Web asebir dic2011
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This document summarizes the program for a conference on embryology and clinical biology of reproduction. It includes sessions on andrology, embryology, quality, genetics, and debate. Topics discussed include new sperm selection techniques, non-invasive embryo assessment, embryo cataloging standards, genetic screening methods, and a discussion on the role of embryologists.
![S E S I Ó N t DI E UAl N D R O l O G Í A
t O
Alberto Pacheco
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EStADO ACtUAl DEl GRUPO DE INtERÉS DE ANDROlOGÍA
Alberto Pacheco
El Grupo de Interés presentará la actualidad del trabajo realizado, los proyectos en marcha y las propuestas de futuro del grupo.
NUEVAS tÉCNICAS DE SElECCIÓN DE ESPERMAtOzOIDES:
SElECCIÓN MEDIANtE SEPARACIÓN MAGNÉtICA
Sonja Grunewald
PD Dr. med. habil. University of Leipzig, European Academy of Andrology Training Centre, Leipzig, Germany.
e-mail: sonja.grunewald@medizin.uni-leipzig.de
INTRODUCTION 1997). Signs of the terminal phase of Although the sperm apoptosis cascade
apoptosis are the externalisation of might differ from somatic cells,
Male infertility is the sole or the phospholipid phosphatidylserine at activated apoptosis signalling in human
contributing factor in almost half of the outer side of the plasmamembrane ejaculated spermatozoa is associated
the couples failing to conceive (Sharlip (early), DNA fragmentation and with impaired fertilization capacity.
et al., 2002). Semen analysis including morphologic changes (late). Male infertility is only a symptom
the assessment of sperm concentration, for a variety of spermatozoal defects
motility and percentage normal While receptor mediated apoptosis originating from different andrological
forms is the standard procedure for signal transduction might be of rather diseases. Possibly, the increased
evaluating the male fertility potential minor functional relevance in human susceptibility on pro-apoptotic stimuli
(World Health Organization, 2010). ejaculated spermatozoa (Grunewald et and activation of apoptosis signalling is
Although the conventional analysis al., 2005a), sperm mitochondria are a common mechanism for various sperm
gives considerable information, it does especially susceptible to cellular stress pathologies.
not provide information about impaired due to the compartmentalization in
sub-cellular processes in human the midpiece. Certain studies proved Several studies indicate that semen
sperm and defined pathophysiological that the classical mitochondria- samples from infertility patients contain
diagnosis of male infertility is often derived apoptosis signalling-cascade higher levels of activated caspases and
missed. In recent years many studies is activated in spermatozoa by disrupted mitochondrial membrane
investigated the presence and specific pro-apoptotic stimuli as well potential compared to healthy donors
significance of activated pathways of as by cryopreservation and thawing (Gandini et al., 2000; Grunewald et al.,
programmed cell death (apoptosis) in (Grunewald et al., 2005a; Oehninger et 2005b; Grunewald et al., 2010; Grunewald
spermatozoa, which may be partially al., 2003; Paasch et al., 2004b; Paasch et al., 2009; Shen et al., 2002).
responsible for the low fertilization and et al., 2003; Perticarari et al., 2008;
implantation rates seen with assisted Wang et al., 2003). High levels of DNA Subgrouping analysis of the infertility
reproductive techniques (Oehninger et fragmentation are one major endpoint patients revealed that the percentage of
al., 2003). and an archetypal signature of the caspase-positive sperm was elevated in
apoptosis process. However, due to the patients with pathological spermiogram
The term apoptosis defines programmed highly packed, condensed chromatin compared to fertile donors, but almost
cell death, which is molecularly and in sperm, the apoptosis signal is only equally elevated in those patients
morphologically distinct from necrosis insufficiently transferred into DNA showing normal spermiogram parameter
(Kerr et al., 1972). Models of apoptosis fragmentation. Particularly the release (Grunewald et al., 2005b). Semen
as known from somatic cells include of ROS from mitochondria contributes samples with oligoasthenozoospermia
receptor-mediated pathways and directly to sperm DNA damage (Aitken show higher incidences of sperm with
intrinsic triggered apoptosis (mediated et al., 2011). DNA fragmentation is apoptotic features compared to samples
by disruption of mitochondria a significant factor in defining the with normozoospermia (Marchiani et
membrane potential) in addition to functionality of spermatozoa and has al., 2007). This might be explained
cytotoxic or stress-induced forms been linked in numerous studies with a by alterations of the mitochondrial
(Green, 1998). Both, extrinsic and wide variety of adverse clinical outcomes membrane potential, which severely
intrinsic pathways result in activation including impaired fertilization, affect sperm motility. Another example
of proteases (cytosolic aspartate disrupted preimplantation embryonic are semen samples from patients with
specific proteases, CASPASES, [CP]) and development, poor implantation varicocele, which contain significantly
as a consequence in well orchestrated rates and an increased incidence of more sperm with active apoptosis
cell degradation (Salvesen et al., miscarriage (Zini et al., 2008). cascade than samples from donors](https://image.slidesharecdn.com/webasebirdic2011-111020052937-phpapp01/85/Web-asebir-dic2011-14-320.jpg)
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Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2
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010: MARcAJE DIREcTO DE EMBRIONES DE RATÓN PARA SU
IDENTIFIcAcIÓN MEDIANTE ADHESIÓN DE MIcROcÓDIGOS A LA
ZONA PELÚcIDA
S. Novo1, O. Penon2,3, R. Gómez4, Ll. Barrios1, M. Duch4, J. Esteve4, J. Santaló1, C. Nogués1, J. A. Plaza4, Ll. Pérez-García 2,3, E. Ibáñez1
1
Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193, Bellaterra.
2
Departament de Farmacologia i Química terapèutica, Facultat de Farmàcia.
3
Institut de Nanociència i Nanotecnologia, Universitat de Barcelona.
4
Institut de Microelectrònica de Barcelona IMB-CNM (CSIC).
e-mail: sergio.novo@uab.cat
e-mail: elena.ibanez@uab.cat
INTRODUCCIÓN Tanto la viabilidad (comparada con en la retención, la tasa de identificación
un grupo no codificado) como la tasa no se vio afectada y se mantuvo en
La correcta identificación de las de retención de los códigos fueron porcentajes similares (n= 171; 97.1%) a
muestras durante la aplicación de determinadas durante las 96h de cultivo. los del grupo no criopreservado.
técnicas de reproducción asistida Se realizaron test de identificación
humana es primordial para evitar cada 24h bajo un microscopio CONCLUSIÓN
errores de trazabilidad. Nuestro grupo invertido sin la manipulación del
trabaja en el desarrollo de un sistema embrión, con el objetivo de simular Con el sistema descrito en este trabajo,
de identificación directo para ovocitos/ un sistema automático de lectura. establecemos un método más sencillo de
embriones. En un trabajo anterior Además, la efectividad del sistema de incorporación de códigos a embriones,
presentamos un sistema basado en la codificación fue testada tras procesos con una tasa de identificación (96.5%)
incorporación de códigos de polisilicio de criopreservación. equivalente a la del método anterior
en el espacio perivitelino (1), logrando (97%) y que soluciona las limitaciones
resultados satisfactorios. No obstante, RESULTADOS descritas. El siguiente paso será analizar
este sistema muestra limitaciones la viabilidad in vivo de los embriones
tales como el uso imprescindible de El desarrollo in vitro hasta blastocisto de de ratón codificados y optimizar este
micromanipulación y que algunos los embriones codificados (n= 140; 90%) sistema de codificación para otras
códigos quedan adheridos a la superficie fue equivalente al del grupo control (n= especies de interés, con el objetivo de
del embrión después de eclosionar. 60; 88.3%). Una media de 9.56 ± 0.7 mejorar la trazabilidad de las muestras
Con el objetivo de superar estas códigos por embrión se mantuvieron asociada a la aplicación de las técnicas
limitaciones, en el presente trabajo unidos a la ZP después de 96 h de cultivo de reproducción asistida.
se plantea una posible alternativa: un (10 códigos: 65.9%; 9 códigos: 26.2%;
sistema de identificación basado en la 8 códigos: 6.3%; 7 códigos: 1.6%). La [1] S. Novo, L. Barrios, J. Santaló, R. Gómez-
incorporación de códigos de polisilicio tasa de identificación fue evaluada en Martínez, M. Duch, J. Esteve, J.A. Plaza, C.
biofuncionalizados para su adhesión a 100 embriones, obteniendo valores del Nogués, E. Ibáñez. Human Reproduction,
la zona pelúcida (ZP). 95.7% al 97.9% en los diferentes puntos 26: 96-105 (2011).
de análisis (cada 24 h). En total, 470 de
MATERIAL Y MÉTODOS los 487 procesos identificatorios fueron
positivos (96.5%).
Se codificaron embriones en estadio
de pronúcleo de la cepa B6CBAF1 Finalmente, se evaluó la validez del
con códigos de polisilicio (10 x 6 x 1 sistema de identificación tras procesos
μm), fabricados utilizando técnicas de criopreservación. Se codificaron
de microelectrónica (1). Los códigos 44 embriones en estadio de pronúcleo
fueron biofuncionalizados utilizando y a las 24h de cultivo se congelaron
la técnica de autoensamblaje de (estadio de 2 células). La viabilidad
monocapas con la lectina del germen de los embriones codificados después
del trigo, la cual se une específicamente de la descongelación (95.5%) fue
a monosacáridos presentes en las equivalente a la del grupo control (n=30;
glicoproteínas que forman la ZP. 90%). La tasa de retención disminuyó a
Los embriones fueron codificados 8.8 ± 1.2 códigos por embrión después
individualmente mediante el contacto de la descongelación, y hasta 8.7 ± 1.2
con 10 códigos biofuncionalizados, al final del periodo de cultivo in vitro
previamente colocados de forma (10 códigos: 33.2%; 9 códigos: 28.6%;
estratégica para lograr una distribución 8 códigos: 16.7%; 7 códigos: 16.7%; 6
uniforme sobre la superficie de la ZP. códigos: 4.8%). A pesar del descenso](https://image.slidesharecdn.com/webasebirdic2011-111020052937-phpapp01/85/Web-asebir-dic2011-93-320.jpg)
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28%, 32% y 18% respectivamente, no fresco de embriones de la misma calidad. que la técnica de criopreservación
mostrando diferencias significativas La vitrificación no sólo debería ser la minimice la pérdida embrionaria y
entre ambos grupos (p>0.05). Las tasas técnica de criopreservación de elección mantenga tasas de éxito comparables a
de implantación tampoco mostraron en la rutina del laboratorio de FIV para las obtenidas con embriones en fresco.
diferencias significativas (32% vs. 27%; la criopreservación de los embriones
31% vs. 28%; 17% vs. 21% y 12% vs. sobrantes, sino también en los casos En los últimos años se ha debatido
9%) (p>0,05). en los que la transferencia tenga que sobre los efectos deletéreos sobre el
posponerse. En estos casos, como endometrio y los embriones de los
CONCLUSIONES pueden ser pacientes que presentan niveles suprafisiológicos de estradiol
síndrome de hiperestimulación ovárica, en los ciclos de FIV. La vitrificación
Las tasas de gestación e implantación sangrados, ciclos de diagnóstico permitiría posponer la transferencia sin
no muestran diferencias significativas genético preimplantacional en los disminuir la probabilidad de embarazo y
tras la transferencia de embriones cuales es necesario acumular embriones evitar así los posibles efectos adversos.
vitrificados frente a la transferencia en o ciclos de donación, es imprescindible
021: EFEctO DE lA MUltINUclEAcIÓN EN DIVISIÓN tEMPrANA
EN El POtENcIAl DE IMPlANtAcIÓN DE EMBrIONES cON rItMO
ÓPtIMO DE DIVISIÓN
MC. Pons, I. Solvas, M. Grossmann, R. Noblom, J. Nadal
Centro Médico Teknon. Unidad de Reproducción Asistida
e-mail: ura@cmteknon.com
INTRODUCCIÓN ó 5-células y además habían presentado de ellos podemos constatar la presencia
DT (observación temprana a las 26,2h de un único núcleo en cada blastómero
Tanto la clasificación ASEBIR 2007 post-fecundación de promedio). (48%).
como el reciente trabajo del grupo de
consenso en clasificación embrionaria Evaluamos la tasa de implantación Comparando la tasa de implantación
(Alpha-ESHRE) penalizan fuertemente a partir de transferencias con 100% cuando se estudian transferencias
aquellos embriones que presenten implantación. homogéneas no se observan diferencias
algun blastómero multinucleado. significativas entre los dos grupos
El promedio de edad de las mujeres estudiados (DT-no MNB vs DT- MNB)
En un trabajo previo habíamos estudiado cuyos ciclos de FIV incluimos fue de (tabla 2).
la incidencia de multinucleación en 34,6 años [rango: 20-47]. Análisis
división temprana (DT) y observamos estadístico: χ2test, P<0,01. DT-no MNB DT- MNB
que la multinucleación detectada en Día+2-no MNB 1121 175
este estadio es un fenómeno temporal RESULTADOS
Embriones
que en día+2 desaparecía en el 75% de descartados
230 (20%) 49 (28%) ns
los embriones, aunque desconocíamos De los 1490 embriones analizados, la Embriones en
su significado clínico-biológico. incidencia de multinucleación en DT es transferencias 554 47
homogéneas
del 17%, se observa en 256 embriones
OBJETIVO (tabla 1). Implantación
165 (29,8%)% 9 (19,1%) ns
evolutiva
El objetivo del presente trabajo será DT Tabla 2
valorar el efecto de la multinucleación DT-no MNB DT- MNB n
en DT en el potencial de implantación 1234 256 1490
de estos embriones (no multinucleados Día+2-no MNB 1121 175 1296 CONCLUSIONES
en día+2), comparando los que Día+2- MNB 113 81 194
presentaban multinucleación en DT Tabla 1 1/ Se confirma que la multinucleación
frente a los que no la presentaban. detectada en DT es un fenómeno
temporal y reversible.
MATERIAL Y MÉTODOS Corroborando nuestro estudio previo,
en día+2 detectamos el fenómeno de 2/ La multinucleación en DT no afecta
Se analiza retrospectivamente (años reversión: no se observa presencia de negativamente a la tasa de implantación
2005- 2010) la nucleación de 1490 multinucleación en 175 (68,3 %) de los de los embriones con ritmo óptimo
embriones con ritmo óptimo de 256 embriones que sí la presentaban en de división (embriones en los que no
división, es decir que en día+2 tenían 4- DT y, lo que es más sorprendente, en 123 observamos multinucleación en día+2).](https://image.slidesharecdn.com/webasebirdic2011-111020052937-phpapp01/85/Web-asebir-dic2011-128-320.jpg)
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Estas marcas específicas del alelo diferencial en las DMR después de la MATERIAL Y MÉTODOS
paterno y materno, se presentan fecundación, tanto en el alelo materno
en las denominadas Regiones como paterno, como ha sido demostrado El DNA genómico extraído de placenta
Diferencialmente Metiladas en modelos animales. Estudios en el y cordón umbilical será analizado
(Differentially Methylated Region- modelo murino han demostrado que mediante la tecnología de arrays de
DMR) del genoma, siendo la expresión células con anomalías en la impronta microesferas basada en la tecnología
monoalélica resultante de los genes pueden quedar confinadas a la placenta Illumina Goldengate. Este array permite
regulados por estas DMR crucial para (Mann et al., 2004), recordando el cuantificar de forma simultánea la
el correcto desarrollo neurológico, fenómeno de rescate observado en metilación de todas las DMR conocidas
embrionario y de los tejidos el caso de anomalías cromosómicas. del genoma humano, así como de
extraembrionarios. La metilación En mamíferos, la placenta es crucial regiones promotoras de 150 genes
diferencial presente en las DMR en para el crecimiento fetal intrauterino relacionados con crecimiento y
las células diploides, se borra en las y los genes regulados por impronta metabolismo.
células germinales primordiales y la tienen un papel en la funcionalidad de
metilación específica del alelo paterno este tejido, por lo que anomalías de RESULTADOS
o materno se establece de nuevo en las la impronta presentes en la placenta
espermatogonias del individuo adulto podrían alterar su función normal, Se compararán los perfiles de metilación
o durante el período de maduración reflejarse en anomalías del crecimiento obtenidos del análisis de una serie de 74
de los ovocitos, respectivamente. y apuntar así una correlación entre los muestras (12 gestaciones gemelares, 4
Considerando que el proceso de datos epidemiológicos y un posible gestaciones de trillizos y 38 gestaciones
establecimiento de la metilación mecanismo. únicas) con aquellos obtenidos de una
en ovocitos es coincidente con la serie control y se discutirá la correlación
estimulación hormonal, planteamos OBJETIVOS de estos resultados con los parámetros
que la estimulación ovárica y reclusión del ciclo de reproducción así como con
de numerosos ovocitos podría alterar el Obtener y valorar los perfiles de los datos clínicos de la gestación y del
correcto establecimiento de la impronta metilación de las DMR en niños de recién nacido.
materna. Asimismo, el cultivo in vitro de concepción espontánea y niños
embriones preimplantacionales fuera concebidos por TRA (estimulación
del ambiente uterino, podría alterar ovárica, donación de ovocitos, FIV,
el mantenimiento de la metilación ICSI).
024: EStUDIO DEl PAtrÓN DE MOVIlIZAcIÓN DE [cA2+]I Y
DEl PAPEl DE lA ActINA EN lA rEAccIÓN AcrOSÓMIcA DE
PAcIENtES AStENOZOOPÉrMIcOS
G. Lozano, A. Ortiz, F. Monllor, M. Jiménez, J. Espino, I. Bejarano, JF. García, JA. Pariente, AB. Rodríguez
Centro Extremeño de Reproducción Humana Asistida. Hospital Materno e Infantil de Badajoz
e-mail: laoliventina@hotmail.com
INTRODUCCIÓN en espermatozoides con problemas en Se les realiza seminograma analizando
la motilidad. morfología, concentración y movilidad
Es conocido el papel del calcio mediante CASA, siguiendo las
intracitosólico [Ca2+]i en la OBJETIVOS indicaciones de la OMS.
fisiología del espermatozoide,
estando estrechamente relacionado Comparar la señal de [Ca2+]i provocada A las muestras tras incubarlas con
con procesos de hiperactivación, por PRG y el papel del citoesqueleto 1 µM de PRG, 1µM de Thapsigargina
quimiotaxis, control de la movilidad y su de actina en la ECC en el eyaculado (inhibidor de la recaptación de [Ca2+]
participación en la reacción acrosómica de pacientes normozoospérmicos y i por la mitocondria), Citocalasina
(RA) astenozoospérmicos. D y Jasplakinolide (inhibidor y
activador de la polimerización de
También es conocido el papel que MATERIALES Y MÉTODOS actina, respectivamente) se mide
juega la Progesterona (PRG) en la la movilización de [Ca2+]i mediante
inducción de la reacción acrosómica Muestras de semen (n= 25) de pacientes un espectrofluorímetro y la sonda
y actividad flagelar movilizando las que acuden al C.E.R.H.A del H.M.I de fluorescente Fura 2-AM.
reservas de [Ca2+]i y favoreciendo la Badajoz.
Entrada Capacitativa de Calcio (ECC), Los datos se tratan estadísticamente
observándose niveles bajos de [Ca2+]i mediante SPSS utilizando T-Student.](https://image.slidesharecdn.com/webasebirdic2011-111020052937-phpapp01/85/Web-asebir-dic2011-130-320.jpg)
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RESULTADOS 3.- Al incubar las células con CONCLUSIONES
antagonistas de los receptores de la
MovILIzaCIóN DE [Ca2+ I PRG (RU-38486) o con anticuerpos de Los espermatozoides de pacientes
EN NoRMozooSPéRMICoS y los receptores de PRG (PR c262), la ECC astenozoospérmicos presentan reducida
aSTENozooPéRMICoS EN RESPuESTa a se reduce significativamente. su respuesta a la PRG, no permitiendo
PRG realizar una ECC tan elevada como la
EFECTo DE La CyToCaLaSINa D y que se produce en espermatozoides
1.- La PRG moviliza el [Ca2+]i JaSPLakINoLIDE EN La ECC sin alteración en su movimiento. Un
déficit en los receptores de la PRG y su
2.- Las células incubadas con 20 1.- Las células estimuladas con PRG incapacidad para movilizar sus reservas
µM de PRG + 1µM de Thapsigargina se incuban con Cytocalasina D y de [Ca2+]i convenientemente puede
(inhibidor de la recaptación de [Ca2+]i Jasplakinolide observándose inhibida ser el responsable de sus problemas de
por la mitocondria) muestran una ECC la ECC en las mismas. movilidad.
significativamente menor en pacientes
astenozoospérmicos e independiente
de la Thapsigargina.
025: EFEctO DE lA SUPlEMENtAcIÓN DIEtÉtIcA cON DHA SOBrE
lA cAlIDAD SEMINAl
J.C. Martínez, J.C. Domingo, Cordovilla, M. Nicolás, L. Fernández, P. Albero, J. Landeras
IVI Murcia
e-mail: juancarlos.martinez@ivi.es
INTRODUCCIÓN ejerce sobre la calidad seminal, RESULTADOS
capacidad antioxidante y niveles de
Los ácidos grasos omega 3 son fragmentación de ADN de varones con En las características seminales
componentes fundamentales de las alteración en los valores espermáticos. iniciales se observa una diferencia
membranas celulares. De ellos el ácido significativa entre el grupo placebo y
docosahexanoico (DHA) se encuentra MATERIAL Y MÉTODOS el grupo suplementado con DHA tanto
en una alta proporción en la membrana en el porcentaje de espermatozoides
de los espermatozoides y está implicado Se realizó un estudio prospectivo, con motilidad total (46,30±2,41
en numerosos procesos funcionales aleatorizado, doble ciego con grupo vs 37,97±2,99) (p=0.02) como con
como son la reacción acrosómica, control con 64 pacientes que acudieron motilidad progresiva (42,95±2,37 vs
la fusión espermatozoide-ovocito o a la clínica IVI Murcia para evaluación 34,02±2,90) (p=0.04). Estas diferencias
la motilidad espermática. Existen por problemas de infertilidad. Los entre grupos desaparecieron tras 10
numerosos estudios que correlacionan pacientes incluidos en el grupo placebo semanas de ingesta de DHA.
la concentración de este ácido graso (29) ingirieron 1050mg/día de
con la calidad espermática así como con aceite de girasol durante 10 semanas. Tras 10 semanas de tratamiento se
la fertilidad masculina. Por otra parte Los pacientes del grupo DHA (35) observa una mejora significativa en el
diversos estudios coinciden en que los ingirieron 1050mg de DHA durante el grupo suplementado con DHA tanto en
ácidos grasos omega-3 presentan una mismo periodo. la capacidad antioxidante del plasma
alta capacidad antioxidante, llegando seminal, pasando de unos niveles
incluso a modular la expresión génica de Se determinó volumen, concentración, iniciales de 1.627,88 ±26,1 equivalentes
ciertas enzimas antioxidantes así como motilidad, morfología, capacidad de Trolox a 1.794,84±37,44 (p<0,1)
un excelente perfil de seguridad lo cual antioxidante total (TAC), composición como en los niveles de fragmentación
posibilita su uso como nutracéuticos lipídica tanto en la membrana de ADN pasando de 26,89±3,38% a
con distintos campos de actuación. espermática como en el plasma 11,01±1,65 % (p< 0,1).
seminal, así como la fragmentación
OBJETIVOS de ADN mediante test TUNEL. Todos En el resto de parámetros espermáticos
estos parámetros fueron evaluados analizados no se observa variación
El objetivo del presente estudio previamente al comienzo de la ingesta significativa tras la conclusión del
es determinar el efecto que la así como a las 5 y 10 semanas de iniciar estudio.
suplementación dietética con DHA la suplementación.](https://image.slidesharecdn.com/webasebirdic2011-111020052937-phpapp01/85/Web-asebir-dic2011-131-320.jpg)
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consecutiva de 72 pacientes sometidas a exacta de Fisher’s usando el programa CONCLUSIONES
tratamientos de fecundación in vitro (ICSI) estadístico SPSS 11.0. Para evitar sesgos
en la Unidad de Reproducción Humana debidos a la obtención consecutiva de los Tras realizar este estudio observamos
Asistida del Hospital General Universitario datos se aleatorizó la muestra. que cuando la rotura de la membrana
durante el período comprendido entre se produce sin salto durante la
abril de 2009 y febrero de 2010. RESULTADOS microinyección la probabilidad de que
el ovocito degenere es 6 veces mayor. En
Durante el procedimiento de microinyección La muestra obtenida en la aleatorización nuestro laboratorio hemos observado
se fueron registrando los distintos tipos fue de 244 ovocitos. Se obtuvieron que los ovocitos obtenidos de folículos
de rotura de la membrana ovocitaria diferencias estadísticamente ecográficamente post-maduros (>22
clasificando de la siguiente forma: con significativas en cuanto a la tasa mm.) presentan una mayor frecuencia
salto y sin salto. Posteriormente se evaluó de degeneración de ovocitos que de rotura de membrana sin salto, por lo
la fecundación, anotando los ovocitos que presentaban salto (8,3%) y la de los que la programación de las punciones
habían degenerado y los que no. que no lo presentaban (35,7%). La chi- en el momento adecuado es importante
cuadrado obtenida fue de 0.001 y la O.R. para los resultados del laboratorio.
Los datos obtenidos se analizaron mediante fue de 6,1 con un intervalo de confianza
el test chi-cuadrado con la corrección al 95% [1,6 – 20,0].
