tesis Brn3a v1

UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA
DE
NUEVO
LEÓN

FACULTAD
DE
CIENCIAS
BIOLÓGICAS

INSTITUTO
DE
BIOTECNOLOGÍA

Construcción
de
un
modelo
in
silico
de
la
interacción
entre
el
factor
de
trascripción
Brn3a
y
la

región
promotora
URR
de
la
variante
16
del
Virus
del
papiloma
humano
en
un
contexto
de

terapia
génica
contra
el
Cáncer
de
Cérvix

TESIS
QUE
PRESENTA

JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO

TESIS
COMO
REQUISITO

PARA
OBTENER
EL

TÍTULO
PROFESIONAL

DE:

LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA

San
Nicolás
de
los
Garza,
N.L.

2
de
Junio
del
2014

RC-‐07-‐026

REV.00-‐09/06

II

CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE

TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL

PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX

TESIS

PRESENTADA
COMO
REQUISITO

PARA
OBTENER
EL

TÍTULO
PROFESIONAL

DE:

LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA

JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO

APROBADA:

COMISIÓN
DE
EXAMEN:

DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ

________________________________

PRESIDENTE

M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA

________________________________

SECRETARIO

DRA.
MARTHA
GUERRERO
OLAZARÁN

________________________________

VOCAL

DR.
JUAN
ANTONIO
GALLEGOS
LÓPEZ
________________________________

SUPLENTE

RC-‐07-‐026

REV.00-‐09/06

III

CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE

TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL

PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX

TESIS

PRESENTADA
COMO
REQUISITO

PARA
OBTENER
EL

TÍTULO
PROFESIONAL

DE:

LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA

JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO

APROBADA:

COMISIÓN
DE
TESIS:

DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ

________________________________

DIRECTOR

M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA

________________________________

CO-‐DIRECTOR

DRA.
MARTHA
GUERRERO
OLAZARÁN

________________________________

SECRETARIO

DR.
JUAN
ANTONIO
GALLEGOS
LÓPEZ
________________________________

SUPLENTE

RC-‐07-‐026

REV.00-‐09/06

IV

CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE

TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL

PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX

TESIS

PRESENTADA
COMO
REQUISITO

PARA
OBTENER
EL

TÍTULO
PROFESIONAL

DE:

LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA

JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO

APROBADA:

COMISIÓN
DE
TESIS:

DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ

________________________________

DIRECTOR

M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA

________________________________

CO-‐DIRECTOR

RC-‐07-‐026

REV.00-‐09/06

V

ÍNDICE

V.

Dedicatoria

..................................................................................................................
VII

VI.

Agradecimientos
.........................................................................................................
VIII

VII.

Lista
de
abreviaturas
.....................................................................................................
IX

VIII.

Lista
de
tablas
................................................................................................................
X

IX.

Lista
de
figuras
............................................................................................................
XII

X.

Resumen
...................................................................................................................
XIV

1.
Introducción
...................................................................................................................
1

2.
Importancia
....................................................................................................................
2

3.
Hipótesis
........................................................................................................................
3

4.
Objetivos
........................................................................................................................
3

4.1
Objetivo
general:
................................................................................................................
3

4.2
Objetivos
específicos:
.........................................................................................................
3

5.
Antecedentes
.................................................................................................................
3

5.1
Epidemiología
y
etiología
del
cáncer
cérvicouterino
..........................................................
3

5.2
Brn3a
y
el
desarrollo
del
CaCu
mediante
la
regulación
del
VPH
........................................
5

5.3
Sitios
de
unión
de
los
homeodominios
...............................................................................
6

5.4
Reconocimiento
específico
de
una
secuencia
de
ADN
por
los
dominios
POU
...................
7

5.5
Predicción
de
la
estructura
tridimensional
de
una
proteína
..............................................
9

5.5.1
Modelaje
por
homología
...........................................................................................
10

5.5.2
Modelaje
por
reconocimiento
de
plegamientos
........................................................
11

5.5.3
Modelaje
por
predicción
Ab-‐initio
.............................................................................
11

6.
Metodología
................................................................................................................
12

6.1
Materiales
y
equipo
..........................................................................................................
12

6.2
Estrategia
General
............................................................................................................
12

6.3
Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional

de
la
proteína
Brn3a
............
13

6.4
Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
estructura

tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16
..........................
13

6.4.1

Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la
región
URR
de

VPH-‐16
..........................................................................................................................
13

6.4.2
Determinación
de
la
energía
del
complejo
proteína-‐ADN
............................................
14

6.5
Optimización
y
cálculo
de
la
energía
de
interacción
de
los
modelos
tridimensionales
de

interacción
de
Brn3a
con
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16
.....................................................
14

7.
Resultados
...................................................................................................................
15

7.1
Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional

de
la
proteína
Brn3a.
...........
15

7.2
Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
estructura

tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16
..........................
19

7.2.1

Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la
región
URR
de

VPH-‐16
.......................................................................................................................
19

7.2.2
Determinación
de
la
energía
del
complejo
proteína-‐ADN
.........................................
27

7.2.3

Optimización
y
cálculo
de
la
energía
de
interacción
de
los
modelos
tridimensionales

de
interacción
de
Brn-‐3a
con
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16
en
forma
de
logo.
............
33

VI

8.
Discusión
......................................................................................................................
36

9.
Literatura
citada
...........................................................................................................
40

VII

DEDICATORIA

Con todo mi cariño y mi amor para las personas que
hicieron todo en la vida para que yo pudiera lograr
mis sueños, por motivarme y darme la mano cuando
sentía que el camino se terminaba, a ustedes por
siempre mi corazón y mi agradecimiento.
A mi madre y padre.
Sapere aude.

VIII

AGRADECIMIENTOS

Agradezco
por
este
trabajo
en
primer
lugar:
a
mis
padres
por
todo
su
apoyo
para
finalizar
la

licenciatura,
asimismo
al
Doctor
José
Ma.
Viader
Salvadó
por
permitirme
terminar
este

proyecto
&
al
M.C.
José
Claudio
Rocha
Moreno.

Un
agradecimiento
muy
especial
a
la
Dra.
Elisa
Shaefer
Satu
por
su
asesoría
personal
en

programación,
instalación
y
ejecución
del
software
necesario
para
la
implementación
del

trabajo.

Se
agradece
al
Centro
Nacional
de
Supercómputo
(CNS)
del
IPICYT,
A.C.
por
los
recursos
de

Supercómputo
proporcionados
asignados,
los
cuales
se
enlistan
a
continuación:
Thubat
Kaal.

Agradezco
por
igual
a
mis
amigos
Marco,
Aracely
y
muy
especialmente
a
Laura
por
todo
el

apoyo
para
poder
continuar
con
el
presente
proyecto
y
concluirlo
a
pesar
de
todos
los

inconvenientes
y
retos
técnicos
que
presento.

IX

LISTA
DE
ABREVIATURAS

ARN

Ácido
ribonucleico

°C

Grados
Celsius

CaCu

Cáncer
Cérvicouterino

ADN

Ácido
desoxirribonucleico

et
al.

Et
alii
(y
colaboradores)

g

Gramos

h

Horas

K

Grados
Kelvin

kb

Kilobase=mil
pares
de
bases

kDa

Kilodaltones

M

Concentración
Molar

mA

Miliamperes

mg

Miligramos

min

Minutos

μg

Microgramo

μL

Microlitro

μM

Micromolar

mL

Mililitros

mM

Concentración
Milimolar

N°
Número

NaCl

Cloruro
de
sodio

NaOH

Hidróxido
de
sodio

NCBI

National
Center
for
Biotechnology
Information

ng

Nangramos

nm

Nanómetros

ns
Nanosegundos

LCR
Región
larga
de
control

pb

Pares
de
bases

ps
picosegundos

P

Fósforo

RMSD
Raíz
cuadrada
media
de
la
desviación
de
posiciones
atómicas

s

Segundos

SD

Desviación
estándar

t

Tiempo

to

Tiempo
inicial

URR
Región
reguladora
río
arriba

V

Volts

VPH-‐16
Virus
del
papiloma
humano
variante
16

%

Porcentaje

3D
Tridimensional

X

LISTA
DE
TABLAS

TABLA

DESCRIPCIÓN

PÁGINA

1

VPH
y
su
asociación
con
las
principales
enfermedades
que
origina

obtenida
del
reporte
anual
de
la
Secretaria
de
Salud.

4

2

Lista
de
las
20
proteínas
con
mayor
identidad
y
valor
E
mas
alto,

listadas
por
su
clave
pdb
generado
por
el
archivo
ejecutable

build_profile.py
obtenidas
de
Modeller.

16

3

Matriz
de
distancias
de
identidad
de
secuencia,
se
presenta
la

clave
del
archivos
pdb
que
presentaron
mayor
identidad
en

secuencia
a
Brn3a.

16

4

Criterios
para
seleccionar
el
archivo
pdb
que
servirá
como

modelo
para
construir
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a.

17

5

Evaluación
mediante
los
3
criterios
de
inclusión
para
escoger
la

mejor
estructura
tridimensional
para
construir
el
modelo
de

Brn3a.

17

6

Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de

evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las

estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
Modeller.

18

7

Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de

evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las

estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo

ejecutable
ligand.py.

19

8

Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de

evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las

estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo

ejecutable
loop-‐refine.py.

20

9

Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de

evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las

estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo

ejecutable
loop-‐refine.py.

22

10

Cantidad
de
ángulos
diédricos
Ψ
(psi)
y

Φ
(phi)

favorables

permitidos
y
atípicos
que
del
total
de
aminoácidos
de
la

estructura
tridimensional
Brn3a-‐ADN.

24

11

11
A:
Energía
total
previa
a
la
simulación
molecular

11
B:
Energía
total
al
final
de
la
simulación
molecular

29

12
Resultados
de
la
dinámica
molecular
por

MMPBSA.
36

XI

LISTA
DE
FIGURAS

FIGURA

DESCRIPCIÓN

PÁGINA

1

Estructura
de
un
factor
de
transcripción
el
cual
contiene
un

homeodominio.

6

2

Interacciones
del
motivo
hélice-‐giro-‐hélice
de
la
proteína

Antennapedia
de
D.
melanogaster
(código
PDB:
1AHD)
con
los

surcos
mayores
y
menores
del
ADN,
obtenido
de
la
base
de
datos

Protein
Data
Bank
(www.rcsb.org).

7

3

a)
Alineamiento
de
secuencias
de
aminoácidos
de
los
dominios

POU
de
las
proteínas
humanas
Brn-‐5,
Oct-‐1
y
Pit-‐1.
Los
residuos

conservados
están
resaltados
en
letra
negrita.
Los
residuos
de

POUS
y
POUH
implicados
en
los
enlaces
de
puentes
de
hidrógeno

con
el
ADN
están
resaltados.
b)
Representación
esquemática
de

la
estructura
del
dominio
POU
de
Brn-‐5.
El
dominio
POUS
se

muestra
en
color
rosa,
el
enlazador
en
amarillo
y
POUH
en
verde.

Las
hélices
de
los
dominios
POU
están
numeradas
como
se

muestra
en
el
alineamiento
de
la
parte
superior.
(N)
extremo

amino-‐terminal,
(C)
extremo
carboxilo-‐terminal.

8

4
Procedimiento
del
modelaje
por
homología.
10

5

Esquema
que
presenta
en
forma
de
jerarquía
las
rutas
de
acceso

a
los
archivos
ejecutables
del
presente
trabajo,
de
esta
manera
se

ordenaron
las
carpetas
contenidas
dentro
del
directorio

Modelaje_básico.

15

6

Dominios

y
familias
de
proteínas
relacionadas
a
los
dominios

presentes
en
la
secuencia
de
Brn3a,
la
familia
POU
a
la
izquierda

y
la
familia
de
los
homeodominios
a
la
derecha,
descritos
en
la

base
de
datos
"Conserved
Domains"
del
NCBI
y
localizados

mediante
la
herramienta
BLASTp.

15

7

Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido

comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
usada
como
modelo

base.
La
región
enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
al

bucle
de
la
región
interdominios
donde
se
presenta
un

incremento
de
energía.

18

8

Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
de
la

nueva
estructura
PDB
Brn3a.B99990001

la
cual
se
encuentra
en

interacción
con
el
ADN
(azul)
obtenido
de
el
archivo
pdb
2XSD,

comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
(verde)
usada
como

modelo
comparativo,
la
región
enmarcada
por
el
rectángulo

corresponde
a
la
región
interdominio
donde
presenta
un

incremento
de
energía.

20

9

Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
de
la

21

XII

nueva
estructura
PDB
Brn3a.BL0006001
el
cual

fue
el
mejor

modelo
de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
denominado
Brn3a-‐
looprefine
(rojo),
comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
(verde)

usada
como
control
o
modelo
comparativo,
en
azul
se
muestra
el

modelo
previo
sin
el
proceso
de
refinamiento
de
bucle,
la
región

enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
al
bucle
en
la
región
C

terminal
del
archivo
pdb
Brn3a
la
cual
muestra
un
incremento
de

la
energía
por
un
arreglo
termodinámicamente
desfavorable
de

los
aminoácidos.

10

Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido

comparado
con
el
archivo
pbb
2XSD
como
control
presentado
en

verde,
en
rojo
se
muestra
el
modelo
Brn3a.BL00040001.pdb
de

Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
denominado
Brn3a-‐looprefine

(rojo),
en
azul
se
muestra
el
archivo
pdb
que
contiene
el
modelo

previo
Brn3a.B99990001
sin
el
proceso
de
refinamiento
de
bucle

denominado
Brn3aligand.

22

11

A
la
derecha
se
presenta
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a

unida
a
DNA,
se
muestra
en
gradiente
de
color
de
azul
(mas

preciso)
a
rojo
(menos
preciso)
los
Å
de
error
la
región
del

enlazador
(en
rojo)
la
cual
presenta
mas
de
3.5
Å
de
error,
a
la

izquierda
se
muestran
los
valores
de
torsión,
solvatación,

interacción
de
átomos
y
Cβ,
relación
SSE,
relación
ACC,
donde
al

final
de
la
barra
se
observa
el
valor
de
cada
uno
de
estos

criterios,
la
barra
negra
indica
que
tan
beneficioso
o
perjudicial
es

cada
valor
para
la
estabilidad
de
la
proteína.

23

12

Se
presentan
los
gráficos
de
Ramachandran
de
la
estructura
de

interacción
Brn3a-‐ADN,
de
izquierda
a
derecha
en
orden
de

aparición
se
muestra
el
gráfico
general
de
la
estructura
donde
se

presenta
en
el
limite
del
gráfico
el
residuo
No
49
correspondiente

a
cisteína,
este
residuo
no
se
no
se
tomo
en
cuenta
en
la

validación
final

debido
a
que
se
encuentra
en
región
límite
del

gráfico
y
en
otros
gráficos
aparece
como
favorecido,
el
segundo

gráfico
presenta
los
residuos
de
Valina
e
Isoleucina,
el
tercer

gráfico
se
muestran
los
residuos
de
pre
Prolina,
el
cuarto
los

residuos
aminoacídicos
de
Glicina,
en
el
quinto
los
residuos
de

trans
Prolina
en
la
cual
se
muestra
el
residuo
No.
38
con
un
valor

atípico
por
lo
cual
se
deberá
modificar
su
posición
espacial
mas

adelante
con
dinámica
molecular,
el
sexto
y
último
gráfico

presenta
solamente
los
residuos
de
la
Prolina
en
posición
Cis.

25

13

A:
Secuencia
nucleotídica
que
se
encuentra
en
la
estructura
pdb

OCT-‐6
(2XSD)
indicándose
a
la
izquierda
la
cadena
a
la
cual

pertenecen
en
el
archivo
pdb.
La
secuencia
nucleotídica
se
mutó

con
el
programa
X3DNA.

V1:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región

URR
de
VPH-‐16
subtipo
1
del
archivo
pdb
V1.
V2:
Secuencia

nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-‐16
subtipo
2
del
archivo

pdb
V2.
V5:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-‐16

subtipo
5
del
archivo
pdb
V5.
Las
letras
en
negrita
indican
las

26

XIII

bases
nucleotídicas
que
se
mutaron.
B:
Representación

esquemática
del
modelo
de
Brn3a-‐ADN
donde
se
representa
el

ADN

en
forma
de
palos
y
la
proteína
en

forma
de
lazos.

14

Figura
14.
Se
muestran
en
orden
ascendente
a
descendente
los

resultados
de
la
minimización
energética
donde
se
equilibró
la

energía
potencial

y
energía
total
de
cada
molécula
de
cada
uno

de
los
complejos
Bn3a
en
unión
al
ADN
de
la
región
URR
de
cada

subtipo
de
VPH-‐16.
Las

figuras
mostradas
a

la
derecha

presentan
la
energía
total

de
cada
molécula
contra
el
tiempo

total
que
fue
de
5
picosegundos,
los
gráficos
mostrados
a
la

izquierda

presentan
la
energía
potencial

de
cada
molécula

contra
el
tiempo
total
que
fue
de
5
picosegundos.
Figura
14
A:

Subtipo
1.
Figura
14
B:
Subtipo
2.
Figura
14
C:
Subtipo
5.

27,28

15

Se
muestran
en
orden
ascendente
a
descendente
los
resultados

de
la
simulación
de
la
dinámica
molecular.
Se
presentan
en
forma

de
gráfica
la
energía
potencial

y
energía
total
de
cada
molécula

de
cada
uno
de
los
complejos
Bn3a
en
unión
al
ADN
de
la
región

URR
de
cada
subtipo
de
VPH-‐16.
Las

figuras
mostradas
a

la

derecha
presentan
la
energía
total

de
cada
molécula.
Los

gráficos
mostrados
a
la
izquierda

presentan
la
energía
potencial

de
cada
molécula.
Figura
14
A:
Subtipo
1.
Figura
14
B:
Subtipo
2.

Figura
14
C:
Subtipo
5.

30

16

Se
muestran
en
orden
descendente
las
gráficas
del
RMSD
de
los

Cα
de
las
estructuras
pdb
obtenidas
del
proceso
de
simulación
de

dinámica
molecular
contra

los
1000
picosegundos
de
la

simulación.
Se
presenta
en
orden
descendente
subtipo
1

como

figura
15
A,
subtipo
2
como
figura
16
B

y
subtipo
5
como
figura

16
C.
LS:
limite
superior.
M:
media.
LI:
limite
inferior.

31,32

17

A:
Densidad

del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
B:

Temperatura
del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

33

18

A:
Energía
potencial

del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
B:

RMSD
del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

34

19

A:
Densidad

del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
B:

Temperatura
del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
C:
Energía

total
del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
D:
RMSD
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

35

20

Figura
20.
Secuencia
nucleotídica
consenso
de
la
región
URR
de

VPH-‐16
.

