Validación Métodos Analíticos

Validación Métodos Analíticos
Cuantitativos, Cualitativos y
SemiCuantitativos en el Lab. Clínico

Norma NCh2547.Of2008
(ISO 15189)
• 5.5 Procedimientos Analíticos.
• 5.5.2 El laboratorio debe usar sólo
procedimientos validados.
VALIDAR VERIFICAR

Validación
“Confirmación mediante el examen y la
obtención de evidencias objetivas que
aseguran el cumplimiento de una serie de
requerimientos particularmente definidos
para aplicaciones concretas”
(ISO 8402-1994 o NCh2000 – ISO 8402).

Validación de Métodos
Cuantitativos
Parámetros de calidad (desempeño analítico):
- LINEALIDAD
- EXACTITUD:
-PRECISIÓN: *Repetibilidad
*Reproducibilidad
-VERACIDAD, Trazabilidad
- INCERTIDUMBRE
- SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS
- SENSIBILIDAD
- LÍMITE DE DETECCIÓN
- LÍMITE CUANTIFICACIÓN
- ROBUSTEZ

Concentración
Respuestadelinstrumento
Intervalo
lineal
LL
LC
LD
LL = L. de linealidad
LC = L. de Cuantificación
LD = L. de Detección
Análisis Cuantitativo

- LINEALIDAD
Capacidad del método analítico de obtener resultados
linealmente proporcionales entre la concentración del analito
y su respuesta.
Análisis estadístico:
*Curva regresión y = a + b x
*Coeficiente de determinación r2
*Análisis de varianza (regresión) con
 Estimación falta de ajuste
 Error residual puro.
Si p>0,05 es
significativo y por
ende los datos
tienden a ser lineales.

1 Selección del modelo: Normalmente una línea recta
y = a + b x
(donde a es la pendiente de la recta y b la ordenada al origen)
2 Establecimiento del diseño experimental:
 dominio experimental: rango de concentraciones
 distribución de las medidas
 número de medidas
3 Estimación de los parámetros del modelo.
Regresión por mínimos cuadrados.
4 Validación del modelo: ANOVA
Etapas De La Regresión

Linealidad: Curva de Calibración IgG
INMUNONEFELOMETRÍA
X log(X) Y log(Y) Y log(Y)
11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977
5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827
2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611
1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332
0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013
0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544
Concentración (mg/dL) Medición 1 Medición 2
Medición instrumental (señal):
Intensidad de la luz dispersada por los complejo
antígenos-anticuerpos.

CONCENTRACION mg/dL
LECTURA
0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
Curva Calibración IgG

log conc.
loglectura
INMUNONEFELOMETRÍA
-0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
Curva Calibración IgG

Exactitud
Grado de concordancia entre el resultado de
una medición y el valor de referencia aceptado
o verdadero.
* Nota: El término “exactitud” cuando se
aplica a un conjunto de resultados de
mediciones implica la combinación de
los componentes aleatorios y de un
error sistemático común o de un
componente de sesgo (Norma ISO
5725-1 e ISO 3534-1)

Exactitud
(Norma ISO 3534-1)
- Precisión: grado de concordancia entre
resultados de mediciones obtenidas
independientes bajo condiciones establecidas
(repetibilidad y reproducibilidad).
- Veracidad: grado de concordancia entre el
valor medio obtenido a partir de una serie de
resultados y un valor de referencia aceptado.
Exactitud = Precisión + Veracidad

Precisión
La precisión depende sólo de la distribución de errores
aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor
verdadero o el valor especificado.
-Repetibilidad
-Precisión intermedia o reproducibilidad
intralaboratorio
-Reproducibilidad
(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

REPETIBILIDAD:
Es la medida de la precisión de un método efectuado
en las mismas condiciones, sobre el mismo analito, con
el mismo método, con el mismo operador, utilizando el
mismo instrumento de medida y durante un corto
intervalo de tiempo.
PRECISIÓN:
Grado de concordancia entre resultados de mediciones
obtenidas de una serie repetida de análisis, sobre una
muestra homogénea, bajo condiciones establecidas
(Norma ISO 3534).
Validación

Media
Desviación estándar
Coeficiente de variación
Análisis de varianza F (comparación de la desviación
estándar)
Estudio homogeneidad muestra:
Análisis de varianza (F)
Prueba de “t”de Student.
Análisis Estadístico De La
Precisión

REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA
PARA LA DETERMINACIÓN IgG
(Homogeneidad Muestra)
Muestra Contramuestra
n 6 6
Media 1557.50 1554.67
s 52.129 82.199
CV 3.347 % 5.287 %
“t” calculado = 0.0713 < “t” tabla 5;0.025 = 2.571
No existe diferencia estadística significativa y por lo tanto las
muestras son iguales y homogéneas.