123: PArÁMEtrOS SEMINAlES EN VArONES cON VIH SEGÚN El
MANUAl DE lA OMS
I. Molina, MC. Gonzalvo, JA. Castilla, B. González, ER. Palacios, AP. Ortiz, S. Carrillo
Unidad de reproducción, Hospital Universitario Virgen de las Nieves
e-mail: imoglez@gmail.com
INTRODUCCIÓN consultan con su respectiva pareja en Número total de espermatozoides:
la Unidad de Reproducción de nuestro 170.714.516 espermatozoides
El estudio del semen permite conocer hospital, por deseos reproductivos.
el estado funcional de la secreción En todos los casos la carga viral para Movilidad total: 46.5%
exocrina de las glándulas sexuales VIH-1 de los pacientes fue inferior
masculinas y nos orienta sobre a 40 copias/ml. Además, 23 de los Movilidad (a + b): 30.8%
patologías del sistema genital. pacientes, presentaron coinfección por
En pacientes con VIH el análisis virus de la hepatitis C, siendo en todos CONCLUSIONES
de semen suele solicitarse dentro los casos la carga viral para el VHC
de la práctica clínica derivada del menor de 15 UI/ml. A todos ellos, se Todos los pacientes con VIH que
empleo de las diferentes técnicas de les realizó un análisis básico del semen, acuden a nuestro centro con deseos
reproducción asistida, encaminadas determinando, entre otros parámetros, reproductivos, presentan un volumen,
fundamentalmente a evitar la la concentración, volumen, número concentración espermática y número de
transmisión horizontal y vertical. de espermatozoides y movilidad de espermatozoides superior a los valores
los mismos. Los seminogramas fueron de referencia del manual de la OMS-
OBJETIVOS realizados en el periodo comprendido 99 de análisis de semen. Sin embargo,
entre 2005-2009. la movilidad espermática (tipo a+b)
El objetivo de este estudio fue comparar presentó un valor medio (30.8%)
los parámetros básicos del semen de RESULTADOS inferior al valor de referencia publicado
individuos infectados por VIH con los en el manual OMS-99 de análisis de
valores de referencia del eyaculado El análisis estadístico de los parámetros semen (≥50% de los espermatozoides
según manual OMS-99 de análisis de seminales, anteriormente citados, con motilidad tipo a + tipo b).
semen. muestran los siguientes valores medios:
MATERIAL Y MÉTODOS Volumen: 3.2 ml
Estudio retrospectivo observacional de Concentración:
33 pacientes infectados por VIH, que 58.453.125 espermatozoides/ml](https://image.slidesharecdn.com/webasebirdic2011-111020052937-phpapp01/85/Web-asebir-dic2011-217-320.jpg)
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- 1. Diciembre 2011 Vol. 16 · Nº2 REVISTA DE EMBRIOLOGÍA CLÍNICA Y BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN REVISTA SESIÓN DE ANDROLOGÍA SESIÓN DE CALIDAD Estado Actual del Grupo de Interés de Andrología Estado Actual del Grupo de Interés de Calidad del Laboratorio Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante de Reproducción Asistida separación magnética Medidas de seguridad en el manejo de las muestras biológicas Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante IMSI Control de calidad en los procesos del laboratorio de embriología SESIÓN DE EMBRIOLOGÍA SESIÓN DE GENÉTICA Estado Actual del Grupo de Interés de Embriología Estado Actual del Grupo de Interés de Genética y Reproducción Técnicas de diagnóstico no invasivo de selección embrionaria Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías Uso en el laboratorio de la catalogación embrionaria de ASEBIR. Estado actual Estandarización de las técnicas de biología molecular al DGP AULA VIRTUAL SESIÓN DE DEBATE Cinematografía para el estudio de la calidad embrionaria: EmbryoScope Embriólogos Clínicos: ¿Somos realmente lo que queremos ser? EXPOSICIÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2009 / COMUNICACIONES ORALES / COMUNICACIONES PÓSTER / AGRADECIMIENTOS
- 3. Í N D I C E Diciembre 2011 Vol. 16 Nº2 SUMARIO SUMARIO Pág. EDITA Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR). EDItORIAl 2 Manuel Ardoy Vilches y Joan Sarquella i Ventura EDITORES Y DIRECTORES CIENTÍFICOS Dra. Marga Esbert Algam PROGRAMA CIENtÍFICO CONGRESO ASEBIR 5 IVI BARCELONA, Barcelona SESIÓN DE ANDROlOGÍA 12 Dr. Jorge Cuadros Fernández CLÍNICA FIVMADRID, Madrid Estado Actual del Grupo de Interés de Andrología Alberto Pacheco COMITÉ EDITORIAL Presidente: Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante Dr. Manuel Ardoy Vilches separación magnética HOSPITAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN - Madrid Sonja Grunewald Vicepresidenta Responsable Certificación ASEBIR y Delegados Autonómicos: Dra. Carmen Ochoa Marieta Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante IMSI CER. CLINICA COTERO - Santander Manuela Alonso Nieto Secretaría, Publicaciones: SESIÓN DE EMBRIOlOGÍA 18 Dra. Montserrat Boada Palá Estado Actual del Grupo de Interés de Embriología INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS - Barcelona Mª José De los Santos Tesorería y Relaciones con la Industria: Dr. Fernando Marina Rugero Técnicas de diagnóstico no invasivo de selección embrionaria INSTITUTO DE REPRODUCCION CEFER - Barcelona Mark G Larman, Petra Wale, Rebecca Collins, Michelle Lane, David K Gardner Vocalía de Grupos de Interés, Investigación y Certificación ASEBIR: Uso en el laboratorio de la catalogación embrionaria de ASEBIR. Estado actual Dr. Josep Santaló Pedro Mª Victoria Hurtado de Mendoza UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA - Bellaterra Vocalía de Congresos y Certificación ASEBIR: SESIÓN DE CAlIDAD 28 Dra. Yolanda Mínguez Royo Estado Actual del Grupo de Interés de Calidad del Laboratorio de IVI MADRID - Madrid Reproducción Asistida Antonio González-Utor Vocalía de Docencia y Formación Continuada: Dra. Mª José Torello Ybañez Medidas de seguridad en el manejo de las muestras biológicas HOSPITAL QUIRÓN, Barcelona Montse Boada Dr. Ignacio Santiago Álvarez Miguel INST. EXTREMEÑO REPRODUCCIÓN ASISTIDA –IERA -Badajoz Control de calidad en los procesos del laboratorio de embriología Dr. Juan Manuel Moreno García Klaus E. Wiemer CLINICA VISTAHERMOSA, Alicante Dra. Marga Esbert Algam SESIÓN DE GENÉtICA 39 IVI BARCELONA, Barcelona Estado Actual del Grupo de Interés de Genética y Reproducción Vocalía Página Web:: Esther Velilla Dr. Juan Manuel Moreno García CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías Mireia Sandalinas Vocalía de Publicaciones: Dr. Jorge Martín Cuadros Fernández CLÍNICA FIV-MADRID, Madrid Estandarización de las técnicas de biología molecular al DGP Esther Fernández García Dra. Marga Esbert Algam IVI BARCELONA, Barcelona AUlA VIRtUAl 55 Dra. Montserrat Boada Palá INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS, Barcelona Cinematografía para el estudio de la calidad embrionaria: EmbryoScope Javier Herrero, Alberto Tejera, María Cruz, Marcos Meseguer Dr. Josu Franco Iriarte CENTRO SANITARIO VIRGEN DEL PILAR, San Sebastian SESIÓN DE DEBAtE 64 La Revista de ASEBIR (Asociación para el Estudio de la Biología Embriólogos Clínicos: ¿Somos realmente lo que queremos ser? de la Reproducción) está indexada en las bases de datos ICYT, de Antonio Urries ciencia y tecnología, e IME, de Biomedicina, del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) de España y en las bases de datos LATINDEX, para Iberoamérica y CUIDEN®, de la Fundación Index. EXPOSICIÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2009 67 Aplicación de la tecnología del EmbryoScope para la cuantificación de la PUBLICIDAD Y COLABORACIONES calidad ovocitaria mediante el análisis de los patrones de respiración. Secretaría ASEBIR Javier Herrero, Alberto Tejera, Maria José de los Santos, Marcos Meseguer C/ Cronos 20, Edificio 4, 1º, 6ª / 28037 Madrid - Tfno: 91 367 89 94 www.asebir.com · asebir@asebir.com Hibridación genómica comparada en célula única (SC CGH): Nueva herramienta para el screening genético preimplantacional (SGP) DISEÑO, MAQUETACIÓN E IMPRESIÓN Belén Lledó, José Antonio Ortiz, Ruth Morales, Rafael Bernabeu GÓBALO: Gráfica · Web · Multimedia · Consultoría C/ Castillo de Fuensaldaña 4, Oficina 213 | 28232 · Las Rozas · Madrid COMUNICACIONES ORAlES 80 Tfno - Fax.: 91 626 39 74 | www.gobalo.es · info@gobalo.es COMUNICACIONES PÓStER 106 Depósito legal: M-18873-1996 | ISSN: 1136-4424 | Soporte válido: 78-R-CM
- 4. E Dt I I tt OURl IOA l 2 Apreciados compañeros y compañeras En nombre de todo el Comité Organizador y de la Junta de ASEBIR, es un placer poder daros la bienvenida a este VI Congreso Nacional. ASEBIR es ya una Asociación adulta, consolidada y reconocida. Prueba de ellos es el aumento constante del número de socios y la organización de actividades científicas, de las cuales, el Congreso es el evento más importante. El proyecto del Congreso de Girona nació hace varios años de un grupo muy reducido de personas que creyeron en la idea, pensaron que la ciudad podría ser una buena sede para el Congreso y han trabajado con ilusión para conseguirlo. En esta edición hemos podido, gracias al esfuerzo de todos, presentar un interesante programa científico que contiene todos los aspectos más novedosos de nuestra especialidad. En esta misma línea se han pensado los Simposios Satélites, Aula Virtual y Sesión de Debate. Pero hay más novedades. Por primera vez se estructuran las sesiones científicas alrededor de los Grupos de Interés dándoles más protagonismo. Embriologia, Genética, Calidad y Andrología. De esta forma esperamos poder despertar mayor interés y aprovechar mejor las sesiones. Nueva forma de presentación y visualización de los pósters a través de pantallas táctiles. Así mismo se han organizado 3 cursos pre-congreso. - Curso de Gestión de Calidad del laboratorio de Embriología, organizado conjuntamente con ALPHA y el GI de Calidad. - Biotecnología de la Reproducción: del modelo animal al modelo humano. Interesante curso que pretende dar a conocer los trabajos que se realizan en el modelo animal. Se celebra en colaboración con la Universitat de Girona. - Curso de Genética Básica para Embriólogos Durante el Congreso se celebrara la primera convocatoria del examen para la obtención de la Certificación ASEBIR en Reproducción Asistida Humana. Embriología Clínica. Queremos agradecer de forma especial el esfuerzo realizado, en estos tiempos complicados para todos, por parte de nuestras empresas proveedoras. Este esfuerzo es imprescindible para la realidad del Congreso. Su colaboración continua con ASEBIR es muy importante y siempre agradecida por nuestra parte. Gracias a todos los que habéis presentado comunicaciones, a los ponentes y moderadores. Vuestras aportaciones y rigor son garantía de éxito para el Congreso. Gracias a todos los que habéis asistido al Congreso y también a los que os habéis quedado atendiendo el laboratorio de vuestra Unidad. Y gracias también al Comité Organizador, Comité Científico y, como no a la secretaria Técnica de ASEBIR. Daros la bienvenida a una ciudad, Girona, cosmopolita y acogedora que espera que vuestra estancia sea agradable y provechosa. Una ciudad en constante movimiento y transformación donde también es posible sentir la presencia de su Historia y encontrar el silencio y la paz interior en cualquier rincón de su Barrio Antiguo. Os invitamos a descubrirlo. Sigueu benvinguts a Girona, desitgem que us trobeu com a casa. Bienvenidos a Girona, deseamos que os encontréis como en casa. Joan Sarquella i Ventura Manuel Ardoy Presidente del Comité Organizador Presidente de ASEBIR
- 5. E D I t I tUlOI A l t O R Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 3 Estimados socios, y no sólo socios, también a todos aquellos que comparten con ASEBIR el placer de poder celebrar un nuevo congreso, quisiera agradeceros el estar de nuevo con nosotros, este año en Gerona. Y cuando se dice la expresión de “este año”, no es algo que deba sonar a expresión ya hecha. Todos sabemos que “este año” implica una dificultad mayor de lo habitual. Aún así, ASEBIR continúa estando al lado de la ciencia, año tras año, intentando mejorar y aportar cada vez más al profesional, a los pacientes, y a la sociedad. Pero permitidme que os dé un pequeño giro al agradecimiento. No sólo hace referencia a las personas asistentes a nuestra reunión, va dirigida también de forma muy especial a las empresas, y sobre todo a aquellas que podríamos considerar históricas, que año tras año ponen su confianza en manos de ASEBIR. Con la esperanza de que nuestra gestión generará los frutos que finalmente el profesional del laboratorio, o de docencia, o investigación… necesita, y que en especial las sociedades científicas están capacitadas para generar con el apoyo necesario de las casas comerciales. De nuevo gracias a todas las partes de este poliedro que conforma finalmente ASEBIR, y muy especialmente a vosotras, las empresas colaboradoras, que de forma continuada e histórica confiáis en nosotros. Un afectuoso saludo, y deseo de que continuemos en este camino, Manuel Ardoy Vilches Presidente de ASEBIR
- 7. P R O G R A M t I tUlO E N t Í F I C O A C I Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 5 COLABORACIÓN ESPECIAL PRINCIPAL PATROCINADOR OTROS PATROCINADORES COMITÉ DE HONOR Excmo. Sr. D. Carles Puigdemont i Casamajó Alcalde de Girona Excma. Dra. Dña. Anna María Geli de Ciurana Rectora Mgfca. de la Universidad de Girona Dra. Dña. Anna Veiga Lluch Socia Fundadora de ASEBIR Presidenta de la Asociación del año 1993 al 2003 En la actualidad Presidenta de la ESHRE COMITÉ ORGANIZADOR COMITÉ CIENTÍFICO Presidente Joan Sarquella i Ventura Vocales Vocales Begoña Aran Marck Grossmann Santiago Álvarez Carles Gimènez Sergi Bonet Mariona Hugas Montserrat Boada María Dolores Lozano Joan Carrera Nuria Porcar Dolors Company Yolanda Minguez María Fernández Reig Anna Rabanal Mª José de los Santos Inmaculada Molina Eugenia Francisco -Busquets Mª José Torelló Esther Fernández Alberto Pacheco Nuria Gimbernat Francesca Vidal Emilio Gómez Mario Sousa Antonio L. González -Utor Antonio Urries
- 8. V I C O N G R E S O N A C IUOlNO l D E A S E B I R t I t A Rev Asoc Est Biol Rep Octubre 2011 Vol. 16 Nº 2 6 SECRETARÍA TÉCNICA Betaprocess, S.L. C/ Cronos, 20, Bloque 4, 1º, 6ª - Madrid 28037 Telf.: +34 91 377 14 23 / Fax: +34 91 377 49 65 E-mail: vicongreso@asebir.com CRÉDITOS Y AUSPICIOS • Actividad Acreditada por el Consejo Catalán de Formación Continuada de las Profesiones Sanitarias – Comisión de Formación Continuada del Sistema Nacional de Salud, con 1,6 Créditos, (Actividad de Formación Continuada registrada con el número 09/02940-BQ) • Congreso Auspiciado por: CURSOS PRECONGRESO Miércoles, 5 de Octubre de 2011 • Curso nº 1. Gestión de Calidad en el Laboratorio de Embriología Clínica • Curso nº 2. Biotecnología de la Reproducción: del Modelo Animal al Modelo Humano • Curso nº 3. Fundamentos de Genética Básica para Embriólogos
- 9. P R O G R A M t I tUlO E N t Í F I C O A C I Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 7 PROGRAMA CIENTÍFICO MIÉRCOLES, 5 DE OCTUBRE DE 2011 15:00 - 20:00 hrs. Apertura de Secretaría 16:00 - 16:40 hrs. Bienvenida y recogida de documentación 16:40 - 17:00 hrs. Inauguración oficial del VI Congreso Nacional ASEBIR 17:00 - 19:00 hrs. Sesión de Andrología. Moderadores: Dr. Fernando Marina (CEFER, Barcelona) y Dra. Margarida Esbert (IVI, Barcelona) 17:00 - 17:40 hrs. Estado actual del Grupo de Interés de Andrología. Ponente Dr. Alberto Pacheco, IVI Madrid 17:40 - 18:20 hrs. Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante separación magnética Ponente Dra. Sonja Grunewald, Universitätsklinikum Leipzig, Leipzig, Germany 18:20 - 19:00 hrs. Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante IMSI Ponente Dra. Manuela Alonso, IVI Madrid 19:00 - 19:30 hrs. Pausa y visita Pósters. 19:30 - 20:30 hrs. Comunicaciones Orales Andrología. Moderadores: Dr. José Antonio Castilla (H. U. Virgen de las Nieves, Granada) y Dra. Mariona Hugas (Clínica Girona, Girona) 19:30 – 19:40 hrs. Comunicación O-001: Aplicación de las redes neuronales al estudio de la influencia de los factores ambientales en la calidad seminal. JL Girela1; D Gil2; MJ Gómez-Torres1; M Johnsson3; J De Juan1 1 Departamento de Biotecnología; Universidad de Alicante; España. 2Departamento de Tecnología informática y computación; Universidad de Alicante; España. 3Departamento de Ciencias Cognitivas; Universidad de Lund; Suecia. 19:40 – 19:50 hrs. Comunicación O-002: Efecto del polimorfismo (TA)n del promotor del receptor de estrógenos alfa (ERA) sobre el recuento espermático. J. A. Ortiz1; B. Lledó1; R. Morales1; J. Llácer2 y R. Bernabeu1y3. 1 Instituto Bernabeu Biotech; 2Instituto Bernabeu Elche; 3Instituto Bernabeu, Alicante 19:50 – 20:00 hrs. Comunicación O-003: Patrones de distribución de los receptores de canabinoides; CB1 y CB2; en espermatozoides humanos frescos; capacitados y reaccionados acrosómicamente. M. M. Francou; E. García-Hernández; J. L. Girela; M. J. Gómez-Torres; J. Ten; R. Bernabeu; J. De Juan Departamento de Biotecnología; Universidad de Alicante, Alicante 20:00 – 20:10 hrs. Comunicación O-004: El efecto negativo de la fragmentación del DNA espermático sobre la calidad embrionaria. J. L. de Pablo1; C. Anarte1; A. Domingo1; I. Ausin1; J. A. Agirregoikoa1;2; G. Barrenetxea 1;2 . 1 Quirón Bilbao; Unidad de Reproducción Asistida; Vizcaya; España. 2Universidad del País Vasco (UPV); Vizcaya; España 20:10 – 20:20 hrs. Comunicación O-005: El uso de las columnas de anexina (MACS) en pacientes con fragmentación de ADN en espermatozoides humanos mejora la calidad embrionaria y la tasa de embarazo. Y. Franco; MJ. Lázaro; I. Lizaso; M. García; S. Cornago; N. Maiz; I. Alzola Centro Sanitario Virgen del Pilar, San Sebastian, Gipuzkoa
- 10. V I C O N G R E S O N A C IUOlNO l D E A S E B I R t I t A Rev Asoc Est Biol Rep Octubre 2011 Vol. 16 Nº 2 8 20:20 – 20:30 hrs. Comunicación O-006: Cambios citomorfológicos tras la congelación / descongelación en sujetos normos; astenos y oligozoospérmicos. 1 MJ. Gómez-Torres,1LL. Medrano-López, 1,2A. García, 1EM. García, 2PJ Fernández-Colom, 1J. De Juan. 1 Deparmento de Biotecnología, Universidad de Alicante. 2Servicio de Ginecología (Reproducción Humana), Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia 20:30 hrs. Cocktail Inaugural en el Auditori Palau de Congressos JUEVES, 6 DE OCTUBRE DE 2011 08:00 - 14:00 hrs. Apertura de Secretaría 09:00 - 11:00 hrs. Sesión de Embriología. Moderadores: Dra. Mª José Torelló (H. Quirón, Barcelona) y Dra. Inmaculada Molina (H. U. La Fe, Valencia) 09:00 - 09:40 hrs. Estado actual del Grupo de Interés de Embriología. Ponente Dra. Mª José de los Santos, IVI Valencia 09:40 - 10:20 hrs. Técnicas de diagnóstico no invasivo de selección embrionaria. Ponente Dr. Mark Graham Larman, Vitrolife, Colorado (USA) 10:20 - 11:00 hrs. Uso en el laboratorio de la catalogación embrionaria de ASEBIR. Estado actual. Ponente Dra. Victoria Hurtado de Mendoza, Centro Másvida Reproducción, Sevilla 11:00 - 11:30 hrs. Pausa café. 11:30 - 12:30 hrs. Comunicaciones Orales Embriología Moderadores: Dra. Yolanda Mínguez (IVI, Madrid) y Dr. Emilio Gómez (TAHE Fertilidad, Murcia) 11:30 – 11:40 hrs. Comunicación O-007: Predicción de la implantación mediante análisis multivariable basado en la morfocinética embrionaria utilizando un sistema automático de cinematografía. M. Meseguer; J. Herrero; A. Tejera; T. Viloria; A. Delgado; MJ de los Santos IVI Valencia, Valencia. 11:40 – 11:50 hrs. Comunicación O-008: ¿Puede la respiración embrionaria predecir la implantación? A. Tejera1; J. Herrero1; N. Ramsing2; M. J. De los Santos1; M. Meseguer1. 1 IVI Valencia; IVF Laboratory; Valencia; Spain. 2Unisense Fertilitech; Designand Development; Aahrus; Denmark. 11:50 – 12:00 hrs. Comunicación O-009: Fallos de fecundación tras FIV/ICSI: Nuevas estrategias de interpretación para el diagnostico. M. Ferrer; E. Ferrer; M. Muñoz; M. Vila; V. Y. Rawe CREA; Centro Médico de Reproducción Asistida; Valencia 12:00 – 12:10 hrs. Comunicación O-010: Marcaje directo de embriones de ratón para su identificación mediante adhesión de microcódigos a la zona pelúcida S. Novo1, O. Penon2,3, R. Gómez4, Ll. Barrios1, M. Duch4, J. Esteve4, J. Santaló1, C. Nogués1, J. A. Plaza4, Ll. Pérez-García 2,3, E. Ibáñez1* 1 Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra. 2 Departament de Farmacologia i Química terapèutica, Facultat de Farmàcia. 3Institut de Nanociència i Nanotecnologia, Universitat de Barcelona. 4Institut de Microelectrònica de Barcelona IMB-CNM (CSIC).Barcelona. 12:10 – 12:20 hrs. Comunicación O-011: Preservación de la fertilidad en pacientes oncológicas: Combinación de criopreservación de tejido ovárico y maduración In Vitro de ovocitos. P. Torres1, E. Novella-Maestre2, J.M. Rubio1, I. Peinado1, P. Polo1, M. Romeu1, M. Andrés3, A. Pellicer1. 1 Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología), Hospital Universitario La Fe, Valencia. 2Unidad de Genética, Hospital Universitario La Fe, Valencia. 3Unidad de Oncología Pediátrica, Hospital Universitario La Fe, Valencia.
- 11. P R O G R A M t I tUlO E N t Í F I C O A C I Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 9 12:20 – 12:30 hrs. Comunicación O-012: Influencia de las uniones adherentes mediadas por e-cadherina en la derivación de células madre embrionarias de ratón. S. González; E. Ibáñez; J. Santaló Unitat Biologia Cel·lular. Fac. Biociències. Universitat Autònoma de Barcelona. Bellaterra 12:45 - 13:30 hrs. Symposium Satélite EMB IVF Witness. RFID (Radio frequency identification) technology to reduce the risk of IVF errors Ponente Dr. Ronny Janssens. Centre for Reproductive Medicine, UZB, Brussels. 13:30 - 15:30 hrs. Comida congresual 15:00 - 19:30 hrs. Apertura de Secretaría 15:30 - 17:30 hrs. Sesión de Calidad. Moderadores: Dr. Juan Manuel Moreno (Clínica Vistahermosa, Alicante) y Dra. Laura Marqués (Clínica Sagrada Familia, Barcelona) 15:30 - 16:10 hrs. Estado actual del Grupo de Interés de Calidad del Laboratorio de Reproducción Asistida Ponente Dr. Antonio L. González-Utor, Centro Masvida Reproducción, Sevilla 16:10 - 16:50 hrs. Medidas de seguridad en el manejo de las muestras biológicas Ponente Dra. Montserrat Boada, Institut Universitari Dexeus, Barcelona 16:50 - 17:30hrs. Control de calidad en los procesos del laboratorio de embriología Ponente Dr. Klaus Wiemer, Northwest Center for Reproductive Sciences, Seattle, USA 17:30 - 18:00 hrs. Pausa y visita Pósters 18:00 - 19:00 hrs. Comunicaciones Orales Calidad del Laboratorio de Reproducción Asistida Moderadores: Dr. Mark Grossmann (Centro Médico Teknon, Barcelona) y Dr. Yosu Franco (Centro Sanitario Virgen del Pilar, San Sebastián) 18:00 – 18:10 hrs. Comunicación O-013: Reducir los errores en Fiv: Witnessing electrónico. X. Orriols Brunetti1; S. Bird1; K. Bennett1; S. Rogers1; C. Ottolini1;2; L. Muriel Rios1; J. Taylor1; A. Thornhill1 1 The London Bridge Fertility; Gynaecology and Genetics Centre; London; Reino Unido; 2Department of Biosciences; University of Kent; Canterbury; Reino Unido 18:10 – 18:20 hrs. Comunicación O-014: Papel del fungible en la generación de componentes volátiles orgánicos (CVO) en el laboratorio de Fiv. F. Marina; N. Pérez; N. Fosas; P. Martín; N. García; S. González; I. Mansilla; M. Rodero; A.Mauri y S. Marina Instituto de Reproducción CEFER. ANACER, Barcelona 18:20 – 18:30 hrs. Comunicación O-015: La elección del medio de cultivo como estrategia de mejora de resultados. C. Bou; D. Becerra; M. Testillano; A. Martínez; A. Rodríguez; F. Bronet IVI Madrid, Madrid 18:30 – 18:40 hrs. Comunicación O-016: Uso de la tecnología de la luz polarizada para la corrección de la posición del huso acromático previo al ICSI. A. Farreras1; M. Asensio1; P. Fernández1; C. Castelló1; B. Peramo1; M. López-Teijón1;2; E. Velilla1 Institut Marquès1; Barcelona; Fundación Leonardo Marquès2; Barcelona. 18:40 – 18:50 hrs. Comunicación O-017: Estudio aleatorizado para comparar la eficacia de dos estrategias de transferencia embrionaria en un hospital público: resultados preliminares. A. Clavero; J. A. Castilla; I. Molina; E. R. Palacios; A. P. Ortiz; S. Carrillo; J. Fontes Unidad de Reproducción. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada 18:50 – 19:00 hrs. Comunicación O-018: Transferencia diferida: ¿práctica rutinaria? M. Lierta; C .Roméu; J. Sánchez Rubio; A. Chueca; A. Urries. Reproducción Asistida Quirón Zaragoza; Grupo Hospitalario Quirón.
