los poros RELACION ENTRE PESO MOLECULAR Y VOLUMENDE ELUCION ( O TIEMPO DERETENCION )
- 9. PRINCIPIOS BASICOS DE CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR En una columna cromatografía de exclusión molecular se distinguen los parámetros siguientes: a) Volumen total (Vt) :Volumen que ocupa el gel hidratado (fase estacionario) + el volumen del eluyente (fase móvil) b) Volumen muerto o vacio (Vo) :Volumen del eluyente fuera de la fase estacionario. c) Volumen de fase estacionaria (Vs) :Volumen que ocupa la matriz del gel hidratado en el interior de la columna. Entonces
- 10. Volumen vacio o volumen muerto (Vo): Volumen de fase móvil en que son eluidas las moléculas que no filtran a través de los poros del gel o moléculas totalmente excluidos. El volumen vacio o volumen muerto se puede calcular usando azul de dextrano, de peso molecular de 2 millones, que a menudo es usado para caracterizar geles hidrofílicos. Volumen de elución (Ve) : Volumen de fase móvil con que emerge de la columna un soluto que filtra a través de los poros del gel o que es totalmente incluido.
- 11. El volumen de elución (Ve), no es suficiente para definir el comportamiento de la sustancia eluida, porque este parámetro varia con el volumen total (Vt) de la columna y con el camino con que la columna ha sido packeada o empaquetada. Por analogía con otros tipos de cromatografía de partición, la elución de un soluto es mejor caracterizarlo por el coeficiente de distribución (Kd) Entonces: Despejando:
- 12. Kd: Es una constante para un gel dado. Su valor esta determinado por las dimensiones moleculares soluto en estudio. Es independiente de la velocidad de la fase móvil o de flujo. Es independiente de la concentración de la muestra.
- 13. Constante de distribución o reparto (Kd): representa la fracción de volumen de fase estacionaria que es disponible para la difusión de una especie de soluto dado. Kd= 1 → implica que todo el solvente de la columna es disponible para el soluto , por lo tanto el soluto emerge de la columna después de que un volumen de elución (Ve) ha pasado a través del lecho del gel. Kd >0 → Implica afinidad del soluto a la fase estacionaria o gel. Ej: sustancias aromáticas muestran mayor afinidad a geles de dextrano.
- 14. De la ecuación: dividimos cada por Vo , obtenemos: Donde: Como es muy complicado determinar el volumen de solvente que embebe el gel (Vi) ,consideraremos una constante de distribución oponente ( KAV) : Donde Los 2 constantes de distribución están relacionados como sigue : Se hacen aproximadamente iguales cuando el gel este muy bien hidratado En la ecuación: todas las variables son fácilmente medibles.
- 15. Kd = 0 y Kv = 0 significa que los solutos son excluidos completamente de la fase estacionaria( gel) o se mueven fuera de la fase estacionaria o eluyen con un volumen de fase móvil igual al volumen vacio o muerto (Vo) , es decir: Para un gel dado hay una relación constante de KAV/Kd que es independiente de la naturaleza y concentración de soluto. KAV y Kd define el comportamiento del soluto Independiente del lecho estacionario y del packeo OTROS métodos de normalización Proporcionan valores , los cuales dependen de cómo la columna esta bien pockeado ( o empoquetada) . Las relaciones aproximadas entre algunos de estos términos son mostrados en la figura siguiente. ó
- 16. TIPOS DE GELES Ambos geles son insolubles en agua ,pero como tienen en su estructura grupos hidroxilo (OH) o grupos amido (R – Co – NH2), forman puentes de hidrogeno con el agua, glicol, dimetil sulfoxido , formomida, etc reteniendo su carácter hidrofilico y se hinchan. La acelacion o alquilacion de grupos OH libres del dextrano forman derivados con excelente capacidad de hinchamiento en solventes orgánicos. Geles de Poliestireno: (stinogel): son preparados por suspensión de estireno con monómeros bifuncionales de divinilbenceno en un eluente inerte:tolueno o n- dodecano. Geles de agarosa: De acuerdo a su preparación puede ser Sepharosa y biogel A y B Sephadex : Geles de dextrano se obtiene por polimerización entre cruzada vía etérea , de la cadena lineal de poliglucosa de dextrano con epiclorhidrina Biogel P : Poliacrilamida entre cruzada con n-n -metilenbisocrilamida
- 18. RESOLUCION ó
- 19. Resolució n Selectividad Efecto de la difusión de zona Dependiendo del carácter inherente a la fase estacionaria Tamaño del poro Volumen del poro Distribución de poros RESOLUCION
- 20. Tamaño del poro.- Define el rango de fraccionamiento Determina los moléculas que puedan Ser excluidos y las moléculas que Pueden ser incluidas El rango de fraccionamiento efectivo es alterado por la presencia de ionos, sales o detergente, por que cambian la configuración de las sustancias cuando están siendo fraccionadas El grado de hinchamiento del gel es independiente de la presencia de soles. Volumen del poro (Vp ó Vi): Define la distancia de separación entre el primer soluto totalmente excluido y el ultimo soluto totalmente incluido Distribución de los poros: Esta relación da con la estructura de la matriz.
- 25. SELECCIÓN DEL TIPO DE GEL Peso molecular de la sustancia Propiedades químicas de las sustancias a reparar Fraccionan principalmente dentro de un rango de peso molecular determinado por el rango del tamaño del poro dentro de la matriz del gel. Las matrices disponibles comercialmente pueden ser usadas comercialmente para fraccionar mezclas de sustancia de peso moleculares de unos pocos cientos a encima de 150 millones. Ejemplo: Bio gelP-10 posee un rango efectivo de operación entre 5,000 y 17,000 unidades de peso molecular Moléculas de PM > 17000 Moléculas de PM <17000 Son totalmente excluidos de la matriz del gel Son totalmente incluidos o filtran a través de la matriz del gel
- 26. La relación entre comportamiento de elución del soluto y peso molecular (sobre una escala logarítmica) para varias sustancias es gráficamente mostrado en las figuras siguientes .La porción lineal de cada curva define los pesos moleculares entre cual cada gel da una separación optima.
- 31. APLICACIONES A. Desalting Esta referido no solamente a la remisión de sales pero también a la remisión de sustancias de peso molecular inferior de soluciones de macromoléculas. Geles de pequeños tamaños que remueven sales en forma rápida y eficiente en una amplia variedad sustancias.
- 32. B. Proceso de aislamiento y purificación de sustancias biológicas y no biológicas a escala preparativa o escala Industrial (Polipéptidos, oligonucleótidos, poli nucleótidos, Proteínas, polímeros, etc.) C. Determinación de pesos moleculares
- 34. VENTAJAS DESVENTAJAS Método preliminar de fraccionamiento de nuestro complejos Tiempos de separación cortos y predecibles No hay perdida de muestras Recuperación de la fase estacionaria (gel) No hay desactivación de la columna Limitada capacidad de picos (N) : 10-12 Incapacidad de resolver muestras de peso molecular similar La resolución no puede manipularse.