36

XIV

RESUMEN

Javier
Alejandro
Rendón
Carrillo

Fecha
de
graduación:
Mayo
de
2014

Universidad
Autónoma
de
Nuevo
León

Facultad
de
Ciencias
Biológicas

Instituto
de
Biotecnología

Titulo
de
Estudio:
CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL

FACTOR
DE
TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL

VIRUS
DEL
PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER

DE
CÉRVIX.

Candidato
para
obtener
el
título
profesional
de
Licenciado
en
Biotecnología
Genómica

Área
de
estudio:
Biotecnología.

Propósito
y
método
de
estudio:
Se
estableció
un
modelo
tridimensional
de
interacción
del

factor
de
transcripción
humano
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16
para
el

diseño
de
una
vacuna
génica
contra
el
CaCu.
Para
ello
se
construyó
y
validó
un
modelo

tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
utilizando
modelaje
por
homología
con
Modeller,
se

validaron
los
modelos
construidos
con
MolProbity
y
QMEAN.
Posteriormente
se
construyó
el

modelo
tridimensional
de
la
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
una
secuencia
nucleotídica

similar
a
la
región
URR
de
VPH-‐16
empleando
el
programa
Modeller,
el
modelo
tridimensional

de
la
proteína
Brn3a
y
la
estructura
tridimensional
de
la
secuencia
nucleotídica
contenida
en
el

archivo
PDB
de
clave
2XSD.
Con
el
programa
X3DNA,
se
mutaron
las
secuencias
nucleotídicas

de
los
archivos
pdb
que
contienen
los
modelos
tridimensional
de
interacción
proteína-‐ADN
en

unión
a
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16,
de
esta
manera

se
obtuvieron
tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región

URR
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16
subtipo
1,
subtipo
2,
y
subtipo
5,
los
cuales
se
validaron

con
MolProbity
y
QMEAN.
Se
mejoraron
los
tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la

proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-‐16
empleando
un
proceso
de
minimización
de

energía
con
el
programa
Amber
12.
Por
último,
se
optimizaron
los
modelos
tridimensionales

de
interacción
de
Brn3a
con
cada
uno
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16
empleando
el
programa

Amber
y
se
calcularon
las
energías
de
interacción
del
complejo
proteína-‐ADN.

Contribuciones
y
conclusiones:
Se
generó
información
sobre
la
energía
de
interacción
de

Brn3a
con
las
secuencias
de
VPH-‐16
y
en
base
a
los
resultados
obtenidos
se
concluye
que
la

secuencia
nucleotídica
de
VPH-‐16
subtipo
1
presenta
la
mayor
afinidad
a
Brn3a,
con
la
cual
se

abre
la
posibilidad
de
crear
una
vacuna
génica
contra
el
VPH-‐16.

DIRECTOR
DE
TESIS

CO-‐DIRECTOR
DE
TESIS

__________________________

____________________________

DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ

M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA

1

1. Introducción

La
transcripción
es
el
proceso
en
que
la
información
codificada
en
el
ADN
se
transcribe
a

ARN
mensajero.
La
síntesis
del
ARN
la
realiza
la
ARN
polimerasa,
pero
para
la
iniciación
y

progresión
del
proceso
se
necesita
la
participación
de
un
gran
número
de
proteínas
(factores

de
transcripción)
que
posibilitan
el
acoplamiento
de
la
ARN
polimerasa
al
promotor
del
gen
en

concreto
y
la
síntesis
del
mensajero
en
una
cantidad
precisa.
La
regulación
de
forma
específica

de
la
síntesis
de
cada
proteína
depende
de
los
factores
de
transcripción.

Los
factores
de
transcripción
son
proteínas
que
coordinan
y
regulan
la
expresión
de
un
gen
o

de
un
grupo
de
genes.
En
muchos
casos
regulan
su
propia
expresión
y
también
es
frecuente

que
regulen
a
otros
factores
de
transcripción.
Estos
factores
interaccionan
con
regiones

específicas
del
ADN,
con
elementos
de
la
maquinaria
de
transcripción
y
con
moléculas
que

activan
o
inhiben
su
actividad.
Su
función
es
conectar
los
estímulos
externos
e
internos
de
la

célula
actuando
como
transductores
de
señales.
El
conjunto
de
los
factores
de
transcripción
de

una
célula
dibuja
una
red
transcripcional
cuyas
conexiones
determinan
el
conjunto
de
genes

que
se
expresan
en
un
determinado
momento
(transcriptoma).

La
diferenciación
celular
depende
de
la
expresión
de
un
patrón
específico
de
genes,
lo
que
está

en
gran
medida
determinado
por
el
perfil
de
factores
de
transcripción
expresados
en
cada
tipo

celular.
Dentro
de
este
perfil
hay
factores
de
transcripción
cuya
expresión
está

constantemente
activa
los
cuales
son
responsables
de
la
expresión
de
los
genes
constitutivos,

y
hay
otros
que
cuya
expresión
se
activa
o
inhibe
en
respuesta
a
estímulos
externos.

Los
factores
de
transcripción
se
clasifican
en
familias
según
su
estructura
tridimensional.
Para

pertenecer
a
la
misma
familia
las
proteínas
deben
poseer
al
menos
un
25%
de
identidad
entre

ellas,
además
de
estar
relacionadas
evolutivamente.
La
familia
de
los
factores
de
transcripción

POU
(Pit-‐1,
Oct-‐1,
Unc-‐86)
poseen
un
papel
determinante
en
el
desarrollo
estructural
de
los

organismos,
esta
familia
contiene
un
dominio
estructural
bipartito
denominado
dominio
POU.

El
dominio
POU
es
un
dominio
proteico
el
cual
se
une
a
ADN
o
ARN
y
está
altamente

conservado
en
la
mayoría
de
los
eucariotas.
Un
dominio
proteínico
se
define
como
una
unidad

compacta,
de
características
globulares,
que
suele
comprender
entre
30
a
150
aminoácidos
y

se
considera
que
su
conformación
tridimensional
está
determinada
por
su
secuencia
de

aminoácidos,
los
cuales
se
pliegan
de
forma
independiente
al
resto
de
la
proteína,
por
lo
que

poseen
una
estructura
y
función
distinguible
de
otras
regiones
de
la
proteína.

La
familia
de
factores
de
transcripción
POU
contiene
por
lo
regular
dos
subdominios
uno

denominado
homeodominio
y
otro
denominado
POU,
este
último
subdominio
está
más

conservado
en
eucariotas
que
el
homeodominio.
Estos
subdominios
trabajan
en
sinergia
para

activar
la
transcripción
de
varios
genes.
Cabe
destacar
a
la
sub-‐familia
de
proteínas
POU
IV
por

su
importancia
en
el
desarrollo
del
sistema
nervioso
del
embrión
humano,
específicamente
a

los
factores
de
transcripción
Brn3a
y
Brn-‐3b.
Estos
factores
poseen
papeles
antagónicos,
el

factor
de
transcripción
Brn3a
está
implicado
en
el
desarrollo
del
tubo
neural,
mientras
que
el

factor
de
transcripción
Brn-‐3b
inhibe
a
Brn3a;
estos
factores
pertenecen
a
la
familia
POU

debido
que
comparten
un
dominio
estructural
de
150
a
160
aminoácidos
el
cual
está
presente

en
las
proteínas
Pit-‐1,
Oct-‐1
y
Unc-‐86
que
tienen
función
regulatoria.
El
dominio
POU
deriva
su

nombre
de
la
identificación
original
en
los
loci
homeóticos
de
Drosophila.
Este
dominio
se

caracteriza
por
un
dominio
de
unión
a
ADN
separado
por
una
región
de
15
a
20
aminoácidos

unida
a
un
homeodominio
el
cual
está
relacionado
con
las
proteínas
homeobox.

2

El
dominio
de
unión
a
ADN
de
la
proteína
Brn3a
ha
sido
estudiado
con
antelación
donde
se

logró
determinar
la
secuencia
de
unión
al
ADN.
Estos
estudios
se
basaron
en
los
sitios

homólogos
de
otras
proteínas
tales
como
Oct-‐1
(el
octámero
TAATGARAT
se
ha
descrito
como

un
sitio
de
unión
específico
para
dicha
proteína).
Cabe
destacar
que
en
diversos
estudios
se
ha

correlacionado
el
papel
de
activación
de
estos
factores
en
los
genes
virales,
puesto
que
los

virus
poseen
secuencias
de
unión
a
estos
factores
de
transcripción.

En
el
presente
estudio
se
decidió
construir
tres
modelos
tridimensionales
de
la
interacción
del

sitio
de
unión
del
factor
de
transcripción
Brn3a
con
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR

correspondiente
a
tres
subtipos
del
virus
del
papiloma
humano
variante
16
(VPH-‐16),

mediante
herramientas
bioinformáticas
para
el
posterior
diseño
de
una
vacuna
génica.

El
genoma
del
VPH
consiste
de
una
molécula
de
ADN
circular
de
doble
cadena,

aproximadamente
de
8
kb.
Se
divide
en
tres
regiones:
la
región
larga
de
control,
LCR
o
URR,

que
no
contiene
regiones
codificantes;
las
regiones
E1
a
E8
que
codifican
para
las
proteínas
de

expresión
temprana;
y
las
regiones
L1
y
L2
que
codifican
para
las
proteínas
de
expresión
tardía

en
el
ciclo
de
vida
del
virus.
La
importancia
del
presente
trabajo
reside
en
que
en
el

experimento
de
Turner
et
al.,
1997
se
encontraron
ocho
sitios
de
unión
de
factores
de

transcripción
en
el
genoma
del
VPH-‐16
con
la
secuencia
nucleotídica
ta/taatnanta/t
los
cuales

están
distribuidos
en
el
20%
del
genoma
del
virus.
Estos
sitios
no
están
ligados
a
la
activación

de
la
expresión
de
los
factores
de
transcripción
del
genoma
viral
ni
de
los
oncogenes,
puesto

que
no
son
regiones
codificantes
y
se
encuentran
frecuentemente
cerca
de
los
extremos
3’
de

los
genes
tardíos
del
VPH.
A
pesar
de
ello
estudios
de
afinidad
demostraron
que
los
factores
de

transcripción
humanos
que
contienen
el
dominio
POU
interaccionan
con
estos
sitios
y
activan

la
expresión
cinco
genes
virales
denominados
E6,
E7,
E5,
E4,
y
E2.

Es
necesario
contar
con
un
modelo
de
interacción
molecular
de
la
proteína
Brn3a
y
la
región

URR
del
VPH-‐16
debido
a
que
la
activación
de
la
expresión
de
genes
virales
se
encuentra

correlacionada
con
el
desarrollo
de
Cáncer
cérvicouterino
(CaCu).

Una
vacuna
génica
del
CaCu
podría
ser
un
vector
con
una
secuencia
nucleotídica
que
presente

una
mayor
afinidad
por
Brn3a
que
la
URR
silvestre.
Una
consecuencia
directa
de
tal
vector

sería
la
disminución
de
la
transcripción
de
proteínas
oncogénicas
del
VPH.
En
el
presente

proyecto,
por
medio
de
técnicas
computacionales
avanzadas
se
construirán
modelos
de

interacción
entre
Brn3a
y
las
secuencias
de
la
región
promotora
URR
de
los
suptipos
1,
2
y
5

del
VPH-‐16
que
permitirán
predecir
la
especificidad
de
unión
de
Brn3a
por
dichas
secuencias.

Esto
permitirá
a
futuro
la
elección
de
secuencias
nucleotídicas
específicas
dentro
de
cientos
de

posibilidades
para
el
desarrollo
de
una
vacuna
génica.

2. Importancia

El
cáncer
de
cérvix
o
cérvicouterino
(CaCu)
es
la
segunda
causa
de
muerte
por
cáncer
en

mujeres
tanto
en
México
como
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009),
afectando
principalmente
a

mujeres
en
edad
productiva
(Parkin
et
al.,
2006;
Agosti
et
al.,
2007).
La
infección
genital
con
el

VPH
es
un
factor
necesario
para
el
desarrollo
del
cáncer
de
cérvix
(Walboomers
et
al.,
1999).
El

VPH
se
destaca
por
ser
el
virus
de
transmisión
sexual
más
frecuente
a
nivel
mundial
(Rapose,

2009).
Por
esto
es
necesario
construir
un
modelo
in
silico
que
analice
la
especificidad
de
la

unión
entre
el
factor
de
transcripción
Brn3a
y
un
fragmento
de
ADN
de
la
región
promotora

URR
de
VPH-‐16,
el
cual
permitirá
diseñar
sitios
específicos
de
unión
a
Brn3a
para
el
desarrollo

y
construcción
de
vectores
virales
terapéuticos
dirigidos
contra
el
CaCu.

3

3. Hipótesis

Mediante
herramientas
bioinformáticas
se
podrá
confeccionar
un
modelo
tridimensional
de
la

interacción
entre
el
factor
de
transcripción
Brn3a
y
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región

promotora
URR
de
tres
subtipos
del
VPH-‐16.

4. Objetivos

4.1 Objetivo
general:

Establecer
un
modelo
tridimensional
de
interacción
del
factor
de
transcripción

humano
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16
para
el
diseño
de
una

vacuna
génica
contra
el
CaCu.

4.2 Objetivos
específicos:

• Construir
y
validar
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a.

• Construir
y
validar
el
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la

región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16.

• Optimizar
los
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
Brn3a
con
cada
uno
de
los

tres
subtipos
de
VPH-‐16
y
calcular
las
energías
de
interacción
del
complejo
proteína-‐
ADN.

5. Antecedentes

5.1 Epidemiología
y
etiología
del
cáncer
cérvicouterino

El
cáncer
de
cérvix
o
cérvicouterino
(CaCu)
es
la
segunda
causa
de
muerte
por
cáncer
en

mujeres
tanto
en
México
como
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009),
afectando
principalmente
a

mujeres
en
edad
productiva
(Parkin
et
al.,
2006;
Agosti
et
al.,
2007).
La
infección
genital
con
el

virus
del
papiloma
humano
(VPH)
es
un
factor
necesario
para
el
desarrollo
del
cáncer
de
cérvix

(Walboomers
et
al.,
1999).
El
VPH
se
destaca
por
ser
el
virus
de
transmisión
sexual
más

frecuente
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009).
En
la
tabla
1
se
muestra
la
relación
entre
el
VPH
y
las

principales
patologías
infecciosas
que
origina
de
las
cuales
algunas
pueden
progresar
a
cáncer

debido
a
su
potencial
oncogénico.

El
Sistema
Nacional
de
Salud
Mexicano
brinda
atención
médica
aproximadamente
a
9,000

casos
de
CaCu
invasor
y
se
registran
4,000
muertes
anualmente
(Walboomers
et
al.;
1999).
En

el
año
2001,
se
reportaron
4,051
muertes
en
mujeres
por
CaCu,
con
una
tasa
de
mortalidad
de

4

8.8
por
cada
100,000
mujeres.
Para
el
año
2002
se
registraron
4,323
casos
con
una
tasa
de
8.6

por
100,000
mujeres
(Estadísticas
de
la
Secretaria
de
Salud;
2002).

Sin
embargo,
este
tipo
de
cáncer
es
absolutamente
prevenible
y
su
tratamiento
es

relativamente
fácil,
cuando
el
diagnóstico
es
oportuno.
El
CaCu
es
de
etiología
infecciosa
y

desde
la
perspectiva
de
la
salud
pública
se
está
consciente
que
los
programas
de
control
no

han
funcionado
como
se
esperaba.
La
experiencia
de
países
desarrollados
ha
permitido

demostrar
que
la
mejor
opción
para
disminuir
la
mortalidad
por
CaCu
es
la
detección
y
el

tratamiento
oportuno
de
lesiones
precursoras
y
lesiones
malignas
por
medio
de
programas
de

detección
oportuna
del
CaCu
y
del
VPH
(World
Health
Organization,
1995).

El
genoma
de
VPH
tiene
una
longitud
aproximada
de
8
kb
y
su
organización
se
encuentra

prácticamente
establecida.
Este
virus
contiene
nueve
genes,
los
cuales
dependiendo
del

momento
de
su
transcripción
durante
la
infección
viral,
se
dividen
en
genes
tempranos
(E1,
E2,

E3,
E4,
E5,
E6,
E7
y
E8)
y
genes
tardíos
(L1
y
L2).
La
expresión
de
estos
genes
está
controlada

por
una
región
promotora
río
arriba
del
gen
E6
(Gloss
et
al.,
1987),
denominada
unidad

reguladora
no
codificada
(URR)
o
también
unidad
larga
de
control
(LCR),
de
0.4
a
1
kb
de

longitud,
esencial
para
funciones
reguladoras
del
genoma
durante
la
replicación,
así
como
para

servir
de
origen
de
replicación
del
ADN
y
actuar
como
una
región
potenciadora
de
la

transcripción
viral
por
promotores
de
síntesis
del
ARN.

Tabla
1:
VPH
y
su
asociación
con
las
principales
enfermedades
que
origina
obtenida
del

reporte
anual
de
la
Secretaria
de
Salud.

5

Los
genes
de
expresión
tempranos
codifican
para
proteínas
responsables
de
las
funciones
de

transformación
celular,
replicación
y
de
la
persistencia
del
ADN
integrado
en
las
células
a
las

que
infecta.
De
este
grupo
destacan
las
proteínas
codificadas
por
los
genes
E1
y
E2
que

intervienen
en
la
replicación
viral,
las
proteínas
codificadas
por
los
genes
E2
en
sinergia
con
E4

para
facilitar
la
amplificación
del
genoma
viral
y
la
expresión
de
proteínas
tempranas
y
sobre

todo,
las
que
intervienen
en
los
procesos
de
transformación
celular
codificadas
por
los
genes

E5,
E6
y
E7.

Las
regiones
E6/E7
tienen
un
especial
interés
ya
que
poseen
un
importante
papel
en
los

mecanismos
de
transformación
celular.
Estas
regiones
están
siempre
virtualmente
expresadas

en
los
cánceres
asociados
al
VPH.
Las
proteínas
codificadas
por
estos
genes
virales
se
unen
y

ubiquitinan
a
las
proteínas
supresoras
de
tumores
p53,
pRB
y
Rb105,
induciendo
su

degradación,
desregulando
el
ciclo
celular
y
provocando
el
bloqueo
de
la
apoptosis.