- 12. V I C O N G R E S O N A C IUOlNO l D E A S E B I R t I t A Rev Asoc Est Biol Rep Octubre 2011 Vol. 16 Nº 2 10 VIERNES, 7 DE OCTUBRE DE 2011 08:00 - 14:00 hrs. Apertura de Secretaría 09:00 - 11:00 hrs. Sesión de Genética. Moderadores: Dr. Josep Santaló (UAB, Barcelona) y Dr. Julio Martín (IVI, Valencia) 09:00 - 09:40 hrs. Estado actual del Grupo de Interés de Genética y Reproducción Ponente Dra. Esther Velilla, Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona 09:40 - 10:20 hrs. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías Ponente Dra. Mireia Sandalinas, Reprogenetics Spain, Barcelona 10:20 - 11:00 hrs. Estandarización de las técnicas de biología molecular al DGP Ponente Dra. Esther Fernández, Geniality Diagnostico Genético, Madrid 11:00 - 11:30 hrs. Pausa café 11:30 - 12:30 hrs. Comunicaciones Orales Genética Moderadores: Dra. Francesca Vidal (UAB, Barcelona) y Dr. Fràncics Xavier Vendrell (Sistemas Genómicos, Valencia) 11:30 – 11:40 hrs. Comunicación O-019: El DGP molecular combinado con microarrays de CGH: Una nueva estrategia diagnóstica. T M Alberola; R Bautista-Llàcer; C Sánchez-Matamoros; M Pardo; E García-Mengual y X Vendrell. Sistemas Genómicos, Paterna, Valencia 11:40 – 11:50 hrs. Comunicación O-020: DGP para estudio de aneuploidías de 24 cromosomas mediante aCGH: Diagnóstico en célula única de día 3 vs. biopsia de trofoectodermo de día 5. L. Rodrigo; P. Mir; E. Mateu; A. Mercader; A. Cervero; P. Buendía; J. Martín; C. Rubio Departamento de Diagnóstico Genético Preimplantacional. Instituto Universitario IVI-Valencia. Valencia, España 11:50 – 12:00 hrs. Comunicación O-021: Error de diagnóstico de la técnica de diagnóstico genético preimplantacional para 24 cromosomas mediante FISH. E. Toro1; S. Fernández1, 2; A. Colomar12; S. Chamosa1; M. López Teijón3, E. Velilla1,2 1 Institut Marquès, Barcelona; 2Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona-Madrid; 3Fundación Leonardo Marquès, Barcelona 12:00 – 12:10 hrs. Comunicación O-022: Diagnóstico prenatal no invasivo (DPNI) en sangre de gestante: Una nueva opción tras DGP. A. Bustamante-Aragonés; S. Perlado; M.J. Trujillo-Tiebas; J. Gallego; L. Rodriguez1; C. Linares1; M. Rodríguez de Alba; I. Lorda; J. Plaza1; C. Hernández1; C. Ramos. Servicios de Genética y Ginecología y Obstetrícia1; Fundación Jiménez Díaz. Madrid 12:10 – 12:20 hrs. Comunicación O-023: Mosaicismo en pacientes con síndrome de Klinefelter: Implicaciones en el consejo genético reproductivo. 1 Garcia-Quevedo, L.; 1Blanco, J.; 1Sarrate, Z.; 2Bassas, Ll.; 3Català, V.; 1Vidal, F. 1 Unitat Biologia Cel·lular. Universitat Autònoma Barcelona. Bellaterra, Barcelona. 2Laboratori d’Andrologia, Fundació Puigvert. Barcelona. 3 Prenatal Genetics, SL. Barcelona. 12:20 – 12:30 hrs. Comunicación O-024: Detección mediante SNaPshot de la deleción en homocigosis del gen SMN1 en el diagnóstico genético preimplantacional de atrofia muscular espinal. M. Martínez-Fresno1 (1); A. Gómez Duro1; P. Eibes Peteiro1; A. Sotillo1; E. Gómez2; E. Fernández1 1 Geniality Diagnóstico Genético, Madrid; 2 Instituto Tahe de Fertilidad y Ginecología, Murcia 12:30 - 13:15 hrs. Symposium Satélite ORIGIO Physiologic ICSI Ponente Dr. Lodovico Parmegiani. GynePro Medical Centers, Bologna, Italy.
- 13. P R O G R A M t I tUlO E N t Í F I C O A C I Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 11 13:15 - 14:15 hrs. XXV Asamblea de Socios ASEBIR 14:15 - 16:00 hrs. Comida congresual 15:00 - 19:30 hrs. Apertura de Secretaría 16:00 - 16:40 hrs. Exposición 4 Pósters seleccionados para discusión Moderadores: Dra. Carmen Ochoa (CER. Clínica Cotero Santander, Santander) y Dra. Mª Dolores Lozano (H. U. Virgen del Rocío, Sevilla) 16:40 – 17:20 hrs. Aula Virtual Moderadores: Dra. Gemma Arroyo (I. U. Dexeus, Barcelona) y Dra. Mercé Durban (Clínic Eugin, Barcelona) Embryoscope Ponente Dr. Marcos Meseguer, IVI Valencia 17:20 - 18:00 hrs. Sesión de Debate Moderadores: Dr. Jorge M. Cuadros (FIV-Madrid, Madrid) y Dra. Gloria Calderón (IVI, Barcelona) Embriólogos clínicos: ¿somos realmente lo que queremos ser? Ponente Dr. Antonio Urries, Clínica Quirón, Zaragoza 18:00 - 18:30 hrs. Pausa y visita Pósters 18:30 - 18:45 hrs. Premio ASEBIR al Mejor Póster 2011 18:45 - 19:05 hrs. Exposición Premios ASEBIR-EMB 2009 Moderadores: Dra. Anna Rabanal (Barcelona IVF, Barcelona) y Dr. Ignacio Santiago Álvarez (IERA, Badajoz) 18:45 - 18:55 hrs. Premio ASEBIR-EMB 2009 de Embriología Clínica Aplicación de la tecnología del embrioscope para la cuantificación de la calidad ovocitaria mediante el análisis de los patrones de respiración. Ponente Dr. Javier Herrero Zapata, IVI Valencia 18:55 - 19:05 hrs. Premio ASEBIR-EMB 2009 de Investigación Básica Hibridación genómica comparada en célula única (SC CGH): nueva herramienta para el screening genético preimplantacional (SGP). Ponente Dra. Belén Lledo Bosch, Instituto Bernabeu, Alicante 19:05 - 19:15 hrs. Clausura VI Congreso Nacional ASEBIR 2011 21:30 hrs. Cena de Clausura, anuncio y entrega de los Premios ASEBIR-EMB 2011
- 14. S E S I Ó N t DI E UAl N D R O l O G Í A t O Alberto Pacheco 12 EStADO ACtUAl DEl GRUPO DE INtERÉS DE ANDROlOGÍA Alberto Pacheco El Grupo de Interés presentará la actualidad del trabajo realizado, los proyectos en marcha y las propuestas de futuro del grupo. NUEVAS tÉCNICAS DE SElECCIÓN DE ESPERMAtOzOIDES: SElECCIÓN MEDIANtE SEPARACIÓN MAGNÉtICA Sonja Grunewald PD Dr. med. habil. University of Leipzig, European Academy of Andrology Training Centre, Leipzig, Germany. e-mail: sonja.grunewald@medizin.uni-leipzig.de INTRODUCTION 1997). Signs of the terminal phase of Although the sperm apoptosis cascade apoptosis are the externalisation of might differ from somatic cells, Male infertility is the sole or the phospholipid phosphatidylserine at activated apoptosis signalling in human contributing factor in almost half of the outer side of the plasmamembrane ejaculated spermatozoa is associated the couples failing to conceive (Sharlip (early), DNA fragmentation and with impaired fertilization capacity. et al., 2002). Semen analysis including morphologic changes (late). Male infertility is only a symptom the assessment of sperm concentration, for a variety of spermatozoal defects motility and percentage normal While receptor mediated apoptosis originating from different andrological forms is the standard procedure for signal transduction might be of rather diseases. Possibly, the increased evaluating the male fertility potential minor functional relevance in human susceptibility on pro-apoptotic stimuli (World Health Organization, 2010). ejaculated spermatozoa (Grunewald et and activation of apoptosis signalling is Although the conventional analysis al., 2005a), sperm mitochondria are a common mechanism for various sperm gives considerable information, it does especially susceptible to cellular stress pathologies. not provide information about impaired due to the compartmentalization in sub-cellular processes in human the midpiece. Certain studies proved Several studies indicate that semen sperm and defined pathophysiological that the classical mitochondria- samples from infertility patients contain diagnosis of male infertility is often derived apoptosis signalling-cascade higher levels of activated caspases and missed. In recent years many studies is activated in spermatozoa by disrupted mitochondrial membrane investigated the presence and specific pro-apoptotic stimuli as well potential compared to healthy donors significance of activated pathways of as by cryopreservation and thawing (Gandini et al., 2000; Grunewald et al., programmed cell death (apoptosis) in (Grunewald et al., 2005a; Oehninger et 2005b; Grunewald et al., 2010; Grunewald spermatozoa, which may be partially al., 2003; Paasch et al., 2004b; Paasch et al., 2009; Shen et al., 2002). responsible for the low fertilization and et al., 2003; Perticarari et al., 2008; implantation rates seen with assisted Wang et al., 2003). High levels of DNA Subgrouping analysis of the infertility reproductive techniques (Oehninger et fragmentation are one major endpoint patients revealed that the percentage of al., 2003). and an archetypal signature of the caspase-positive sperm was elevated in apoptosis process. However, due to the patients with pathological spermiogram The term apoptosis defines programmed highly packed, condensed chromatin compared to fertile donors, but almost cell death, which is molecularly and in sperm, the apoptosis signal is only equally elevated in those patients morphologically distinct from necrosis insufficiently transferred into DNA showing normal spermiogram parameter (Kerr et al., 1972). Models of apoptosis fragmentation. Particularly the release (Grunewald et al., 2005b). Semen as known from somatic cells include of ROS from mitochondria contributes samples with oligoasthenozoospermia receptor-mediated pathways and directly to sperm DNA damage (Aitken show higher incidences of sperm with intrinsic triggered apoptosis (mediated et al., 2011). DNA fragmentation is apoptotic features compared to samples by disruption of mitochondria a significant factor in defining the with normozoospermia (Marchiani et membrane potential) in addition to functionality of spermatozoa and has al., 2007). This might be explained cytotoxic or stress-induced forms been linked in numerous studies with a by alterations of the mitochondrial (Green, 1998). Both, extrinsic and wide variety of adverse clinical outcomes membrane potential, which severely intrinsic pathways result in activation including impaired fertilization, affect sperm motility. Another example of proteases (cytosolic aspartate disrupted preimplantation embryonic are semen samples from patients with specific proteases, CASPASES, [CP]) and development, poor implantation varicocele, which contain significantly as a consequence in well orchestrated rates and an increased incidence of more sperm with active apoptosis cell degradation (Salvesen et al., miscarriage (Zini et al., 2008). cascade than samples from donors
- 15. S E S I Ó N D E I tUlO D R O l O G Í A t A N Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 13 without varicocele. The effect may MATERIALS AND METHODS can also be found in non-vital sperm with be explained by the higher testicular holey membranes and in bicarbonate- temperatures in the varicocele patients POTENTIAL OF STANDARD SPERM exposed, artificially capacitated, sperm (Chen et al., 2004). SEPARATION METHODS (De Vries et al., 2003). A negative impact of activated Over the last decades a variety of The loss of membrane asymmetry in apoptosis signalling on sperm standard procedures have been sperm is independent of standard fertilizing capacity was assumed and developed with certain modifications. spermiogram parameters (World Health recent studies using hamster oocytes These conventional sperm selection Organization, 2010) and more frequent proved this relationship. All studies techniques can be classified by their in infertility patients (Glander et al., used animal models to simulate either basis on centrifugation, filtration 1999). The amount of EPS in donor in vitro fertilization (IVF) by the zona- or sperm migration. Among the sperm correlates with the level of lipid free hamster oocyte sperm penetration centrifugation techniques, density peroxidation (Schuffner et al., 2001). assay (SPA) or the intracytoplasmic gradient centrifugation (DGC) has In addition, it correlates directly with sperm injection (ICSI) by hamster been proposed as the gold standard for the activation of caspases and the oocyte-ICSI (H-ICSI). sperm preparation. disruption of the transmembrane mitochondrial potential (Kotwicka et Using the SPA, increased oocyte As mentioned above, semen samples al., 2008; Paasch et al., 2004a; Paasch penetration potential was directly of subfertile patients contain higher et al., 2003; Said et al., 2006). correlated with the absence of apoptosis levels of spermatozoa with activated markers in human donor sperm (Said et apoptosis signalling which is likely to Annexin V is a phospholipid-binding al., 2006; Sion et al., 2004). Analyses impair their fertility. protein that has high affinity for of semen samples of infertility patients phosphatidylserine and lacks the ability revealed an even stronger negative Own investigations of semen samples to pass through an intact membrane correlation between the apoptosis- from healthy donors showed a (van Heerde et al., 1995). Annexin related parameters: disruption of the significant reduction of sperm with V-conjugated super-paramagnetic mitochondria membrane potential, activated apoptosis signalling by microbeads can effectively separate activation of caspase-3 as well as DGC (Said et al., 2005a). Moreover, non-apoptotic spermatozoa from those externalized phosphatidylserine and ejaculates of 20 subfertile men were with deteriorated plasma membranes the performance of the spermatozoa in investigated before and after DGC using magnetic-activated cell sorting the hamster oocyte penetration assay. followed by a swim up procedure. While (MACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Semen samples showing subnormal the amount of apoptotic sperm was Gladbach, Germany). Annexin-V SPA values (<20% penetrated oocytes) reduced in the majority of the samples, MACS separation of sperm yields were characterized by significantly profound inter-individual differences in two fractions: EPS-negative (intact increased levels of disruption of the the separation effect ranging from < 1 % membranes, nonapoptotic) and EPS- mitochondrial membrane potential, up to > 65 % were observed (Grunewald positive (apoptotic) which is retained activation of caspase-3 and externalized et al., 2010). Therefore, further in the magnetic field (Grunewald et al., phosphatidylserine (Grunewald et al., development of specific, molecular- 2001; Paasch et al., 2003). 2008), indicating an impact of apoptosis- based separation methods to deplete related processes not only at the plasma apoptotic spermatozoa is needed. RESULTS AND DISCUSSION membrane but also at the mitochondrial and cytoplasmic level on the spermatozoal ANNEXIN-V BASED MAGNETIC ACTIVATED Many own studies proved the ability of capacity to penetrate oocytes. CELL SORTING: DEPLETION OF SPERM Annexin-V MACS to enrich vital, motile WITH ACTIVE APOPTOSIS SIGNALLING sperm with inactivated apoptosis Analysis of sperm performance in signalling and lower DNA fragmentation hamster oocyte-ICSI revealed a negative Currently available molecular-based rate (Grunewald et al., 2001; Grunewald correlation of fertilization rates with methods to deplete sperm with activated et al., 2006b; Paasch et al., 2004a; the percentage of apoptotic sperm apoptosis signalling are based on Paasch et al., 2003). Moreover, in samples from infertility patients the specific binding of Annexin-V to selected non-apoptotic sperm are (Grunewald et al., 2009). externalized phosphatidylserine (Glander characterized by a superior ability to et al., 1999; Grunewald et al., 2001; Said undergo capacitation and acrosome Due to the limitation of the animal et al., 2006; von Schonfeldt et al., 1999). reaction (not spontaneous acrosome model, the assessment of embryonic reaction!) (Grunewald et al., 2006a; development was not possible, Externalisation of phosphatidylserine Lee et al., 2010). The depletion of sperm but many other studies proved the (EPS) is one of the first external features with activated apoptosis signalling is correlation of DNA fragmentation with of cells undergoing apoptosis. In able to increase cryosurvival rates by later stages of the fertilization process somatic cells, it is a sign of the beginning integration of MACS before or after such as embryonic development, the terminal phase of the programmed cryopreservation and thawing of sperm blastocyst development rate and clinical cell death (Vermes et al., 1995). The said (Grunewald et al., 2006b; Paasch et pregnancy rates (Zini et al., 2008). externalisation of phosphatidylserine al., 2004a; Said et al., 2005b).
- 16. S E S I Ó N t DI E UAl N D R O l O G Í A t O Sonja Grunewald. Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante separación magnética 14 Sperm preparation that combines MACS spermatozoa: a rapid assay for detection of Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972) with double-density centrifugation membrane changes after cryostorage. Mol. Apoptosis: a basic biological phenomenon provides spermatozoa of higher quality Hum.Reprod. 5:109-115 with wide-ranging implications in tissue in terms of motility, viability and kinetics. Br.J Cancer 26:239-257 apoptosis indices (caspase activation, Green DR (1998) Apoptotic pathways: the mitochondrial membrane disruption roads to ruin. Cell 94:695-698 Kotwicka M, Filipiak K, Jedrzejczak P, and DNA fragmentation) compared with Warchol JB (2008) Caspase-3 activation and other conventional sperm preparation Grunewald S, Baumann T, Paasch U, Glander phosphatidylserine membrane translocation methods (Said et al., 2005a). HJ (2006a) Capacitation and acrosome in human spermatozoa: is there a relationship? Furthermore, sperm prepared according reaction in nonapoptotic human spermatozoa. Reprod.Biomed.Online. 16:657-663 to this protocol showed improved ability Ann.N.Y.Acad.Sci. 1090:138-146 to fertilize eggs using the hamster Lee TH, Liu CH, Shih YT, Tsao HM, Huang CC, oocyte penetration assay and hamster Grunewald S, Miska W, Miska G, Rasch M, Chen HH, Lee MS (2010) Magnetic-activated oocyte-ICSI (Grunewald et al., 2009; Reinhardt M, Glander HJ, Paasch U (2007) cell sorting for sperm preparation reduces Said et al., 2006). Molecular glass wool filtration as a new spermatozoa with apoptotic markers and tool for sperm preparation. Hum.Reprod. improves the acrosome reaction in couples In recent years, first clinical studies and 22:1405-1412 with unexplained infertility{dagger}. reports proved the advantage of integrating Hum.Reprod. 25:839-846 Annexin-V MACS in conventional sperm Grunewald S, Paasch U, Glander HJ (2001) preparation protocols. The combination Enrichment of non-apoptotic human Marchiani S, Tamburrino L, Maoggi A, Vannelli leads to superior pregnancy rates and spermatozoa after cryopreservation by GB, Forti G, Baldi E, Muratori M (2007) so far, healthy babies (Dirican et al., immunomagnetic cell sorting. Cell Tissue Characterization of M540 bodies in human 2008; Rawe et al., 2010). Currently, the Bank. 2:127-133 semen: evidence that they are apoptotic manufacturer is working to produce a GMP- bodies. Mol.Hum Reprod 13:621-631 conform Annexin V MACS kit. Grunewald S, Paasch U, Said TM, Rasch M, Agarwal A, Glander HJ (2006b) Oehninger S, Morshedi M, Weng SL, Taylor REFERENCES Magnetic-activated Cell Sorting before S, Duran H, Beebe S (2003) Presence and Cryopreservation Preserves Mitochondrial significance of somatic cell apoptosis Aitken RJ, Koppers AJ (2011) Apoptosis and Integrity in Human Spermatozoa. Cell Tissue markers in human ejaculated spermatozoa. DNA damage in human spermatozoa. Asian J Bank. 7:99-104 Reproductive Biomedicine Online 7:469-476 Androl 13:36-42 Grunewald S, Paasch U, Said TM, Sharma Paasch U, Grunewald S, Agarwal A, Glandera Chen CH, Lee SS, Chen DC, Chien HH, Chen RK, Glander HJ, Agarwal A (2005a) Caspase HJ (2004a) Activation pattern of caspases IC, Chu YN, Liu JY, Chen WH, Wu GJ (2004) activation in human spermatozoa in response in human spermatozoa. Fertil.Steril. 81 Apoptosis and kinematics of ejaculated to physiological and pathological stimuli. Suppl 1:802-809 spermatozoa in patients with varicocele. J Fertil.Steril. 83 Suppl 1:1106-1112 Androl 25:348-353 Paasch U, Grunewald S, Dathe S, Glander HJ Grunewald S, Paasch U, Wuendrich K, (2004b) Mitochondria of human Spermatozoa De Vries KJ, Wiedmer T, Sims PJ, Gadella Glander HJ (2005b) Sperm caspases become are preferentially susceptible to apoptosis. BM (2003) Caspase-independent exposure more activated in infertility patients than Ann.N Y.Acad.Sci. 1030:403-409 of aminophospholipids and tyrosine in healthy donors during cryopreservation. phosphorylation in bicarbonate responsive Arch.Androl 51:449-460 Paasch U, Grunewald S, Fitzl G, Glander HJ human sperm cells. Biol.Reprod 68:2122-2134 (2003) Deterioration of plasma membrane Grunewald S, Reinhardt M, Blumenauer V, is associated with activated caspases in Dirican EK, Ozgun OD, Akarsu S, Akin KO, Hmeidan AF, Glander HJ, Paasch U (2010) human spermatozoa. J.Androl 24:246-252 Ercan O, Ugurlu M, Camsari C, Kanyilmaz O, Effects of post-density gradient swim- Kaya A, Unsal A (2008) Clinical outcome up on apoptosis signalling in human Perticarari S, Ricci G, Boscolo R, De SM, of magnetic activated cell sorting of non- spermatozoa. Andrologia 42:127-131 Pagnini G, Martinelli M, Presani G (2008) apoptotic spermatozoa before density gradient Fas receptor is not present on ejaculated centrifugation for assisted reproduction. Grunewald S, Reinhardt M, Blumenauer human sperm. Hum.Reprod. 23:1271-1279 J.Assist.Reprod.Genet. 25:375-381 V, Said TM, Agarwal A, Abu HF, Glander HJ, Paasch U (2009) Increased sperm Rawe VY, Boudri HU, Sedo CA, Carro M, Papier Gandini L, Lombardo F, Paoli D, Caponecchia chromatin decondensation in selected S, Nodar F (2010) Healthy baby born after L, Familiari G, Verlengia C, Dondero F, nonapoptotic spermatozoa of patients with reduction of sperm DNA fragmentation Lenzi A (2000) Study of apoptotic DNA male infertility. Fertil.Steril. 92:572-577 using cell sorting before ICSI. Reprod. fragmentation in human spermatozoa. Biomed.Online. 20:320-323 Hum.Reprod. 15:830-839 Grunewald S, Said TM, Paasch U, Glander HJ, Agarwal A (2008) Relationship between sperm Said TM, Agarwal A, Grunewald S, Rasch Glander HJ, Schaller J (1999) Binding of apoptosis signalling and oocyte penetration M, Baumann T, Kriegel C, Li L, Glander HJ, annexin V to plasma membranes of human capacity. Int.J.Androl 31:325-330 Thomas AJ, Jr., Paasch U (2006) Selection of
- 17. S E S I Ó N D E I tUlO D R O l O G Í A t A N Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 15 nonapoptotic spermatozoa as a new tool for Sharlip ID, Jarow JP, Belker AM, Lipshultz LI, apoptotic cells using fluorescein labelled enhancing assisted reproduction outcomes: Sigman M, Thomas AJ, Schlegel PN, Howards Annexin V. J Immunol.Methods 184:39-51 an in vitro model. Biol Reprod 74:530-537 SS, Nehra A, Damewood MD, Overstreet JW, Sadovsky R (2002) Best practice policies for von Schonfeldt V, Krishnamurthy H, Said TM, Grunewald S, Paasch U, Glander male infertility. Fertil.Steril. 77:873-882 Foppiani L, Schlatt S (1999) Magnetic HJ, Baumann T, Kriegel C, Li L, Agarwal A cell sorting is a fast and effective method (2005a) Advantage of combining magnetic Shen HM, Dai J, Chia SE, Lim A, Ong CN (2002) of enriching viable spermatogonia from cell separation with sperm preparation Detection of apoptotic alterations in sperm in Djungarian hamster, mouse, and marmoset techniques. Reprod Biomed.Online 10:740-746 subfertile patients and their correlations with monkey testes. Biol Reprod 61:582-589 sperm quality. Hum.Reprod 17:1266-1273 Said TM, Grunewald S, Paasch U, Rasch M, Wang X, Sharma RK, Gupta A, George V, Agarwal A, Glander HJ (2005b) Effects of Sion B, Janny L, Boucher D, Grizard G Thomas AJ, Falcone T, Agarwal A (2003) magnetic-activated cell sorting on sperm (2004) Annexin V binding to plasma Alterations in mitochondria membrane motility and cryosurvival rates. Fertil. membrane predicts the quality of human potential and oxidative stress in infertile Steril. 83:1442-1446 cryopreserved spermatozoa. International men: a prospective observational study. Journal of Andrology 27:108-114 Fertil Steril 80 Suppl 2:844-850 Salvesen GS, Dixit VM (1997) Caspases: intracellular signaling by proteolysis. 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Hum.Reprod. 23:2663-2668 NUEVAS tÉCNICAS DE SElECCIÓN DE ESPERMAtOzOIDES: SElECCIÓN MEDIANtE IMSI Manuela Alonso Nieto IVI Madrid e-mail: ivimadrid@ivi.es INTRODUCCIÓN de los orgánulos del espermatozoide asociado a la morfología nuclear del móvil a grandes aumentos” (high espermatozoide. La técnica más utilizada de magnification motile sperm organellar inseminación en todos los centros IVI morphology examination, MSOME), la A raíz de estos datos han aparecido es la inyección intracitoplasmática magnificación que utiliza está entre varios grupos como los de Antinori del espermatozoide (ICSI). Esta 6000X y 13500X aumentos. et al. (2007), o Vanderzwalmen et al. técnica permite la observación (2007, 2008), mostrando resultados morfológica tanto del ovocito como del Posteriormente el mismo grupo espectaculares de gestación e espermatozoide a un aumento máximo introdujo el IMSI (inyección implantación con esta nueva técnica, de 400x. La capacidad de observación intracitoplasmática del espermatozoide en parejas que tenían varios ciclos de la morfología espermática a 400x móvil seleccionado morfológicamente) fallidos de reproducción asistida. Uno puede ser insuficiente, llegando a (Bartoov et al., 2003), que permite, de los inconvenientes de estos trabajos discernir únicamente características además de acceder a la observación de la es que todas las comparaciones se han morfológicas graves como dobles colas, morfología fina del núcleo espermático hecho relacionando los resultados de la dobles cabezas, globozoospermia, a tiempo real, seleccionar con estos IMSI con los resultados retrospectivos megalozoospermia, etc. aumentos el espermatozoide que va a de ciclos anteriores de ICSI. ser microinyectado en el ovocito. Este En la actualidad varios grupos estudio muestra una mayor tasa de En este estudio se pretende determinar están utilizando un nuevo método gestación e implantación, y una menor si el desarrollo embrionario temprano, de selección de espermatozoides, tasa de aborto temprano espontáneo, en D2 y D3, así como el de blastocistos, introducido por Bartoov et al. (2002), en parejas con 2 o más ciclos fallidos se ve comprometido por la morfología que permite la observación de la y sémenes teratozoospérmicos fina del núcleo espermático elegido en morfología del núcleo espermático, y moderados. La conclusión es que el el momento de la microinyección. Para que se denomina “Examen morfológico desarrollo temprano del embrión está ello se utilizará la IMSI, en la que se