REPRODUCIBILIDAD:
Es la medida de la precisión de los resultados de un
método analítico efectuado sobre el mismo analito, pero
en condiciones diferentes (diferentes equipos utilizados,
el operador, el período de tiempo, etc.)
PRECISIÓN
Validación

Reproducibilidad
Inmunonefelometría para
Determinación de IgG
IgG mg/dL
DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3
1556 1568 1564
1568 1543 1606
1624 1556 1585
1481 1598 1556
1598 1602 1535
1518 1413 1568

n 18 (en tres dìas diferentes)
media 1557.72
DE 12.27
CV 0.8 %
Precisión 99.2 %
Análisis de Varianza
--------------------------------------------------------------------------------------
Fuente var. SC gl CM F P
--------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626
Intra grupos 40682,8 15 2712,19
--------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 42179,6 17
REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG
Si F < P no existe
diferencia
estadística
significativa en
las mediciones
de los grupos.

VERACIDAD:
Grado de concordancia entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y el valor de
referencia aceptado (certificado). Norma ISO 3534
Análisis estadístico
Media experimental
Desviación estándar experimental
Prueba de “t” de Student
ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA
MRC DB Lote 084705
IgG mg/dL
n = 10 931,8
942,3
951.8
924,8
918,6
927.1
920,5
938,4
935,2
918,8
Media experimental 930.9
Media certificada 925.0

Valor exp. MRC
media 930,9 925
s (DE) 11,0545
“t” calculado = 1,6963 <“t” (tabla) 9;0.025 = 2,262
p = 0,124
s
nμΧ
t
α/21,-n
Se acepta la hipótesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad
VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA

Incertidumbre
Magnitud asociada con el
resultado de medición que
caracteriza la dispersión de
los valores que
razonablemente podrían ser
asignados al mesurando.

-Incertidumbre estándar:
Incertidumbre de un resultado de medición expresada
como desviación estándar.
-Incertidumbre estándar combinada:
Incertidumbre estándar como resultado de una
estimación mediante la propagación de errores con
base en las incertidumbres individuales.
-Incertidumbre expandida
Incertidumbre estándar que se expresa como un
intervalo de confianza.
Incertidumbre

Cálculo de Incertidumbre
Expandida
gl = n - 1 (grado libertad)
nivel = 0,05
U MRC IgG exp. = ± 7,9 mg/dL
n
s
tU 1-nα/2;
x

SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD
Capacidad del método analítico para medir en
forma exacta un analito particular dentro de una
mezcla compleja, sin interferencia de otras
sustancias o analitos.
Magnitud influyente, magnitud que no es el mesurando
pero afecta al resultado de la medición (interferencia).
Validación

Interferencia de la
Señal
Algunos compuestos presentes en la muestra
por un artefacto aumentan o disminuyen la
magnitud del mecanismo de detección.
Ejemplos:
Fluoresceína, EDTA , Azida de
Sodio, Lípidos, Complemento,
Fibrinógeno, Albúmina

Detección y Control de
Interferencias
• Son difíciles de detectar pues se desconoce el resultado
verdadero. Se obtienen de los datos del fabricante o de
literatura. El laboratorio debe establecer requisitos de
ausencia de interferencia para valores definidos de las
magnitudes.
• Verificar resultados de pacientes con condiciones clínicas
asociadas con interferencias (enfermedades hepáticas,
fallas renales, embarazo, incongruencias con cuadro
clínico).
• Inspeccionar las muestras visualmente buscando hemólisis,
ictericia, lipemia o evaluarlas usando indicadores séricos.

Estudio de Interferencias
1 Prueba de dilución lineal (las interferencias no se
comportan linealmente con la dilución).
2 Analizar la muestra por otro método
(comparación de métodos).
3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir
sustancias potencialmente interferentes.
4 Análisis de muestras enriquecidas con el
interferente.