Existen
vacunas
eficientes
en
la
prevención
de
neoplasias
cervicales
intraepiteliales
de
grado
2

y
3
causadas
por
los
VPH-‐16
y
18,
aunque
todavía
no
se
conoce
el
grado
de
protección
contra

otro
tipo
de
VPH
como
VPH-‐31,
33,
35,
45,
52,
y
58.
El
alto
costo
es
también
un
factor
limitante

para
su
aplicación
en
países
en
vías
de
desarrollo
(Lowy,
2006;
Agosti
et
al.,
2007).

5.2 Brn3a
y
el
desarrollo
del
CaCu
mediante
la
regulación
del
VPH

Uno
de
los
factores
de
transcripción
que
se
une
al
sitio
URR
del
VPH
es
Brn3a.
Esta
proteína

pertenece
a
la
subfamilia
4
de
las
proteínas
POU,
identificada
en
el
GenBank
del
NCBI
como

POU4F1
y
está
conformada
por
3
miembros
homólogos:
Brn3a,
Brn-‐3b,
Brn-‐3c
(Guerrero
et
al.,

1993).
Brn3a
juega
un
papel
importante
en
el
proceso
del
desarrollo
del
tubo
neural
durante
la

embriogénesis
regulando
el
balance
entre
proliferación
y
diferenciación
celular,
por
lo
que

ejerce
una
gran
influencia
en
el
destino
celular
neuronal.
Sin
embargo,
su
abundancia
declina

llegando
a
ser
ausente
en
neuronas
maduras.
Por
otra
parte,
se
ha
detectado
la

sobreexpresión
de
este
factor
en
diversos
tipos
de
cáncer
como
el
cáncer
de
próstata,

neuroblastoma,
neuroendocrino
y
CaCu.
Respecto
al
CaCu,
diversos
estudios
en
pacientes
han

demostrado
la
sobreexpresión
del
ARNm
de
Brn3a
en
tejido
tumoral
de
hasta
300
veces

comparada
con
el
tejido
circundante
(Ndisang
et
al.,
1998).

La
sobreexpresión
de
este
factor
transcripcional
se
ha
visto
correlacionada
con
la
activación
de

la
expresión
génica
del
VPH,
principalmente
de
los
oncogenes
E6
y
E7,
los
cuales
alteran
la
tasa

de
crecimiento
celular
tanto
in
vivo
como
in
vitro.
Se
han
detectado
alteraciones
específicas
en

las
secuencias
del
URR
de
los
subtipos
1,
2
y
5
del
VPH-‐16
las
cuales
están
correlacionadas
con

el
aumento
en
la
tasa
de
transcripción
de
los
oncogenes
virales.
De
manera
similar
se
han

identificado
variantes
en
las
secuencias
de
la
región
E5
de
VPH-‐16,
que
están
asociadas
con

diferencias
en
los
niveles
de
transcripción
viral
de
los
oncogenes
virales,
ocasionando
la

inducción
de
la
neoplasia,
encontrando
al
subtipo
2
asociado
positivamente
al
desarrollo
de

CaCu.
Aunado
a
esto
se
ha
reportado
que
el
subtipo
2
presenta
mayores
niveles
de
expresión

de
los
oncogenes
E6
y
E7,
estos
oncogenes
son
activados
por
el
factor
de
transcripción
Brn3a.

Se
ha
demostrado
experimentalmente
que
la
región
URR
de
variantes
de
VPH
presentan
una

afinidad
a
los
factores
de
transcripción
Brn3a
y
Brn-‐3b,
sin
embargo
ambas
proteínas
se

antagonizan.
En
el
subtipo
2
del
VPH-‐16,
el
factor
de
transcripción
Brn3a
es
más
afín
a
dicha

secuencia
que
Brn-‐3b
promoviendo
la
activación
de
la
región
URR
y
con
ello
la
expresión
de
los

6

oncogenes
E6
y
E7,
contrario
a
la
función
de
la
proteína
Brn-‐3b,
la
cual
en
ensayos
de

silenciamiento
de
Brn3a
ha
regulado
negativamente
la
expresión
de
dichos
genes
(Ndisang
et

al.,
2001).
Se
ha
identificado
la
presencia
de
Brn3a
en
las
líneas
celulares
cervicales
C33
y
SiHa

(Ndisang
et
al.,
1999).
Experimentos
de
sobreexpresión
de
Brn3a
en
células
SiHa
con
el

genoma
de
VPH-‐16
han
demostrado
que
la
concentración
de
Brn3a
inherente
en
este
tipo

celular
se
encuentra
en
cantidades
saturantes
para
la
expresión
de
E6,
ya
que
presenta
el

mismo
efecto
que
el
mostrado
por
los
tratamientos
exógenos
con
dicha
proteína.

La
reducción
de
los
niveles
de
expresión
de
Brn3a
in
vivo
reduce
los
niveles
de
expresión
del

gen
E6
y
del
gen
antiapoptótico
Bcl-‐2,
así
como
la
inducción
de
la
tumorogénesis
(Ndisang
et

al.,
1999,
2001).
Por
el
contrario
la
sobreexpresión
de
Brn-‐3b
resulta
en
la
disminución
de
la

transcripción
de
los
genes
del
VPH
(Ndisang
et
al.,
1999),
mientras
que
una
disminución
de

Brn-‐3b
presenta
efectos
similares
a
la
sobreexpresión
de
Brn3a
(Ndisang
et
al.,
2001).
La

sobreexpresión
de
Brn-‐3b
in
vivo
presenta
un
efecto
inhibitorio
de
la
expresión
de
los

oncogenes
E6
(Ndisang
et
al.,
2001).

Con
base
en
el
papel
que
juega
Brn3a
en
la
interacción
y
activación
de
la
URR
del
VPH
se
han

sugerido
varias
vías
terapéuticas
posibles
contra
el
CaCu.
Algunas
alternativas
son
la
alteración

de
la
actividad
de
Brn3a
por
medios
farmacológicos,
o
bien
una
reducción
de
la
actividad
del

promotor
Brn3a
(Ndisang
et
al.,
1999,
2001).

La
terapia
genética
abre
el
camino
hacia
el
diseño
de
vectores
plasmídicos
o
adenovirales

como
tratamiento.

5.3 Sitios
de
unión
de
los
homeodominios

La
homeocaja
es
una
secuencia
nucleotídica
que
codifica
para
un
dominio
de
alrededor
de
60

aminoácidos
(figura
1),
que
se
encuentra
en
muchos
organismos
eucariotas,
cuyo
nombre

deriva
de
su
identificación
en
los
loci
homeóticos
de
la
mosca
de
la
fruta
(Drosophila

melanogaster).
En
los
genes
homeóticos
de
D.
melanogaster
a
menudo
el
homeodominio
está

cerca
del
extremo
C-‐terminal
de
las
proteínas
producto
de
estos
genes.

Figura
1.
Estructura
de
un
factor
de
transcripción
el
cual
contiene
un
homeodominio.

7

El
homeodominio
puesto
que
es
un
subdominio
suele
combinarse
con
otros
segmentos
o

dominios
en
los
factores
de
transcripción,
como
pasa
con
las
proteínas
Oct
(de
unión
de

octámero),
donde
una
cadena
conservada
de
75
aminoácidos,
llamada
región
POU,
se
localiza

cerca
de
una
región
que
simula
el
homeodominio,
tal
y
como
sucede
con
Brn3a.

El
homeodominio
se
encarga
de
la
unión
con
el
ADN
(figura
2),
este
posee
la
capacidad
de

reconocimiento,
donde
la
región
C-‐terminal
del
homeodominio
es
idéntico
en
secuencia
al

segmento
de
los
represores
procarióticos.
La
diferencia
entre
ambas

estructuras
radica
en
la
longitud
de
la
hélice
que
reconoce
al
ADN,
la
hélice-‐3
la
cual
contiene

17
aminoácidos
de
longitud
que
son
parte
del
homeodominio
en
comparación
a
los
9

aminoácidos
del
represor
λ.

Figura
2.
Interacciones
del
motivo
de
la
proteína
Antennapedia
de
D.

melanogaster
(código
PDB:
1AHD)
con
los
surcos
mayores
y
menores
del
ADN,
obtenido
de
la

base
de
datos
Protein
Data
Bank
(www.rcsb.org).

La
hélice-‐3
se
une
con
el
surco
mayor
del
ADN
y
establece
el
mayor
número
de
contactos
entre

la
proteína
y
el
ácido
nucleico,
de
los
cuales,
muchos
de
los
que
orientan
la
hélice
en
el
surco

mayor
son
con
la
columna
de
fosfatos,
de
manera
que
no
son
específicos
para
la
secuencia
del

ADN,
sino
que
se
encuentran
sobre
todo
en
una
cara
de
la
doble
hélice
y
flanquean
las
bases

con
las
que
se
hacen
contactos
específicos.
Los
contactos
restantes
son
del
brazo
N-‐terminal

del
homeodominio,
secuencia
inmediata
a
la
primera
hélice,
y
se
proyecta
hacia
el
surco

menor.
Así
las
regiones
N-‐terminal
y
C-‐terminal
del
homeodominio
son
las
principales

encargadas
de
hacer
contacto
con
el
ADN.

5.4 Reconocimiento
específico
de
una
secuencia
de
ADN
por
los
dominios
POU

Pit,
Unc,
Oct
son
proteínas
de
la
familia
POU
que
se
encuentra
muy
conservada

evolutivamente
entre
especies.
Además
de
la
proteína
Brn3a
incluye
a
gran
variedad
de

miembros
tales
como
Pit-‐1,
Oct-‐1,
Oct-‐2,
Unc-‐86,
Brn-‐5,
Brn-‐3b
(Herr
&
Cleary,
1995).
El

dominio
POU
de
unión
a
ADN
característico
de
dicha
familia
se
compone
de
dos
subdominios:

POUS
y
POUH.
El
subdominio
amino-‐terminal
específico
(POUS)
contiene
alrededor
de
75

aminoácidos

y
el
subdominio
homeo
carboxi-‐terminal
POUH
contiene
60
aminoácidos.
Los
dos

subdominios
se
encuentran
unidos
por
una
región
flexible
híper
variable
que
contiene
de
15
a

56
aminoácidos
llamada
linker
o
enlazador.
Los
subdominios
POUS
y
POUH
tienen
estructuras

independientes,
sin
embargo
la
flexibilidad
del
linker
permite
su
interacción
mutua
y
en

puntos
específicos
con
el
ADN
(Herr
&
Cleary,
1995),
(figura
3).

8

Estudios
cristalográficos
recientes
elucidaron
la
estructura
del
complejo
proteína
Brn-‐5
unida
a

ADN,
determinándose
que
los
dominios
POUS
y
POUH
se
unen
al
surco
mayor
del
ADN
en

posición
opuesta
(Pereira
&
Kim,
2009).
El
subdominio
POUS
se
une
a
la
secuencia
nucleotídica

atgc
en
sentido
5’,
mientras
que
el
subdominio
POUH
se
une
a
la
secuencia
aaat
en
sentido
3’,

ambos
subdominios
se
unen
en
la
misma
cadena
de
ADN.
Las
subunidades
POUS
y
POUH
no

interaccionan
directamente.
Los
dos
subdominios
contienen
un
motivo

(HTH)
formado
por
las
hélices
alfa-‐2
y
alfa-‐3
distribuidas
perpendicularmente,
de
las
cuales
la

hélice
alfa-‐3
permite
la
unión
con
el
ADN.
La
estructura
HTH
de
POUS
está
estabilizada
por
las

hélices
alfa-‐1
y
alfa-‐4,
mientras
que
la
estructura
HTH
de
POUH
está
estabilizada
por
la
hélice

alfa-‐1.

La
capacidad
de
las
proteínas
de
la
familia
POU
para
activar
a
sus
promotores
blanco
está

influenciada
por
varios
factores.
Uno
de
ellos
es
atribuido
a
la
variabilidad
del
linker
entre
los

subdominios,
proporcionando
una
gran
diversidad
de
sitios
de
reconocimiento
en
el
ADN

blanco
por
parte
de
las
proteínas
POU.
El
fragmento
peptídico
linker
entre
los
dominios
se

comporta
como
un
estabilizador
de
los
subdominios
POUS
y
POUH
de
Brn-‐5
(Pereira
&
Kim,

2009).
Además
la
estructura
cristalizada
de
Oct-‐1
sugiere
que
Oct-‐1
no
tiene
una
estructura

rígida,
ya
que
en
los
experimentos
realizados
no
se
logró
localizar
la
presencia
del
linker
en
el

mapa
de
densidad
electrónica.

Por
otro
lado
las
proteínas
de
la
familia
POU
pueden
compartir
sitios
de
unión
preferenciales

Figura
3.
a)
Alineamiento
de
secuencias
de
aminoácidos
de
los
dominios
POU
de
las
proteínas

humanas
Brn-‐5,
Oct-‐1
y
Pit-‐1.
Los
residuos
conservados
están
resaltados
en
letra
negrita.
Los

residuos
de
POUS
y
POUH
implicados
en
los
enlaces
de
puentes
de
hidrógeno
con
el
ADN
están

resaltados.
b)
Representación
esquemática
de
la
estructura
del
dominio
POU
de
Brn-‐5.
El

dominio
POUS
se
muestra
en
color
rosa,
el
enlazador
en
amarillo
y
POUH
en
verde.
Las
hélices

de
los
dominios
POU
están
numeradas
como
se
muestra
en
el
alineamiento
de
la
parte

superior.
(N)
extremo
amino-‐terminal,
(C)
extremo
carboxilo-‐terminal.

Subdominio
específico
-‐
POU

Subdominio
homeo
-‐
POU

9

que
se
traslapan
y
que
son
capaces
de
unirse
a
secuencias
nucleotídicas
con
afinidades

diversas.
Por
ejemplo,
los
factores
Oct-‐1
y
Oct-‐2
reconocen
exactamente
la
misma
secuencia

nucleotídica
encontrada
en
varios
promotores,
y
a
su
vez
el
factor
Pit-‐1
se
une
in
vitro
e
in
vivo

a
esta
secuencia
común
aunque
en
menor
afinidad
(Li
et
al.,
1993).

Los
factores
Oct-‐1,
Brn3a
y
Brn-‐3b
se
unen
a
la
secuencia
del
promotor
viral
URR
en
VPH-‐16,

en
la
secuencia
nucleotídica
atgcaatt.
El
factor
ubicuo
Oct-‐1
se
expresa
en
células
cervicales
lo

que
contribuye
normalmente
a
inhibir
la
actividad
del
promotor
viral
URR
en
VPH-‐16,
contrario

al
efecto
de
Brn3a
(Morris
et
al.,
1993).
Esta
última
proteína
activa
también
al
promotor

inmediato-‐temprano
(Immediate-‐Early)
del
virus
herpes
simplex

(VHS-‐IE3)
por
medio
de
la

secuencia
nucleotídica
tatgarat
(Dawson
et
al.,
1996).

Las
modificaciones
al
contexto
del
sitio
de
unión
a
ADN
también
tienen
efectos
variables.
En
el

caso
del
factor
de
transcripción
Brn3a
en
unión
con
el
promotor
viral
en
VHS-‐IE3,
únicamente

es
necesario
que
se
conserve
el
espacio
entre
los
sitios
de
unión
a
ADN,
efecto
contrario
al

causado
por
Brn-‐3b
(Dawson
et
al.,
1996).
A
diferencia
de
esto
la
represión
de
dicho
promotor

por
Oct-‐2.4
y
Oct-‐2.5
depende
del
contexto
nucleotídico
además
del
espacio
entre
los
sitos
de

unión
(Dawson
et
al.,
1996).

El
dominio
POU
puede
influenciar
su
propia
asociación
con
una
proteína
co-‐reguladora
en
un

sitio
diferente.
Un
buen
ejemplo
es
el
complejo
VP16-‐inducido
que
sirve
como
activador
al

promotor
IE
del
virus
del
herpes
simplex
(Herr
&
Cleary,
1995).
Aunque
el
dominio
POU
se

encuentra
altamente
conservado,
la
región
linker
le
confiere
a
estas
proteínas
la
capacidad
de

adoptar
varias
conformaciones
para
su
unión
con
el
ADN
que
se
traducen
en
cambios

posicionales
y
direccionales
entre
POUS
y
POUH

(Li
et
al.,
1993).
Ensayos
in
vitro
han

demostrado
que
los
efectos
antagonistas
de
las
proteínas
Brn3a
y
Brn-‐3b
son
invertidos
al

intercambiar
la
isoleucina
de
Brn-‐3b
por
la
valina
de
Brn3a
en
la
posición
22
de
la
región
POU

(Morris
et
al.,
1994,
1997).

Debido
al
complejo
proceso
de
reconocimiento
entre
ADN
y
proteínas,
es
importante
realizar

estudios
que
permitan
elucidar
secuencias
exactas
de
interacción
de
Brn3a
con
la
secuencia

URR
de
VPH-‐16
con
el
fin
de
diseñar
nuevas
estrategias
terapéuticas
en
el
combate
contra
el

CaCU.

5.5 Predicción
de
la
estructura
tridimensional
de
una
proteína

Aunque
la
estructura
de
Brn3a
no
se
conoce
experimentalmente,
existe
la
posibilidad
de

inferirla
in
silico
utilizando
modelos
de
predicción.
Existen
varios
métodos
que
permiten

predecir
una
estructura
tridimensional
protéica.
De
forma
general,
se
distinguen
tres
métodos:

1. Modelaje
por
comparación
o
modelaje
por
homología.

2. Modelaje
por
reconocimiento
de
plegamientos.

3. Modelaje
por
predicción
Ab-‐initio.

La
estrategia
utilizada
para
predecir
la
estructura
tridimensional
de
una
proteína
es

determinante
para
obtener
un
buen
modelo
tridimensional,
lo
cual
requiere
generalmente
la

integración
de
varios
de
los
métodos
conocidos
(Ding
et
al.,
2008).

El
estado
de
los
avances
de
los
métodos
de
predicción
de
estructuras
tridimensionales
de

10

proteínas
se
puede
valorar
con
los
experimentos
CASPs
(Critical
Assessment
of
Techniques
for

Protein
Structure
Prediction
o
Evaluación
crítica
de
las
técnicas
de
predicción
de
la
estructura

de
proteínas)
que
son
rondas
donde
se
predice
la
estructura
tridimensional
de
proteínas
y
se

comparan
con
estructuras
tridimensionales
dilucidadas
por
cristalografía
(Jauch
et
al.,
2007;

Ben-‐David
et
al.,
2009).