- 18. S E S I Ó N t DI E UAl N D R O l O G Í A t O Manuela Alonso Nieto. Nuevas técnicas de selección de espermatozoides: Selección mediante IMSI 16 elegirá el espermatozoide utilizando espermatozoides por mililitro o Antinori M., Licata E., Dani G., Cerusico F., la clasificación MSOME; y la ICSI en astenozoospermia moderada con Versaci C., d’Angelo D., Antinori S. 2007 la que se elige el espermatozoide una movilidad inferior a 30% de Intracytoplasmic morphologically selected morfológicamente pero con menos espermatozoides móviles progresivos. sperm injection: a prospective randomized aumentos. Ambas técnicas se realizarán trial. Reproductive BioMedicine Online 16 No 6. en ovocitos de donante, siendo la TAMAÑO MUESTRAL 835-841 cohorte utilizada para cada técnica elegida al azar. Todos los ciclos se 100 ciclos de ovodonación con las Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosowski iniciarán como cultivo secuencial, características antes indicadas. A, Menezo Y, Barak Y. 2002 Relationship siguiendo los criterios del laboratorio between human sperm subtle morphological de FIV. Las transferencias se harán GRUPOS DE ESTUDIO characteristics and IVF-ICSI outcome. J en estadio de blastocisto (D5 o D6), Androl;23:1–8. excepto en aquellos casos en los que Mujeres incluidas en el programa de el número de fecundados sea menor de donación de ovocitos sometidas a una Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F et al. 2003 6 o que haya menos de 6 embriones de terapia hormonal sustitutiva. Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic calidad aceptable en D3, en cuyo caso se morphologically selected sperm injection than haría la transferencia el mismo D3. Al ser Las parejas irán distribuidas en 2 grupos with conventional intracytoplasmic injection. ovocitos de donante, la calidad de éstos determinados al azar: Fertility and Sterility 80, 1413–1419. no tiene porqué estar comprometida y al realizar la misma técnica en todos los • El grupo 1 ovodonaciones destinadas Berkovitz A, Eltes F, Yaari S et al. 2005 The ovocitos obtenemos transferencias puras a la técnica de IMSI. morphological normalcy of the sperm nucleus de ambas técnicas, lo que nos permite • El grupo 2 ovodonaciones destinadas and pregnancy rate of intracytoplasmic comparar los resultados de gestación, a la técnica de ICSI. injection with morphologically selected sperm. implantación y aborto temprano; además Human Reproduction 20, 185–190. de la calidad embrionaria. VARIABLES A COMPARAR EN CADA GRUPO Berkovitz A, Eltes F, Lederman H et al. 2006a How MATERIALES Y MéTODOS • % de ovocitos fecundados to improve IVF−ICSI outcome by sperm injection? • Número de blastómeras en D2 y D3 Reproductive BioMedicine Online 12, 634–638. Se trata de un estudio prospectivo • % de fragmentación en D2 y D3 randomizado de carácter experimental • Tipo de fragmentación en D2 y D3 Cayli S, Jakab A, Ovari L et al. 2003 Biochemical para determinar la validez de un método • Simetría de las blastómeras en D2 y D3 markers of sperm function: male fertility de selección de espermatozoides antes • Existencia de multinucleación en and sperm selection for ICSI. Reproductive de su inyección en el interior del ovocito. D2 y D3 BioMedicine Online 7, 462–468. • Estadio y grado de expansión de los LA POBLACIÓN EN ESTUDIO blastocistos Dalzell LH, McVicar CM, McClure N, Lutton • Tipo de la masa celular interna y D, Lewis SE. 2004 Effects of short and long Parejas en ciclos de ovodonación trofoectodermo en los blastocistos incubations on DNA fragmentation of testicular (donaciones mayores o iguales a 10 • Porcentaje de gestación con sperm. Fertil Steril;82:1443–5. ovocitos MII frescos) y cuya muestra embriones transferidos de ICSI de semen haya sido diagnosticada de • Porcentaje de gestación con De Vos A, Van De Velde H, Joris H et al. 2003 teratozoospermia. embriones transferidos de IMSI Influence of individual sperm morphology • Tasa de implantación con embriones on fertilization, embryo morphology, and CRITERIOS DE INCLUSIÓN transferidos de ICSI pregnancy outcome of intracytoplasmic sperm • Tasa de implantación con embriones injection. Fertility and Sterility 79, 42–48. Greco Parejas en ciclos de ovodonación. Con transferidos de IMSI E, Iacobelli M, Rienzi L et al. 2005ª donaciones mayores o iguales a 10 • Porcentaje de aborto temprano con ovocitos MII frescos cuya muestra de embriones transferidos de ICSI Garolla A, Fortini D, Menegazzo M, De Toni L, semen sea teratozoospérmica. • Porcentaje de aborto temprano con Nicoletti V, Moretti A, Selice R, Engl B, Foresta embriones transferidos de IMSI C. 2008 High-power microscopy for selecting CRITERIOS DE EXCLUSIÓN spermatozoa for ICSI by physiological status. RESULTADOS Reproductive BioMedicine Online 17(5):610-6 • Parejas que no sean de ovodonación • Parejas de ovodonación con Se presentarán en el congreso Hammadeh ME, Strehler E, Zeginiadou T, donaciones menores a 10 ovocitos MII. Rosenbaum P, Schmidt W. 2001Chromatin • Parejas de ovodonación de ovocitos REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS decondensation of human sperm in vitro and vitrificados. its relation to fertilization rate after ICSI. Arch • Parejas de ovodonación con muestras Agarwal A, Gupta S, Sharma RK 2005 Oxidative Androl ;47:83–7 . de semen diagnosticadas como stress and its implication in female infertility oligozoospermia severa con una – a clinician’s perspective. Reproductive Mansour RT, Aboulghar MA, Serour GI et al. concentración menor a 10x106 de BioMedicine Online 11, 641–650. 1995 The effect of sperm parameters on the
- 19. S E S I Ó N D E I tUlO D R O l O G Í A t A N Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 17 outcome of intracytoplasmic sperm injection. Sakkas D, Seli E, Bizzaro D et al. 2003 Tesarik J, Greco E, Mendoza C 2004 Late, Fertility and Sterility 64, 982–986. Abnormal spermatozoa in the ejaculate: but not early, paternal effect on human abortive apoptosis and faulty nuclear embryo development is related to sperm Nagy ZP, Liu J, Joris H et al. 1995 The result remodelling during spermatogenesis. DNA fragmentation. Human Reproduction of intracytoplasmic sperm injection is not Reproductive BioMedicine Online 7, 428–432. 19, 611–615. related to any of the basic sperm parameters. Human Reproduction 10, 1123–1129. Shoukir Y, Chardonnens D, Campana A, Tesarik J 2005 Paternal effects on cell division Sakkas D 1998 Blastocyst development from in the human preimplantation embryo. Oehninger S, Chaturvedi S, Toner J, Morshedi supernumerary embryos after intracytoplasmic Reproductive BioMedicine Online 10, 370–375. M, Mayer J, Lanzendorf S, Muasher S. sperm injection: a paternal influence? Human Semen quality: is there a paternal effect on Reproduction 13, 1632–1637 . Vanderzwalmen P, Bach M. and Zech N. pregnancy outcome in in-vitro fertilization/ 2007. Selection of the bset spermatozoa intracytoplasmic sperm injection? Hum Sukcharoen N, Sithipravej T, Promviegchai at high magnification: Can we consider Reprod. 1998;13:2161–2164. S et al. 1998 Sperm morphology evaluated intracitoplasmic morphologically selected by computer (IVOS) cannot predict sperm injection (IMSI) as the new Parinaud J, Mieusset R, Vieitez G et al. 1993 the fertilization rate in vitro after generation of ICSI? ASEBIR Congress 2007. Infl uence of sperm parameters on embryo intracytoplasmic sperm injection. Fertility quality. Fertility and Sterility 60, 888–892. and Sterility 69, 564–568. Svalander P, Vanderzwalmen P, Hiemer A., Rubner P, BachM., Jakobsson AH, Forsberg AS. Neyer A., Stecher A., Uher P., Zintz M., Lejeune Peer S, Eltes F, Berkovitz A, Yehuda B., Vanderzwalmen S, Cassuto G, Zech NH. 2008 R, Itsykson P, Bartoov B. 2007 Is fine Tesarik J, Greco E, Mendoza C 2002 Paternal Blastocyst development after sperm selection morphology of the human sperm nuclei effects acting during the fi rst cell cycle of at high magnification is associated with size affected by in vitro incubation at 37 degrees human preimplantation development after and number of nuclear vacuoles Reproductive C? Fertil Steril 88(6):1589-94. Epub 2007 ICSI. Human Reproduction 17, 184–189. BioMedicine Online 17 No 5., 617-627.
- 20. S E S I Ó N D tE I t U lB OR I O l O G Í A E M Mª José De los Santos 18 EStADO ACtUAl DEl GRUPO DE INtERÉS DE EMBRIOlOGÍA Mª José De los Santos El Grupo de Interés presentará la actualidad del trabajo realizado, los proyectos en marcha y las propuestas de futuro del grupo. NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF EMBRyO SElECtION tEChNIqUES (tÉCNICAS DE DIAGNÓStICO NO INVASIVO DE SElECCIÓN EMBRIONARIA) Mark G Larman1, Petra Wale2, Rebecca Collins3, Michelle Lane4, David K Gardner2 1 Vitrolife, 3601 South Inca St, Englewood, CO 80110, USA 2 Dept of Zoology, University of Melbourne, Parkville, VIC 3010, Australia 3 Repromed, Dulwich, Adelaide, Australia e-mail: mlarman@vitrolife.com INTRODUCTION During the preimplantation period the embryonic genome activation and embryo undergoes significant changes X-chromosome inactivation, around The ultimate goal of human IVF is in gene expression patterns, as the the blastocyst stage. Consequently, the birth of a healthy singleton child embryonic genome is gradually activated, prior to implantation male and female following the transfer of a single embryo. and in physiology as it develops and embryos exhibit differences in their To attain the routine transfer of a single differentiates. Underlying such changes cellular phenotype. Manifestations of embryo requires both the appropriate are fundamental differences in nutrient such differences include altered total culture system to maintain development requirements and energy metabolism of activity of specific X-linked enzymes and of the embryo, and the ability to the embryo. Of significance, the nutrient the metabolic pathways they regulate. determine, non-invasively, the viability requirements of the embryo are mirrored Subsequently, one would expect to be of each embryo within a patient’s cohort. by the gradient of nutrients within the able to determine differences in the Analysis of embryo nutrition has enabled female reproductive tract. rate of consumption and utilisation the development of more physiological of specific nutrients between male media, but now it is helping to identify The pronucleate oocyte and cleavage and female embryos (Gardner et al., biomarkers of developmental potential. stage embryo are metabolically 2010). A recent study by Sturmey quiescent. Consequently there is limited and colleagues (Sturmey et al., 2010) From fertilisation to implantation the demand for biosynthesis and energy has demonstrated a difference in the human preimplantation embryo has requirements remain low, hence glucose uptake of seven amino acids between limited endogenous energy stores, is not utilised for energy production. male and female bovine blastocysts and consequently obtains its nutrition Rather the energy demands during the cultured in vitro. Additionally Pickton from the surrounding fluids within first 48h of life are met predominantly by et al. (2010) observed that gender the oviduct and uterus. As the embryo pyruvate and lactate, although specific significantly affected the metabolism of passes through the female reproductive amino acids are involved in nutrient certain amino acids by cleavage stage tract it is exposed to gradients of utilisation and metabolic regulation. human embryos. nutrients. Within the oviduct the From the 8-cell stage onwards, as cell embryo is exposed to relatively high numbers increase exponentially and The relationship between embryo levels of pyruvate and lactate, but the embryo undergoes morphological nutrition and viability has been low levels of glucose. In contrast, the changes at compaction and subsequently documented for three decades. uterine environment provides more the generation of a blastocoel, there However, the technologies required for glucose and significantly less pyruvate is an increased need and demand for the analysis of such limited amounts and lactate. Furthermore, the fluids glucose as a nutrient. of biological material has been highly within the reproductive tract contain sophisticated and confined to a few significant levels of certain amino Of interest, male and female laboratories. Hence this approach has acids, together with changing levels preimplantation mammalian embryos not been adopted by clinical IVF. With of glycosaminoglycans. Finally, it is differ not only in their chromosomal the advent of novel and more sensitive also evident that a complex dialogue complement, but in their proteome analytical platforms, the quantification takes place between the embryo and and subsequent metabolome. This of nutrient utilisation is finally being the mother through complex signaling phenomenon is due to a finite period applied in clinical studies. Data to date pathways involving cytokines (including during preimplantation development from such work indicate that both the chemokines) and growth factors, the when both X-chromosomes in the utilisation of specific carbohydrates modes of which are still be elucidated. female embryo are active, between and amino acids is associated with
- 21. S E S I Ó N D E t I tUlO R I O l O G Í A E M B Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 19 pregnancy outcome. Significantly, all such studies are completely non- invasive, requiring only small volumes of spent culture medium for analysis. As well as the analysis of specific nutrients, metabolomic technologies are being used to quantitate the overall metabolic footprint by employing variants of optical spectroscopy including Raman and Near Infrared (NIR) methods. Such methods have previously dominated biospectroscopy, because of their efficiency, sensitivity and amenability to milli- and micro- scale volumes. Seli and colleagues (2007) were the first to report comparisons of metabolomic embryo profiles obtained from spent culture medium using both techniques, and found strong correlations between pregnancy outcomes. The validity of such a metabolomics approach is currently being evaluated prospectively. A study included in this presentation by Gardner and colleagues (2011) has also observed sex-specific differences in the uptake of glucose by human embryos post compaction. Furthermore, glucose consumption by embryos that resulted in a pregnancy was significantly higher on both day 4 and day 5 than those embryos that failed to develop post transfer. MATERIALS AND METHODS The embryos of 50 patients having single blastocyst transfer were cultured individually from day 3 in 10μl drops of medium G2 (Vitrolife) under Ovoil and 15 were girls. Glucose consumption to 72.1 ± 7.3 pmol/embryo/h for those (Vitrolife) in 5%O2, 6%CO2, 89%N2. by embryos that continued on to establish which failed to develop post transfer. Embryos were moved to fresh drops a pregnancy was significantly higher of medium every 24h. Spent media on both culture day 4 (82.0 ± 4.9 pmol/ CONCLUSION samples, including controls containing embryo/h) and day 5 (182.1 ± 20.6 pmol/ no embryo, were coded, frozen and embryo/h) compared to those embryos The data presented here indicate that on subsequently analysed blind. Analysis which failed to develop post transfer (50.3 day 4 and day 5 of development there is a of glucose was performed using enzyme ± 4.4 and 90.8 ± 11.6 pmol/embryo/h positive correlation with glucose uptake linked reactions and quantitative respectively) (Figure 1). Furthermore, on and human embryo viability, and that fluorescence microscopy (Leese et al., day 4 there was a significant difference furthermore, there are differences in the 1984; Gardner, 2007). (28% increase) in glucose uptake by metabolism of male and female embryos. females (92.5 ± 7.1 pmol/embryo/h) Prospective randomized trials are now RESULTS compared to males (72.0 ± 6.3 pmol/ required to evaluate the merits of metabolic embryo/h). By day 5 the difference criteria for human embryo selection. Of the 50 patients having a single between males and females was reduced blastocyst transferred, 32 had a positive to 19% and was not significantly different. ACKNOWLEDGEMENTS hCG (64%) and 29 resulted in a fetal heart The overall glucose consumption over the beat (58% implantation rate). Twenty 48h period from day 3 to day 5 was 131.0 The authors would like to thank the staff and eight children were subsequently born ± 11.4 pmol/embryo/h for those embryos patients of Repromed, Adelaide. This work (56% live birth rate) of which 13 were boys which subsequently implanted, compared was funded by the University of Melbourne.
- 22. S E S I Ó N D tE I t U lB OR I O l O G Í A E M Mark G Larman et al. Non-invasive diagnosis of embryo selection techniques 20 REFERENCES predictive of embryo sex and live-birth Seli E, Sakkas D, Scott R, Kwok SC, outcome. Hum Reprod. in press. Rosendahl SM, Burns DH (2007) Gardner DK (2007). Non-invasive metabolic Noninvasive metabolomic profiling of assessment of single cells. Methods Mol Leese HJ and Barton AM (1984) embryo culture media using Raman and Med: 132,1-9. Pyruvate and glucose uptake by mouse near-infrared spectroscopy correlates ova and preimplantation embryos. J with reproductive potential of embryos in Gardner DK, Larman MG and Thouas ReprodFertil: 72,9-13. women undergoing in vitro fertilization. GT (2010) Sex-related physiology of Fertil Steril 88: 1350-7. the preimplantation embryo. Mol Hum Picton HM, Elder K, Houghton FD, Hawkhead Reprod16: 539–547. JA, Rutherford AJ, Hogg JE, Leese HJ, Harris Sturmey RG, Bermejo-Alvarez P, Gutierrez- SE (2010) Association between amino acid Adan A,Rizos D, Leese HJ, Lonergan P Gardner DK, Wale P, Collins R and Lane M turnover and chromosome aneuploidy during (2010) Amino acid metabolism of bovine (2011) Glucose consumption of single human preimplantation embryo development blastocysts: a biomarker of sex and post-compaction human embryos is in vitro. Mol Hum Reprod. 16:557-69. viability. Mol Reprod Dev 77:285–296. USO EN El lABORAtORIO DE lA CAtAlOGACIÓN EMBRIONARIA DE ASEBIR. EStADO ACtUAl Mª Victoria Hurtado de Mendoza Centro Mas Vida Reproducción. Sevilla e-mail: victoria.hurtado@masvidareproduccion.com INTRODUCCIÓN Nacional de la Sociedad Española grupo de interés (Cuadros, 2007). de Fertilidad en Zaragoza 2006, MJ La gran discrepancia entre los centros Torelló y colaboradores presentaron la Una vez asentadas las bases, lo importante de reproducción asistida, tanto clasificación embrionaria y su utilidad era que todos los centros aplicasen la internacionales como nacionales, en un a fin de elegir el mejor embrión, reducir clasificación ¿cómo fue la respuesta? Ya, aspecto básico de la embriología clínica los embarazos múltiples e intentar ese mismo año, el 23% de los trabajos como es la clasificación embrionaria y unificar criterios a la hora de expresar presentados en la sección Embriología en la imposibilidad de generar estudios resultados (Torelló et al., 2006). La el Congreso de la SEF aplicaban criterios multicéntricos con valores de calidad materialización de todo este trabajo de ASEBIR. Y las opiniones de los socios se embrionaria, interpretar informes la Comisión se recogió en la publicación manifestaban en la sección DEBATE de clínicos de laboratorios externos o dentro de los Cuadernos de Embriología la revista ASEBIR Junio 2008, donde comparar los datos bibliográficos, dio Clínica editado por ASEBIR bajo el título aparecían las primeras experiencias, la lugar a la formación de una Comisión “Criterios de Valoración Morfológicos mayoría de ellas muy positivas: coincidían de trabajo ASEBIR, en el año 2004, de Oocitos, Embriones tempranos en que el periodo de familiarización con que bajo el enunciado: ”Definición de y Blastocistos Humanos” (2007) en el manejo de los criterios ASEBIR era muy criterios de valoración morfológica y su una primera edición y en el 2008 se corto; se obtenía un mayor consenso caracterización, de ovocito a blastocisto” realizó una segunda edición revisada. entre los distintos embriólogos del se marcó como objetivo la unificación Posteriormente, con la finalidad de dar a centro; valoraban muy positivamente y el consenso sobre los parámetros conocer este trabajo en otras sociedades el seguimiento del embrión desde más sobresalientes para determinar científicas, se editó una versión en el principio de su desarrollo; se una correcta y eficaz clasificación. Para inglés. contemplaban aspectos que antes no ello, como todos sabéis, Manuel Ardoy se habían valorado como la presencia y Gloria Calderón fueron los encargados En los sucesivos congresos de ASEBIR de vacuolas o alteraciones de la zona de la organización y coordinación del se han ido presentando actualizaciones pelúcida, y la importancia de los tiempos trabajo junto a 10 embriólogos de de la clasificación, que por tratarse exactos de observación (Hugas et al., diversos centros de España. Se realizó de un proceso dinámico no puede 2008; Ferrando et al., 2008). Además, una exhaustiva revisión bibliográfica, quedarse estancada. Jorge Ten, en el 4º se apreciaba una tendencia a unificar una encuesta multicéntrica y se contó Congreso ASEBIR (Ten, 2007) presentó: criterios entre diversos centros que era con la experiencia de los miembros “Clasificación ASEBIR de la Calidad bastante heterogénea (Cortés et al., 2008). de la comisión. La propuesta de los Embrionaria. Estado actual”, donde criterios morfológicos para cada se mostraban los primeros resultados Por otro lado, se comentaban algunos estadio fue presentada por Mª José de su aplicación en la práctica clínica puntos como negativos, por ejemplo Torelló en el 3er Congreso ASEBIR en diferentes centros. Y Jorge Cuadros que sólo clasifica embriones frescos, (2005). Posteriormente, en el Congreso señalaba los proyectos futuros del no congelados (Cortés et al., 2008); la
- 23. S E S I Ó N D E t I tUlO R I O l O G Í A E M B Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 21 imposibilidad de promocionar un embrión incluyen, mediante la incorporación FIG.1. ENCUESTA de D+2 a D+3 y ¿por qué promocionaba de la luz polarizada, la estructura del un embrión si se le practicaba la eclosión huso meiótico (Lasienè et al., 2009), si 1.- Usas en el laboratorio los Criterios asistida? ; se echaba de menos un score bien es cierto que de momento no hay ASEBIR de valoración morfológica para ovocitos (Brossa et al., 2008). un consenso claro en la bibliografía de oocitos, embriones tempranos y También había opiniones escépticas que determine ninguna característica blastocistos humanos? sobre la posibilidad de que los criterios morfológica concreta que pueda ser ASEBIR se implantasen dada la gran empleada como valor pronóstico SI NO diversidad de centros, pero animaban (Rienzi et al., 2010). a seguir adelante (Mandiola, 2008). *Si es NO da una razón A lo largo de este tiempo se han ido Por otro lado, las observaciones en sugiriendo algunos aspectos a tener en periodos de tiempo continuo (Wong 2.- ¿Desde cuándo? cuenta, con carácter complementario, et al., 2010) evidentemente dan más como es la clasificación del patrón información que las observaciones 2007 2008 pronuclear (Brossa et al., 2010). puntuales a determinadas horas, pero son metodologías excesivamente caras 2009 2010 La Comisión de trabajo ASEBIR tenía y de momento poco prácticas para claro que aún quedaba mucho por hacer la rutina clínica. No obstante dejan 3.- ¿Tienen los clínicos de tu centro y por ello solicitó a la Junta Directiva en tela de juicio si las clasificaciones conocimiento de los criterios de pasar a ser un Grupo de Interés Calidad morfológicas tendrán futuro. ASEBIR? Embrionaria, que no ha dejado de seguir profundizando e intentando corroborar Todo lo expuesto nos ha hecho SI NO con datos lo expuesto. Así en el V plantearnos desde el hoy Grupo de Congreso ASEBIR J. Cuadros expuso los Interés de Embriología, y es el objetivo 4.- ¿Te parece que recogen todos resultados sobre la correlación de las de este trabajo: desde que se presentaron los aspectos fundamentales de una tasas de implantación y categorías A, B, las recomendaciones para la evaluación catalogación? C, D de los embriones (Cuadros, 2009). embrionaria ASEBIR hasta el día de hoy ¿Cuál es el uso actual de la catalogación SI NO La difusión de la catalogación ha ido ASEBIR en los laboratorios? avanzando mediante la realización de * Si es NO da una razón Jornadas de Formación ASEBIR (2009; MATERIAL Y MéTODOS 2011) También hemos intentado su difusión 5.- ¿Hay varios observadores en tu a otras sociedades como ESHRE y ALPHA, A fin de poder conocer el uso de la centro de la calidad embrionaria? por lo que la publicación fue traducida al catalogación ASEBIR en los laboratorios inglés. Recientemente, a través de Gloria FIV, se ha confeccionado una encuesta SI NO Calderón ASEBIR participó en la reunión que de forma aleatoria se ha enviado de expertos a nivel mundial con el objetivo a 82 centros de reproducción asistida, 6.- ¿Qué diferencia inter-observador de llegar a un consenso de criterios tanto en el ámbito privado como público, a la hora de catalogar los embriones mínimos en la evaluación de ovocitos y con gran volumen de trabajo o poco, de habéis apreciado? embriones, promovida por ALPHA (Alpha toda la geografía española. La encuesta Executive) y el Grupo de Interés especial consta de 23 preguntas o ítems, tanto 5% 10% 15% de Embriologia de la ESHRE (European abiertas como cerradas, en las que se Society of Human Reproduction and intentaba obtener información general No se ha valorado Embryology and Embryology Consensus (ítems 1-4); si se realizan controles de Workshop on Embryo Assesment) calidad (ítems 5-9); cómo se valoran 7.- ¿Qué diferencia mínima de celebrada en febrero de 2010 en Estambul algunas características como la división porcentaje de restos citoplasmáticos (Join Alpha / ESHRE, 2010). temprana (ítems-13); la multinucleación crees que eres capaz de distinguir? (ítems 14-15); qué caracteres se valoran Por último, no podemos obviar la más en un embrión óptimo (ítem 16); la A) Creo que puedo distinguir un embrión incorporación de metodologías no utilidad de los esquemas y tablas de la con un 10% de restos de otro con un invasivas para la valoración morfológica clasificación; el D+4; y se pedía opinión 30% de restos del ovocito y el embrión, con el objetivo sobre qué aspectos parecían menos de mejorar la selección del embrión claros o pensaban que faltaban en la B) Creo que puedo distinguir un con mayor potencial de implantación. catalogación (ítems 17-22). Por último, embrión con un 10% de restos de otro Algunos trabajos no sólo contemplan si la aplicación de la clasificación con un 20% de restos las características morfológicas del ASEBIR había incrementado su tasa de ovocito limitándose al complejo de implantación (ítem 23) ENCUESTA. Fig.1 C) Creo que puedo distinguir un embrión las células del cúmulus, citoplasma con un 10% de restos de otro con un ovocitario, corpúsculo polar, espacio El tratamiento estadístico en estos 15% de restos perivitelino, zona pelúcida, sino que momentos todavía no se ha completado.