SENSIBILIDAD
Es la capacidad de un método analítico de
registrar ligeras variaciones de la concentración.
ms
b
γ Sensibilidad
b = Pendiente obtenida desde la regresión lineal.
Sm = desviación estándar de la muestra.
Validación

LÍMITE DE DETECCIÓN (LD)
Menor concentración o cantidad de analito
detectable con razonable certeza por un
procedimiento analítico dado. Concentración que
proporciona una señal en el instrumento
significativamente diferente de una muestra blanco.
b
s*3y
LD bl
b l
Ybl = señal promedio del blanco.
Sbl = desviación estándar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del
analito.
Validación

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC)
Es la menor concentración de analito que puede
determinarse con precisión y exactitud razonables
en las condiciones establecidas y se expresa en
unidades de concentración.
b
s*10y
LC bl
bl
Ybl = señal promedio del blanco.
Sbl = desviación estándar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del
analito.
Validación

ROBUSTEZ:
Grado de concordancia de los resultados al efectuar
cambios en las condiciones operativas y
ambientales normalizadas del método.
Validación

Robustez
Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado
por pequeñas pero deliberadas variaciones en los
parámetros del método y provee información de su
comportamiento en la rutina.
Parámetros estudiar:
- Efectos del congelado-descongelado
- Tiempos de incubación
- Cambio pH tampones
- Temperaturas de incubación
- Longevidad de los reactivos
- Preparación de la muestra
- Conservación de la muestra.

NORMA NCh 2446.Of1999
Guía para la validación de métodos de ensayo
Principios y conceptos generales
5 Procedimiento de validación
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditación
deben contar con procedimientos y directrices para planificar y
controlar el proceso de validación de métodos de ensayo. Sin
embargo, la discusión anterior ha indicado claramente que no
puede desarrollarse un procedimiento único. En consecuencia,
tiene que desarrollarse una gama de diferentes alternativas de
técnicas de validación. Cuán detallada deba ser la validación,
depende de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).

DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de
Bioq. Clín. y Patología Molecular
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clínico debería establecer requisitos y verificar, al menos
las siguientes características metrológicas:
1.-Error sistemático (sesgo). El fabricante del calibrador deberá
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deberá proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados. Sin
embargo, el Laboratorio debería obtener sus evidencias que el proceso
proporciona resultados satisfactorios.
2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deberá
proporcionar la información de las interferencias.

SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:
3.-Imprecisión interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Límite de detección. El fabricante deberá propocionar
especificaciones de imprecisión, sensibilidad y límite de detección. El
Laboratorio debería estudiar el límite de detección cuando observa
diferencia.
5.-Contaminación
6.-Verificar dilución
DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de
Bioq. Clín. y Patología Molecular

Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,
College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)
Recomendación de validación de métodos de acuerdo a la
complejidad de la prueba o determinación:
Pruebas de mínima complejidad (waived tests).
No hay recomendación para la validación de método.
Seguir directrices del fabricante.

Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el
FDA los estudios de validación de métodos deberian seguir las siguientes
recomendaciones:
- Verificar los parámetros de calidad o especificaciones de desempeño
(demostrar resultados comparables a los establecidos por el fabricante):
- Exactitud
- Precisión
- Rango de los resultados analíticos reportado por el método
- Verificar que los intervalos de referencia del fabricante son apropiados para
la población de pacientes del laboratorio.
Accreditation)

Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el
FDA
Actividades a realizar por el laboratorio:
- Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo.
- Replicar muestra o control para estimar la imprecisión
- Hacer estudio de linealidad para estimar el rango de la determinación
reportado por el fabricante
- Obtener valores de referencia para verificar intervalo de referencia indicado
por el fabricante
Accreditation)

Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio, la validación de los métodos requiere:
- Exactitud
- Precisión
- Sensibilidad analítica
- Especificidad analítica, incluyendo el estudio de sustancias
interferentes
- Rango de los resultados analíticos reportado por el método
- Intervalo de referencia (valores normales)
- Cualquier otro parámetro requerido para el desempeño del método
Accreditation)

Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio
Actividades a realizar por el laboratorio:
- Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo.
- Replicar muestra o control para estimar la imprecisión
- Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar
- Límite de detección para estimar interferencias permanentes
- Experimentos de recuperación para estimar proporción de interferencias
- Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
Accreditation)

Métodos Cualitativos y/o
Semicuantitativos
• En los laboratorios de análisis se generan
cada vez más mediciones que dan
respuesta rápidas de tipo cualitativo.
• Respuesta de tipo binario: Si / No .
– Presencia o ausencia de determinado analito.
– Presencia o ausencia de un determinado nivel del analito.
• Se denominan sistemas de “screening”.