Actualmente
existen
dos
limitantes
en
los
procesos
de
predicción
y
validación
de
estructuras

tridimensionales,
lo
que
requiere
una
mejora
o
implementación
de
nuevos
métodos.
Primero,

no
se
puede
predecir
cualquier
estructura
in
silico:
durante
la
ronda
experimental
de
2008,
de

las
13
estructuras
tridimensionales
a
predecir,
4
predicciones
no
fueron
aceptables
para

ninguno
de
los
grupos
participantes
(Ben-‐David
et
al.,
2009).
Segundo,
los
criterios
de

evaluación
de
la
similitud
entre
la
predicción
y
la
estructura
experimental
aún
no
están
bien

definidos
(Jauch
et
al.,
2007;
Ben-‐David
et
al.,
2009).

5.5.1 Modelaje
por
homología

El
modelaje
por
homología
permite
predecir
una
estructura
tridimensional
desconocida
de
una

proteína
blanco
por
medio
de
la
comparación
de
su
secuencia
con
secuencias
de
proteínas

templado
cuyas
estructuras
tridimensionales
son
conocidas
(figura
4).
Las
principales
etapas

son:

a. La
selección
de
templados.

b. El
alineamiento
con
la
secuencia
blanco.

Figura
4.
Procedimiento
del
modelaje
por
homología.

11

c. El
refinamiento
para
resolver
las
regiones
de
baja
similitud.

El
modelaje
por
homología
se
utiliza
frecuentemente
con
el
fin
de
descubrir
nuevos

medicamentos
o
para
guiar
experimentos
de
mutagénesis
(Costanzi,
2008).
También
se
utiliza

para
estudios
de
relación
de
estructura
–
actividad
(QSAR),
los
cuales
buscan
relaciones

cuantitativas
entre
actividad
y
estructura
de
una
biomolécula
(Costanzi,
2008).

El
proceso
de
alineamiento
de
secuencias
es
crítico.
Rost
determinó
que
si
la
identidad
de
las

secuencias
en
los
alineamientos
es
del
30%,
el
90%
de
los
modelos
que
sean
predichos
por

homología
serán
acertados,
mientras
que
si
esta
identidad
es
del
20%
sólo
el
10%
de
los

modelos
serán
acertados,
a
esta
característica
Rost
la
denominó
la
zona
de
incertidumbre

(Rost
1999).
Si
se
obtienen
valores
mayores
al
50%
de
identidad
entre
la
secuencia
de
las

proteínas
blanco
y
de
las
proteínas
templado
se
producen
predicciones
de
alta
calidad
(hasta

3Å
de
resolución).
Por
el
contrario,
valores
de
25
a
30%
de
identidad
producen
predicciones

propensas
a
presentar
errores
(Floudas
et
al.,
2006).

El
programa
3D-‐Coffe
(O’Sullivan
et
al.,
2004)
permite
un
mejor
alineamiento
secuencia-‐
estructura
en
comparación
con
otros
programas,
particularmente
para
identidades
por
debajo

del
50%
(Dalton
&
Jackson,
2007).
En
las
estructuras
complejas
los
pasos
de
refinamiento

permiten
mejorar
la
predicción
hasta
0.5
Å.

En
comparación
con
SWISS-‐MODEL
(Schewede
et
al.,
2003)
o
Builder
(Koehl
&
Delarue,
1994),

Modeller
(Sali
&
Blundell,
1993),
SegMod/ENCAD
(Levitt,
1992)
y
Nest
(Petrey
et
al.,
2003)
son

los
programas
que
presentan
mejores
resultados
en
cuanto
a
resolución
y
predicción
de
los

modelos
tridimensionales
(Wallner
&
Elofsson,
2005),
siendo
éste
último
el
que
mejor
resuelve

las
estructuras
tipo
bucle
(Dalton
&
Jackson,
2007).

5.5.2 Modelaje
por
reconocimiento
de
plegamientos

El
método
de
reconocimiento
de
plegamientos
asume
que
las
estructuras
tridimensionales
de

las
proteínas
están
más
conservadas
que
las
secuencias.
Existen
diversas
técnicas
para
llevar
a

cabo
dicho
reconocimiento,
tales
como
la
predicción
de
estructuras
secundarias
y

comparaciones
avanzadas
de
secuencias
o
pruebas
de
compatibilidad
de
secuencias
con
un

plegamiento
tridimensional
conocido
(Floudas
et
al.,
2006).
Estos
métodos
han
tenido
éxito
en

los
experimentos
CASPs
(Jauch
et
al.,
2007;
Ben
–David
et
al.,
2009).

Este
método
asegura
que
la
secuencia
es
compatible
con
cualquiera
de
los
miembros
de
un

conjunto
de
estructuras
proteicas
conocidas.
Esto
se
produce
al
colocar
los
residuos

“desconocidos”
de
la
proteína
a
lo
largo
de
la
cadena
principal
de
una
estructura

tridimensional
de
una
proteína
conocida,
para
luego
determinar
la
estabilidad
de
las
cadenas

laterales
de
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
desconocida
en
esa
disposición
y
luego

deslizar
la
secuencia
de
la
proteína
que
no
se
conoce
su
estructura
a
lo
largo
de
la
proteína

que
sí
se
conoce
su
estructura
tridimensional,
esto
se
realiza
residuo
por
residuo
repitiendo
el

cálculo
(Voet,
2006).

5.5.3 Modelaje
por
predicción
Ab-‐initio

El
modelaje
por
predicción
Ab-‐initio
consiste
en
encontrar
la
estructura
tridimensional
proteica

12

más
estable
que
corresponde
a
la
conformación
que
posee
la
menor
energía
libre
según
la

hipótesis
de
Anfinsen
(Anfinsen,
1973).
Este
método
se
utiliza
con
cualquier
secuencia,

independientemente
al
conocimiento
previo
de
la
estructura,
permitiendo
así
predicciones
de

novo.
En
este
método
se
utilizan
primero
campos
de
fuerza
simplificados
en
los
cuales
se

mueven
los
residuos,
seguido
por
un
refinamiento
con
un
potencial
de
átomos
totales
(Fluodas

et
al.,
2006;
Jamal
Rahi
et
al.,
2008;
Shaeffer
et
al.,
2008;
Rohs
et
al.,
2009).

Estos
modelos
tratan
de
predecir
la
estructura
tridimensional
desconocida
de
una
proteína

comenzando
desde
cero,
y
se
basan
en
principios
físicos
con
los
cuales
se
construyen

algoritmos
que
intentar
imitar
el
plegado
de
las
proteínas,
o
bien
pueden
aplicar
un
método

estocástico
para
buscar
la
conformación
más
estable
termodinámicamente.
Este
método

requiere
de
vastos
recursos
computacionales,
como
las
supercomputadoras,
puesto
que
la

cantidad
de
información
a
procesar
es
enorme,
esto
además
los
vuelve
muy
costosos

6. Metodología

6.1 Materiales
y
equipo

Se
utilizaron
dos
sistemas
operativos
diferentes,
el
primer
sistema
operativo
fue
Mac
OS

X

Mavericks
10.9.2
ejecutado
en
una
Apple
Mac
Book
Pro
con
un
procesador

Intel
Core
i5
de

2.5
GHz
con
8
Gb
de
RAM,
el
segundo
sistema
operativo
fue
Red
Hat
Enterprise
Linux
Server

release
6.2
ejecutado
remotamente
en
el
clúster
de
Supercómputo
del
IPN
en
el
equipo
IBM

iDataPlex

denominado
Thubat
Kaal
con
los
siguientes
procesadores:
Intel
Xeon
8-‐core
E5-‐
2680
a
2.7
GHz,
Intel
Xeon
8-‐core
a
2.7
GHz,
2
CPU's
Intel
Xeon
8-‐core
a
2.7
GHz
y
2
CPU's
Intel

Xeon
8-‐core
a
2.7
GHz
con
288
Gb
de
RAM.

6.2 Estrategia
General

En
primer
lugar
se
construyo
y
valido
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
utilizando

modelaje
por
homología
con
el
programa
Modeller
y
validado
por
MolProbity
y
QMEAN.

Posteriormente
se
construirá
el
modelo
tridimensional
de
la
interacción
de
la
proteína
Brn3a

con
una
secuencia
nucleotídica
similar
a
la
región
URR
de
VPH-‐16
empleando
el
programa

Modeller
se
construyo
el
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
en
formato
PDB
unida
a

la
secuencia
nucleotídica
descrita
en
el
archivo
PDB
de
clave
1AU7.
Con
el
programa
X3DNA,
se

mutaron
las
secuencias
nucleotídicas
del
modelo
tridimensional
de
interacción
proteína-‐ADN,

las
mutaciones
fueron
con
el
objeto
de
que
hacer
coincidir
a
la
secuencia
con
la
secuencia

nucleotídica
de
la
región
URR
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16.
De
esta
manera
se
obtuvieron

tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de

los

tres
subtipos
de
VPH-‐16
subtipo
1,
subtipo
2
y
subtipo
3
los
cuales
se
validaron
con
los

programas
MolProbity
y
QMEAN.
Se
optimizaron
los
tres
modelos
tridimensionales
de

interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-‐16
empleando
un
proceso
de

minimización
de
energía
con
el
programa
Amber
12.
Por
último
se
calcularon
las
energías
de

interacción
del
complejo
proteína-‐ADN.

13

6.3 Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional

de
la
proteína

Brn3a

La
estructura
terciaria
de
Brn3a
fue
elucidada
in
silico
mediante
un
modelo
de
homología.
Se

determinó
una
estructura
tridimensional
templado
mediante
la
herramienta
Blastp
del

National
Center
for
Biotechnology
Information
(NCBI)
empleando
la
secuencia
aminoácidica
de

Brn3a
(clave
GenBank
NP_006228)
contra
la
base
de
datos
de
estructuras
tridimensionales

PDB
del
Protein
Data
Bank.
Se
descartaron
las
estructuras
tridimensionales
cuya
secuencia

aminoácidica
presenten
una
identidad
menor
al
30%
con
la
secuencia
de
Brn3a.
De
las

estructuras
tridimensionales,
se
eligió
a
la
plantilla
que
presento
la
mayor
identidad
en

secuencia
con
Brn3a
y
que
a
su
vez
presento
la
mejor
estructura
experimental
en
cuanto
a

resolución
cristalográfica,
y
su
secuencia
se
alineo
con
la
secuencia
de
Brn3a.
Se
calculo
o

predijo
el
modelo
tridimensional
de
Brn3a
con
el
programa
Modeller.
El
modelo
fue
evaluado

utilizando
los
programas
MolProbity
y
QMEAN
(Benkert
et
al.,
2009).

Se
ejecutaron
todos
los
comandos
desde
la
terminal
del
equipo
de
cómputo,
en
este
caso
se

utilizó
el
sistema
operativo
de
Unix
con
la
versión
de
Ubuntu
10.4,
así
como
Mac
OS
X
versión

10.8.2
Lion.
En
ambos
sistemas
se
realizaron
todos
los
comandos
del
programa
Modeller
con
la

misma
versión
del
programa,
la
versión
9.11.

Todos
los
comandos
del
programa
Modeller
ejecutan
programas
específicos
los
cuales
se

escribieron
en
el
lenguaje
de
programación
Python.
Este
lenguaje
de
alto
nivel
posee
una

sintaxis
muy
limpia
que
favorece
a
que
el
código
sea
legible.
Además
tiene
licencia
de
código

abierto
la
cual
es
compatible
con
la
licencia
pública
general
de
GNU
en
que
basan
los
sistemas

Unix.

Se
ejecutaron
los
comandos
de
modelado
básico
del
programa
Modeller.
Una
vez
obtenido
el

modelo,
se
utilizó
el
programa
Loop-‐refine
para
corregir
los
bucles
en
la
estructura

tridimensional
de
la
proteína
y
se
validó
el
modelo
construido
con
los
programas
Molprobity
y

QMEAN.
El
modelo
fue
aceptable
según
los
criterios
de
validación
obtenidos
en
dichos

programas

y
se
procedió
al
próximo
paso.

6.4 Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la

estructura
tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de

VPH-‐16

6.4.1 Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la

región
URR
de
VPH-‐16

Se
utilizó
la
conformación
estructural
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
determinada

previamente
y
se
estableció
la
estructura
de
Brn3a
en
interacción
con
la
secuencia
de
unión
a

la
variante
1
del
VPH-‐16
con
el
software
Modeller.
Se
usó
el
programa
Ligand
el
cual
genero
un

modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
unida
a
la
secuencia
nucleotídica
extraída
de
un

archivo
PDB
de
clave
1AU7.
Esta
clave
corresponde
a
la
estructura
tridimensional
de
la

proteína
con
mayor
identidad
a
Brn3a
por
ello
sirvió
como
modelo
base.
Con
el
programa

X3DNA
se
mutó
la
secuencia
nucleotídica
del
modelo
de
interacción
ADN-‐proteína
(Brn3a-‐
ADN)
para
obtener
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
VPH-‐16.
El
programa
X3DNA
se

ejecutó
desde
la
terminal
del
equipo
de
cómputo
y
se
usó
el
comando
mutate
bases
de

X3DNA.
En
el
comando
a
ejecutar
se
especifico
en
primer
lugar
la
cadena
del
modelo

14

tridimensional
en
formato
PDB
donde
se
realizó
el
cambio,
en
segundo
lugar
el
número
del

nucleótido
a
mutar
y
en
tercer
lugar
se
escribió
con
una
letra
el
código
del
nucleótido
que

sustituyo
al
que
se
desea
mutar.
El
resultado
generó
un
nuevo
modelo
tridimensional
en

formato
PDB.
Para
lograr
mutar
todos
los
nucleótidos
necesarios
se
repitió
el
proceso
anterior,

nucleótido
por
nucleótido,
generando
un
nuevo
modelo
por
cada
mutación
utilizando
el

modelo
PDB
previamente
creado.
Este
paso
se
repitió
generando
las
secuencias

correspondientes
a
los
demás
subtipos
de
VPH-‐16.
Se
emplearon
los
parámetros
del
campo
de

fuerza
CHARMM.

6.4.2 Determinación
de
la
energía
del
complejo
proteína-‐ADN

Se
utilizó
el
programa
Amber
12
con
el
campo
de
fuerza
parm99,
y
un
modelo
de
agua

implícito.
No
se
aplicó
un
de
punto
de
exclusión.
Para
evitar
choques
estéricos,
se
permitió
el

reacomodo
libre
de
átomos
de
hidrógeno
y
bases
nucleicas.
Se
limitó
el
movimiento
de
la

proteína
y
la
cadena
de
ADN
mediante
muelles
con
una
constante
de
1.0
kcal/mol.
Previo
al

cálculo
de
la
energía,
se
aplicaron
2500
pasos
de
minimización
con
el
método
“steepest

descent”
y
2500
pasos
de
minimización
con
el
método
del
gradiente
conjugado
para
asegurar

la
convergencia
de
los
modelos
generados.
Se
realizó
el
paso
anterior
para
cada
conformación

a
analizar
(complejo
ADN-‐proteína
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16).

6.5 Optimización
y
cálculo
de
la
energía
de
interacción
de
los
modelos

tridimensionales
de
interacción
de
Brn3a
con
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16

Se
optimizaron
los
procesos
de
predicción
de
estructura
y
de
cuantificación
de
las
energías
de

interacción
utilizando
algoritmos
de
rápida
predicción
(Wolf
&
de
Leeuw
2008;
Ding
et
al.,

2008).
Asimismo,
se
optimizo
la
ejecución
paralela
de
los
modelos
en
un
cluster.
Para
ello
se

uso
el
programa
Amber
que
es
un
software
especializado
en
dinámica
molecular
que
puede

simular
ecuaciones
Newtonianas
para
sistemas
con
millones
de
partículas
y
está
diseñado

especialmente
para
biomoléculas
como
proteínas,
lípidos
y
ácidos
nucleicos.
Amber
se
ejecutó

desde
la
terminal
puesto
que
no
posee
interfaz
gráfica.
Se
utilizó
el
archivo
PDB
obtenido
del

paso
anterior
con
Amber,
el
cual
contenía
la
estructura
tridimensional
de
la
interacción
entre

Brn3a
y
la
región
URR
de
VPH-‐16,
y
se
cuantificaron
las
energías
de
interacción
de
Brn3a
con
la

región
URR
de
los
tres
subtipos
VPH-‐16.
Con
este
proceso
se
optimizo
el
modelo

tridimensional

y
se
corrigieron
regiones
de
plegamiento.

15

7. Resultados

7.1 Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional

de
la
proteína

Brn3a.

Se
genero
1
archivo
dentro
de
una
carpeta
denominada
Modelaje_básico
ver
figura
5,

en
esta

carpeta
se
encontraba
la
secuencia
aminoácidica
de
Brn3a
bajo
el
nombre
de
Brn3a.ali,
esta

secuencia
se
uso
para
generar
el
archivo
pdb_95.fas
el
cual
contiene
todas
la
secuencias

obtenidas
mediante
la
herramienta
BLAST
de
página
web
del
National
Center
for

Biotechnology
information
(NCBI),
las
secuencias
se
guardaron
en
formato
PIR.
La
subcarpeta

Atom_files
dentro
de
la
carpeta
Modelaje_básico
contenía
los
archivos
pdb
con
las

coordenadas
en
el
espacio
de
los
átomos
que
conforman
las
estructuras
tridimensionales

obtenidas
mediante
la
herramienta
BLAST.

Figura
5.
Esquema
que
presenta
en
forma
de
jerarquía
las
rutas
de
acceso
a
los
archivos

ejecutables
del
presente
trabajo,
de
esta
manera
se
ordenaron
las
carpetas
contenidas
dentro

del
directorio
Modelaje_básico.