- 24. S E S I Ó N D tE I t U lB OR I O l O G Í A E M Mª Victoria Hurtado de Mendoza. Uso en el laboratorio de la catalogación embrionaria de ASEBIR. Estado actual 22 D) Creo que puedo distinguir un 15.- ¿A partir de qué grado de 18.- ¿Utilizas las tablas del cuaderno embrión con un 10% de restos de otro multinucleación se rechaza un embrión para la clasificación embrionaria? con un 12% de restos a transferir, caso de existir únicamente embriones multinucleados? SI NO E) Creo que puedo distinguir un embrión con un 10% de restos de otro con un Micronucleación: Embrión con una 19.- ¿Te resultan útiles los 11% de restos blastómera con más de dos núcleos esquemas de gradación de la calidad embrionaria? 8. -¿Realizáis algún control externo? Binucleación: Embrión con una blastómera con dos núcleos SI NO SI NO Multinucleación: Embrión con más de *Si es NO da una razón Explica sus características una blastómera micro o binucleada 20.- ¿Crees necesario unos criterios 9.- ¿Realizáis algún control interno? En cualquier caso ASEBIR para dia+4? SI NO 16.- ¿Qué criterios utilizas para definir SI NO a un embrión de óptima calidad? Explica en que consiste (Da una puntuación de 1 a 10 a *Si es NO da una razón cada característica en función de la 10.- Se siguen en tu centro los importancia que tiene para ti, siendo 10 21.- ¿Qué otros criterios o tiempos de chequeo indicados en los la máxima puntuación) características embrionarias no criterios ASEBIR para la evaluación incluidos crees que faltan? embrionaria? - Ritmo de división 22.- ¿Cuál crees que será el papel Fecundación: 16-22h postinseminación - Fragmentación (señala por orden de de los criterios de ASEBIR ante los importancia) sistemas automáticos de evaluación D+2: 44-47h postinseminación · Porcentaje de fragmentación en embrionaria? D+3: 67-71h postinseminación D+2 D+3 23.- ¿Crees realmente que los criterios SI NO de ASEBIR han supuesto una mejora · Distribución de los fragmentos en tu tasa de implantación? * Si es NO da una razón Centrados Dispersos SI NO 11.- Realizas el chequeo de división temprana? · Tamaño de los fragmentos *Si es NO da una razón 25h 26h 27h >27h NO - Presencia de vacuolas 12.- ¿Concedes algún valor a borrar Escasas Abundantes RESULTADOS pronúcleos entre 25-27h? - Multinucleación Dada la premura para entregar el SI NO - Simetría resumen de la ponencia no se dispone - Zona pelúcida de todos los datos tratados que serán 13.- ¿Es determinante la división presentados y desarrollados en el temprana para la selección del Normal Densa Congreso. embrión a transferir? Delgada No circular De los 82 centros consultados han SI NO respondido, tras 3 peticiones de envío, - Anillo Acitoplasmático 36 centros (34 con nombre del centro y 14.- ¿Cuándo es determinante para ti 2 no) y 8 correos han sido devueltos. la multinucleación de una blastómera 17.- ¿Qué parámetros de la para descartar el embrión a transferir? clasificación de ASEBIR te parecen La inmensa mayoría de los centros afirma menos claros? Los referidos a utilizar los criterios ASEBIR (88,8%) División Temprana y prácticamente desde el principio, año 2007, el 43,7%. Los clínicos están D+2 Oocitos Embriones D+1 al corriente de los criterios ASEBIR, D+3 Embriones D+2 Embriones D+3 únicamente en 3 centros la contestación fue NO. Los principios fundamentales Cualquier Momento Blastocistos que abarcan los criterios ASEBIR no
- 25. S E S I Ó N D E t I tUlO R I O l O G Í A E M B Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 23 satisfacen a 2 centros, que consideran Tabla 1. Resultados de la valoración de las características de un embrión óptimo. Media ± desviación que se le da poca importancia a la estándar (x± sd). Rango mínimo -máximo multinucleación y al porcentaje de células multinucleadas, así como a la Carácter x±sd Min-máx distribución de fragmentos. Ritmo de división 9.5±1.3 (5-10) Sólo en 6 centros la observación Fragmentación 8.6±1.31 (5-10) embrionaria la realiza un solo Distribución 7.35±1.93 (2-10)** observador. Por problemas técnicos, la pregunta 6 sobre la diferencia Porcentaje D+2 8.33±1.33 (6-10) interobservadores no ha sido Porcentaje D+3 8.75±1.29 (6-10) respondida correctamente. Tamaño 7.85±1.88 (1-10) La pregunta 7 intentaba valorar qué Presencia de vacuolas 6.5±1.84 (2-10) porcentaje mínimo de fragmentos era capaz de distinguir el entrevistado. La gran Escasas mayoría (58,3%) distingue entre 10% y Abundantes 5.63±2.66 (1-10) 30% y un 22,2% entre el 10% y 15%. 7.80±2.25 (1-10) Respecto al uso de los controles Multinucleación 8.4±1.81 (3-10) externos sólo el 38,8% lo realizan, mientras que los controles internos Simetría 7.72±1.93 (1-10) lo realizan el 58,3% de los centros entrevistados y ambos controles, Zona pelúcida 5.94± 2.3 (1-10)* externos e internos, el 27,7%. Los tiempos de observación Normal 7.00±2.44 recomendados por ASEBIR son seguidos Densa 6.61±2.47 por todos los centros salvo por 1. Delgada 6.54±2.53 La división temprana la realiza el 47,2% No circular 6.82±2.50 de los centros y le dan importancia a borrar pronúcleos justo el 50% de Anillo acitoplasmático 6.02±2.29 (1-10)* los mismos. Sin embargo, la división temprana no es determinante a la hora *1 centro que no lo valora * 2 centros que no lo valora de seleccionar el embrión a transferir en el 72,2% de los grupos. Los esquemas y tablas para facilitar la Respecto a los aspectos menos claros, clasificación embrionaria según los que, según los encuestados, necesitarían Respecto a la multinucleación, en criterios ASEBIR son empleados por el ser tratados con mayor detalle, son: cualquier momento en que se observa es 75% y los consideran útiles (91,6%) la valoración en D+ 4 (34,2%) seguido un carácter desfavorable en el 52,7% de por el D+ 3 (20%), una clasificación de los centros, especialmente si se detecta En cuanto a la evaluación embrionaria los ovocitos (17%), el D+ 6 (5,7%), D+ en D+2 (36,1%). En la pregunta 15, se en D+4, el 30,5% de los grupos no la 1 (2,8%). Un 20% no hace ninguna insistía ante el hipotético caso de contar realiza y por lo tanto no la consideran valoración o considera que los criterios sólo con embriones multinucleados, necesaria. de evaluación están bien. FIGURA 1 cómo lo valorarían, se observa que la multinucleación es el carácter decisivo para rechazar el embrión para la transferencia (61,1%), seguido por la micronucleación (22,2%), la aparición de más de un núcleo en la blastómera en cualquier estadio (3,2%) y la binucleación sería importante sólo para un centro. En la Tabla I se encuentra la media del valor concedido a cada carácter del embrión óptimo (ritmo de división, fragmentación, multinucleación, presencia de vacuolas, etc.), así como el rango mínimo y máximo. Gráfico 1. Criterios morfológicos que suscitan mayor interés.
- 26. S E S I Ó N D tE I t U lB OR I O l O G Í A E M Mª Victoria Hurtado de Mendoza. Uso en el laboratorio de la catalogación embrionaria de ASEBIR. Estado actual 24 Los aspectos no incluidos en los criterios y la variabilidad intra e interobservador de división temprana y, de los que la realizan, que los encuestados proponen son: calidad la morfología embrionaria, entendiendo el 76,4% también le conceden importancia ovocitaria, revisar la multinucleación como la variabilidad interobservador la a la rotura de pronúcleos. Sin embargo, (grado, severidad y tipos); pronúcleos variación a la hora de asignar un grado un valor determinante de este parámetro y precursores nucleolares; blastocistos; a un mismo embrión cuando es evaluado a la hora de seleccionar el embrión a embriones congelados; división temprana, por varios embriólogos y la variabilidad transferir, únicamente se lo confiere simetría y tamaño de blastómeros. intraobservador a la variación al el 58,8%. En la bibliografía, trabajos establecer un grado de un embrión cuando recientes encuentran que la división Los criterios ASEBIR frente a los sistemas es evaluado por el mismo embriólogo en temprana es un marcador independiente automatizados no tienen una única más de una ocasión. Lamentablemente, del potencial de implantación, mejor que respuesta, en general se consideran por problemas técnicos, esta información la morfología del zigoto (Brezinova et al., útiles si bien dependerán de los nuevos no pudo ser recogida. Sin embargo, 2009), y otros autores otorgan más valor hallazgos. bibliográficamente se ha descrito predictivo a otro tipo de caracteres como el desde hace tiempo que la diferencia número de blastómeras, las características Por último, en referencia a si el empleo de interobservadores puede ser alta, morfológicas y el grado (Nicoli et al., 2011). los criterios ASEBIR ha mejorado las tasas mientras que la intraobservador es A fin de valorar la división temprana, como de implantación, el 58,3% reconocen moderada, y que pueden incidir sobre un potencial marcador de implantación, que sí han incrementado su tasa de los resultados del programa de FIV/ICSI se han venido realizando por parte de implantación. (Baxter Bendus et al., 2006). Por lo tanto, la Comisión y actualmente por el Grupo para unificar y acercar criterios a la hora de Interés de Embriología, revisiones DISCUSIÓN de la evaluación, las diferentes sociedades bibliográficas que permitiesen un resultado científicas recomiendan la participación concluyente, pero no se ha podido tomar La aplicación de los criterios ASEBIR en en controles externos para la evaluación una decisión. Recientemente, desde los laboratorios ha supuesto un esfuerzo embrionaria (Practice Committee of el grupo de interés se está llevando a por parte de todos, con la finalidad American Society for Assisted Reproductive cabo un estudio multicéntrico sobre la de unificar criterios. Muchos centros Medicine and Practice Committee of división temprana, cuyos datos se están teníamos nuestros propios sistemas the Society for Assisted Reproductive procesando y esperamos poder presentar de evaluación embrionaria y, ante la Technology, 2006; ASEBIR, 2008; Magli et en nuestro próximo congreso. perspectiva de cambiar, algunos no lo al., 2008) y diversos trabajos realizados han hecho, otros los cambiaron sin más al respecto, si bien la bibliografía no es La multinucleación (preguntas 14-15) y otros realizaron pruebas comparativas, muy abundante, ponen de manifiesto es uno los caracteres que más inquietud donde no encontraron una diferencia que participar en controles de calidad produce entre los encuestados, a pesar significativa; en el trabajo de Vanrell et al. externos disminuyen las diferencias entre de estar documentado bibliográficamente (2007) la diferencia era un 6%. laboratorios (Ruiz de Assín et al., 2008; que la presencia de dos o más núcleos 2009; Castilla et al., 2010). Así como el o micronúcleos en una célula está Con objeto de conocer si se están entrenamiento con imágenes hace que correlacionado directamente con alta aplicando los criterios ASEBIR, se realizó disminuyan las diferencias intra e inter tasa de anomalías cromosómicas y bajas una encuesta de opinión sobre una observador (Arce et al., 2006; Paternot tasas de implantación (Van Royen et al., muestra representativa de 82 centros et al., 2009). Sin embargo, a pesar de 2003). Según la catalogación ASEBIR, un con preguntas abiertas y cerradas. las recomendaciones, sólo un 38,8% de embrión con multinucleación es categoría Las preguntas 1-4 intentaban recabar los centros consultados realiza controles D; sin embargo, es uno de los caracteres información general, así se constata que externos, de los cuales el 85,7% los realiza morfológicos al que más referencia se hace la gran mayoría de los centros consultados con el Centro de Estudio e Investigación en diversos items. Según los encuestados, aplican los criterios ASEBIR; sólo 4 de la Fertilidad (Ceifer), centro pionero las consideraciones de los criterios centros no lo hacen porque los consideran en nuestro país, auspiciado por ASEBIR ASEBIR son incompletas, p.e. no se complicados, confusos, y no les aportan (Castilla et al. 2003). Un centro lo hace define qué porcentaje de multinucleación ventajas respecto a sus propios sistemas a través de la ESHRE y otro con Fertaid podría ser aceptable. Es cierto que hay de clasificación embrionaria, si bien (Australia) referencias de niños nacidos transfiriendo uno de los centros comenta que usa los embriones multinucleados, pero evitar la criterios ASEBIR como apoyo. Desde la En las preguntas 10-13 la idea era mutinucleación es la recomendación. La publicación de los criterios ASEBIR en el conocer cómo se valoran los tiempos de consulta realizada sobre en qué momento 2007, se ha ido extendiendo a lo largo de observación y la división temprana en los en que se observe la multinucleación se estos años su uso en los laboratorios dada diversos centros. Como todos sabemos, descarta un embrión para transferencia, su gran acogida. Para intentar valorar de uno de los aspectos más importantes el 52,7% responde que en cualquier qué forma se unifican los criterios entre a la hora de realizar la valoración de la momento; el 36,1% en D+2 y el 11,1% en los embriólogos de un mismo centro o morfología embrionaria es el respetar los D+3. En caso de no disponer nada más que entre distintos centros se realizaron las tiempos de observación, y esto es seguido de embriones multinucleados, por orden preguntas 5-9. La pregunta nº 6 de la por todos los centros consultados excepto de importancia se rechazaría: aquel con encuesta pretendía determinar si se había uno. No llega a la mitad el porcentaje de multinucleación; micronucleación; en realizado algún control en los centros sobre centros que realizan la observación de la cualquier caso y, por último, binucleación.
- 27. S E S I Ó N D E t I tUlO R I O l O G Í A E M B Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 25 Presuponemos que sabemos elegir un mayor frecuencia que en D+5; la valoración de las nuevas tecnologías no invasivas embrión óptimo, y con la finalidad de saber morfológica en D+3; la valoración de y que no todos los centros tendrán hasta qué punto estamos de acuerdo, se la morfología de ovocitos; blastocistos fácil acceso a ellas. No obstante, la realizaron las preguntas y subpreguntas en D+6; y por último la valoración en información obtenida a través de las en el ítem 16. Hay determinados caracteres D+1. En referencia a los blastocistos, el nuevas tecnologías no invasivas es de en los que hay acuerdo, como un buen Grupo de Interés de Embriología está esperar que dé mayor información y ritmo de división, la baja fragmentación, la trabajando en este sentido, realizando un permita aclarar algunas controversias ausencia de vacuolas, sin multinucleación; estudio multicéntrico sobre la valoración en nuestro sistema de graduación, sabemos lo que queremos, pero a la vista morfológica de los blastocistos, y este p.e. definir mejor la catalogación entre de las respuestas hay una gran dispersión mismo año ha sido el tema tratado, con embriones B y C. en la valoración de determinados gran éxito de asistencia, en la II Jornada caracteres, como son la distribución y el de Formación bajo el título: “Uso clínico CONCLUSIONES tamaño de los fragmentos; la presencia del blastocisto en Fecundación in vitro” de vacuolas; la simetría y la zona pelúcida. (Jornada ASEBIR, 2011). • El uso de los criterios ASEBIR está Estas discrepancias van a influir a la muy extendido en los diversos hora de catalogar los embriones como Por otro lado, otras valoraciones que laboratorios que consideran que A, B, C o D y por lo tanto en la decisión consideran que se deberían incluir son: recoge los aspectos fundamentales clínica. La gran variabilidad a la hora de a) el grado de multinucleación; ha sido en la evaluación embrionaria. valorar estos caracteres hace pensar que mencionado con insistencia en varios sería deseable, como ya se comentó al apartados, se requiere información sobre • La aplicación de los criterios principio de la discusión, la realización de qué porcentaje es aceptable de blastómeras ASEBIR permite no sólo un mayor controles externos e internos de calidad con multinucleación, determinar entendimiento entre los miembros embrionaria, así como animar a ASEBIR realmente si es tan importante ya que de un mismo centro, sino entre los a realizar mayor número de cursos y/o algunos opinan que se le da demasiada diferentes centros, reduciendo las jornadas para aclarar y eliminar ciertas importancia, etc.; b) clasificación para diferencias intra e interobservadores. discrepancias, uniformizando los criterios embriones congelados, es una de las y que el futuro del embrión no dependa primeras propuestas realizadas cuando • Se recomienda: del laboratorio donde se ha generado aparecieron los criterios ASEBIR y aún no • La participación en controles de (Castilla, 2009). se ha abordado; c) tratar con más detalle calidad externos e internos. las observaciones en D+4, D+5, D+6; el • Formación continuada mediante Los esquemas y tablas que acompañan desarrollo embrionario del D+4 al D+6 está la realización de cursos o la clasificación morfológica ASEBIR son esquematizado en la catalogación ASEBIR, jornadas a fin de ir unificando los útiles (ítems 17,18 y 23), y se utilizan de hecho fue revisado y actualizado, pero criterios. de forma habitual para catalogar los puede que el hecho de que el cultivo • La participación en trabajos embriones. Si bien hay que resaltar que extendido a estos estadios no lo realicen multicéntricos que permitirán no hay concordancia en las respuestas, todos los centros puede dar lugar a dar potencia a los criterios de ya que dentro del grupo de aquellos que que exista un mayor desconocimiento; ASEBIR. han contestado que no usan el cuaderno, d) calidad ovocitaria, incluyendo la el 77,7% sin embargo lo considera útil. valoración del dimorfismo de los ovocitos • Hay aspectos de los que se demanda Y dentro del grupo de los que usan el durante la microinyección (resistencia/ una información con mayor detalle, cuaderno, sólo 1 no lo considera útil. En elasticidad de la membrana; formación del como la multinucleación, una cuanto a si esta catalogación ha supuesto cono; la viscosidad del citoplasma). valoración para ovocitos, embriones un incremento en la tasa de implantación, D+4 a blastocisto, entre otros. un 58,3% de los centros ha contestado Frente a la aparición de nuevas técnicas que sí. Los que han contestado que no invasivas como las “-ómicas”, el • Al ser un sistema dinámico, los no, alegan que sus propios sistemas de sistema de monitorización del embrión criterios han de estar en continua catalogación son muy similares a los de mediante observación ininterrumpida actualización, y la existencia de ASEBIR, por lo cual no les ha supuesto (Embryoscope, Unisense Fertil Tech A/S, nuevas metodologías no invasivas una diferencia significativa en cuanto a Dinamarca) o analizadores de imágenes no parece que vaya a hacer peligrar sus tasas de implantación. automáticas por periodos de tiempo los fundamentos, si bien puedan dar (Wong et al., 2010) o, por el contrario, los lugar a algunas modificaciones. A pesar de la buena acogida y empleo de que abogan por un solo análisis en D+3 los criterios, hay ciertos aspectos en los (Racowsky et al., 2009), se podría pensar AGRADECIMIENTOS que los encuestados desearían disponer que los criterios ASEBIR pueden quedar de mayor información (ítems 19-21) y por desfasados en poco tiempo. Sin embargo, A José Luis del Pico Sánchez por su empeño orden de importancia serían: la valoración la respuesta (ítem 22) ha sido bastante en la elaboración de esta encuesta y su morfológica en D+4, si bien es cierto positiva, puesto que la mayoría de los infinita paciencia. Asimismo, a todos y cada que el 30,5% no evalúa este estadio, laboratorios considera que seguirán uno de los centros que han respondido quizá debido a que las transferencias siendo válidos. Entre otras cosas, porque a la encuesta y sin cuya colaboración no embrionarias se llevan a cabo en D+3 con está por demostrar la potencia predictiva hubiera sido posible realizar este trabajo.
- 28. S E S I Ó N D tE I t U lB OR I O l O G Í A E M Mª Victoria Hurtado de Mendoza. Uso en el laboratorio de la catalogación embrionaria de ASEBIR. Estado actual 26 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS de oocitos, preembriones tempranos y Racowsky C, Ohno-Machado L, Kim J, Biggers blastocistos humanos propuestos por JDb.Is there an advantage in scoring early Arce JC, Ziebe S, Lundin K, Janssens R, ASEBIR Rev. ASEBIR 2008; 14 (1): 25 embryos on more than one day? Hum Reprod Helmgaard L, Sørensen P. Interobserver 2009; 24 (9): 2104–2113 agreement and intraobserver reproducibility Cuadros, J. Proyectos de futuro del grupo de of embryo quality assessments .Hum Reprod interés”calidad embrionaria”.IV Congreso Rienzi L, Vajta G, Ubaldi F. Predictive 2006; 21 (8): 2141–2148. ASEBIR, Bilbao 2007. Rev ASEBIR 2007; value of oocyte morphology in human IVF: a 12(2): 24-26 systematic review of the literature. Reprod ASEBIR. Cuadernos de embriología clínica II. Update. 2011 Jan-Feb; 17(1):34-45. Criterios ASEBIR de valoración morfológica de Cuadros, J. Estado actual del grupo de interés oocitos, embriones tempranos y blastocistos de Calidad Embrionaria. V Congreso ASEBIR. Ruíz de Assín R, Gonzálvo MC, Clavero A, Zamora humanos. 2ª ed. Madrid: Góbalo; 2008 Valencia, 2009. Rev ASEBIR 2009; 14 (2): 8 S, Fernández A, Roldán M, et al., Reducción de la variabilidad interobservador en la evaluación ASEBIR 1ª Jornada de Formación en Ferrando, P. Criterios de valoración embrionaria tras sesión de consenso entre Reproducción Asistida. Sevilla 15 de Mayo. 2009 morfológicos de embriones ASEBIR. Rev. expertos Rev. ASEBIR 2008; 13 (2): 10-13. ASEBIR 2008; 14 (1): 25 ASEBIR. Jornada ASEBIR de Formación. Ruiz de Assensi R, Clavero A, Gonzalvo MC, ”Uso clínico del Blastocisto en Fecundación Hugas M, Fernández M, Sarquella J. Criterios Ramírez JP, Zamora S Fernández A, et al. in vitro”. Madrid 12 de Mayo. 2011 de valoración morfológicos ASEBIR. Nuestra Comparison of methods to determine the Experiencia. Rev. ASEBIR 2008; 14 (1): 24 assigned value in an external quality control Baxter Bendus AE, Mayer JF, Shipley programme for embryo evaluation. RBM SK, Catherino WH. Interobserver and Join Alpha/ ESHRE. Consensus Workshop on Online 2009; 19 (6): 824-829 intraobserver variation in day 3 embryo Embryo Assessment. Stanadarization of grading grading. Fertil Setril 2006; 86(6):1608-15. morphology. Fertil Steril 2010; 94(3):1152-53 Ten J, Ardoy M, Calderón G, Cuadros J, de los Santos MJ, Herrer R et al. Clasificación Brezinova J, Oborna I, Svobodova M, Lasienë K, Vitkus A, Valanèiûtë A, Lasys V. embrionaria según los criterios ASEBIR: Fingerova H. Evaluation of day one embryo Morphological criteria of oocyte quality resultados de su aplicación en la práctica quality and IVF outcome--a comparison of clínica en diferentes centros. IV Congreso two scoring systems. Reprod Biol Endocrinol. 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ASEBIR Diciembre 2003; 1(8): 40-44. en transferencias selectivas de un embrión. Nicoli A, Capodanno F, Moscato L, Rondini XXVI Congreso Nacional SEF pp193 Castilla JA. . Calidad Embrionaria. I, Villani MT, Tuzio A et al.,Aneanalysis of Catalogación ASEBIR. Casos prácticos, pronuclear zygote configurations in 459 Van Royen E, Mangelschots K, Vercruyssen test de control de calidad. 1ª Jornada de clinical pregnancies obtained with assisted M, De Neubourg D, Valkenburg M, Ryckaert Formación en Reproducción Asistida. Sevilla reproductive technique procedures. Reprod G et al.,Multinucleation in cleavage stage 15 de Mayo. 2009 Biol Endocrinol 2010, 8:77 embryos Human Reproduction 2003; 18 (5):1062-1069 Castilla JA, Ruíz de Assin R, Gonzalvo MC, Paternot G, Devroe J, Debrock S, D’Hooghe Clavero A, Ramírez JP, Vergara F, et al. External TM, Spiessens C. 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Evaluación de andrology laboratories. Fertil Steril 2008; development to the blastocyst stage. Nat los criterios de valoración morfológicos 90 (Suppl 3): 45-59 Biotechnol. 2010 Oct; 28(10):1115-21
- 29. ¿Sabe que están haciendo sus embriones mientras duerme? EmbryoScope™ Embryo EmbryoViewer™ EmbryoSlide® Monitoring System Workstation Culture Dish Monitorización contínua de Sistema de gestión Condiciones de cultivo los embriones en cultivo de datos en 4D controladas Sistema de Time-lapse Observación permanente de los embriones para una mejor toma de decisiones Cultivo sin interrupciones Condiciones de cultivo estables en un entorno controlado Evaluación flexible En cualquier momento, en cualquier lugar, no se pierda nada Información completa en 4D Haga un mejor análisis teniendo toda la información
- 30. S E S I Ó Nt IDt EU l O l I D A D C A Antonio González-Utor 28 EStADO ACtUAl DEl GRUPO DE INtERÉS DE CAlIDAD DEl lABORAtORIO DE REPRODUCCIÓN ASIStIDA Antonio González-Utor El Grupo de Interés presentará la actualidad del trabajo realizado, los proyectos en marcha y las propuestas de futuro del grupo. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN El MANEjO DE lAS MUEStRAS BIOlÓGICAS Montse Boada Departamento de Obstetricia, Ginecología y Reproducción. Institut Universitari Dexeus. Barcelona. e-mail: monboa@dexeus.com INTRODUCCIÓN o embriones), a los propios pacientes riesgo de errores. El personal debe o sus cónyuges, o a los futuros niños poder realizar todo el trabajo que se Los laboratorios de reproducción que nazcan fruto de la técnica de haya programado (asistencial, docencia asistida son laboratorios en los que se reproducción asistida efectuada. e investigación) respetando siempre la trabaja con un material muy preciado y En cuanto al personal, los técnicos premisa de que no se deben realizar dos con el que se debe proceder con máximo y embriólogos del laboratorio, los procesos distintos simultáneamente rigor y minimizando los riesgos. médicos del servicio, personal afín e y que se dispondrá siempre de un Normalmente, cuando se habla de incluso a la dirección del centro, si una controller que puede ser otro biólogo, un seguridad en el manejo de muestras demanda llegara a producirse, pueden técnico u otro personal del staff que en biológicas, siempre solemos pensar en verse afectados por una situación de los procedimientos críticos verifique la los casos de muestras de riesgo biológico riesgo importante. Es evidente que no identidad de las muestras. Actualmente con las que es preciso adoptar medidas deben ahorrarse esfuerzos en planificar se están desarrollando algunos de seguridad extremas para evitar correctamente el buen funcionamiento sistemas alternativos para identificar una posible contaminación cruzada. de un laboratorio de reproducción las muestras y minimizar los riesgos Sin embargo, la práctica clínica diaria asistida, ya sea de andrología, FIV o de error que emplean, además de los conlleva muchísimos otros riesgos que DGP, con el fin de minimizar los posibles códigos de barras habituales, sistemas deben evitarse y para ello, la única riegos y encaminar el trabajo hacia la de alarma por radiofrecuencia que solución es disponer de un sistema de excelencia. Un buen laboratorio no es avisan cuando en una misma estación control de calidad implementado no solo aquel que únicamente consigue mejores de trabajo se introducen muestras de porque la normativa actual lo exige sino resultados, sino que además debe correr distintos pacientes (Glew et al., 2006). para mejorar la seguridad y resultados los mínimos riesgos posibles y registrar Asimismo, nuevos métodos, hoy por hoy del laboratorio. Es imprescindible el menor número de incidencias. aun experimentales, están estudiando disponer de todos los procedimientos la posibilidad de aplicar dispositivos de laboratorio protocolarizados de PERSONAL DE LABORATORIO microscópicos de formas distintas acuerdo a los estándares de calidad, a la zona pelúcida de los ovocitos y realizar controles de calidad internos Para un correcto funcionamiento es embriones para marcarlos y poder y externos, evaluar los resultados de imprescindible disponer del personal distinguirlos evitando confusiones con acuerdo a los indicadores de calidad necesario y adecuadamente formado los de otras pacientes (Novo et al., establecidos, registrar incidencias (Asebir, 2008; Magli et al., 2008). 2011). Si no se dispone de ninguno y planificar proyectos de mejora. Es importante disponer de personal de estos sistemas alternativos de Trabajar de acuerdo a los protocolos suficiente, pero no excesivo, para cubrir vigilancia, debería velarse siempre para normalizados de trabajo no solo cualquier situación respetando los que ningún embriólogo trabaje nunca disminuye la variabilidad de resultados periodos de descanso, comidas, etc. La solo sin un controller. y eficiencia entre los distintos miembros gestión de guardias, bajas, congresos de un mismo equipo, sino que disminuye u otras situaciones excepcionales Es altamente recomendable realizar enormemente los riesgos de error. también debe estar cubierta sin formación continuada para preparar posibilidad de imprevistos, siendo en al personal para las nuevas técnicas Los riegos pueden ser de naturaleza algunos casos recomendable disponer o avances que se vayan produciendo. muy variada y pueden afectar al de colaboradores externos o free-lance La realización de controles de calidad propio personal o a los pacientes. En que puedan cubrir dichas situaciones internos servirá para comparar los el caso de los pacientes, el grado de sin sobrecargar al equipo habitual. La resultados entre los distintos embriólogos afectación puede ser distinto según falta de personal y un exceso de trabajo del equipo, y los controles externos, para afecte únicamente a las muestras que suele comportar cansancio, falta de valorar y comparar los resultados propios manipulamos (gametos, tejido gonadal atención y, en consecuencia, mayor con los de otros laboratorios.