Sistemas de Screening
• Muchas veces se utilizan como una etapa previa
para luego realizar un análisis cuantitativo y
confirmatorio.
• Evita análisis cuantitativos a muestras que dan
negativo.
• A nivel microbiológico generalmente en
identificación bacteriana son diagnósticos y no
presuntivos.

Análisis Cualitativo
Sistema de
tamizaje
(screening)
Análisis
cuantitativo
No se
analiza
> 2 ng/mL
< 2 ng/mL
NO
SI
•Menor experimentación.
•Decisión rápida.
•De fácil manejo, portátiles, etc.
•Sin necesidad de equipos.
•Ahorro.
Presencia del analito
Ausencia del analito
Método Confirmatorio

Sistemas de Medida Cualitativos
 Análisis cualitativo clásico o sensorial:
 Color: cambio, aparición.
 Olor.
 Turbidez.
 ELISA.
 Crecimiento bacteriano.
 Detección instrumental:
 UV: fluorescencia, potenciometría.
 Sensores: químicos, bioquímicos, etc.
 ELISA.

Análisis Cualitativo Clásico o
Sensorial
• La respuesta binaria SI/NO se obtiene
directamente.
• En general la presencia del analito se determina
por comparación con un blanco.
– Pruebas baterías bioquímicas
• Se encuentran también las pruebas de Kits.
– Son dispositivos comerciales para pruebas concretas.
– Contienen todos los reactivos necesarios.
– Pueden contener algún instrumento sencillo.

Análisis Cualitativo Clásico o
Sensorial
• Pruebas de kits:
– Látex para serotipificar Streptococcus.
– Tiras de orina.
– Pruebas rápidas para meningitis bacterianas.
– API.
– Método de CIM por microdilución
en microplacas.
– Coaglutinación.
– Método ELISA rápido para detección
C. difficile

Análisis Cualitativo Sensorial
• La determinación se hace mediante una
medida instrumental:
– Colorimetría.
– Fluorescencia.
• La presencia o no de un determinado analito
puede ser el nivel límite de detección o a un
nivel superior.

Análisis Cualitativo Sensorial
• La respuesta instrumental que se obtiene se
transforma en respuesta binaria SI/NO e implica
un tratamiento de datos.
• Primero hay que establecer la respuesta
instrumental:
• Valor de absorbancia para la concentración
correspondiente.
• Si el valor es superior la respuesta es Si.
• Ej. Métodos automatizados para Hemocultivos.
• Ej. Métodos automatizados para CIM.
• Ej. Estandarización automatizada a 0,5 MF.

Método de ELISA
• Método Semicuantitativo.
• Se basan en una reacción inmunológica.
• La detección puede ser sensorial o
instrumental.
• Ej. Bacterias: C. difficile, E. coli .
• Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampión, etc.
• Ej. Parásitos: Chagas
• Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc.

Validación Métodos Cualitativos
• Métodos cualitativos también deben validarse.
• Validar consiste en verificar y documentar su
validez a requisitos específicos.
• La validación implica como etapa previa la definición
de los requisitos analíticos o de calidad.
• Luego entonces la determinación de estos
requisitos.
• Los resultados se expresan diferente a los métodos
cuantitativos.

Expresión de Resultados
 Métodos Cualitativos
Análisis Cualitativo / screening
SI / NO
Con probabilidad
de error
 También tiene dos valores el primero binario y el
segundo es la probabilidad de error asociada a la
decisión tomada.
 Se expresan en términos probabilísticos.

Requisitos de Calidad
Método Cuantitativo Método Cualitativo
Linealidad.
- Homogeneidad.
Precisión:
- Repetibilidad.
- Reproducibilidad.
- Robustez.
Veracidad (exactitud).
Incertidumbre.
Limite de detección.
Límite de cuantificación.
Rango de cuantificación
Selectividad e Interferentes.
Especificidad.
Sensibilidad.
Valor predictivo positivo (VPP).
Valor predictivo negativo (VPN).
Exactitud diagnóstica.
Límite de corte (cut-off).
Incertidumbre o región de error.
Límite de detección.
Robustez.

Especificidad
• Se define como la capacidad o habilidad del
sistema de detectar en forma exacta un analito
en una matriz.
• Proporción de muestras negativas (no reactivas)
que son correctamente identificadas.
• Generalmente se expresa como probabilidad.