En
la
figura
6
se
muestra
la

los
resultados
obtenidos
por
la
herramienta
BLAST
donde
se

muestran
las
dos
familias
de
proteínas
relacionadas
a
los
dominios
presentes
en
la
secuencia

de
Brn3a,
localizados
mediante
la
herramienta
BLASTp
en
la
página
web
del
National
Center

for
Biotechnology
information
(NCBI)
empleando
la
secuencia
aminoácidica
de
Brn3a
(clave

GenBank
NP_006228)
contra
la
base
de
datos
de
estructuras
tridimensionales
pdb
del
Protein

Data
Bank
(PDB).
Los
dominios
fueron
identificados

comparando
la
secuencia
aminoácidica

contra
la
base
de
datos
CDD
(Conserved
Domain
Database
)
de
BLASTp
y
solo
se
mostraron
los

que
estaban
en
la
base
de
datos
del
PDB.
Se
obtuvieron
109
secuencias
blanco
de
las

que
se

seleccionaron
solo
51

debido
a
que
el
resto
se
encontraba
debajo
de
la
zona
de

incertidumbre.
En
la
figura
6
se
observan
los
dos
subdominios
conservados
en
la
región
final

de
la
proteína
uno
de
ellos
es
el
subdominio
POU
y
otro
el
homeodominio,
la
imagen
muestra

que
este
subdominio
realiza
interacciones
directas
con
el
ADN
como
lo
describen
los

antecedentes.

Figura
6.
Dominios

y
familias
de
proteínas
relacionadas
a
los
dominios
presentes
en
la

secuencia
de
Brn3a,
la
familia
POU
a
la
izquierda
y
la
familia
de
los
homeodominios
a
la

derecha,
descritos
en
la
base
de
datos
"Conserved
Domains"
del
NCBI
y
localizados
mediante

la
herramienta
BLASTp.

Modelaje
_basico

Brn3a.ali

pdb_95.fas

Atom_Biles

16

En
la
tabla
2
se
presentan
las
20

claves
de
los
archivos
pdb
que
contienen
las
coordenadas
en

el
espacio
de
los
átomos
que
conforman
las
estructuras
tridimensionales.
Las
claves
pdb
de
las

proteínas
fueron
obtenidas
mediante
la
herramienta
BLASTp.
Comparando
la
secuencia

aminoácidica
de
Brn3a
contra
la
base
de
datos
de
estructuras
tridimensionales
pdb
del
Protein

Data
Bank.
Las
secuencias
aminoácidicas
fueron
filtradas
para
seleccionar
a
las
proteínas
1AU7

y
2XSD
como
los
mejores
modelos
de
acuerdo
a
su
identidad
y
valor
E
contra
Brn3a.
La

identidad
(mayor
identidad
se
obtiene
un
modelo
más
preciso)
y
el
valor
E
(mas
cercano
a
0
se

obtiene
un
modelo
más
preciso)
son
los
dos
principales
criterios
para
seleccionar
la
mejor

plantilla
para
generar
el
modelo
tridimensional
de
Brn3a.

Tabla
2:
Lista
de
las
20
proteínas
con
mayor
identidad
y
valor
E
mas
alto,
listadas
por
su
clave

pdb
generado
por
el
archivo
ejecutable
build_profile.py
obtenidas
de
Modeller.

*
Se
abreviaron
los
encabezados
de
la
segunda
y
tercera
columna
con
el
número
1
y
número
2,
el
1
es
el
número
de
residuos

aminoácidicos
de
la
secuencia,
el
2
es
el
numero
de
iteraciones
del
algoritmo
de
Modeller.

Se
construyo
una
matriz
de
distancias.
De
la
tabla
anterior
se
seleccionaron
los
6
archivos
pdb

que
contienen
las
coordenadas
en
el
espacio
de
los
átomos
que
conforman
las
estructuras

tridimensionales
que
presentaron
mayor

identidad
a
la
secuencia
aminoácidica
de

Brn3a.
El

triángulo
superior
muestra
el
número
de
residuos
idénticos
a
la
secuencia
aminoácidica
de

Brn3a,
el
triángulo
inferior
muestra
el
%
de
identidad
en
secuencia.

Tabla
3:
Matriz
de
distancias
de
identidad
de
secuencia,
se
presenta
la
clave
del
archivos
pdb

que
presentaron
mayor
identidad
en
secuencia
a
Brn3a.

Columna1
1AU7
2XSD
1CQTA
1OCTC
3L1PA
3L1PB

1AU7
130
1
1
2
1
1

2XSD
1
128
8
9
11
11

1CQTA
1
6
129
106
74
74

1OCTC
2
7
82
131
70
70

3L1PA
1
9
57
53
145
142

3L1PB
1
9
57
53
98
147

Código
PDB

1
2

N°
de
residuos
Inicio
de
alineamiento

Fin
del
alineamiento

Puntaje
Identidad
Valor
E

1AU7
165
5
153
22
165
141
54
9.60E-‐05

1CQTA
183
2
152
27
181
148
47
7.00E-‐05

1CQTB
185
2
152
29
183
148
47
6.90E-‐05

1E3O
179
2
152
23
178
148
47
1.30E-‐04

1GT0C
178
2
152
23
177
148
46
1.20E-‐04

1HF0A
178
2
152
23
177
148
46
1.20E-‐04

1HF0B
178
2
152
23
177
148
46
1.20E-‐04

1O4XA
186
2
152
27
181
148
48
5.40E-‐05

1OCTC
175
3
152
20
173
147
47
7.90E-‐05

2XSDC
185
6
152
35
178
143
54
1.20E-‐05

3D1NI
172
6
150
26
170
142
41
2.10E-‐03

3D1NJ
171
6
150
25
169
142
41
2.10E-‐03

3D1NK
172
6
150
26
170
142
41
2.10E-‐03

3D1NL
172
6
150
26
170
142
41
2.10E-‐03

3D1NM
172
6
150
26
170
142
41
2.10E-‐03

3D1NN
173
6
150
27
171
142
41
2.10E-‐03

3D1NO
170
6
150
24
168
142
41
2.10E-‐03

3D1NP
173
6
150
27
171
142
41
2.10E-‐03

3L1PA
175
5
151
30
173
141
51
3.70E-‐04

3L1PB
175
5
151
30
173
141
51
3.70E-‐04

17

La
tabla
4
presenta
los
dos
criterios
de
inclusión
principales
para
seleccionar
el
archivo
pdb

que
se
usara
como
modelo
para
construir
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a.

Debido
al

valor
que
presentó
2XSD
y
1AU7
en
cuanto
a
identidad
de
secuencia
y
resolución

cristalográfica
se
seleccionaron
como
los
mejores
modelos
para
construir
la
estructura

tridimensional
de
Brn3a.
El
valor
de
resolución
cristalográfica
permite
construir
una
estructura

tridimensional
más
precisa
por
modelaje
con
homología
cuando
el
valor
es
mas
cercano
a
0.

Tabla
4:
Criterios
para
seleccionar
el
archivo
pdb
que
servirá
como
modelo
para
construir
la

estructura
tridimensional
de
Brn3a.

La
tabla
5
se
usó
para
comparar
y
seleccionar
el
archivo
pdb
con
que
se
construyó
la
estructura

tridimensional
de
Brn3a.
El
valor
R
fue
uno
de
los

criterios
más
importantes
para
seleccionar

al
archivo
pdb.
Los
valores
cristalográficos
los
cuales
son
el
valor
R
y
la
resolución

cristalográfica
cuando
el
valor
es
mas
cercano
a
0
se
obtienen
modelos
más
precisos
cuando
se

utiliza
el
modelaje
por
homología.
El
factor
R
es
una
medida
de
las
diferencias
en
los
patrones

de
difracción
observados
y
calculados.
Entre
más
pequeño
sea
este
valor
mejor
se
ajusta
el

modelo
a
los
datos
experimentales
(se
desea
que
el
factor
R
<
0.2).
La
identidad
de
la

secuencia
de
ADN
que
se
encuentra
en
el
archivo
pdb
2XSD
con
la
secuencia
nucleotídica
de
la

región
URR
de
VPH16
(identidad
de
secuencia
70%)
fue
el
factor
definitivo
para
seleccionar
el

archivo
pdb
2XSD.

Tabla
5:
Evaluación
mediante
los
3
criterios
de
inclusión
para
escoger
la
mejor
estructura

tridimensional
para
construir
el
modelo
de
Brn3a.

Se
muestran
con
un
*
los
criterios
cristalográficos.

Los
modelos
tridimensionales
en
formato
PDB
generados
por
Modeller
utilizando
el
archivo

pdb
2XSD
se
presentan
en
la
tabla
6
con
sus
respectivos
perfiles
energéticos,
debido
a
su

importancia
los
perfiles
DOPE
(mientras
más
pequeño
el
valor
es
mas
estable

termodinámicamente)
y
GA341
(más
cercano
a
1
es
mas
preciso
el
modelo
tridimensional)
se

seleccionó
a
Brn3a.B99990003.pdb
como
el
mejor
modelo
tridimensional
construido
por
el

programa.
El
valor
DOPE
es

Código
PDB

Resolución

cristalográfica

Porcentaje
de
Identidad

en
secuencia

1AU7
2.3
Å
54

2XSD
2.0

Å
54

1CQTA
3.2

Å
47

1OCTC
3.0

Å
48

3L1PA
2.8

Å
51

3L1PB
2.8

Å
51

Archivo
PDB
Valor
R*
Resolución
cristalográfica*
Identidad
a
Brn3a

1AU7
0.23
2.3

Å
54

2XSD
0.198
2.05

Å
54

18

Tabla
6:
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por

Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
Modeller.

La
estructura
número
4
(Brn3a.B99990004.pdb)
fue
seleccionada
debido
a
su
valor
DOPE
y

GA341
para
construir
el
modelo
de
Brn3a
en
interacción
con
el
DNA.

El
análisis
de
validación

de
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
se
presenta
en
la
figura
7
donde
la
energía
DOPE
se

muestra
por
residuo
aminoácidico
de
Brn3a
contra
la
estructura
de
2XSD.
Esta
gráfica
es
el

resultado
de
la
minimización
de
energía
de
los
bucles
en
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a

tras
ser
corregidos
por
el
archivo
ejecutable
looprefine.py.

El
modelo
construido
y
optimizado

se
validó
con
los
programas
Molprobity
y
QMEAN.
Acorde
con
los
criterios
de
QMEAN
el

modelo
presentó
errores
en
6
Å
en
la
región
interdominio.
Igualmente
fuerón
identificados
por

Molprobity.
Los
rotámeros
erróneos

y
choques
estéricos
fueron
corregidos
con
la

optimización
del
modelo
con
el
programa
Amber.

MODELO
MOLPDF
DOPE
GA341

Brn3a.B99990001.pdb
1665.54187
-‐13961.95605
1

Brn3a.B99990002.pdb
2703.74683
-‐12594.87891
1

Brn3a.B99990003.pdb
1819.4043
-‐14326.72559
1

Brn3a.B99990004.pdb
1691.96265
-‐13392.82422
1

Brn3a.B99990005.pdb
1916.22791
-‐13456.32715
1

Brn3a.B99990006.pdb
1801.36853
-‐13854.13574
1

Brn3a.B99990007.pdb
1788.70483
-‐13771.97559
1

Brn3a.B99990008.pdb
1722.06458
-‐14091
1

Brn3a.B99990009.pdb
2736.51709
-‐12917.14258
1

Brn3a.B99990010.pdb
1891.42981
-‐14097.02832
1

Figura
7.
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
comparado
con
la

estructura
PDB
2XSD
usada
como
modelo
base.
La
región
enmarcada
por
el
rectángulo

corresponde
al
bucle
de
la
región
interdominios
donde
se
presenta
un
incremento
de

energía.

Posición
del

alineamiento

Puntaje
DOPE
por
residuo

19

7.2 Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la

estructura
tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de

VPH-‐16

7.2.1 Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la

región
URR
de
VPH-‐16

En
la
tabla
7
se
presentan
los
nombres
de
los
archivos
pdb
de
los
modelos
tridimensionales
de

la
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
secuencia
de
ADN
parecida
a
la
región
URR
de
VPH-‐
16
y
obtenida
del
archivo
pdb
2XSD
generados
por
Modeller
utilizando
el
script
ligand.py
con

sus
respectivos
perfiles
energéticos.
Estos
modelos
PDB
se
encuentran
unidos
al
DNA
el
cual

fue
copiado
del
modelo
PDB
1AU7
por
su
identidad
en
secuencia
a
la
región
URR
de
VPH-‐16,

los
perfiles
DOPE

y
GA341
se
presentan
en
la
tercera
y
cuarta
columna
respectivamente.
Se

seleccionó
a
Brn3a.B99990001.pdb
como
el
mejor
modelo
tridimensional
construido
por
el

programa
debido
a
su
puntuación
del
parámetro
DOPE
(el
menor)
y
GA341
(igual
a
1).

Tabla
7:
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por

Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo

ejecutable
ligand.py.

El
análisis
de
validación
del
archivo
pdb
Brn3a.B99990001
que
contiene
la
estructura

tridimensional
de
Brn3a
en
unión
a
la
secuencia
nucleotídica
similar
a
la
región
URR
de
VPH-‐16

se
presenta
en
la
figura
8.
La
energía
DOPE
se
muestra
por
residuo
aminoacídico
de

Brn3a

contra
la
estructura
de
2XSD.
Esta
gráfica
es
el
resultado
de
la
minimización
de
energía
de
los

bucles
en
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
tras
ser
corregidos
por
el
archivo
ejecutable

looprefine.py.
La
región
C
terminal
de
Brn3a

mostró
un
incremento
de
la
energía
por
un

arreglo
termodinámicamente
desfavorable
de
los
aminoácidos.

MODELO
MOLPDF
DOPE
GA341

Brn3a.B99990001.pdb
1993.96
-‐11974.69
1

Brn3a.B99990002.pdb
1882.40
-‐11190.74
1

Brn3a.B99990003.pdb
2070.81
-‐11818.44
1

Brn3a.B99990004.pdb
1958.50
-‐11888.73
1

Brn3a.B99990005.pdb
2019.44
-‐11294.67
1

Brn3a.B99990006.pdb
1976.97
-‐11759.99
1

Brn3a.B99990007.pdb
1922.72
-‐11242.20
1

Brn3a.B99990008.pdb
1987.85
-‐11897.29
1

Brn3a.B99990009.pdb
2056.30
-‐11277.06
1

Brn3a.B99990010.pdb
1993.80
-‐11451.67
1

20

Figura
8:
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
de
la
nueva
estructura
PDB

Brn3a.B99990001

la
cual
se
encuentra
en
interacción
con
el
ADN
(azul)
obtenido
de
el
archivo

pdb
2XSD,
comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
(verde)
usada
como
modelo
comparativo,
la

región
enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
a
la
región
interdominio
donde
presenta
un

incremento
de
energía.

En
la
tabla
8
se
presentan
los
archivos
pdb
que
contienen
los
modelos
tridimensionales

construidos
en
primer
ciclo
de
refinamiento
estructural
generados
por
Modeller
utilizando
el

script
loop-‐refine.py.
El
script
loop-‐refine.py
funciona
mediante
una
minimización
energética

por
un
método
iterativo.
Se
modeló
la
región
que
abarca
del
aminoácido
70
al
105.
El

programa
loop-‐refine.py
generó
10
estructuras
tridimensionales
optimizando
la
región

interdominio.
La
estructura
con
un
valor
DOPE
de
-‐12779.72
y
GA341

de
1
fue
el
mejor
modelo
creado
tal
como
se
presenta
en
la
tercera
y
cuarta
columna

respectivamente.

Tabla
8:
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por

Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo

ejecutable
loop-‐refine.py.

MODELO
MOLPDF
DOPE
GA341

1993.96
-‐11837.82
1

1882.40
-‐11852.94
1

2070.81
-‐12186.81
1

1958.51
-‐10818.17
1

2019.44
-‐10147.17
1

1976.97
-‐12779.72
1

1922.73
-‐12259.41
1

1987.86
-‐11678.15
1

2056.30
-‐10671.55
1

1993.80
-‐10687.07
1

Puntaje
DOPE
por
residuo

Posición
del

alineamiento

21

En
la
figura
9
se
muestra
el
gráfico
de
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
del
nuevo
archivo

pdb
Brn3a.BL0006001
el
cual

fue
el
modelo
de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
seleccionado.

Se
compara

el
modelo
actual
contra
el
modelo

anterior
Brn3a.B99990001
y
contra
el
archivo

pdb
2XSD
usado
como
control.
Se
observa
claramente
como
se
optimizo
mediante

una

minimización
energética
la
región
interdominio.
La
región
C
terminal
del
archivo
pdb

Brn3a.BL0006001
mostró
un
incremento
de
la
energía
por
un
arreglo
termodinámicamente

desfavorable
de
los
aminoácidos.

Figura
9:
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
de
la
nueva
estructura
PDB

Brn3a.BL0006001
el
cual

fue
el
mejor
modelo
de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN

denominado
Brn3a-‐looprefine
(rojo),
comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
(verde)
usada

como
control
o
modelo
comparativo,
en
azul
se
muestra
el
modelo
previo
sin
el
proceso
de

refinamiento
de
bucle,
la
región
enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
al
bucle
en
la

región
C
terminal
del
archivo
pdb
Brn3a
la
cual
muestra
un
incremento
de
la
energía
por
un

arreglo
termodinámicamente
desfavorable
de
los
aminoácidos.

En
la
tabla
9
se
presentan
los
modelos
tridimensionales
del
segundo
ciclo
de
refinamiento

estructural
generados
por
Modeller
utilizando
el
script
loop-‐refine.py.
Se
modeló
la
región
que

abarca
del
aminoácido
150
al
158
(C
terminal).
El
programa
loop-‐refine.py
generó
10

estructuras
tridimensionales
optimizando
la
región
C
terminal.
La
estructura

fue
seleccionada
por
su
valor
DOPE
con
un
total
de
-‐12953.200195
y

GA341
de
1
como
se
muestra
en
la
tercera
y
cuarta
columna
respectivamente.

Puntaje
DOPE
por
residuo

Posición
del

alineamiento

22

Tabla
9:
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por

Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo

ejecutable
loop-‐refine.py.

En
la
figura
10
se
muestra
el

gráfico
de
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
del
nuevo
archivo

pdb
Brn3a.BL0004001
el
cual

fue
el
modelo
de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
seleccionado.

Se
compara

el
modelo
actual
contra
el
modelo

anterior
Brn3a.B99990001
y
contra
el
archivo

pdb
2XSD
usado
como
control.
Se
puede
observar
como
se
optimizó
el
perfil
energético

derivado
de
un
plegamiento
termodinámicamente
estable
de
la
región
C
terminal
de
el

modelo
previo.

Figura
10.
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
comparado
con
el
archivo

pbb
2XSD
como
control
presentado
en
verde,
en
rojo
se
muestra
el
modelo

de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
denominado
Brn3a-‐looprefine

(rojo),
en
azul
se
muestra
el
archivo
pdb
que
contiene
el
modelo
previo
Brn3a.B99990001
sin

el
proceso
de
refinamiento
de
bucle
denominado
Brn3aligand.