- 31. S E S I Ó N tD tUlO A l I D A D I E C Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 29 Es imprescindible un adiestramiento monitorizar el nivel de oxígeno en el aire estar vacunado contra la hepatitis B. básico del personal para evitar posturas y alerte cuando se rebaje críticamente. Debe estar informado de los riesgos ergonómicas inadecuadas cuando se que supone manejar material biológico trabaja al microscopio o a la lupa, que Asimismo, dentro del laboratorio de FIV infectado y ser suficientemente pueden llegar a ocasionar problemas debería reducirse al máximo la entrada competente y tener el conocimiento y graves de salud (cervicales, lumbares, de papel, cajas, etc., por lo que las experiencia adecuados para desarrollar etc.), hábitos de limpieza mínimos zonas de almacén y archivo deberían las tareas que le son asignadas sin como el lavado de manos cada vez que estar fuera del laboratorio. Una buena cometer errores que supongan un se entra al laboratorio o la limpieza distribución de los equipos como por incremento del riesgo de contagio frecuente de los oculares y la norma de ejemplo, disponer de una cabina de flujo para sí mismo o para los pacientes. Es no manipular lentes de contacto dentro laminar y un incubador al lado de cada importante disponer en el laboratorio del laboratorio para evitar problemas equipo de micromanipulación, facilita de un manual de bioseguridad para oftalmológicos. La prohibición de el trabajo y evita errores. Disponer de saber como proceder correctamente. guardar comida en el laboratorio, una fuente de energía independiente comer, beber, mascar chicle o fumar son que garantice la autonomía en caso de Para manipular muestras infecciosas asimismo normas básicas para evitar interrupción del suministro eléctrico es o potencialmente contagiosas se contaminaciones. El uso de material imprescindible para todos los equipos recomienda el uso de cabinas de flujo protector específico (guantes, mascara, críticos. Las condiciones de trabajo (luz, laminar de clase II, que protegen botas) puede ser necesario para temperatura) y ambiente en general tanto a la muestra como al operario. determinados procedimientos como son también factores a controlar para Estas cabinas poseen un panel frontal por ejemplo para evitar quemaduras favorecer el trabajo eficaz y sin riesgos. de protección y mantienen un flujo con el nitrógeno líquido. La utilización Trabajar en condiciones de luz muy tenue laminar vertical estable en el interior de cabinas de extracción de gases para puede favorecer la aparición de errores. con un sistema de filtro HEPA (High la manipulación de productos tóxicos La utilización de luz amarilla en lugar Efficiency Particulate Air). Asimismo, es como por ejemplo el ácido Tirodes, de luz blanca disminuye enormemente aconsejable disponer de equipamiento etc., habitualmente usados en los los efectos deletéreos de la luz sobre específico para la manipulación de procedimientos de DGP, es altamente los gametos y embriones y a su vez, muestras infectadas que no debe recomendable. no afecta negativamente el confort usarse para el resto de la rutina del del personal de laboratorio. Controles laboratorio. Son medidas de protección El lema “Trabaja, pero seguro” también anuales del aire del laboratorio el uso de gafas, mascarillas, doble debe aplicarse a los laboratorios de TRA. (análisis de partículas y volátiles), así guantes, pipeteadores automáticos Hay que cumplir la normativa de Riesgos como verificación de la presión positiva, y objetos no punzantes, así como la laborales pero adecuándola a las los filtros y la renovación del aire, son señalización diferencial de todos los peculiaridades de nuestros laboratorios necesarios. contenedores de almacenamiento de y al material con que trabajamos. La gametos y embriones y demás equipos seguridad para el personal se consigue La limpieza frecuente de los incubadores en los que se maneje o conserve si hay una buena gestión de recursos y con productos no corrosivos pero con material de riesgo. Es imprescindible del tiempo. efecto fungicida y bacteriostático disponer de contenedores específicos evitará contaminaciones en los cultivos. para residuos infecciosos, realizar DISEÑO DEL LABORATORIO Productos de limpieza específicos para una descontaminación rutinaria de laboratorios diluidos en agua son los los desechos y limpiar las superficies El buen diseño del laboratorio para adecuados para suelos y superficies. La y equipos tras su utilización con un trabajo ágil y efectivo es de gran práctica de controles microbiológicos desinfectantes oxidativos que no importancia. Siempre que sea posible, periódicos tanto de las superficies del contengan alcohol (Asebir, 2008). las zonas de criobiología y DGP deberían laboratorio como del interior de los estar ubicadas fuera del laboratorio incubadores es necesaria para controlar En un laboratorio de TRA, el riesgo de FIV donde se realizan los cultivos la ausencia de gérmenes. para el personal de laboratorio viene para evitar los efectos nocivos de los provocado por la existencia o realización productos que en estas áreas se utilizan. MUESTRAS DE RIESGO BIOLÓGICO de una herida percutánea, ingestión o El nitrógeno líquido es un producto exposición de mucosas a una muestra potencialmente peligroso. Hierve a La bioseguridad entendida como la infectada. Cuando se desconoce si una -196ºC y produce grandes cantidades práctica especialmente diseñada para muestra puede estar infectada o no, de vapores de nitrógeno. El nitrógeno el adecuado manejo y manipulación de es crucial cumplir la norma básica de reduce la concentración ambiental de material u organismos de riego biológico considerar cualquier muestra biológica oxígeno al evaporarse y al ser inodoro, se considera de crucial importancia. como potencialmente contaminante y incoloro e insípido, se respira como Solamente los laboratorios que cuenten por tanto tratarla como una muestra si fuese aire. Por este motivo la sala con áreas específicas deberían trabajar potencialmente de riesgo biológico. criogénica debe tener una extracción con agentes infecciosos. El personal Debe ser preceptivo el uso de guantes de aire y se recomienda disponer de un debe estar testado para VIH, VHC, VHB, para la manipulación de cualquier oxiómetro (Asebir, 2008) que permita presentar serologías negativas y debe muestra y no quitárselos hasta finalizar
- 32. S E S I Ó Nt IDt EU l O l I D A D C A Montse Boada. Medidas de seguridad en el manejo de las muestras biológicas 30 el proceso. Es altamente recomendable embargo, algunos autores se muestran de infección tras herida punzante se disponer del resultado de los análisis más reticentes cuando es la mujer estima en 3/1000 y de 1/1000 si es serológicos de los pacientes antes de quien es la portadora crónica del virus por exposición directa sobre mucosas. empezar a procesar cualquier muestra. ya que el VHB puede atravesar la zona Antes de empezar una TRA en parejas Hasta el momento, no se ha reportado pelúcida de los ovocitos, y al practicarse serodiscordantes en las que el varón ningún caso de contaminación del la microinyección espermática podría es VIH+, es imprescindible comprobar personal de los laboratorios de TRA por favorecerse su introducción, pudiendo que las últimas determinaciones de la manipulación de muestras infectadas, llegar a integrarse en el DNA del ovocito carga viral en plasma sean negativas y y cuando los pacientes o donantes y al fecundarse, pasarlo al embrión el nivel de CD4 sea correcto. La muestra han estado testados y el resultado es (Lutgens et al., 2009). de semen también deberá testarse y negativo, el riesgo para el personal únicamente utilizarse si es negativa. puede considerarse mínimo (Wingfield Hepatitis C: Este virus es más lábil y La preparación de la muestra seminal y Cottell, 2010). Distinto es cuando se solo aguanta a temperatura ambiente debe realizarse mediante gradientes tiene conocimiento de que la muestra periodos cortos de tiempo. El riesgo de densidad, repetidos lavados y swim es positiva para virus de transmisión de infección es aproximadamente del up, y aplicando todas las medidas sanguínea (BBVs) como son el virus de 1,8% y en un laboratorio suele ser de seguridad para muestras de alto la hepatitis B (VHB), virus de hepatitis por vía parenteral, generalmente por riesgo biológico (Semprini, 1992). En C (VHC) y virus de inmunodeficiencia herida causada por material punzante ningún caso se aceptarán muestras humana (VIH). En este caso deben contaminado. Se puede inactivar en las que se observe la presencia extremarse las precauciones de con alcohol, soluciones hipocloradas de leucocitos en el eyaculado ya que procesamiento y manipulación para y compuestos de amonio. No hay se conoce que los glóbulos blancos evitar el riesgo de contagio para el vacuna para este virus y el riesgo de son las células huésped del VIH en personal y/o otras muestras procesadas contaminación por vía sexual es muy el plasma seminal de los individuos o almacenadas en el laboratorio. bajo. Como el riego de transmisión infectados (Quayle et al., 1997). En el Según la bibliografía, la mayoría de las vertical y horizontal es limitado, no caso de que sea la mujer VIH+, deben contaminaciones del personal suelen está contraindicada la práctica de una extremarse las precauciones durante producirse por vía percutánea y solo TRA tanto si es el varón como la mujer la punción folicular. Se recomienda un 20% son causadas por contacto quien presenta el VHC+, aunque se la descontaminación de todas las a través de las mucosas cutáneas o recomienda un seguimiento estricto y superficies con soluciones hipocloradas conjuntivales (Elder et al., 2005). Los empezar el tratamiento de TRA cuando al 10% y óxido de etileno para la casos descritos de transmisión del VHC la carga viral sea baja y al cabo de unos esterilización del instrumental, aunque de un paciente a otro se han atribuido a meses de haber dejado el tratamiento. siempre es preferible la utilización la falta de seguimiento de las estrictas El genoma del VHC no es de DNA sino de de material de un solo uso. En estos medidas de precaución y/o limpieza RNA, sin actividad transcriptasa inversa, casos es muy importante explicar a la y descontaminación del material por lo que aunque se puede encontrar paciente, previamente al inicio del ciclo, empleado (Lesourd et al., 2000). carga viral en el plasma seminal en los riesgos de transmisión perinatal, concentraciones muy variables según la necesidad de realizar el parto por Hepatitis B: El virus de la Hepatitis B las muestras (Abou-Setta, 2004), es cesárea y desaconsejar la lactancia es muy estable y puede persistir en el imposible que se integre en el genoma materna. ambiente durante largos periodos. El de los espermatozoides o embriones riesgo de contaminación por contacto (Steyaert et al., 2000). Aunque algunos NORMATIVA ACTUAL con material contaminado se estima del autores recomiendan que es necesario 30%. Se puede inactivar con alcohol, testar cada muestra de semen antes En el año 2004, el Parlamento Europeo soluciones hipocloradas y compuestos de su utilización en TRA (Elder et al., publicó una directiva sobre los de amonio. Cuando un paciente 2005), no existe consenso ya que si se estándares de calidad y seguridad para (varón o mujer) presenta el antígeno prepara la muestra adecuadamente, las la donación, obtención, evaluación, HBsAg positivo debe recomendarse probabilidades de que se encuentren procesamiento, congelación, la vacunación del cónyuge. En el virus en la solución final son almacenaje y distribución de tejidos y DNA de los espermatozoides de prácticamente nulas. Existen amplias células de origen humano, para todos los varones positivos se han encontrado series publicadas que demuestran que estados miembros de la Unión Europea y secuencias virales integradas (Huang no se ha producido seroconversión del Área Económica Europea (2004/23/ et al., 2002) lo que demuestra que los tras TRA en pacientes VHC positivos EC). El objetivo de esta directiva es espermatozoides podrían actuar como (Semprini et al., 2001). establecer unos criterios uniformes vector para la transmisión vertical por para todos los países miembros para vía germinal a la progenie. Teniendo VIH: El virus del VIH afecta la importación/exportación de tejidos en cuenta que los procedimientos de mayoritariamente a individuos en edad humanos, la abierta disponibilidad lavado seminal son altamente efectivos, reproductiva y el riesgo de contagio de los tejidos donados, pero también cuando un varón es portador crónico al otro miembro de la pareja o a la asegurar la buena praxis, trazabilidad del VHB no debe contraindicarse descendencia es muy elevado. Este de todas las muestras y evitar errores la realización de una FIV/ICSI, sin virus es lábil en el ambiente y el riesgo procedentes de múltiples y variados
- 33. S E S I Ó N tD tUlO A l I D A D I E C Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 31 sistemas de procesamiento, codificación respuesta inesperada del donante o positivos de la directiva ya que cuando se y clasificación. En definitiva, promover del receptor, incluida una enfermedad establezca, facilitará la comunicación y la implantación de sistemas de calidad transmisible, asociada a la obtención registro de los datos inter-centros, siendo así como sistemas de seguridad para o aplicación, que resulte mortal, de gran importancia principalmente en evitar riesgos. Aunque inicialmente potencialmente mortal, discapacitante, los casos de distribución o importación/ se plantearon algunas dudas sobre que produzca invalidez o incapacidad, exportación de gametos, embriones o su aplicación en el ámbito de la hospitalización, enfermedad o su tejido gonadal. reproducción asistida, queda claro prolongación. Cualquier tipo de error que a pesar de las características en la identificación, pérdida o mix-up de Bioseguridad: Las medidas de particulares de nuestro campo, esta gametos o embriones debe considerarse bioseguridad establecidas por la directiva aplica también para las células un efecto adverso grave, y si ello conduce directiva europea y en consecuencia el reproductivas (semen, ovocitos, tejido al nacimiento de un niño, entonces RD 1301/2006, constituyen uno de los testicular, tejido ovárico y embriones) debería contabilizarse también aspectos más conflictivos de la norma y en consecuencia, es de aplicación en como una reacción adversa grave. en el caso de la reproducción asistida, todos los centros que dispongan de Por desgracia, aunque la normativa En opinión de los expertos, estas laboratorios de reproducción asistida europea estableció la puesta en marcha medidas exceden a las necesidades y/o Criobancos que preparen muestras en todos los estados miembros de reales, pudiendo incluso comprometer para la práctica de inseminación un sistema de biovigilancia para la el éxito de las TRA (Mortimer, 2005) artificial y/o Fecundación In Vitro y/o comunicación y control de los efectos (Bhargava, 2005). almacenen muestras (gametos, tejidos y reacciones adversas, este sistema no gonadales o embriones). se ha implementado aun en nuestro • Calidad del aire: se establece que país para los centros de reproducción al menos debe ser equivalente En España la transposición de la asistida, a diferencia de otros países al grado D de la Guía Europea de directiva a nuestro marco jurídico como por ejemplo Inglaterra, en Normas de correcta Fabricación se realizó mediante la promulgación el que todos los incidentes deben en lo que al contaje de partículas y del Real Decreto 1301/2006 y es la comunicarse a la Human Fertilisation colonias microbiológicas se refiere Organización Nacional de Transplantes and Embryology Authority (HFEA) y siempre que las células se vayan la autoridad competente en España y pueden ser supervisados por el a procesar en exposición abierta de la implementación de la directiva. National Health Service (NHS) (Toft, y sin un proceso de inactivación Para los aspectos relacionados con las 2004). La falta de un sistema estatal de biológica, se exigirá una calidad TRA, la Ley 14/2006 sobre técnicas de biovigilancia, no excluye sin embargo a del aire equivalente al grado A. Este reproducción humana asistida sigue los centros de la obligación de instaurar aspecto de la norma ha propiciado estando vigente pero se complementa un sistema propio de control y análisis numerosas críticas por considerarse con la nueva norma. Uno de los aspectos de incidencias. inadecuada a los laboratorios de importantes del RD 1301/2006 es que TRA y la ESHRE se ha posicionado en obliga a disponer de un sistema de Trazabilidad: Otro aspecto importante contra (ESHRE, 2007). control de calidad a los laboratorios del RD 1301/2006 es que exige poder de Reproducción Asistida y bancos garantizar la trazabilidad de cualquier • Serologías: A pesar de que nunca se de gametos, tejidos gonadales y muestra o proceso. Esto significa que ha reportado una contaminación embriones. Entre muchos de los temas cualquier gameto, embrión o tejido cruzada en TRA, la directiva que regula destacan la biovigilancia, gonadal debería poderse localizar establece el análisis sistemático para trazabilidad y bioseguridad. e identificar en cualquier momento el cribado de estas enfermedades de su procesamiento, almacenaje o antes de empezar cada ciclo de TRA. Biovigilancia: El RD 1301/2006 envío. Asimismo, se especifica que es La ESHRE manifiesta el gran impacto establece en su artículo 34 que se imprescindible que se registre claramente económico que representa la creará un sistema de biovigilancia la identidad de la persona que manipula la adopción de estas medidas y sugiere que permitirá notificar, registrar muestra en todo momento, la fecha y hora un sistema en el que los análisis y transmitir información sobre los de cada proceso desde el principio hasta para donaciones entre miembros de efectos y reacciones adversas graves. el final, así como de todo el material que una misma pareja puedan realizarse Se entiende por “Efecto adverso ha intervenido. El registro de los datos durante los 30 días previos al inicio grave” aquel hecho desfavorable debe realizarse preferiblemente mediante del tratamiento y cuando el test vinculado a la obtención, evaluación, un sistema informatizado y efectuándose resulte negativo, éste sea válido procesamiento, almacenamiento y copias de seguridad de forma periódica como mínimo durante 24 meses. En distribución de células y tejidos que para garantizar que puedan custodiarse las donaciones fuera de la pareja, pueda conducir a la transmisión de una por un periodo de tiempo largo, de al la ESHRE reconoce que la situación enfermedad, a la muerte del paciente, menos 30 años. La incorporación de un es distinta y manifiesta que o a estados que hagan peligrar su nuevo sistema de codificación que obligue actualmente no hay consenso entre vida, minusvalías, incapacidades, a todos los centros a trabajar con un código los distintos países de la UE (ESHRE, hospitalización o su prolongación único e inequívoco para la identificación 2009). Wingfield y Cottell (2010) y por “Reacción adversa grave” a la de las muestras es otro de los aspectos consideran que no hay evidencia
- 34. S E S I Ó Nt IDt EU l O l I D A D C A Montse Boada. Medidas de seguridad en el manejo de las muestras biológicas 32 científica que sostenga que es criopreservadas en el mismo tanque Bielanski A, Bergeron H, Lau PC, Devenish necesario repetir las analíticas cuando muestras infectadas J. Microbial contamination of embryos and en cada ciclo y considerarían más con virus se almacenaban en semen during long term banking in liquid adecuado intentar reducir los pajuelas correctamente selladas nitrogen. Cryobiology 2003; 46:146-152. riesgos de contaminación cruzada (Bielanski et al., 2003). En el caso combinando la regulación del de la reproducción asistida, la Bielanski, A. Non-transmission of bacterial screening previo con unas medidas utilización de pajuelas o soportes and viral microbes to embryos and semen adecuadas de procesamiento cerrados para la criopreservación stored in the vapour phase of liquid nitrogen in y mejora de los sistemas de de gametos, embriones y tejido dry shippers. Cryobiology 2005;50: 206-210. almacenamiento. gonadal evita este riesgo aunque puede afectar a la tasa de Elder K, Baker D, Ribes J. Infections, • Criopreservación: El RD 1301/2006 supervivencia y viabilidad de las Infertility and Assisted Reproduction. establece que deberá disponerse muestras (Pomeroy et al., 2010). Cambridge University Press; 2005. de una infraestructura de Actualmente se están valorando almacenamiento que permita otras medidas para minimizar los ESHRE. (2007) ESHRE position paper on the impedir contaminaciones cruzadas riesgos teóricos de una posible EU Tissues and Cells Directive EC/2004/23. y mezclas simples. Es importante contaminación cruzada y seguir http://www.eshre.eu/ESHRE/English/ tener en cuenta que en el ámbito utilizando soportes abiertos, Guidelines-Legal/ESHRE-Position-Papers. de la reproducción asistida, sobre todo para la vitrificación aunque no se ha detectado ningún de ovocitos. Algunas de las ESHRE. (2009) Statement of the European caso de contaminación cruzada en alternativas propuestas son el uso Society of Human Reproduction and la criopreservación de gametos de contenedores de nitrógeno en Embryology (ESHRE) on the European y embriones, la probabilidad fase vapor (Bielanski, 2005) o la Commission proposal of viral screening in de que se produzca se considera esterilización del nitrógeno líquido assisted reproduction treatments. http:// razonablemente baja aunque no por ultrafiltración o radiación www.eshre.eu/ESHRE/English/Guidelines- nula. La alarma saltó en 1995 ultravioleta (Parmegiani et al., Legal/ESHRE-Position-Papers cuando seis pacientes sometidos 2010). Los tanques de vapores de a tratamientos citotóxicos por nitrógeno poseen menor capacidad Glew AM, Hoha K, Graves J, Lawrence H, Read problemas hemáticos desarrollaron para enfriar y se calientan con S, Ah-Moye M. Radio frequency identity un brote agudo de hepatitis mayor rapidez produciendo tags “RFID” for electronic witnessing of IVF B después de someterse al en consecuencia grandes laboratory procedures. Fertil Steril 2006; autotrasplante del material fluctuaciones de temperatura. 86. suppl 1. p.S170. criopreservado (médula ósea Hoy por hoy no existe la solución y/o sangre periférica) que había perfecta para congeniar la norma Huang JM, Qiu HY, Fang XW, Zhuang TG, sido almacenado en el mismo con las necesidades técnicas sin Qiu JW. Studies on the integration of tanque criogénico que el de otros comprometer la eficacia de la hepatitis B virus DNA sequence in human pacientes infectados con hepatitis técnica, por lo que se deberá seguir sperm chromosomes. Asian J Androl B. En este caso, el contagio se buscando nuevas alternativas. 2002;4:209-212. produjo como consecuencia de un error en el empaquetamiento REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Lesourd F, Izoped J, Mervan C Payen y almacenaje de las muestras, ya JL, Sandres K, Monrozies X, Parinaud J. que se observó que las bolsas que Abou-Setta AM. Transmisión risk of Transmission of hepatitis C virus during the contenían el material infeccioso hepatitis C virus via semen during assisted ancillary procedures for assisted conception. se deterioraron con el tiempo reproduction: how real is it? Hum Reprod Hum Reprod 2000;15:1083-1085. provocando la contaminación del 2004; 12:2711-2717. nitrógeno del tanque y de algunas Lutgens S, Nelissen E, Van Loo I, Koek G, de las otras muestras que allí se ASEBIR. Cuadernos de Embriología Clínica. Derhaag J, Dunselman G. To do or not to almacenaban (Tedder et al., 1995). Recomendaciones sobre Recursos Humanos do: IVF and ICSI in chronic hepatitis B virus Estudios posteriores demuestran y Físicos para el Laboratorio de Reproducción carriers. Hum Reprod 2009;24:2676-2678. que el factor decisivo para evitar Asistida Humana. Ed. ASEBIR 2008. el contagio es el correcto envasado Magli C, Van den Abbeel E, Lundin K, de las muestras. Se comprobó Bhargava PM. On the critical assessment of Royere D,Van der Elst J, Gianaroli L. ESHRE que muestras criopreservadas en the impact of the recent European Union Committee of the Special Interest Group on pajuelas selladas herméticamente Tissues and Cells Directive. RBM Online Embryology. Revised guidelines for good no se contaminaban a pesar de 2005; 11:161. practice in IVF laboratories. Hum Reprod estar almacenadas en nitrógeno 2008; 23: 1253–1262. líquido contaminado (Bielanski et Bielanski A, Nadin-Daris S, Sapp T, Lutze- al., 2000). Asimismo se demostró Wallace C. Viral contamination of embryos Mortimer D. A critical assessment of the que tampoco se contaminaba cryopreserved in liquid nitrogen. Cryobiology impact of the European Union Tissues el nitrógeno ni otras muestras 2000; 40:110-116. and Cells Directive (2004) on laboratory
- 35. S E S I Ó N tD tUlO A l I D A D I E C Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 33 practices in assisted conception. RBM Online M, Pardi G. Insemination of HIV-negative REFERENCIAS LEGALES: 2005;11:162-176. women with processed semen of HIV- positive partners. Lancet 1992; 340:1317-9. Directive 2004/23/EC of the European Novo S, Barrios L, Santaló J, Gómez-Martínez Parliament and of the Council of 31 March R, Duch M, Esteve J, et al. A novel embryo Semprini AE, Vucetich A, Persico T. Hepatitis 2004 on setting standards of quality and identification system by direct tagging C detection. Lancet 2001;357:557. safety for the donation, procurement, of mouse embryos using silicon-based testing, processing, preservation, storage barcodes. Hum Reprod 2011; 26:96-105. Steyaert SR, Leroux-Roels GG, Dhont M. and distribution of human tissues and Infections in IVF: review and guidelines. cells. Official Journal of the European Parmegiani L, Accorsi A, Cognigni GE, Hum Reprod 2000;6:432-441. Union L 102, 07/04/2004 P. 0048 – 0058. Bernardi S, Troilo E, Filicori M. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet Tedder RS, Zuckerman MA, Goldstone AH , Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobre irradiation for safe vitrification of Hawkins AF, Fielding A, Briggs EM, Irwin D, Blair D, técnicas de reproducción humana asistida. human oocytes or embryos. Fertil Steril Gorman AM, Patterson KG, Linch DC, Heptonstall BOE núm 126, 19947-19956. 2010;94:1525-1528. J, Brink NS. Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank. Lancet Ley 31/1995 de 8 de noviembre, de Pomeroy KO, Harris S, Canaghan J, 1995; 346: 137-140. Prevención de Riesgos Laborales. BOE núm Papadakis M, Centola G, Basuray R, Battaglia 269. 32590-32611. D. Storage of cryopreserved reproductive Toft B. Independent review of the tissues: evidence that cross-contamination circumstances surrounding four adverse Real Decreto 1301/2006, de 10 de of infectious agents is a negligible risk. events that occurred in the Reproductive noviembre, por el que se establecen las Fertil Steril 2010;94:1181-1188. Medicine Units at the Leeds Teaching normas de calidad y seguridad para la Hospitals NHS Trust, West Yorkshire. donación, la obtención, la evaluación, Quayle AJ, Xu C, Mayer KH, Anderson DJ. Department of Health; 2004. el procesamiento, la preservación, el T lymphocytes and macrophages, but not almacenamiento y la distribución de motile spermatozoa, are a significant Wingfield M and Cottell E. Viral screening células y tejidos humanos y se aprueban las source of human immunodeficiency virus in of couples undergoing partner donation normas de coordinación y funcionamiento semen. J Infect Dis 1997;176:960-968. in assisted reproduction with regard to EU para su uso en humanos. BOE núm 270, Directives 2004/23/EC, 2006/17/EC and 39475-39502. Semprini AE, Levi-Setti P, Bozzo M, Ravizza 2006/86/EC: what is the evidence for repeated M, Taglioretti A, Sulpizio P, Albani E, Oneta screening? Hum Reprod 2010; 25;3058-3065
- 36. Nuevo LifeGuard™ Aceite de alta calidad con alta viscosidad para proteger el embrión humano Nuevo Global Total™, suplementado con Albúmina enriquecida con α y β Globulinas NEW Sistema S3 para la Vitrificación de Blastocistos Humanos: - No contiene DMSO - Glicerol y Etileno Glicol, como Crioprotectores. Global w/ Hepes, como medio base - Sistema de sellado cerrado, con pajuelas convencionales Pipetas ICSI Agujas Punción OPS Catéter de Transferencia Catéter de Transferencia Full Echo Pearl Tip Placas Calefectadas Selladora por ultrasonidos Baño en seco Estación de trabajo