Analito
presente
Analito
ausente
Método
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos (FP)
Método
negativo
Falsos
negativos (FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporción de muestras sin el analito, cuyo método es
negativo:
E = VN / (VN + FP)
Especificidad (E)

• Es la capacidad o habilidad del sistema de
detectar muestras positivas cuando realmente lo
son.
• Proporción de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
• Generalmente se expresa como probabilidad.
• Concentración de un analito necesaria para
producir una unidad de cambio de lectura
instrumental.
Sensibilidad

Analito
presente
Analito
ausente
Método
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos (FP)
Método
negativo
Falsos
negativos (FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporción de muestras que contiene el analito cuyo
método es positivo:
S = VP / (VP+FN).
Sensibilidad (S)

Falsos Negativos (FN)
• Desviación negativa.
• El método a validar da un resultado negativo y el
método de referencia da positivo.
• Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, dé como negativa por el método.
• Corresponden a muestras que contienen uno o más
analitos por encima del valor límite permitido y que en
prueba de screening dan respuesta negativa.
• Se concluye con este resultado previo que la muestra
no contiene el analito en los niveles fijados cuando si
lo contiene.

Falsos Positivos (FP)
• Desviación positiva.
• Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, dé como positiva por el método.
• Corresponden a aquellas muestras que realmente no
contienen el analito en el nivel definido y que por Ej. la
prueba de screening lo detecta.
• Se produce cuando el método a validar proporciona
un resultado positivo sin confirmación y el método de
referencia da un resultado negativo.

Exactitud Diagnóstica
• Proporción de resultados correctos
(verdaderos positivos + verdaderos negativos).
• Capacidad para detectar correctamente los
positivos y los negativos.
• Es el grado de concordancia entre el resultado
obtenido en un ensayo y el valor de referencia
que debiera obtenerse.

Analito
presente
Analito
ausente
Método
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos(FP)
Método
negativo
Falsos
negativos(FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporción de resultados correctos :
ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)
Exactitud Diagnóstica (ED)

Criterio de Exactitud Diagnóstica
El mejor criterio actual para establecer la
presencia o ausencia de la condición
(enfermedad), evento o característica de
interés usando un método simple o una
combinación de métodos de laboratorios que
incluyan, pruebas de imagen, patológicos,
información clínica, ensayos o paneles de
referencia.

Límite de Corte o Cut-off
• Limite de cuantificación??
• Número mínimo de microorganismos dentro de una
variabilidad definida que pueden determinarse bajo
las condiciones experimentales del método
evaluado.
• Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos.
• Relacionado a la sensibilidad, corresponde al nivel
de concentración donde la sensibilidad es un 95% y
la probabilidad de error tipo β es de un 5%.

Resultados métodos
Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
Límite de Corte (cut-off)

Definiciones de Requisitos de
Calidad
• Valor del Límite de Corte (cut-off). Valor de corte del método, dado
principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados positivos y
bajo cut-off, resultados negativos. Se basa en una dicotomía
(presencia/ausencia, si/no, etc.).
C= 2ng/mL

Calidad
• Región de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisión del
método, es un rango donde encontramos error Tipo I o α (Falsos
positivos) y Tipo II o β (falsos negativos) del método.
C= 2ng/mLα β

Calidad
• Región de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2):
– C50: Concentración del analito donde se produce un 50% de resultados
positivos y un 50% de resultados negativos.
– Intervalo C5 – C95: Rango de concentraciones requeridas del analito
donde a concentraciones < de C5, son resultados concretamente
negativos y > C95 son concretos positivos.
Verdaderamente Negativas. Verdaderamente Positivas.C50

Límite de Detección
• Cantidad mínima de analito que puede ser
detectado en una muestra pero que no puede
ser estimado con precisión o sea que no
necesariamente es cuantificado en las
condiciones del ensayo.
• Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos.
• Los resultados se expresan como detectado / no
detectado.

Robustez
 Efecto Matriz:
 Capacidad de un procedimiento de permanecer
inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones
en los parámetros del método y provee información
de su comportamiento en la rutina.
 Identificar variables que pueden tener efectos
significativos en la respuesta del método.
 Analizar cada set en condiciones experimentadas
dadas y determinar el efecto de cada cambio.
 Efectos congelado/descongelado, tiempos y
temperaturas de incubación, cambios pH, preparación
y conservación de la muestra y reactivos.

Resumen: Definiciones Requisitos
de Calidad
• Especificidad. Proporción de muestras negativas (no reactivas)
que son correctamente identificadas.
• Sensibilidad. Proporción de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
• Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, dé positiva por el método.
• Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, dé negativa por el método.
• Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra
de ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba
resulta reactivo.
• Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra
de ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo.
• Exactitud diagnóstica analítica. Capacidad del método para
detectar correctamente los positivos y los negativos.