MODELO
MOLPDF
DOPE
GA341

1993.96
-‐12548.38
1

1882.40
-‐12781.05
1

2070.81
-‐12638.90
1

1958.51
-‐12953.20
1

2019.44
-‐12783.43
1

1976.97
-‐12540.14
1

1922.73
-‐11740.19
1

1987.86
-‐12320.75
1

2056.30
-‐12727.31
1

1993.80
-‐11835.12
1

Puntaje
DOPE
por
residuo

Posición
del

alineamiento

23

Para
validar
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
en
interacción
con
el
DNA
se
usaron
los

programas
Molprobity
y
QMEAN.
Los
valores
obtenidos
en
la
página
web
QMEAN
del
Instituto

Suizo
de
bioinformática
fueron
los
mencionados
a
continuación.
El
modelo
generado
presentó

una
estructura
más
estable
en
la
región
interdominio
entre
los
dos
dominios
respecto
al

modelo
tridimensional
de
Brn3a
que
no
incluía
el
ADN
como
se
muestra
en
la
figura
11.
El

error
de
plegamiento
se
disminuyó
a
4
Å
en
la
región
interdominio.
Un
valor
Z
=
0.03.
El
valor
Z

representa
una
estimación
de
la
calidad
absoluta
del
modelo
relacionándola
con
las

puntuaciones
obtenidas
por
las
estructuras
de
referencia
resueltas
experimentalmente

mediante
cristalografía
de
rayos
X.
El
valor
Z
mientras
más
cercano
a
0
es
un
modelo
más

similar
a
los
modelos
resueltos
experimentalmente
por
cristalografía
de
rayos
X.
Un
valor

global
QMEAN
=
0.753%
(mientras
mas
cercano
a
1
es
más
adecuado).
La
función
de

puntuación
QMEAN
estima
la
calidad
global
de
los
modelos
en
base
a
la
combinación
de
seis

descriptores
estructurales
(torsión,
solvatación,
desviaciones
de
carbonos
β,
relación
SSE
y

relación
ACC)
.
El
primer
valor
obtenido
fue
el
valor
de

torsión
fue
de
-‐1.25
(indica
si
los

ángulos
Ψ
(psi)
y

Φ
(phi)

están
en
una
conformación
correcta).
El
valor
de
solvatación
fue
de
-‐
1
(mientras
mayor
a
0
es
un
valor
más
adecuado)
el
cual
indica
el
grado
de
exposición
de
los

aminoácidos.
El
valor
de
las
desviaciones
de
carbonos
β
fue
de
-‐1.33
(mientras
mayor
a
0
es
un

valor
más
adecuado).
El
valor
de
carbonos
β
indica
si
la
interacciones
de
los
carbonos
son

adecuadas.
El
valor
de
interacción
de
los
átomos
fue
de
0.63
(mientras
mayor
a
0
es
un
valor

más
adecuado).
El
valor
de
interacción
de
todos
los
átomos
indica
si
hay
impedimentos

estéricos
en
la
conformación.
La
relación-‐SSE
la
cual
es
la
correlación
entre
la
estructura

secundaria
predicha
de
la
secuencia
blanco
(con
el
programa
PSIPRED)
y
la
estructura

secundaria
calculada
del
modelo
(con
el
programa
DSSP)
fue
de
-‐0.40
(mientras
mayor
a
0
es

un
valor
más
adecuado).
El
valor
de
relación-‐SSE

indica
si
la
estructura
calculada
posee
una

conformación
correcta.
El
valor
de
la
relación-‐ACC
que
corresponde
a
la
relación
entre
la

accesibilidad
a
solventes
relativa
predicha
usando
el
algoritmo
ACCpro
(aminoácidos

enclaustrados/expuestos)
y
la
accesibilidad
relativa
a
solventes
derivado
del
programa
DSSP
(>

25%
de
accesibilidad
è
expuesta)
fue
de
0.40
relación-‐SSE.
Estos
datos
se
muestran
en
la

figura
12.
El
error
estimado
de
los

residuos
aminoacídicos
es
visualizado
utilizando
un

gradiente
de
color
de
azul
(regiones
más
estables)
a
rojo
(regiones
mas
inestables,
debido
a

que
presentan
un
error
estimado
superior
a
3,5
Å)

tal
como
se
muestra
en
la
figura
12.

Figura
11.
A
la
derecha
se
presenta
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
unida
a
DNA,
se

muestra
en
gradiente
de
color
de
azul
(mas
preciso)
a
rojo
(menos
preciso)
los
Å
de
error
la

región
del
enlazador
(en
rojo)
la
cual
presenta
mas
de
3.5
Å
de
error,
a
la
izquierda
se

muestran
los
valores
de
torsión,
solvatación,
interacción
de
átomos
y
Cβ,
relación
SSE,
relación

Valor
Z

24

ACC,
donde
al
final
de
la
barra
se
observa
el
valor
de
cada
uno
de
estos
criterios,
la
barra
negra

indica
que
tan
beneficioso
o
perjudicial
es
cada
valor
para
la
estabilidad
de
la
proteína.

En
la
tabla
10
se

muestran
los
valores
Ψ
(psi)
y

Φ
(phi).

Estos
valores
están
clasificados
según

su
estado
conformacional
(favorable,
permitido
y
atípico).
El
estado
conformacional
indica
si

los
pares
de
ángulos
Ψ
(psi)
y

Φ
(phi)
que
conforman
la
estructura
secundaria
de
una
proteína

están
en
la
posición
correcta.
Estos
ángulos
definen
regiones
del
diagrama
de
Ramachandran

que
corresponden
a
elementos
de
estructura
secundaria
(helices
alfa
y
láminas
beta).
En
este

caso
se
muestran
los
resultados
para

el
archivo

pdb
de
la
interacción
Brn3a-‐ADN.
Como
se

puede
observar
solo
se
presentó
un
ángulo
desfavorable
en
el

aminoácido
número
38

el
cual

corresponde
a
una
prolina
ver
figura
12.
Mediante
la
tabla
10
se
observó
que
el
99.3%
de
los

ángulos
poseen

una
adecuada
conformación,
solo
el
0.6%
posee
una
conformación

inadecuada.

Tabla
10:
Cantidad
de
ángulos
diédricos
Ψ
(psi)
y

Φ
(phi)

favorables
permitidos
y
atípicos
que

del
total
de
aminoácidos
de
la
estructura
tridimensional
Brn3a-‐ADN.

En
la
figura
12
se
muestra
por
medio
de
los
diagramas
de
Ramachandran
descargados
de
la

página
web
de
Molprobity.
En
el
diagrama
de
Ramachandran
se
muestran
todas
las

combinaciones
posibles
de
ángulos
diédricos
Ψ
(psi)
contra
Φ
(phi).
Basándose
en
cálculos
en

los
que
se
utilizan
radios
de
Van
der
Waals
y
ángulos
de
enlace
conocidos,
las
conformaciones

consideradas
posibles
son
las
que
entrañan
poca
o
ninguna
interferencia
estérica.
Las
áreas

limitadas
de
azul
claro
reflejan
conformaciones
sin
solapamiento
estérico
y
por
lo
tanto
están

totalmente
permitidas;
el
área
limitada
por
el
azul
obscuro
indica
conformaciones
que
están

permitidas
sí
se
permite
cierta
flexibilidad
en
los
ángulos
de
enlace.
La
estereoquímica
de
los

residuos
L-‐aminoácidos
origina
la
asimetría
de
la
representación.
Las
representaciones
para

otros
residuos
aminoácidos
de
la
serie
L
sin
ramificaciones
en
sus
cadenas
laterales
son

prácticamente
idénticas.
Los
márgenes
permitidos
para
los
residuos
aminoácidos
ramificados

tales
como
Val,
Ile
y
Thr
son
algo
más
pequeños
que
para
Ala.
El
residuo
de
Gly,
el
que
tiene

menos
impedimentos
estéricos,
presenta
un
margen
mucho
más
amplio
de
conformaciones

permitidas.
El
margen
para
los
residuos
de
Pro
esta
muy
restringido
debido
a
que
el
valor
de
Φ

(phi)
está
limitado
a
un
margen
entre
-‐35°
a
-‐85°
debido
a
su
cadena
lateral
cíclica.

Por
lo

tanto
como
se
observó
en
el
residuo
aminoácidica
número
38
que
corresponde
a
una
prolina,

este
aminoácido
posee
la
capacidad
de
encontrarse
en
un
ángulo
cis
y
trans
y
la
configuración

del
enlace
peptídico
de
la
prolina
dependerá
específicamente
de
las
fuerzas
generadas
por
la

estructura
tridimensional
plegada
única
de
cada
proteína.
El
valor
del
ángulo
Φ
(phi)
que
fue

de
-‐40°
se
encontró
dentro
de
los
límites
permitidos
para
este
aminoácido
no
sino
para
su

ángulo
Ψ
(psi)
que
fue
de
90°.
Esto
indicó
que
es
posible
que
su
ángulo
estuviera
en
el
lugar

incorrecto
debido
a
un
inadecuado
plegamiento
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a

encontrada
en
el
archivo
pdb
que
se
analizó.
Este
plegamiento
incorrecto
se
resolverá
en
la

minimización
energética
posterior.

Zona
Brn3a

Favorecida
149
(95.5%)

Permitida
6
(3.8%)

Atípica
1
(0.6%)

25

Figura
12.
Se
presentan
los
gráficos
de
Ramachandran
de
la
estructura
de
interacción
Brn3a-‐
ADN,
de
izquierda
a
derecha
en
orden
de
aparición
se
muestra
el
gráfico
general
de
la

estructura
donde
se
presenta
en
el
limite
del
gráfico
el
residuo
No
49
correspondiente
a

cisteína,
este
residuo
no
se
no
se
tomo
en
cuenta
en
la
validación
final

debido
a
que
se

Caso
general

Valina
e
Isoleucina

Prolina

Glicina
Trans-‐prolina

Cis-‐prolina

95.5%
(149/156)
de
los
residuos
se
encuentran
en
la
región
ideal
(98%).

98.7
%
(154/156)
de
los
residuos
se
encuentran
en
la
región
limite
(99.8%).

26

encuentra
en
región
límite
del
gráfico
y
en
otros
gráficos
aparece
como
favorecido,
el
segundo

gráfico
presenta
los
residuos
de
Valina
e
Isoleucina,
el
tercer
gráfico
se
muestran
los
residuos

de
pre
Prolina,
el
cuarto
los
residuos
aminoacídicos
de
Glicina,
en
el
quinto
los
residuos
de

trans
Prolina
en
la
cual
se
muestra
el
residuo
No.
38
con
un
valor
atípico
por
lo
cual
se
deberá

modificar
su
posición
espacial
mas
adelante
con
dinámica
molecular,
el
sexto
y
último
gráfico

presenta
solamente
los
residuos
de
la
Prolina
en
posición
Cis.

En
la
figura
13
se
muestran
los
resultados
de
las
mutaciones
de
los
nucleótidos
del
archivo
pdb

de
la
interacción
de
Brn3a
con
el
ADN
copiado
de
2XSD
(Brn3a.BL00040001.pdb).
Se

cambiaron
las
bases
nucleotídicas
del
archivo
pdb
y
se
les
hizo
coincidir
con
la
región
URR
de

VPH-‐16
con
el
programa
X3DNA.

Se
presentan
en
orden
de
inferior
a
superior
las
secuencias

obtenidas
con
el
comando
mutate
bases.
La
primera
secuencia
muestra
la
secuencia

nucleotídica
de
la
cadena
B
y
C
las
contienen
las
coordenadas
en
el
espacio
de
los
átomos
que

conforman
el
ADN
del
archivo
PDB
de
la
proteína
2XSD,
el
segundo
denominado
V1
pertenece

a
la
secuencia
nucleotídica
del
subtipo
1
de
VPH-‐16
donde
se
realizaron
5
mutaciones

obteniendo
como
resultado
un
nuevo
modelo
(Brn3a_m.pdb),
el
tercer
modelo
denominado

V2
pertenece
a
la
secuencia
nucleotídica
del
subtipo
2
de
VPH-‐16
donde
se
realizaron
4

mutaciones
obteniendo
como
resultado
un
nuevo
modelo
(Brn3a_m2.pdb)
URR
de
VPH-‐16,
el

cuarto
modelo
denominado
V5
pertenece
a
la
secuencia
nucleotídica
del
subtipo
5
de
VPH-‐16

donde
se
realizaron
4

mutaciones
obteniendo
como
resultado
un
nuevo
modelo

(Brn3a_m3.pdb).

153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163

B
5’
A
T
G
C
A
T
G
A
G
G
A
3’

C
3’
T
A
C
G
T
A
C
T
C
C

5’

173
172
171
170
169
168
167
166
165
164

Figura
13.
A:
Secuencia
nucleotídica
que
se
encuentra
en
la
estructura
pdb
OCT-‐6
(2XSD)

indicándose
a
la
izquierda
la
cadena
a
la
cual
pertenecen
en
el
archivo
pdb.
La
secuencia

nucleotídica
se
mutó
con
el
programa
X3DNA.

V1:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de

VPH-‐16
subtipo
1
del
archivo
pdb
V1.
V2:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-‐16

subtipo
2
del
archivo
pdb
V2.
V5:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-‐16
subtipo
5

del
archivo
pdb
V5.
Las
letras
en
negrita
indican
las
bases
nucleotídicas
que
se
mutaron.
B:

153
154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

B
5’
A
T
G
C
A
A
T
T
A
G
G
3’

C
3’
T
A
C
G
T
T
A
A
T
C

5’

173
172
171
170
169
168
167
166
165
164

153
154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

B
5’
A
T
G
A
A
T
T
A
T
T
G
3’

C
3’
T
A
C
T
T
A
A
T
A
A

5’

173
172
171
170
169
168
167
166
165
164

153
154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

B
5’
A
T
G
A
G
T
T
A
T
T
G
3’

C
3’
T
A
C
T
C
A
A
T
A
A

5’

173
172
171
170
169
168
167
166
165
164

2XSD

V1

V2

V5

B
A

27

Representación
esquemática
del
modelo
de
Brn3a-‐ADN
donde
se
representa
el
ADN

en
forma

de
palos
y
la
proteína
en

forma
de
lazos.

7.2.2 Determinación
de
la
energía
del
complejo
proteína-‐ADN

En
la
serie
de
figuras
número
14
se
presentan
los
resultados
de
la
minimización

energética
en

forma
de
gráfica
de
la
estructura
tridimensional
en
formato
PDB
de
cada
modelo
de
Brn3a
en

unión
a
la
secuencia
nucleotídica
de
cada
subtipo
de
VHP-‐16.
Se
repitió
la
minimización

energética
para
cada
conformación
a
analizar
(complejo
ADN-‐proteína,
ADN
solo,
proteína
sola

correspondiente
a
cada
uno
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16).
Se
muestran
en
orden

ascendente
a
descendente
subtipo
1
(figura
13
A),
subtipo
2
(figura
13
B),

y
subtipo
5(figura

13
C).
Se
observó
como
se
equilibro
la
energía
potencial
de
cada
molécula
mostrada
a
la

derecha
y
la
energía
total

de
cada
molécula
mostrada
a
la
izquierda
contra
el
tiempo
de
5

picosegundos.
En
cada
grafica
de
la
figura
13
se
presenta
de
color
negro
la
serie
de
datos

correspondiente
al
complejo
(Brn3a-‐ADN),
en
rojo
la
serie
de
datos
correspondiente
a
la

proteína
(Brn3a)
y
de
color
verde
la
serie
de
datos
correspondiente
al
ADN
(secuencia

nucleotídica
de
cada
subtipo
correspondiente
a
cada
modelo
pdb.

En
todas
las
gráficas
de
la

figura
13
observamos
que
no
hay
cambios
abruptos
en
la
energía
potencial

y
total
del
sistema

debido
a
que
alcanzan
una
fase
estacionaria.
En
base
a
estos
resultados
se
concluyó
que
se

alcanza
un
equilibrio
termodinámico
demostrando
que
el
sistema
es
estable
después
de
la

minimización
energética.

Energía
(Kcal/mol)

Energía
(Kcal/mol)

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

Energía
potencial
Energía
total

Figura
14
A:
Subtipo
1

28

Figura
14.
Se
muestran
en
orden
ascendente
a
descendente
los
resultados
de
la
minimización

energética
donde
se
equilibró
la
energía
potencial

y
energía
total
de
cada
molécula
de
cada

uno
de
los
complejos
Bn3a
en
unión
al
ADN
de
la
región
URR
de
cada
subtipo
de
VPH-‐16.
Las

figuras
mostradas
a

la
derecha
presentan
la
energía
total

de
cada
molécula
contra
el
tiempo

total
que
fue
de
5
picosegundos,
los
gráficos
mostrados
a
la
izquierda

presentan
la
energía

potencial

de
cada
molécula
contra
el
tiempo
total
que
fue
de
5
picosegundos.
Figura
14
A:

Subtipo
1.
Figura
14
B:
Subtipo
2.
Figura
14
C:
Subtipo
5.

En
la
tabla
11
A
se
presentan
las
energías
totales
de
las
moléculas
que
conforman
cada
uno
de

los
tres
modelos
de
interacción
en
formato
pdb
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
los
tres

subtipos
de
VPH-‐16.
Se
muestra
la
energía
de
cada
molécula
en
kcal/mol
previo
al
calculo
de
la

simulación
de
la
dinámica
molecular.
Se
denominaron
de
la
siguiente
manera
VPH16V1

(subtipo
1),
VPH16V2
(subtipo2),
VPH16V5
(subtipo
5).
Para
calcular
la
energía
utilizamos
la

ecuación
de
la
sumatoria
de
energía
total
del
sistema
mostrada
a
continuación.

𝐸!"#$%&'" − 𝐸!"#$%í!" − 𝐸!"# = 𝐸!"#ó!

Ecuación
1.
Se
presenta
la
ecuación
del
calculo
de
energía
de
unión
de
un
sistema
de
2
o
más

moléculas
utilizado
para
determinar
la
energía
de
unión
del
complejo
Brn3a-‐ADN

Energía
total
Energía
potencial

Energía
(Kcal/mol)

Energía
(Kcal/mol)

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

Energía
total
Energía
potencial

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

Energía
(Kcal/mol)

Energía
(Kcal/mol)

Figura
14
B:
Subtipo
2

Figura
14
C:
Subtipo
5

29

En
la
tabla
11
B

se
muestran
los
resultados
tras
la
simulación
de
la
dinámica
molecular.
En
la

ultima
fila
se
presentan
las
energías
de
unión
donde
observamos
al
final
de
segunda
columna

que
la
energía
de
unión
del
modelo
VPH-‐16
subtipo

1
es
la
que
presenta
una
mayor
energía

de
unión
frente
a
los
otros
subtipos.