- 37. S E S I Ó N tD tUlO A l I D A D I E C Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 35 qUAlIty CONtROl PROCESSES wIthIN thE EMBRyOlOGy lABORAtORy (CONtROl DE CAlIDAD EN lOS PROCESOS DEl lABORAtORIO DE EMBRIOlOGÍA) Klaus E. Wiemer PhD INTRODUCTION (Leese, 1991). The changes that are RESULTS AND DISCUSSIONS noted are not only morphological Thorough understanding of every but functional as well. During When contemplating the type of quality process that occurs within the IVF preimplantation development, the management system to implement in laboratory is essential for efficient fertilized oocyte changes from a an IVF laboratory, one of the initial development of human embryos as metabolically quiescent entity under decisions that should be made is if the well as maintaining high implantation the control of maternal transcripts systems will a proactive as compared to rates. Understanding how variables into a dynamic multicellular, rapidly a reactive system. The type of system and outside influences can impact developing embryo under its own that is implemented is principally outcomes is of paramount importance functioning genome with complete based upon resources available such as as well. The basis of most quality control homeostatic mechanisms. The lab personnel as well as philosophical (QC)/ quality assurance (QA) programs ability to allow this transition to approach to this topic. This author is to thoroughly understand all the occur without any induced stress believes in implementation of both steps involved within a process as well can have far reaching consequences. types of systems. as recognize how variables can interact Perturbations in the environment within the processes that can either that can be caused by a variety of This discuss will deal in principal with influence embryonic developmental factors can result in reduced embryo proactive measure that can reduce rates or pregnancy rates. viability and impaired development variability within the laboratory. post transfer. It is important for Reactive methods of QC are very easy The development of the human clinical embryologists to recognize to implement. For example, the embryo within an in vitro environment that these perturbations do not implementation of a spreadsheet presents many challenges to the always affect embryo morphology but whereby all manufacture lots of clinical embryologist. We must can affect far reaching consequences plasticware are logged into is an example recognize that we are trying to on a cellular level. Therefore, it is of a reactive form of QC. It is a reactive allow a highly regulated sequence of important to understand that any form of QC because lab personnel will events to occur without any external aberrations during the collection of refer back to this spreadsheet if there influences that a lab, it materials oocytes and culture of embryos can is a suspected issue within a certain lot and environment might have on the significantly alter developmental of plasticware. In contrast, testing of process required for an oocyte to potential and cellular mechanisms plasticware prior to implementation is a become a competent embryo. The without altering embryo morphology proactive form of QC. key to a quality management system thus making the assessment of which incorporates QC and QA is to culture conditions difficult. PLASTICWARE ensure repeatability of embryo quality and outcomes within the laboratory. Previously it was discussed that the Prior to use, all plasticware that comes embryo is a dynamic entity that changes in contact with human gametes should In this discussion, we will review the rapidly during the typical time periods be tested. The most practical method various steps involved within the that embryos are cultured prior to to test this is using a human sperm clinical IVF laboratory and what steps replacement and/or cryopreservation. assay. Admittedly, human sperm are might help in reducing variable within More specifically, the human embryo not as sensitive as using one or two- the embryology laboratory. prior to compaction is extremely cell mouse embryos but the cost of sensitive to outside variables due in mouse embryos makes this impractical MATERIALS AND METHODS principal to lack of self regulating for most laboratories. In addition, mechanisms such as intracellular the volume of material that is tested Before we begin our discussion of pH (Baltz et al., 1990). Therefore, makes the use of mouse embryos not quality management, we should even small alterations such as pH practical. To perform this test, one first clarify a few matters. We must and temperature fluctuations within will need a proven sperm donor that recognize that the human embryo the culture environment at early pre- has demonstrated good sperm survival is a unique structure because of the compaction developmental stages can over an extend period of time. We dynamic changes that occur within result in far reaching developmental perform direct contact testing in our the embryo during it course of and functional capabilities within laboratories. We have plasticware that development within the laboratory the embryo. we know has passed our testing which
- 38. S E S I Ó Nt IDt EU l O l I D A D C A Klaus E. Wiemer PhD . Quality Control Processes within the Embryology Laboratory 36 serves as a control and then compare Incubators should be cleaned on well as how many oocytes we can inject this to the plasticware in question a regular basis and the water pans when performing ICSI. For example, we by incubating media over night in an should be checked on a daily basis. can safely keep a Nunc® 35 mm dish incubator with the plasticware to be The water pans can potentially be a sitting on our stage for 5-7 minutes tested as well as the control. A known major source of contamination and a without affecting the temperature concentration of sperm is placed into fully humidified chamber is essential within the drops. the previously incubated media from for proper CO2 measurement by the the plasticware that is in question as sensors within the incubator. BLOCK HEATERS well as the control plasticware. The sperm parameters such as motility, rate An often over looked aspect of Block heaters are notorious for having of forward progress and percent motile maintaining sound culture conditions is wide temperature fluctuations. For this are noted at the onset. The samples are to establish a policy to reduce incubator reason, we keep an appropriate sized incubated for a total of 48 hours in a CO2 door openings. The designation of water filled tube with a thermometer incubator and motility characteristics working incubators can often reduce in all our block heaters. These are noted at 24 hour intervals. The the number of openings for incubators temperatures are monitored on a daily samples from the plasticware in designated for embryo culture. In our basis. Because these block heaters tend question must be within 80% of the laboratory, we make every effort to to be warmer on the bottom, we make control. The entire test is invalid if the culture no more than 4 patients per every attempt possible to not allow more motility of the control is less than 50%. incubator. This reduces the number of than 3-4 tubes containing follicular In addition to incubation at 37°C, incubator openings to a point we are not aspirates within these heaters. We are we also incubate samples at room impacting development. Avery et al., very proactive to reduce any possible temperature for a total of 96 hours and (2000) noted that multiple incubator exposure of the oocytes to temperature compare the motility characteristics to door openings had a negative impact fluctuations. the control over 24 hour increments. on the number of cells in developing We use the same criteria as described bovine blastocysts. WORK STATIONS above for the room temperature samples in determining the suitability All of lots of gases used for the Most embryologists work in modified of plasticware. incubators are recorded and carbon heated laminar flow hoods or in inline filters are used for all gases converted infant isolates. Regardless When we find manufactured lots of of work station used, the temperatures plasticware that pass our testing, we HEATED MICROSCOPE STAGES within these devices must be try to purchase as much of that lot established. In our IVF laboratory, as reasonable. For embryo culture All heated stages on microscopes should we use modified heated laminar flow dishes, we have recently started to be tested for temperature consistency. hoods. We first diagram the heated use mouse embryo tested dishes in A word of caution about heated stages surfaces and establish the temperature order to reduce the amount of testing should be noted. Most stages do not characteristics of the hood. This performed. In addition, any plastic heat in a constant fashion but rather allows us to determine areas that are containers, tubes and flask that we in a pulsating manner. This means that hot or cold as compared to the set use to make media in or store such the temperature can vary significantly temperature. Following this step, we products as human albumin are rinsed on the stage itself. This is unavoidable check the temperature of our oocyte with culture media prior to use. in most instances so this must be kept holding dish and the micro droplets of in mind when establishing a QC protocol the embryo culture dishes. We are now INCUBATORS for calibrating stage temperatures. in a position to make any modifications In our laboratory, we first determine to the surface temperature. We believe The incubator environment is the where the “hot spots” and “cold spots” that the temperature of the microdrops single most important aspect of the IVF are on the stage using a fine wire is better reflection of culture conditions laboratory. Incubator temperatures, thermocouple and diagram this. We than the temperature of the actual carbon dioxide levels as well as oxygen then set up a variety of culture dishes heated surface itself. For example, levels should be checked several times as well as micromanipulation dishes and the surfaces of our hoods are often a week. Determination of pH should be confirm the temperatures within their set at 41.3°C to ensure microdrop performed several times a week as well respective drops. The temperature of temperatures of 36.9 to 37.3°C. as when a new lot of media is received. the stage is then adjusted accordingly. Several times a year, the temperature Finally, we check the temperature We pay special importance to the within the culture microdrops should be within these various drops in the dish we use to hold oocytes in during confirmed using a thermocouple. We try aforementioned dishes during different the retrieval process and check the to maintain a pH of 7.23 to 7.30 in our time intervals to note which drops are temperature following different time culture media as well as a temperature heating up or cooling down. We have intervals that the dish is sitting on of 37.3° C within our incubators. This found that by going through these the heated surface. By determining allows for a temperature of 36.9 to steps, we have determined how long we the temperature characteristics of 37.3° C within our microdrops. can leave culture dishes on the stage as these dishes, we can establish time
- 39. S E S I Ó N tD tUlO A l I D A D I E C Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 37 limits that dishes can sit outside the • Oocyte retrieval. CONCLUSION incubator. In all instances, we mimic • ICSI or conventional insemination. the actual conditions that the dishes • Removal of cumulus cells at time Maintaining a consistent laboratory will be exposed to. For example, the of ICSI or following conventional environment is of paramount embryo culture dishes are checked at insemination. importance if a center hopes to different time increments when placed • Change over to culture droplets. preserve the physiology of oocytes under the humidified gas bubbling • Embryo evaluation on Days 2, 3 and developing embryos. Even small jars. In contrast, the uncovered oocyte and 5. perpetuations can influence outcomes holding dishes are kept in the area of • Selection of embryos for transfer. that are not always expressed as the heated surface where this dish • Embryo transfer. suboptimal embryo morphology. would normally sit during the actual Therefore, it is important that clinical retrieval process. EMBRYOLOGY PROCESSES embryologists ensure that their equipment and materials do not A WORD ON PH In our laboratory, following the quality have an adverse affect on embryo management processes described development and outcomes. In The discussions thus far have above, we modified many of the addition, it is of equal importance emphasized the importance of embryology processes we routinely that there is thorough understanding understanding how the temperatures perform. For example, we found that of the actual embryology processes are in our various dishes and how we in order to not expose our oocytes and how these can influence these modify our techniques to reduce the to temperature drifts, we found that aforementioned parameters. By potential of exposure to temperature placing several mls of warm oil on the understanding how one’s technique fluctuations. This same philosophical HEPES buffer culture media reduced influences the environment of the task approach is used with pH testing. For the temperature drift in our oocyte at hand, meaningful changes can be example, we have noted that embryo holding dish. In addition, we found put into place. culture dishes can sit on our heated that we could safely keep oocytes in an surfaces for 5-7 minutes without oil covered dish for up to 20 minutes. REFERENCES the temperature changing. We also Therefore, if we anticipate that a established that pH changes do patient is going to have a large number Avery B., Melsted, J.K., and Greve, T. not start to occur until dishes have of oocytes, we will have a second (2000). A novel approach for in vitro been sitting out for more then 7-8 embryologist process the oocytes production of bovine embryos: use of the minutes. These data points allowed from the first ovary to reduce the risk Oxoid atmosphere generating system. us to determine that we have about 5 of temperature fluctuations as well as Theriogenology 54, 1259-1268. minutes to safely evaluate embryos exposure to HEPES buffered media. without exposing them to temperature Baltz, J. M., Biggers, J. D. and Lechene, and pH fluctuations. It is very Similarly, we found with our heated C. (1990). Apparent absence of NA+/H+ important that each IVF laboratory stage that no matter how we adjusted antiport activity in the two-cell mouse mimic their processes and determine the temperature of the stage, we still embryo. Dev. Biol. 138, 421-429. if they are introducing any fluctuations had wide ranges of temperatures in that impact development. the micromanipulation dish we used Leese, H.J. (1991) Metabolism of the for ICSI. As a consequence of this, preimplantation mammalian embryo. IMPACT OF EMBRYOLOGIST ON we reduced the number of oocytes we Oxford Re. Reprod. Biol. 13, 35-72. OUTCOMES placed into a manipulation dish to no more than 4 to 6 depending on sperm Part of any quality management quality. The new policy reduced the program is to track the effects of the temperature fluctuations the oocytes embryologists themselves on embryo were being exposed to. In turn, this development and outcomes. This is a improved the quality of resulting form of reactive QC but it nonetheless embryos following ICSI and improved helps us reduce the impact of staffing the quality of blastocysts as well. on outcomes. The data goes into a data base and outcomes are calculated on The examples above are but many a quarterly basis. Each center should modifications that have been made perform these types of analysis based in our procedures following the upon volume. The key is to perform complete understanding of how our these often enough with enough processes were affecting embryo meaningful volume to ensure that quality. By understanding when pH the staff are not having a negative and temperatures begin to change, impact on outcomes. The data we one can then modify their techniques record on each embryologist are the accordingly. This has resulted in much following tasks: less variability within our lab.
- 41. S E S I Ó N D E G E N É t I C A Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 39 EStADO ACtUAl DEl GRUPO DE INtERÉS DE GENÉtICA y REPRODUCCIÓN Esther Velilla El Grupo de Interés presentará la actualidad del trabajo realizado, los proyectos en marcha y las propuestas de futuro del grupo. APlICACIÓN DEl ARRAy-CGh EN El SCREENING DE ANEUPlOIDÍAS Mireia Sandalinas Reprogenetics. Barcelona. e-mail: msandalinas@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN así como en ciertos casos de factor sin detectar. En segundo lugar, la masculino. FISH es dependiente de cómo se haya Desde los años noventa, el estudio realizado la fijación. No todas las cromosómico de embriones sobrantes El diagnóstico genético Preimplantacional técnicas de fijación permiten obtener de FIV, mediante la técnica de FISH de aneuploidías (DGP-AS) se llevó a núcleos interfásicos en condiciones (Hibridación in situ de fluorescencia) cabo por primera vez en el año 1995 óptimas. En función de la morfología nos ha permitido observar que por los grupos de Munné (Munné et del núcleo, de su tamaño y/o de la un porcentaje muy elevado de los al.,1995) y Verlinsky (Verlinsky et al., presencia de citoplasma, la FISH embriones de un programa de FIV son 1995). Desde entonces el DGP-AS se puede verse comprometida. Por ello, cromosómicamente anormales, y que ha venido aplicando en diferentes el número de hibridaciones al que se hay determinados grupos de pacientes estadios de desarrollo embrionario, puede someter a un núcleo es limitado con un mayor riesgo de generar desde el corpúsculo polar en ovocitos y varía de núcleo a núcleo. embriones anormales. Y lo que es más hasta en blastocisto con biopsia de importante, los estudios que intentaron trofectodermo, siendo el estadio La evaluación simultánea de todos relacionar morfología y desarrollo con de mayor aplicación el de día 3, los cromosomas fue posible con la anormalidad cromosómica concluyeron correspondiente a un embrión con 6-8 aparición de las técnicas de SKY que no es posible identificar los células. En sus inicios sólo se podían (Spectral Karyotyping) (Schröck embriones cromosómicamente detectar 3 o 5 cromosomas. Con el et al.,1996) y la CGH (Comparative anormales mediante los criterios de tiempo se mejoraron los protocolos Genome Hybridization) (Kallioniemi selección rutinariamente aplicados en de FISH, y hasta el año 2010 el DGP- et al., 1992). Si bien con la técnica de el laboratorio por los embriólogos. AS se ha venido aplicando en día 3 SKY era posible la detección de todos y con el diagnóstico de entre 9 y 12 los cromosomas, para ello el análisis La mayoría de las anomalías cromosomas. se debía realizar sobre metafases y cromosómicas son letales, por lo que requería la fijación de la muestra, por el embrión no llegará a implantar o, El análisis de aneuploidías en embriones lo que su aplicación clínica se limitó si lo hace, dará lugar a una pérdida de preimplantacionales mediante a la investigación de aneuploidía en embarazo. Parece lógico pensar que protocolos óptimos de hibridación in metafases de ovocitos y corpúsculos evitando la transferencia de estos situ fluorescente (FISH) ha ofrecido polares. La aparición en 1992 de la embriones las tasas de embarazo excelentes resultados en pacientes hibridación genómica comparada y, sobre todo, las de niño en casa, correctamente indicadas (Gianaroli et (CGH), (Kallioniemi et al., 1992), que mejoren, y la de abortos, disminuya. al., 1999; Munné et al., 1999, 2003, permitía la detección de ganancias 2005; Schoolcraft et al., 2008; Rubio y pérdidas de material genético en Así pues, el diagnóstico genético et al., 2009), pero esta metodología tumores sólidos, ha permitido, previa preimplantacional de aneuploidías presenta limitaciones técnicas. En evolución del protocolo (Wells and surgió para intentar mejorar las primer lugar disponemos de un número Delhanty, 1996), el análisis de todo posibilidades de conseguir un embarazo limitado de fluorocromos, por lo que el el complemento cromosómico. Así, sano en aquellas parejas que se someten número de cromosomas analizables en la CGH permitió solventar los dos al proceso de Fecundación in Vitro una sola hibridación es pequeño y para principales problemas de la FISH. Por (FIV) y cuya esterilidad o infertilidad poder analizar un número aceptable una parte, no se precisaba de la fijación puede ser en parte atribuible a causas de cromosomas (al menos 8) deben celular, las células se manipulaban cromosómicas. Las parejas con más realizarse varias rondas de hibridación. introduciéndolas en un tubo de PCR; por riesgo de generar embriones anormales Los protocolos más completos analizan otro, se analizan todos los cromosomas. son las que incluyen pacientes con edad entre 9 y 12 cromosomas, por lo materna avanzada, historial previo de que inevitablemente quedará un Sin embargo, las dificultades técnicas abortos, de fallos de implantación, determinado porcentaje de aneuploidía asociadas al elevado tiempo de
- 42. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Mireia Sandalinas. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías 40 hibridación y de diagnóstico para aplicarla clínicamente en ciclos en fresco limitó su uso a la investigación o en clínica al corpúsculo polar. El grupo de Wilton (Wilton et al., 2003) aplicó la técnica en embriones en día 3, pero se requería la congelación de los embriones biopsiados con resultados subóptimos. Otras aproximaciones han sido descritas por otros autores, como la biopsia de primer corpúsculo polar (Wells et al., 2002), análisis mediante CGH y transferencia en D+3, aunque esta aproximación no permite determinar las anomalías acaecidas en meiosis II, las de origen paterno ni las postzigóticas. Recientemente, se ha presentado una modificación de la metodología que permitiría una reducción en el tiempo necesario para obtener resultado (Rius et al., 2010), lo cual permite la transferencia dentro del mismo ciclo. Aún así, la principal desventaja de la CGH es que se trata de una técnica extremadamente compleja, en la que a pesar de tener un tiempo más reducido de hibridación, el análisis de resultados es extraordinariamente lento, lo que la convierte en una metodología de difícil uso rutinario en la práctica clínica. Pero lo más importante es lo que la CGH nos ha enseñado (Wells and Delhanty, 2000; Voullaire et al., 2002; Wilton et al., 2003): blastocisto. Los datos más recientes de consecuencia la interpretación de los aplicación de la CGH en reproducción resultados. Una aplicación subóptima 1) la aneuploidía puede afectar, y asistida los han aportado la colaboración del DGP-AS no sólo no consigue afecta, a cualquier cromosoma durante entre Reprogenetics y el Colorado Center mejorar los resultados, sino que los el desarrollo preimplantacional; for Reproductive Medicine. Utilizando empeora. (Cohen et al., 2007; Munné 2) aún así, no todos los cromosomas la CGH como herramienta diagnóstica et al., 2007). tienen el mismo riesgo de aneuploidía; y la biopsia de blastocisto junto con la 3) se han detectado anomalías en vitrificación del embrión biopsiado en Así pues, después de veinte años en cromosomas para los que nunca se pacientes con fallos de implantación, la historia del DGP de aneuploidías, había observado aneuploidía en se ha conseguido una tasa de embarazo sabemos que necesitamos una técnica diagnóstico prenatal o en material evolutivo del 68,9% (Schoolcraft et al., que analice todos los cromosomas, abortivo, por lo que se presume 2010). independientemente del estado que causan bloqueo del desarrollo nuclear, que sea aplicable en todos los embrionario preimplantacional, fallo MICROARRAYS estadios celulares, que dependa poco o de implantación o abortos tempranos; nada de la habilidad del manipulador 4) se han detectado roturas cromosómicas El análisis de todos los cromosomas (aspecto que sigue siendo vital y de no detectables mediante FISH; mediante una técnica efectiva, que se momento inevitable en la biopsia), 5) entre el 20-40% de los embriones son pueda aplicar de forma rutinaria, que que nos permita dar resultado en un portadores de anomalías cromosómicas presente el mínimo error y que sea plazo corto de tiempo, que se adapte al no detectables mediante los kits de reproducible, ha sido la piedra filosofal ciclo en fresco y que sea incorporable FISH comerciales. del DGP de aneuploidías de la última de forma relativamente fácil a la rutina década. La validez del DGP-AS para en los laboratorios de embriología y de La puesta a punto de la vitrificación en mejorar los resultados de FIV se ha diagnóstico genético. embriones humanos permitió aplicar la visto en entredicho sobre todo debido técnica de CGH no sólo en embriones a la dificultad de replicar la técnica Tras muchos años de investigación, las en día 3, sino también en estadio de de biopsia y fijación, la FISH y en últimas publicaciones (Hellani et al.,
- 43. S E S I Ó N D IE G E N É t I C A t tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 41 Tabla 1. Resultados EMB.en EMB.en Edad ciclos seguim. transf no T emb EMB/ciclo EMB/Tra media tasa curso curso Mat. embr.Tra implant. /CICLO /TRANSFER G1 d3/d5 37 454 252 173 31% 94 37,3% 54% 1,63 40% 33.7% 49% G2 d5/CP 36.5 75 40 24 40% 15 37,5% 63% 1,63 51% 37,5% 63% TOTAL 529 292 197 32,50% 109 37,30% 55,30% 1,63 41,70% d3/d5- biopsia día3,transferencia embrionaria en día 5 d5/CP- biopsia de blastocisto, día 5, transferencia en ciclo posterior 2008; Gutierrez-Mateo, 2010; Treff et número de copias de los cromosomas, RESULTADOS al., 2010; Harper et al., 2010) apuntan por lo que la mayoría de las diferentes a que parece ser que se ha conseguido plataformas de microarrays están La técnica ha sido previamente encontrar una técnica que cumple basadas en una hibridación competitiva validada para su uso en blastómeros con todos estos requisitos: la técnica de un DNA muestra y un DNA de (Gutierrez-Mateo et al., 2011). Hasta de microarrays. No es una técnica referencia marcados con fluorocromos la fecha se han llevado a cabo en nueva, ha sido ampliamente utilizada diferentes. La diferencia estriba sobre Reprogenetics más de 500 ciclos con en el campo del estudio del cáncer, “qué” se hace hibridar (BAC’s, oligos, aCGH. 454 ciclos de FIV-DGP-AS se han pero recientemente se ha conseguido librerías, SNP’s). La ventaja de los realizado mediante biopsia en día 3 y modificarla con éxito para emplearla microarrays sobre la CGH convencional, transferencia en día 5 (grupo 1:G1) y en célula única. es que la lectura de la fluorescencia 75 mediante biopsia de blastocisto, es simple y rápida, y que el tiempo de vitrificación y transferencia en ciclo ¿QUé ES UN MICROARRAY? hibridación es generalmente menor. posterior (grupo2: G2). El total de ciclos con seguimiento es de 292 hasta Los ensayos de hibridación en En esta ponencia nos centraremos en la fecha. En la tabla 1 se resumen los microarrays, descritos a finales de el llamado array-CGH, array basado resultados obtenidos. los años ochenta, se basan en la en la técnica de CGH (Comparative disposición de material genético Genome hibridization), y los resultados Se dispone de seguimiento en 292 sobre un substrato (plástico, cristal, obtenidos en su aplicación en ciclos de ciclos de los 529 realizados. En estos membranas), en posiciones conocidas. FIV-DGP-AS. casos, el porcentaje de embarazo en curso fue del 49% en el grupo de Una colección (array) de ADN consiste Microarrays aCGH (BAC’s): La biopsia en día 3, mientras que del 63% en un gran número de moléculas de plataforma sobre la que se hace en el grupo en el que se biopsiaron ADN ordenadas en un sustrato sólido hibridar el DNA de la muestra y el test, blastocistos. La media de embriones de manera que formen una matriz la constituyen “puntos” formados por transferidos fue idéntica (1,63) en de secuencias en dos dimensiones. A clones de cromosomas artificiales ambos grupos, mientras que la tasa estos fragmentos de ADN inmovilizados de bacteria (BAC) de tamaño de implantación de los embriones en el soporte, se les denomina relativamente grande (150-200Kb), transferidos fue del 51% en el G2 y del “sondas”. Los ácidos nucleicos de que cubren la total longitud de cada uno 40% en el G1. En un 31% de los casos las muestras a analizar se marcan de los cromosomas (ver figura 1). Sobre no hubo transferencia en el G1 y en un por diversos métodos (enzimáticos, cada uno de estos puntos hibridan un 40% en el G2. fluorescentes) y se incuban sobre gran número de fragmentos del DNA el panel de sondas, permitiendo la muestra y referencia. El annealing de Si separamos por intervalos de edad hibridación (reconocimiento y unión múltiples fragmentos derivados de la materna, observamos que si bien en entre moléculas complementarias) misma región del cromosoma sobre el grupo 1 hay un descenso en la tasa de secuencias homólogas. Durante la el mismo punto, reduce el efecto que de embarazo a medida que aumenta hibridación, las muestras de material puedan tener los artefactos técnicos la edad, no sucede lo mismo en el genético marcadas se unirán a sus creados por posibles amplificaciones grupo 2, en el que los porcentajes de complementarias inmovilizadas en preferenciales y el ADO. Como en cada embarazo se mantienen relativamente el soporte del chip, permitiendo punto hibridan centenares o miles de estables a pesar del incremento en la la identificación y cuantificación fragmentos amplificados, el hecho edad materna de la paciente. (Tabla 2). del ADN presente en la muestra. de que unos pocos fragmentos no se Con posterioridad, el escáner y hayan amplificado queda diluido por Se biopsiaron un total de 5042 las herramientas informáticas nos la gran cantidad de otros que sí se han embriones, con 4541 embriones permiten interpretar y analizar los adherido a la sonda. De todas formas, biopsiados en día 3 y 501 embriones datos obtenidos. el diagnóstico no se puede basar en el en estadio de blastocisto. La media resultado obtenido en un solo BAC, sino total de embriones normales fue del En el campo de la aneuploidía, la idea que se obtiene combinando resultados 31,5%, siendo de un 30% en el grupo1 es la detección de la variación en el de varias sondas adyacentes (figura 1). y del 48,5% en el grupo 2.