Observaciones
• Hay pruebas en las que tiene un impacto a nivel
de Salud Pública además de individual al dar un
resultado Falso (+) o Falso (-)
– Ej. VIH, HEP. B
• En resistencia antibiótica es de mayor impacto
los falsos negativos, o sea informar como
sensible cuando es resistente.
• De mayor trascendencia también en Falsos (-):
– Hemocultivos, meningitis, resistencia antibiótica,
VIH, etc.

Método ideal
„Normal‟ Enfermo
Valores
método
No falsos positivos o negativos
Nrdeindividuos

Realidad Métodos
Normal, sin el analito Enfermo, con el analito
Valores
Método
+2SD
Falsos
Negativos
Falsos
Positivos
Nrdeindividuos

Resultados métodos
Sin enfermedad
Con enfermedad
Verdaderos Positivos
Definiciones del ejemplo

Resultados método
Pacientes “negativos” Patientes “positivos”
Sin enfermedad
Con enfermedad
Falsos
Positivos

Resultados métodos
Sin enfermedad
Con enfermedad
Verdaderos
negativos

Resultados método
Sin enfermedad
Con enfermedad
Falsos
negativos

Evaluador de los requisitos de
Calidad
• Tablas de Contingencia. Diferencian las muestras en dos
categorías, (+)/(-) según el método, y establecen una tabla de
comparación respecto del resultado obtenido mediante el
criterio de exactitud diagnóstica analítica.
Criterio de exactitud diagnóstica
Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total
POSITIVOS VP FP VP + FP
NEGATIVOS FN VN FN + VN
Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN
*CLSI: EP12-A2

Tablas de Contingencia
• Las mas simples son las que diferencian las
muestras en dos categorías : positivo o
negativo.
• Luego se establece una tabla de comparación
respecto al resultado obtenido con resultado de
método de referencia .
• A partir de la tabla se calculan los cuatro
parámetros básicos, además de otros: falsos(+),
falsos(-), sensibilidad y especificidad.

Tablas de Contingencia
Ventajas:
o Son de fácil aplicación en la mayoría de los
bioensayos.
Desventajas:
o Dan una medida global de la capacidad del método.
o Se estima que la muestra se comportará
estadísticamente de forma similar a las ya analizadas.
o No se calcula una probabilidad de error en cada
muestra en particular.
o La capacidad de la tabla depende del número de
muestras analizadas.

Calidad
• Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero
(positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale
decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B.
P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b)
P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b)
P(a): prob. de obtener un resultado positivo
P(b): prob. de obtener un resultado negativo
P(p/a): prob. de obtener un resultado (+)
cuando esta presente la enfermedad.
P(p/b): prob. de obtener un resultado (+)
cuando no esta presente la enfermedad.

Calidad
• Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Curvas de
Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones en
la sensibilidad y especificidad que son resultantes de la modificación
que se haga en los niveles de corte, de acuerdo al proceso de
decisión clínica para un analito determinado.
* A. Pulido, I. Ruisánchez, R.
Boqué , F.X. Rius

Sensibilidad vs. Especificidad.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
ESPECIFICIDAD (Fracción verdaderos
negativos)
SENSIBILIDAD
(Fracciónverdaderospositivos)
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
1-ESPECIFICIDAD (Fracción falsos
positivos, FFP)
SENSIBILIDAD
(Fracciónverdaderospositivos)
Sensibilidad vs. 1- Especificidad.

Lectura de las Curvas ROC
* http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/

PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO ANALÍTICO- Identificación
- Titulo
- Protocolo redactado por
- Protocolo aprobado por
- Objetivo
- Alcance
- Factores críticos
- Selección y tratamiento muestra y MRC
- Identificación equipo: certificado calibración
- Método analítico:
- Variables a determinar : análisis estadístico
- Personal que desarrollará la validación
- Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño
- Conclusiones
- Registros
- Referencias

INFORME DE VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO ANALÍTICO- Identificación
- Titulo
- Informe redactado por
- Informe aprobado por
- Objetivo
- Alcance
- Responsabilidad
- Equipo, materiales, documentos
- Procedimiento
- Cálculos y análisis estadísticos
- Criterio de aceptación vs Resultados
- Informe de desviaciones
- Informe resultados y conclusiones de validación del
método

Cuándo Verificar y
cuándo Validar ???
VALIDAR VERIFICAR

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