En
la
serie
de
figuras
n.°
15
se
presentan
los
resultados
de
la
simulación
de
la
dinámica

molecular
de
la
estructura
tridimensional
en
formato
pdb
de
cada
modelo
de
Brn3a
en
unión
a

la
secuencia
nucleotídica
de
cada
subtipo
de
VHP-‐16.
Se
repitió
la
simulación
de
la
dinámica

molecular
para
cada
conformación
a
analizar
(complejo
ADN-‐proteína,
ADN,
proteína

correspondiente
a
cada
uno
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16).
Se
muestran
en
orden

ascendente
a
descendente
subtipo
1
(gráfica
6a),
subtipo
2
(gráfica
6b),

y
subtipo
5
(gráfica

6c),

en
las
graficas
se
presenta
como
se
equilibró
la
energía
potencial
(kcal/mol)
de
cada

molécula
mostrada
a
la
derecha
y
la
energía
total
(kcal/mol)

de
cada
molécula
mostrada
a
la

izquierda
contra
el
tiempo
que
fue
de
10
ps.
En
cada
grafica
se
presenta
de
color
negro
la
serie

de
datos
correspondiente
al
complejo
(Brn3a-‐ADN),
en
rojo
la
serie
de
datos
correspondiente

a
la
proteína
(Brn3a)
y
de
color
verde
la
serie
de
datos
correspondiente
al
ADN
(secuencia

nucleotídica
de
cada
subtipo
correspondiente
a
cada
modelo
PDB.

En
todas
las
graficas

observamos
que
no
hay
cambios
abruptos
en
la
energía
potencial

y
total
del
sistema
por
lo

que
se
alcanza
un
equilibrio
termodinámico
demostrando
que
el
sistema
es
estable
después

de
la
simulación
de
la
dinámica
molecular.

Tabla
11
A:
Energía
total
previo
a
la
simulación
molecular.

Tabla
11
B:
Energía
total
al
final
de
la
simulación
molecular.

30

Energía
total
Energía
potencial

Energía
(kcal/mol)

Energía
(kcal/mol)

Tiempo
(ps)

Energía
(Kcal/mol)

Energía
(Kcal/mol)

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

Energía
total
Energía
potencial

Energía
total
Energía
potencial

Energía
(kcal/mol)

Energía
(kcal/mol)

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

Figura
15
A:
Subtipo
1

Figura
15
C:
Subtipo
5

Figura
15
B:
Subtipo
2

Tiempo
(ps)

31

Figura
15.
Se
muestran
en
orden
ascendente
a
descendente
los
resultados
de
la
simulación
de

la
dinámica
molecular.
Se
presentan
en
forma
de
gráfica
la
energía
potencial

y
energía
total
de

cada
molécula
de
cada
uno
de
los
complejos
Bn3a
en
unión
al
ADN
de
la
región
URR
de
cada

subtipo
de
VPH-‐16.
Las

figuras
mostradas
a

la
derecha
presentan
la
energía
total

de
cada

molécula.
Los
gráficos
mostrados
a
la
izquierda

presentan
la
energía
potencial

de
cada

molécula.
Figura
15
A:
Subtipo
1.
Figura
15
B:
Subtipo
2.
Figura
15
C:
Subtipo
5.

En
la
serie
de
figuras
16
se
presentan
los
resultados
de
la
Raíz
cuadrada
media

de
la

desviación
de
las
posiciones
atómicas
(RMSD)
de
los
Cα
(eje
Y)
contra
el
tiempo
de
la

simulación
molecular
que
fue
de
10
ps.

El
RMSD
es
la
medida
de
la
distancia
media
entre
los

átomos
(por
lo
general
los
átomos
del
Cα)
de
proteínas
superpuestas.
Se
mide
la
similitud
en
la

estructura
tridimensional
por
el
RMSD
de
las
coordenadas
atómicas
de
los
Cα
después
de
la

superposición
de

las
coordenadas
atómicas

de
proteínas
diferentes
(archivos
en
formato

pdb).
Las
mejores
estructuras
tienen
valores
de
RMSD
para
el
esqueleto
del
proteína
(cadena

de
Cα)

menores
a
1.0
Å,
lo
que
significa
que
no

hay
grandes
movimientos
en
el
esqueleto
o

que
coexisten
diferentes
conformaciones
en
la
solución
(Andrade
et
al.
2005).

El
RMSD

de
las
estructuras
tridimensionales
en
formato
pdb
obtenidas
del
proceso
de

simulación
de
dinámica
molecular,
fueron
generadas
por
Amber
superponiendo
las

coordenadas
atómicas
iniciales
de
la
estructura
de
interacción
de
Brn3a-‐ADN
contra
las
nuevas

coordenadas
atómicas
de
la
misma
estructura

tras
1
ps
se
repitió
este
ciclo
con
las

coordenadas
atómicas
nuevas
comparando
las
anteriores
hasta
que
se
completaron
los
1000

picosegundos
de
la
simulación.
Se
presenta
en
orden
descendente
subtipo
1

como
figura
15
A,

subtipo
2
como
figura
15
B

y
subtipo
5
como
figura
15
C.
Se
delimitaron
con
líneas
punteadas

los
límites
máximos
y
mínimos
que
se
alcanzaron
durante
la
simulación
molecular
en
el
RMSD

de
las
3
estructuras
pdb
analizadas
y
se
indicó
con
una
línea
sin
puntos
la
media.

En
base
a
los

resultados
se
determinó
que
los
sistemas
fueron
conformacional
y

termodinámicamente

estables
debido
a
que
no
hubo
cambios
abruptos
o
terminación
del
RMSD
antes
de
los
1000

ps.
El
sistema
se
mantiene
en
un
rango
promedio
de
1.65
Å
durante
la
simulación
molecular

con
un
rango
de
cambios
de
±
1.8
Å.
Esto
validó
el
proceso
de
la
determinación
de
la
energía

del
complejo
proteína-‐ADN
y
se
puede
proceder
a
la
optimización
del
modelo.

M

LS

LI

Figura
16
A:
Subtipo
1

32

Figura
16.
Se
muestran
en
orden
descendente
las
gráficas
del
RMSD
de
los

Cα
de
las

estructuras
pdb
obtenidas
del
proceso
de
simulación
de
dinámica
molecular
contra

los
1000

picosegundos
de
la
simulación.
Se
presenta
en
orden
descendente
subtipo
1

como
figura
15
A,

subtipo
2
como
figura
16
B

y
subtipo
5
como
figura
16
C.
LS:
limite
superior.
M:
media.
LI:

limite
inferior.

M

LS

LI

M

LS

LI

Figura
16
C:
Subtipo
5

Figura
16
B:
Subtipo
2

33

7.2.3 Optimización
y
cálculo
de
la
energía
de
interacción
de
los
modelos

tridimensionales
de
interacción
de
Brn-‐3a
con
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16

en
forma
de
logo.

La
energía
libre
de
interacción
(∆Gunión,
Kcal·∙mol-‐1)

de
los
modelos
de
interacción
de
Brn3a-‐
VPH16
se
calculó
empleando
el
método
MM-‐PBSA
(mecánica
molecular
área
de
superficie
de

Poisson
Boltzmann)
(Miller
et
al,
2012),
con
el
módulo
GB33
implementado
en
Amber

(MMPBSA.py),
(Stymiest
L.,
2005).
Los
complejos
de
interacción
Brn3a-‐VPH16
fueron

preparados
para
la
dinámica
molecular
utilizando
el
programa
tleap
(Salomon-‐Ferrer
R.,
2013).

Con
el
campo
de
fuerza
ff99bsc0.
Los
complejos
de
interacción
Brn3a-‐VPH16
fueron

embebidos
en
una
figura
octaédrica
(TIP3P)
de
moléculas
de
agua
con
un
margen
de
12
a
lo

largo
de
cada
dimensión.
Se
añadieron
iones
Cloro
y
Sodio
para
neutralizar
las
cargas
del

sistema.
Los
sistemas
finales
fueron
conformados
por
un
total
de
78549
átomos.
Los

complejos
solvatados
fueron
equilibrados
mediante
una
corta
minimización
energética

consistente
en
300
ps

de
calentamiento
y
300
ps
de
equilibrado
de
densidad
con
restricciones

débiles,
seguido
de
600
ps
a
presión
constante
a
300
K.
Todas
las
simulaciones
fueron
llevadas

a
cabo
bajo
agitación
de
átomos
de
hidrógeno,
en
paso
de
2
fs,
y
haciendo
uso
de
la
dinámica

de
Langevin
para
el
control
de
temperatura
de
los
sistemas.

Los
resultados
fueron
graficados
en
la
serie
de
figuras
17.
En
la
figura
17
A
se
muestra
la

densidad
del
sistema
(complejo-‐ADN)
en
g/cm3

contra
el
tiempo
600
ps.
Se
observó
como
tras

alcanzar
los
100
ps
de
simulación
el
sistema
se
ha
equilibrado
a
una
densidad
de

aproximadamente
1.015
g/cm3

lo
cual
es
razonable,
debido
a
que
la
densidad
del
agua
líquida

pura
a
300
K
es
de
aproximadamente
1,00
g/cm3
.
En
la
figura

17
B
se
observó
como
la

temperatura
de
nuestro
sistema
comenzó
en
0
K
y
posteriormente
aumentó
a
300
K

tras

alcanzar
los
50
ps
durante
un
período
de
600
ps,
la
temperatura
se
mantuvo
constante

durante
el
resto
de
la
simulación
que
indica
el
uso
de
la
dinámica
de
Langevin
de
regulación
de

la
temperatura
tuvo
éxito.

Figura
17:

A:
Densidad

del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
B:
Temperatura
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

g/cm
3

Tiempo
(ps)

Figura
17
A:
Densidad

del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

Figura
17
B:
Temperatura
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

34

Se
graficaron
la
energía
total
del
sistema
y
el
RMSD
de
los
Cα
de
los
modelos
de
interacción

Brn3a-‐VPH16

obtenidos
en
el
paso
anterior
con
Amber
(ver
figura
18
A
y
18
B).
Con
ello

se

determinó
que
los
modelos
se
encontraban
adecuadamente
equilibrados.
En
la
figura
18
A
se

observó
como
la
energía
aumentó
durante
los
primeros
ps
que
corresponden
al
calentamiento

nuestro
sistema

de
0
K
a
300
K.
La
energía

se
mantuvo
constante
durante
el
resto
de
la

simulación
demostrando
la
estabilidad
termodinámica
del
complejo
de
interacción
Brn3a-‐
VPH16.
La
figura
18
B

corresponde
a
la
gráfica
del
RMSD
durante
la
simulación
no
se
observo

ningún
cambio
abrupto
o
interrupción
en
la
continuidad
de
la
grafica
lo
cual
indicaría
que
el

sistema
no
es
estable.
El
RMSD
aumentó
durante
la
simulación

hasta
estabilizarse
a
los
170
ps

indicando
que
se
puede
proceder
a
la
simulación
molecular.

Se
realizaron
los
mismos
pasos
para
los
modelos
de
interacción
Brn3a-‐VPH16
subtipo
2
y

subtipo
5.
Los
tres
sistemas
se
comportaron
idénticamente
por
lo
cual
se
presentan
la
serie
de

figuras
17
y
18
solo
una
ocasión.

Figura
18:

A:
Energía
potencial

del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
B:
RMSD
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

La
fase
de
la
producción
de
la
simulación
molecular
fue
realizada
en
las
mismas
condiciones

que
el
proceso
de
equilibrado
previo
durante
20
ns,
con
registro
de
las
coordenadas
atómicas

cada
10
ps.
Para
el
cálculo
de
la
energía
libre
de
unión
y
solvatación
del
complejo
fueron

utilizados
el
método
MMPBSA
como
describe
(Gohlke
&
Case,
2004).

Los
resultados
fueron
graficados
en
la
serie
de
figuras
19.
En
la
figura
19
A
se
muestra
la

densidad
del
sistema
(complejo-‐ADN)
en
g/cm3

contra
el
tiempo
2500
ps.
Se
observó
como

tras
alcanzar
los
100
ps
de
simulación
el
sistema
se
ha
equilibrado
a
una
densidad
de

aproximadamente
1.015
g/cm3

lo
cual
es
razonable,
debido
a
que
la
densidad
del
agua
líquida

pura
a
300
K
es
de
aproximadamente
1,00
g/cm3
.
En
la
figura

19
B
se
observó
como
la

temperatura
de
nuestro
sistema
comenzó
en
0
K
y
posteriormente
aumentó
a
300
K

tras

alcanzar
los
50
ps
durante
un
período
de
600
ps,
la
temperatura
se
mantuvo
constante

durante
el
resto
de
la
simulación
que
indica
el
uso
de
la
dinámica
de
Langevin
de
regulación
de

la
temperatura
tuvo
éxito.

Se
graficaron
la
energía
total
del
sistema
y
el
RMSD
de
los
Cα
de
los
modelos
de
interacción

Brn3a-‐VPH16

obtenidos
en
el
paso
de
equilibramiento
del
sistema
con
Amber
(ver
figura
19
A

y
19
B).
Con
ello

se
determinó
que
los
modelos
se
encontraban
adecuadamente
equilibrados.

En
la
figura
19
C
se
observó
como
la
energía
aumentó
durante
los
primeros
ps
que

g/cm
3

Energía
(kcal/mol)

RMSD

Figura
18
A:
Energía
potencial

del

complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

Figura
18
D:
RMSD
del
complejo
Brn3a-‐
VPH16
subtipo
1.

35

corresponden
al
calentamiento
nuestro
sistema

de
0
K
a
300
K.
La
energía

se
mantuvo

constante
durante
el
resto
de
la
simulación
demostrando
la
estabilidad
termodinámica
del

complejo
de
interacción
Brn3a-‐VPH16.
La
figura
19
D

corresponde
a
la
gráfica
del
RMSD

durante
la
simulación
no
se
observo
ningún
cambio
abrupto
o
interrupción
en
la
continuidad

de
la
grafica
lo
cual
indicaría
que
el
sistema
no
es
estable.
Esto
se
llevo
a
cabo
durante
20
ns

repitiendo
los
pasos
de
la
simulación
por
2500
ps
por
8
veces
para
completar
los
20
ns.
20
ns

es
el
tiempo
mínimo
establecido
para
aceptar
los
resultados
de
una
simulación
de
dinámica

molecular

(Gohlke
&
Case,
2004).

Figura
19:
A:
Densidad

del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
B:
Temperatura
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
C:
Energía
total
del
complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.
D:
RMSD
del

complejo
Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

En
la
tabla
12
se
presentan
las
energías
totales
de
las
moléculas
que
conforman
cada
uno
de

los
tres
modelos
de
interacción
Brn3a-‐VHP16
en
unión
a
la
secuencia
nucleotídica
de
cada
uno

de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16
denominados
VPH16V1
(subtipo
1),
VPH16V2
(subtipo2),

VPH16V5
(subtipo
5),
obtenidas
por
método
MMPBSA.
Se
muestran
los
resultados
tras
la

simulación
de
la
dinámica
molecular,
en
la
primera
columna
se
muestra
la
energía
total
en

base
a
dos
modelos
el
de
nacimiento
general
y
el
Poisson-‐Boltzman,
en
base
a
estos
dos
se

Figura
19
A:
Densidad

del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

Figura
19
C:
Energía
total
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

Figura
19
D:
RMSD
del
complejo
Brn3a-‐
VPH16
subtipo
1.

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

Tiempo
(ps)
Tiempo
(ps)

RMSD

Energía
(kcal/mol)

K

g/cm
3

Figura
19
B:
Temperatura
del
complejo

Brn3a-‐VPH16
subtipo
1.

36

presentan
las
energías
de
unión
donde
observamos
al
final
de
segunda
columna
que
la
energía

de
unión
del
modelo
VPH-‐16
subtipo

1
es
la
que
presenta
una
mayor
energía
de
unión
frente

a
los
otros
subtipos
de
VPH-‐16.

Tabla
12.
Resultados
de
la
dinámica
molecular
por

MMPBSA

En
la
figura
20
se
muestra
las
secuencia
nucleotídica
consenso
de
la
región
URR
de
VPH-‐16

que
se
une
a
Brn3a
la
cual
fue
formada
tomando
en
cuenta
la
energía
de
unión
que
presenta

cada
base
nucleotídica
de
los
3
subtipos
de
VPH-‐16
subtipo
1,
subtipo
2
y
subtipo
5,
obtenida

gracias
al
método
MMPBSA.
EL
logo
fue
obtenido
de
la
pagina
de
WebLogo

http://weblogo.berkeley.edu
.
En
base
a
los
resultados
obtenidos
se
concluyó
que
las
bases

nucleotídicas
más
conservadas
en
las
secuencias
son
la
timina
en
la
2da
posición,
la
adenina
en

la
3ra
posición,
adenina
en
la
4ta
posición,
la
guanina
en
la
7ma
posición,
citosina
en
la
8va

posición,
adenina
en
la
9
posición
y
timina
en
la
10ma
posición.
Esto
indico
que
son
las
bases

nucleotídicas

TAA
son
las
que
hacen
interacción
especifica
con
la
hélice
alfa-‐3
del
subdominio

POUS
de
Brn3a
permitiendo
la
unión
con
el
ADN
mediante
los
aminoácidos
Glicina
45
y
Serina

46.

Mientras
que
las
bases
nucleotídicas
GCAT
son
las
que
hacen
contacto
con
la
hélice
alfa-‐3

del
subdominio
POUH

mediante
los
aminoácidos
Glicina
147
,
Argenina
146
y
Argenina
139.

Estas
interacciones
son
las
esperadas
debido
a
que
fueron
reportadas
anteriormente
en

proteínas
con
alta
homología
a
Brn3a
como
Pit1,
Oct1
y
Brn5
(Pereira
&
Kim,
2009).

Figura
20.
Secuencia
nucleotídica
consenso
de
la
región
URR
de
VPH-‐16
.

8. Discusión

Se
establececio
un
modelo
tridimensional
de
interacción
del
factor
de
transcripción
humano

Brn-‐3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-‐16
para
el
diseño
de
una
vacuna
génica

contra
el
CaCu,
se
realizó

el
presente
proyecto
en
tres
etapas:
primera
etapa,
se
construyó
y

validó
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn-‐3a.
segunda
etapa,
se
construyó
y
validó
el

modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
proteína
Brn-‐3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos

de
VPH-‐16.
Tercera
etapa,
se
optimizaron
los
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
Brn-‐
3a
con
cada
uno
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16
y
se
calcularon
las
energías
de
interacción
del

37

complejo
proteína-‐ADN.
Al
no
contar
con
una

hipótesis
que
probar
solo
se
presentaron
los

resultados
del
presente
trabajo

Para
concretar
el
presente
trabajo
no
hubo
problemas
mayores
con
los
sistemas
operativos

usados,
puesto
que
están
basados
en
la
plataforma
UNIX,
más
sin
embargo
fue
necesario

homologar
las
librerías
de
python
en
ambos
sistemas
operativos
y
actualizar
versiones
del

software
utilizado
para
que
fueran
las
mismas
en
ambos
sistemas,
esto
fue
necesario
para

ejecutar
Modeller
y
Amber,
el
segundo
obstáculo
fue
compilar
el
software
AMBER,
Amber
esta

basado
en
C++,
la
compilación
completa
del
programa
tomo
un
día
entero
debido
a
las

múltiples
librerías
y
códigos
necesarios
que
fueron
descargados
en
automático
por
el

programa
de
la
red,
en
un
comienzo
falló
la
compilación
del
programa
debido
a
que
tanto

Ubuntu
como
MAC
OSX
fueron
actualizados
y
con
ello
se
eliminaron
algunas
rutas
de
acceso
y

librerías
necesarias
por
el
compilador.
Fue
necesario
la
instalación
de
otras
herramientas
para

que
fuera
completado
el
proceso
de
compilación,
una
vez
instalado
y
probado
el
software
para

validar
la
correcta
compilación
se
comenzó
a
programar,
se
utilizó
Amber
el
cual
esta
basado

en
fortran
uno
de
los
primeros
lenguajes
de
programación.
En
cuanto
a
los
resultados
del

experimento
cabe
mencionar
los
siguientes
puntos,
el
primero
de
ellos
fue
el
tiempo
de

ejecución
puesto
que
fue
extremadamente
largo
para
algunos
programas,
es
decir
días,

mientras
que
para
otros
solo
tomo
unos
minutos
ejecutar
los
comandos;
como
segundo
punto

fue
aplicar
correctamente
los
códigos
y
controladores
de
Amber
y
Modeller
para
escribir
los

programas
que
calcularon
la
energía
de
unión
por
el
modelo
de
Poisson
–
Boltzman.

Con
los

resultados
obtenidos
se
interpretó
la
manera
en
las
interacciones
de
la
proteína
como
afectan

la
energía
de
unión
del
complejo
ADN
–
proteína,
concluyendo
que
secuencia
posee
mayor

afinidad
al
sitio
de
reconocimiento
de
la
proteína
Brn3a.

La
metodología
MMPBSA
nos
permitió
resolver
por
medio
de
un
procedimiento
mas
preciso
la

energía
de
unión
del
complejo
ADN-‐proteína,
aunque
los
recursos
necesarios
para
dicho

procedimiento
fueron
altamente
demandantes
por
ejemplo
el
tiempo
de
simulación
en
una

sola
computadora
para
una
sola
simulación
de
la
dinámica
molecular
fue
reducido
de
un
mes
a

solo
78
horas
en

96
procesadores,
esto
fue
posible
gracias
a
los
recursos
del
Centro
Nacional

de
Supercómputo,
utilizando
la
supercomputadora
en
clúster
Tubaat
Kaal
fue
posible
realizar

todos
los
cálculos
con
el
tiempo
de
20
nanosegundos
el
cual
es
el
mínimo
permitido
para

publicar
los
datos
en
una
revista
internacional.

Los
cálculos
de
estructuras
tridimensionales
de
proteínas
por
homología
ofrecen
una
poderosa

base
para
los
métodos
que
predicen
las
características
estructurales
de
una
nueva
proteína
sin

estructura
3D
resuelta,
basándose
en
su
similitud
con
estructuras
3D
de
proteínas
conocidas
y

sus
secuencias
de
proteínas.
La
similitud
en
la
secuencia
completa
o
en
un
fragmento
de
gran

tamaño,
permite
la
predicción
y
modelización
de
todos
los
dominios
estructurales,
mientras

que
las
estadísticas
derivadas
de
las
distribuciones
de
las
características
locales
de
estructuras

de
proteínas
conocidas
permite
que
sea
posible
predecir
características
de
las
proteínas
con

estructuras
3D
desconocida.

En
nuestro
caso
se
tiene
conocimiento
de
proteínas
con
dominios
altamente
idénticos
en

secuencia
aminoácidica
como
la
familia
de
proteínas
POU,
es
el
primer
reporte
que
se
hace

sobre
un
modelo
por
homología
de
la
proteína
Brn3a,
asociada
a
las
enfermedades

oncogénicas
especialmente
a
CaCu,
lo
que
permite
proponer
el
presente
modelo
como
una

herramienta
importante
para
el
estudio
estructural
y
de
funciones
de
la
mencionada
proteína,

de
tal
manera
que
se
desarrollen
propuestas
de
investigaciones
adicionales.
Mas
sin
embargo

ha
sido
de
gran
soporte
los
modelos
3D
generados
por
homología
y
validados
por
cristalografía

de
rayos
X
de
otras
proteínas
de
la
familia
POU,
como
demostró
Gopalsamy
et.
al.
2004,
Calista

K.
et.
al.
2005,

el
dominio
POU
es
un
dominio
proteico
altamente
conservado
y
que
puede
ser

modelado
a
partir
de
la
secuencia
aminoácidica
con
una
precisión
del
90%
si
la
identidad
en

secuencia
es
mayor
al
70%.

La
respuesta
del
trabajo
actual
no
solo
recae
en
la
propuesta
de

un
modelo
para
la
proteína
Brn3a
humana,
sino
en
la
validación
del
modelo
por
diversos

métodos,
para
proponer
un
modelo
confiable
y
realista.
A
pesar
de
iniciar
con
una
plantilla

38

molde
con
de
54%
de
similitud
en
la
secuencia
de
aminoácidos,
cuando
la
semejanza
de
la

secuencia
entre
la
plantilla
molde
y
la
secuencia
del
problema
es
inferior
al
42%,
se
aumenta
la

probabilidad
que
el
modelo
resultante
sea
inapropiado,
lo
cual
queda
bien
definido
por
el

efecto
denominado
zona
de
incertidumbre
(Rost
1999),
en
nuestro
caso
no
sucedió
de
esta

manera
por
lo
que
los
modelos
generados
presentaron
una
baja
incertidumbre,
por
lo
tanto

los
modelos
generados
fueron
confiables.
La
zona
de
incertidumbre
permite
establecer
que
el

modelo
obtenido
es
bueno,
ya
que
a
pesar
de
iniciar
con
una
plantilla
molde
de
una

similaridad
no
muy
alta,
produjo
un
resultado
validado
por
diversas
herramientas

bioinformáticas,
que
permite
aproximar
nuestro
modelo
a
una
realidad
biológica.

En
comparación
de
los
resultados
y
metodología
utilizados
por
(Diaz
et.
al.,
Sali
et.
al.,
Wolf
et.

al.)
en
todos
ellos
es
posible
construir
un
modelo
tridimensional
de
la
región
o
dominio,
en

nuestro
caso
el
dominio
POU
con
la
mayor
identidad
en
secuencia
aminoácidica
a
la
proteína

objetivo,
a
pesar
de
ello
aun
es
complicado
obtener
modelos
de
la
proteína
completa
debido
a

la
baja
identidad
en
secuencia
y
la
ausencia
de
modelos
similares,
no
solo
los
dominios
activos

o
regiones
funcionales
de
estas,
sin
embargo
los
modelos
generados
posen
una
buena

estereoquímica.

Para
validar
los
modelos
creados
se
utilizo
la
herramienta
DOPE
utilizada
por
Sali
et.
al.,
este

método
de
validación
fue
contrastado
con
el
servidor
QMEAN
del
portal

swissprot,
se

comprobaron
los
valores
Qmean
y
Z-‐score
de
los
modelos.
El
valor
Qmean
mide
los
errores
de

modelo
comparándolo
con
los
modelos
no
redundantes
del
mismo
tamaño,
estimando
su

fiabilidad
entre
0-‐1
(0-‐
100%).
El
Z-‐score
medio
de
un
modelo
de
Rayos
X
de
alta
resolución
es

de
0.
La
evaluación
de
la
calidad
de
un
modelo
es
un
aspecto
clave
desde
que
se
desarrollaron

los
primeros
métodos
de
predicción
de
estructura
de
proteínas,
siendo
importante
resaltar

que
el
modelo
presente
que
se
propone,
se
evaluó
positivamente
con
el
empleo
de
diversos

métodos
de
validación
de
uso
internacional
mas
ampliamente
usados
fue
el
de
los
diagramas

de
Ramachandran,
la
ubicación
de
los
ángulos
y
de
las
torsiones
de
los
enlaces
de
los

aminoácidos
que
forman
la
estructura
secundaria
evaluada
se
encuentran
dentro
de
niveles

aceptados
y
permitidos,
obteniéndose
una
validación
suficiente
para
el
modelo
propuesto

como
se
observa
en
la
figura
12.

Se
utilizo
el
programa
Amber
12
para
el
calculo
de
la
energía
de
interacción
de
Brn3a-‐ADN
tal

como
se
utiliza
en
la
metodología
utilizada
por
Wang
et.
al.
Con
el
campo
de
fuerza
parm99SB,

un
modelo
de
agua
implícito
y
sin
punto
de
exclusión
se
generaron
los
archivos
de
topología
y

las
coordenadas
de
los
átomos
para
el
complejo,
ADN
y
proteína.
Una
ventaja
de
Amber
es

que
el
programa
Tleap
agrega
automáticamente
los
hidrógenos
y
revisa
las
interacciones
entre

los
átomos
generando
una
reporte
donde
presenta
los
átomos
que
pueden

presentar

impedimentos
estéricos.
Un
punto
importante
es
tener
presente
la
configuración
de
los

protones,
le
permite
a
uno
para
comprobar
el
estado
de
protonación
de
los
residuos

protonables.
Por
defecto
tleap
utiliza
los
estados
de
protonación
más
comunes
para
estos

residuos.
Por
ejemplo,
para
el
residuo
aminoacidico
histidina
HIS
su

forma
predeterminada
de

protonación
es
ε.
Se
tuvo
especial
cuidado
con
los
aminoácidos
CIS,
HIS
y
GLU
en
el
presente

trabajo
debido
a
que
su
carga
afectaría
etapas
posteriores
del
cálculo.
Con
los
archivos
de

topología
se
realizó
una
minimización
energética
para
posteriormente
correr
pruebas
de

dinámica
molecular
obteniendo
la
energía
de
estabilización
del
complejo.

Para
el
cálculo
de
las
energías
con
AMBER,
las
posiciones
de
los
hidrógenos
fueron

minimizadas
primero
esto
es
necesario
como
determinan
trabajos
previos
como
el
de
Wang

et.
al.,
García
et.
al.,
esto
es
debido
a
que
pequeños
cambios
en
las
distancias
entre
los
átomos

pueden
afectar
la
energía
de
unión
gran
medida.
La
aplicación
de
procedimientos
de

minimización
significa
que
una
mutación
en
una
base
posiblemente
afecta
la
energía
en
otra

base,
en
otras
palabras,
los
resultados
de
las
mutaciones
en
diferentes
posiciones
de
base

serán
no
aditivos.

Se
realizo
la
minimización

y
para
evitar
choques
estéricos,
se
permitió
el
reacomodo
libre
de

átomos
de
hidrógeno
y
bases
nucleicas.
Se
limito
el
movimiento
de
la
proteína
y
la
cadena
de

39

ADN
mediante
muelles
con
una
constante
de
1.0
kcal/(molA2
).
Se
aplicaron
2500
pasos
de

minimización
con
el
método
“steepest
descent”
y
2500
pasos
de
minimización
con
el
método

del
gradiente
conjugado
para
asegurar
la
convergencia
de
los
modelos
generados,
para

nuestro
modelo
de
solvente
implícito
usamos
el
modelo
GB
de
Hawkins,
Cramer
y
Truhlar.
Tras

calentar
y
equilibrar
los
tres
sistemas
comprobamos
la
estabilidad
de
nuestra
minimización

energética,
que
puede
ser
afectada
debido
a
la
inestabilidad,
falta
de
hidrogenación
y
otras

variables.
En
la
serie
de
graficas
5
observamos
que
no
hay
cambios
abruptos
en
la
energía

potencial
del
sistema
y
se
alcanza
un
equilibrio
demostrando
que
el
sistema
es
estable

después
de
la
minimización.
Se
repitió
la
minimización
energética
para
cada
conformación
a

analizar
(complejo
ADN-‐proteína,
ADN,
proteína
de
los
tres
subtipos
de
VPH-‐16).

Comprobamos
en
la
serie
de
graficas
16
con
el
RMSD
la
adecuada
conformación
de
el

complejo
ADN-‐proteína
para
los
3
modelos
analizados,
en
relación
al
calculo
de
la
energía
de

unión
del
complejo
fueron
obtenidos
los
3
datos
de
cada
uno
de
los
subtipos
de
VPH-‐16

resultando
VPH-‐16
subtipo
1
como
el
modelo
con
la
mayor
energía
de
unión
frente
a
los
otros

dos
modelos,
este
resultado
sin
embargo
debe
ser
optimizado
de
una
manera
más
precisa

para
calcular
con
mayor
precisión
la
energía
de
unión
para
esto
utilizaremos
el
método

MMPBSA.

Los
modelos
utilizados
en
paso
anterior
fueron
solvatados
en
una
caja
octaédrica
de

aproximadamente

18
mil
moléculas
de
agua
usando
el
sistema
modelo
TIP3P
el
fin
de
imitar
el

comportamiento
fisiológico
de
las
moléculas
debido
a
que
Brn3a
es
una
proteína
citológica

debe
estar
solubilizada
en
agua.

En
el
presente
los
tres
modelos

de
interacción
DNA-‐proteina

fueron
equilibrados,
calentados
y
su
carga
eléctrica
fue
igualada
a
0
con
el
fin
de
evitar
que
las

cargas
de
las
cadenas
de
ADN
y
los
grupos
funcionales
de
los
aminoácidos
causaran

interacciones
con
la
simulación
molecular,
en
comparación
con
la
metodología
utilizada
en
el

trabajo
realizado
por
Furini
et.
al.,
se
utilizó
una
mayor
capacidad
de
cómputo
con
un
total
de

96
procesadores
en
6
nodos
del
cluster
Tubat
Kaal
del
CNS,
lo
cual
facilito
la
obtención
de

resultados,
una
vez
obtenida
la
equilibración
inicial
de
los
datos
se
procedió
al
protocolo
de
la

simulación
molecular
la
cual
tomo
un
total
de
78
por
cada
uno
de
los
modelos
de
interacción

Brn3a-‐ADN
de
la
secuencia
de
VPH-‐16,
tras
ejecutar
la
simulación
molecular
procedimos
al

protocolo
MMPBSA,
con
el
cual
se
obtuvieron
las
energías
de
unión
siendo
de
nueva
cuenta
el

subtipo
1
el
de
mayor
energía
de
unión,
esto
es
un
resultado
esperado
debido
a
que
la

literatura
señala
la
correlación
entre
la
expresión
del
RNAm
de
Brn3a
y

el
RNAm
del
gen
E6
de

VPH-‐16
subtipo
1
con
una
r
=
70
(Ndisang
et.
al.
2006),
mientras
que
el
subtipo
2
posee
una
r
=

80,
en
base
a
esto
debemos
analizar
mas
a
fondo
las
interacciones
de
otros
promotores
rio

arriba
de
esta
región
puesto
que
podemos
determinar
que
aunque
Brn3a
presenta
una
mayor

afinidad
por
la
secuencia
de
VPH-‐16
subtipo
1,
el
subtipo
2
presenta
una
mayor
correlación

con
la
expresión
de
el
oncogén
E6,
la
respuesta
yace
nuevamente
en
las
regiones
rio
arriba
de

esta
secuencia
donde
se
unen
mas
promotores
de
transcripción
los
cuales
pueden
incrementar

la
expresión
y
la
interacción
de
Brn3a
con
la
secuencia
de
VPH-‐16,
Ndisang
et.
al.
determina
4

mutaciones
rio
arriba
y
una
deleción
de
38
pb
en
el
subtipo
2,
de
las
cuales
cabe
mencionar

a

la
deleción
como
un
optimizador
de
la
unión
de
diversos
promotores
debido
a
la
mayor

proximidad
entre
ellos
ocasionada
por
la
deleción,
este
estudio
puede
servir
como
una
manera

de
trabajar
para
diseñar
un
modelo
de
vacuna
génica
contra
VPH
-‐16
con
la
información

generada.

En
base
a
los
resultados
se
concluyo
que
el
modelo
propuesto
de
interacción
Bnr3a
–
VPH16
es

un
modelo
con
una
adecuada
conformación
debido
a
que
cumplió
con
los
parámetros
físicos
y

estequiométricos
de
estabilidad.
Por
lo
tanto
fue
posible
llegar
a
desarrollar
un
modelo
de

interacción
con
el
cual
se
pueden
desarrollar
modelos
moleculares
de
vacunas
génicas
contra

el
VPH
específicamente
para
la
variante
16
del
virus.
Estos
modelos
funcionarían
como
agentes

competitivos
contra
el
virus
los
cuales
no
evitarían
necesariamente
que
lleve
a
cabo
su
ciclo
de

replicación
viral
sino
evitarían
que
los
oncogenes
fuesen
activados
en
este
virus,
con
esto
se

propone
reducir
la
mortandad
por
metástasis
del
cáncer
ocasionado
por
la
detección
tardía
de

40

VPH,
este
modelo
además
serviría
como
una
guía
para
implementar
otros
agentes
que

controlen
el
nivel
de
expresión
de
estos
oncogenes.

Por
lo
tanto
es
posible
desarrollar
una

vacuna
génica
con
la
secuencia
nucleotídica
de
VPH-‐16
subtipo
1
para
disminuir
la
progresión

a
cáncer
cérvicouterino.
La
presente
metodología
permitirá
desarrollar
una
metodología
mas

accesible
que
el
scrennig
molecular
para
desarrollar
fármacos
altamente
específicos.

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