- 44. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Mireia Sandalinas. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías 42 Tabla 2: Porcentaje de embarazo según edad materna en grupo 1 y grupo 2. Para profundizar en los aspectos Mediante el análisis de 9 aneuploidías aumenta por encima de lo deseado y cromosómicos, se analizaron en sólo se detectarían el 52% de eventos se pierden embriones que deberían detalle los resultados obtenidos de aneuploides, pero correspondientes a poder transferirse, disminuyendo 303 embriones de 54 pacientes con una un 75,9% de embriones aneuploides. la posibilidad de selección y en media de edad de 35,6 años del grupo 1. consecuencia de embarazo. Por otro CONCLUSIONES lado, los trabajos de investigación La clasificación de los embriones en sobre aneuploidía y desarrollo nos han función del resultado cromosómico fue Históricamente, en el diagnóstico confirmado la necesidad de evaluar la siguiente: genético preimplantacional, la técnica todo el componente cromosómico del de PCR se ha utilizado para casos de embrión. En los últimos años se ha 1. embrión normal: euploide para todos enfermedades genéticas mientras que dedicado un gran esfuerzo a adaptar los cromosomas la técnica de elección para detectar plataformas de diagnóstico de DNA 2. aneuploide: si presenta de 1 a 3 eventos las anomalías cromosómicas ha sido la genómico a célula única. Finalmente, de aneuploidía FISH. Si bien, los resultados obtenidos parece ser que el esfuerzo está 3. anormal complejo: de 4 a 11 eventos de con la aplicación de esta técnica culminando con la aparición simultánea aneuploidía han sido muy positivos, el grado de de varias plataformas de microarrays 4. caótico: con >12 eventos de aneuploidía. experiencia es muy determinante a la que permiten el diagnóstico de todos hora de aplicar la técnica. Los resultados cromosomas, (aCGH-Bacs, aCGH-Oligos, La media de embriones biopsiados dispares obtenidos como consecuencia SNP’s). La principal ventaja que supone en este subgrupo fue de 6,02, con un de la falta de experiencia en el uso de la el uso de microarrays es la eliminación 37,62% de embriones normales. Del técnica han llegado a generar un debate de las limitaciones que nos suponía la 62,37% de los embriones anormales, sobre el beneficio de la aplicación de técnica de FISH. Si bien es cierto que el 44,5% correspondían a embriones la técnica en sí misma (Mastenbroek et cada plataforma tiene sus pros y sus aneuploides, el 11,5% a anormales al., 2007; Cohen et al., 2007; Simpson, contras, los resultados que se están complejos y el 6,3% resultaron ser 2008; Munné et al., 2010). La necesidad obteniendo son bastante homogéneos. caóticos. de fijar los núcleos complica el proceso, puesto que no todos los métodos La elección del microarray de aCGH En el análisis de los cromosomas de fijación utilizados son igual de 24sure (Bluegnome) se debe a la afectados por aneuploidía no se tuvieron óptimos, ni todos los núcleos presentan siguiente pregunta: ¿Qué estamos en cuenta los embriones caóticos, sólo cromatina con la misma consistencia buscando? ¿Qué queremos detectar?. los aneuploides y anormales complejos que permita hibridar repetidas veces En el caso del DGP de aneuploidía (tabla 3). Se contabilizaron un total para obtener un diagnóstico fiable. aplicado a reproducción, buscamos de 406 eventos aneuploides con una poder detectar pérdidas y ganancias media de 2,4 cromosomas afectados por La limitación en el uso de fluorocromos de cromosomas o partes sustanciales embrión. El porcentaje de embriones requiere hibridar múltiples veces para de estos cromosomas. Los aCGH que con aneuploidías diferentes a las conseguir analizar los 24 cromosomas, estamos utilizando están diseñados detectadas habitualmente en el test de por lo que la eficiencia de la técnica para la detección de la ganancia o 9 sondas fue del 24,1%, con entre 1 y 5 disminuye. La posibilidad de aplicar el pérdida de todo un cromosoma y no se cromosomas afectados por embrión. llamado rescate de no resultado (NRR), valora ningún polimorfismo de número hibridando con sondas diferentes a las de copia (CNP), ni rasgos fenotípicos, Del resultado del análisis realizado (tabla que dan resultado dudoso o requieren ni ningún resultado que pudiera 3) se desprende que los cromosomas confirmación, queda prácticamente ser éticamente cuestionable (como más implicados en aneuploidía fueron eliminada. Sin posibilidad de enfermedades de aparición tardía, por este orden, el 22, 16, 21, 19, y 15. aplicar el NRR, el error de la técnica predisposición al cáncer,….), así como
- 45. S E S I Ó N D IE G E N É t I C A t tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 43 NºEVENTOS tampoco desequilibrios de significado CR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 total incierto. Esta aplicación es todavía muy 8 2 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 7 reciente, y por lo tanto debemos ser muy 1 2 1 3 1 0 1 0 1 0 0 0 9 cautos a la hora de informar, puesto que 6 0 1 1 0 0 2 5 0 0 0 0 9 aún no existe experiencia suficiente 14 1 2 5 0 0 0 1 0 0 1 0 10 sobre cómo interpretar los resultados a 20 1 1 0 4 0 0 2 1 1 0 0 10 nivel de célula única embrionaria. 3 0 0 3 1 0 2 2 1 1 1 0 11 10 1 1 4 1 0 1 0 2 0 1 0 11 Por otro lado, los buenos resultados 4 1 4 2 1 0 2 0 2 0 0 0 12 preliminares obtenidos mediante la 12 0 1 2 3 0 1 3 2 1 0 0 13 biopsia de blastocisto y transferencia 5 3 3 0 1 0 4 2 0 0 1 0 14 en ciclo posterior nos hacen sugerir que 7 2 5 1 1 0 1 3 0 0 1 0 14 éste es el camino a seguir. El hecho de 9 3 0 3 4 0 1 1 2 1 0 0 15 que un embrión llegue a blastocisto ya 2 2 4 3 1 0 3 2 0 1 0 0 16 nos demuestra “per se” una más elevada 11 1 4 2 5 0 1 1 0 1 1 0 16 capacidad de implantación que el resto XY 4 1 2 0 0 2 3 3 1 1 0 17 de la cohorte. Si además podemos 17 3 4 4 3 0 3 3 0 0 1 0 21 elegir de entre los blastocistos, el que 18 5 5 5 2 0 0 3 1 1 1 0 23 presenta la dotación cromosómica 13 5 7 5 3 0 2 1 0 0 1 0 24 normal, la selección del embrión 15 3 3 7 7 0 1 1 2 1 0 0 25 con máximo potencial implantatorio 19 9 4 8 2 0 3 2 1 0 0 0 29 aumenta. De hecho, los resultados nos 21 6 7 10 2 0 2 3 2 0 0 0 32 muestran que, independientemente de 16 12 6 6 7 0 1 0 1 0 0 0 33 la edad materna, una vez conseguido 22 9 5 14 2 0 3 2 0 0 0 0 35 un blastocisto y diagnosticado Tabla 3. Eventos aneuploides según número y cromosoma implicado como normal, el porcentaje de embarazo resultante se mantiene independientemente de la edad de to reduce the efficacy of chromosomal tests Hellani A, Abu-Amero K, Azouri J, El-Akoum la paciente. También hay que tener that are used to enhance implantation S. Successful pregnancies after application en cuenta la posibilidad de que la rates. Fertil Steril. 2007 Mar;87(3):496- of array-comparative genomic hybridization transferencia en un ciclo asincrónico, 503. Epub 2006 Dec 4. in PGS-aneuploidy screening. Reprod en un útero más receptivo y menos Biomed Online. 2008 Dec;17(6):841-7. sometido al estrés de la estimulación Cohen J, Grifo JA. Multicentre trial of hormonal sea beneficioso y contribuya preimplantation genetic screening Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, a aumentar las posibilidades de reported in the New England Journal Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel embarazo. Pero para poder aplicar el of Medicine: an in-depth look at the D. Comparative genomic hybridization DGP-AS en estadio de blastocisto, ya findings. Reprod Biomed Online. 2007 for molecular cytogenetic analysis sea en ciclo fresco o asincrónico, se Oct;15(4):365-6. of solid tumors. Science. 1992 Oct nos presenta un reto muy importante: 30;258(5083):818-21. no sólo conseguir optimizar las Gianaroli L, Magli C, Ferraretti AP, técnicas de diagnóstico genético Munné S. Preimplantation diagnosis for Munné S, Alikani M, Tomkin G, Grifo J, Cohen preimplantacional, sino también las aneuploidies in patients undergoing in- J. Embryo morphology, developmental condiciones de estimulación hormonal vitro fertilization with a poor prognosis: rates and maternal age are correlated with y cultivo en el laboratorio para poder identification of the categories for which chromosome abnormalities. Fertil Steril obtener unas tasas de formación de it should be proposed. Fertil Steril 1999; 1995; 64:382-391. blastocisto elevadas que nos permitan 72:837-844. llevar a cabo esa doble selección Rubio C, Buendía P, Rodrigo L, Mercader A, embrionaria. Así pues, la identificación Gutiérrez-Mateo C, Colls P, Sánchez-García Mateu E, Peinado V, et al. Prognostic factors del embrión con máxima capacidad J, Escudero T, Prates R, Ketterson K, Wells for preimplantation genetic screening in implantatoria nos permitirá, no sólo D, Munné S. repeated pregnancy loss. Reprod Biomed ayudar a las pacientes con riesgo Online 2009; 18:687-693. de generar embriones anormales, Validation of microarray comparative genomic sino también disminuir las tasas de hybridization for comprehensive chromosome Munné S, Magli C, Cohen J, Morton P, Sadowy embarazos múltiples mediante la analysis of embryos. Fertil Steril. 2011 Mar S, Gianaroli L, et al. Positive outcome after transferencia de un solo embrión. 1;95(3):953-8. Epub 2010 Oct 25. preimplantation diagnosis of aneuploidy in human embryos. Human Reprod 1999; REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Harper JC, Harton G.The use of arrays in 14:2191-2199. preimplantation genetic diagnosis and Cohen J, Wells D, Munné S Removal of 2 screening. Fertil Steril. 2010 Sep;94(4):1173- Munné S, Sandalinas M, Escudero T, Velilla cells from cleavage stage embryos is likely 7. Epub 2010 Jun 25. Review. E, Walmsley R, Sadowy S, et al. Improved
- 46. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Mireia Sandalinas. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías 44 implantation after preimplantation genetic Schröck E, du Manoir S, Veldman T, Schoell cells by whole genome amplification and diagnosis of aneuploidy. Reprod Biomed B, Wienberg J, Ferguson-Smith MA, Ning Y, comparative genomic hybridisation. Online 2003; 7:91–97. Ledbetter DH, Bar-Am I, Soenksen D, Garini Nucleic Acids Res 1999; 27:1214–1218. Y, Ried T. Multicolor spectral karyotyping Munné S, Gianaroli L, Tur-Kaspa I, Magli C, of human chromosomes. Science. 1996 Jul Wells D, Delhanty JD. Comprehensive Sandalinas M, Grifo J, Cram D, Kahraman 26;273(5274):494-7. chromosomal analysis of human S, Verlinsky Y, Simpson JL. Substandard preimplantation embryos using whole application of preimplantation genetic Simpson JL.What next for preimplantation genome amplification and single cell screening may interfere with its clinical genetic screening? Randomized clinical comparative genomic hybridization. Mol success. Fertil Steril. 2007 Oct;88(4):781-4. trial in assessing PGS: necessary but Hum Reprod 2000; 6:1055–1062. not sufficient. Hum Reprod. 2008 Rius M, Obradors A, Daina G, Cuzzi J, Marquès Oct;23(10):2179-81. Epub 2008 Jul 9. Wells D, Escudero T, Levy B, Hirschhorn L, Calderón G, Velilla E, Martínez-Passarell K, Delhanty JD, Munné S. First clinical O, Oliver-Bonet M, Benet J, Navarro J. Treff NR, Su J, Mavrianos J, Bergh PA, Miller application of comparative genomic Reliability of short comparative genomic KA, Scott RT. Accurate 23 chromosome hybridization and polar body testing hybridization in fibroblasts and blastomeres aneuploidy screening in human for preimplantation genetic diagnosis for a comprehensive aneuploidy screening: blastomeres using single nucleotide of aneuploidy. Fertil Steril 2002; first clinical application. Hum Reprod. 2010 polymorphism (SNP) microarrays. Fertil 78:543–549. Jul;25(7):1824-35. Epub 2010 May 19. Steril 2010; 88:S1. Wells D, Fragouli E, Stevens J, Munne Schoolcraft WB, Katz-Jaffe MG, Stevens Verlinsky Y, Cieslak J, Freidine M, S, Schoolcraft W, Katz-Jaffe M. High J, Rawlins M, Munne S. Preimplantation Ivakhnenko V, Wolf G, Kovalinskaya L, pregnancy rate after comprehensive aneuploidy testing for infertile patients White M, Lifchez A, Kaplan B, Moise J, et chromosomal screening of blastocysts. of advanced maternal age: a randomized al. Pregnancies following pre-conception Fertil Steril 2008; 90:S80. prospective trial. Fertil Steril 2008; 8. diagnosis of common aneuploidies by fluorescent in-situ hybridization.Hum Wilton L, Williamson R, McBain J, Edgar Schoolcraft WB, Fragouli E, Stevens J, Munne Reprod. 1995 Jul;10(7):1923-7. D, Voullaire L. Birth of a healthy infant S, Katz-Jaffe MG, Wells D. Clinical application after preimplantation confirmation of comprehensive chromosomal screening Wells D, Sherlock JK, Handyside AH, of euploidy by comparative genomic at the blastocyst stage. Fertil Steril. 2010 Delhanty JD. Detailed chromosomal hybridization. N Engl J Med 2001; Oct;94(5):1700-6. Epub 2009 Nov 25. and molecular genetic analysis of single 345:1537–1541.
- 47. DGP para todos los cromosomas* detectan más anomalías y se Con esta nueva técnica se mejoran las posibilidades de embarazo. *sin coste añadido Nuevo servicio!!! ESTUDIOS GENÉTICOS PARA EL SCREENING DE DONANTES: Fibrosis quística (50 mutaciones* + polimor smo TN) www.pgdcem.co Estudio de X-Frágil Madrid y Barcelona - Chicago - USA www.pgdcem.com pgd@pgdcem.com
- 48. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Esther Fernández García. Estandarización de las técnicas de biología molecular al Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) 46 EStANDARIzACIÓN DE lAS tÉCNICAS DE BIOlOGÍA MOlECUlAR Al DIAGNÓStICO GENÉtICO PREIMPlANtACIONAl (DGP) Esther Fernández García Geniality Diagnóstico Genético, Madrid e-mail: efgarcia@geniality.es aplicarse en pacientes presintomáticos, polar (CP) o del blastómero y herniación INTRODUCCIÓN abren la puerta a otras enfermedades de las células del trofoectodermo (TE). de aparición tardía como el Alzheimer, Las diferentes técnicas de biopsia, EVOLUCIÓN DEL DGP pacientes portadores de genes con aparecen extensamente explicadas predisposición al cáncer (BRCA1, en una revisión de De Vos and Van El Diagnóstico Genético BRCA2) (Goossens et al., 2008), así Steirteghem publicada en el año 2001. Preimplantacional (DGP) permite como el DGP que implica la selección analizar los embriones obtenidos de embriones de acuerdo a su HLA, de La Biopsia del primer y segundo CP, se mediante fecundación in vitro (FIV), en manera que los niños nacidos de estos puede realizar sin dañar las tasas de busca de alteraciones cromosómicas ciclos de DGP pueden ser donantes de fecundación y división posterior del o enfermedades genéticas graves, células madre para su hermano enfermo ovocito. Su utilidad está limitada a la seleccionando aquellos embriones sanos (Verlinsky et al., 2001). identificación de los desequilibrios o cromosómicamente normales, antes cromosómicos numéricos y de la transferencia al útero materno Sin embargo el DGP tiene en la enfermedades moleculares de origen y por tanto, antes de que se haya actualidad retos a los que enfrentarse, materno (Verlinsky and Kuliev, 2003), producido la implantación. Esta técnica como es el diagnóstico de enfermedades y en algunos casos para análisis de representa para las parejas portadoras mitocondriales. Hasta la fecha se segregación previo al proceso de DGP de alteraciones genéticas graves, la han intentado un número limitado de (Spits et al., 2006), siendo la única única alternativa a la interrupción del casos, debido a la dificultad de predecir opción en aquellos países donde no está embarazo después de un Diagnóstico la carga de mutación en el embrión permitido el diagnóstico en embriones. Prenatal (DP) de feto afecto. (depleción mitocondrial) y su efecto clínico (Bredenoord et al., 2008). La biopsia de uno o dos blastómeros En 1990 se publica el primer embarazo del embrión, es la técnica obtenido mediante DGP, en una pareja ASPECTOS TéCNICOS DEL DGP mayoritariamente utilizada. Para ello portadora de enfermedad ligada al se deja en cultivo al embrión hasta sexo (Handyside et al., 1990). Desde TRA Y BIOPSIA EMBRIONARIA el día +3 post inseminación (6 o más entonces han pasado ya más de dos células). En cuanto a la eficacia del décadas, durante las cuales esta Todos los embriones analizados en el DGP diagnóstico, existen dos tendencias a la tecnología, utilizada por primera vez provienen de técnicas de reproducción hora de realizar la biopsia, una a favor para seleccionar el sexo del embrión, ha asistida, donde las pacientes se someten de la biopsia de una blastómera (Cohen ido ampliando sus indicaciones tanto a una estimulación ovárica controlada, et al., 2007), menos perjudicial para el en enfermedades monogénicas como con el fin de obtener un elevado número embrión, y la otra a favor de la biopsia anomalías cromosómicas estructurales, de ovocitos, que serán denudados para de dos blastómeras, que se ha podido siendo una técnica consolidada y de evitar contaminaciones con células comprobar que no afecta a la capacidad aplicación rutinaria en muchos centros maternas durante el proceso de DGP. de desarrollo a estadio de blastocisto de Reproducción Asistida, donde esta Estos ovocitos son microinyectados del embrión (Staessen et al., 2004) técnica es especialmente importante (ICSI) para evitar fallos inesperados de y puede aumentar la eficacia de los debido a la frecuente asociación entre fecundación (Staessen et al., 1999) y análisis realizados con la PCR (Goossens la esterilidad y los factores genéticos. prevenir posibles contaminaciones con et al., 2008a). espermatozoides que queden adheridos Uno de los aspectos diferenciales del a la zona pelúcida (ZP) (Liebaers et al., La biopsia del embrión en estadio de DGP, son aquellas indicaciones que 1998; Thornhill et al., 2005). blastocisto, se realiza en el día +5 de nunca habían sido contempladas en el cultivo post inseminación. En este caso, DP y que debido a las características El proceso de biopsia implica dos pasos, aunque se tienen más células para el de la técnica pueden ser defendidas abrir la ZP y extraer la célula. Para diagnóstico, hay que tener en cuenta desde un punto de vista ético. Estas ello se pueden utilizar tres diferentes que solo la mitad de los embriones nuevas indicaciones han sido objeto de métodos, el mecánico con una fina preimplantacionales evolucionan in modificación de leyes, como es el caso aguja, el químico con ácido de Tyrode’s vitro hasta este estadio (Van Landuyt de la Ley Española (Ley 14/2006) sobre y mediante la técnica del Laser, para et al., 2005) y que además contamos Reproducción Asistida. Enfermedades luego extraer la célula mediante con poco tiempo para dar el resultado como el Huntington, donde el DGP puede extrusión o aspiración del corpúsculo del diagnóstico, ya que la transferencia
- 49. S E S I Ó N D IE G E N É t I C A t tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 47 embrionaria se realiza en día +5 o +6. amplicones. Tras la amplificación por tiene una implicación especialmente Una posible solución es la congelación PCR se realiza la discriminación alélica, importante en enfermedades de los embriones, aunque hay que tener que en el caso más simple se basa en el autosómicas dominantes, donde en cuenta que los embriones biopsiados tamaño de los fragmentos. un embrión afecto podría llegar a presentan una tasa de supervivencia ser transferido. Se han realizado menor, debido posiblemente a la abertura Las endonucleasas de restricción han numerosos estudios en un intento de de la ZP (Magli et al., 1999, 2006; Joris sido utilizadas ampliamente en el DGP, dilucidar los factores que influyen en la et al., 1999; Stachecki et al., 2005). La para distinguir entre dos alelos, uno aparición del ADO y encontrar maneras introducción de la técnica de vitrificación mutado y el normal. O para detectar de evitarlo o disminuir en lo posible su en este campo hace más realista esta los diferentes alelos de un SNP, single aparición. Se ha sugerido como causa situación (Escribá et al., 2008). nucleotide polymorphism, en lugar una lisis imperfecta de la célula o una de utilizar RFLP, restriction fragment temperatura de desnaturalización ANÁLISIS GENéTICO length polymorphism. Por ejemplo en inadecuada. De ahí que hayan sido DGP para FQ (Goossens et al., 2000), muchos los estudios encaminados PCR Y MéTODOS POST-PCR beta-thalassemia y anemia de células a investigar diferentes métodos de falciformes (De Rycke et al., 2001), lisis celular y pasos desnaturalizantes La técnica más común utilizada en el Síndrome de Marfan (Spits et al., 2006a) (Sermón et al, 1995;. Ray and Handyside, DGP para enfermedades monogénicas o para la detección de polimorfismos 1995, El-Hashemite and Delhanty, 1997; es la PCR, aunque en algunos casos la (Ioulianos et al., 2000). Verlinsky and Kuliev, 1998; Thornhill et hibridación in situ fluorescente (FISH) al, 2001.; Piyamongkol et al., 2003). puede ser de utilidad en el análisis de En la actualidad las endonucleasas de Existe actualmente el consenso de grandes deleciones, como es el caso restricción están siendo reemplazadas que los mejores métodos de lisis son de la Distrofia Muscular de Duchenne por la minisecuenciación. Los primers la lisis alcalina y la lisis con proteinasa y Becker. Cuando utilizamos la PCR en para la minisecuenciación están K-SDS (Thornhill et al., 2005). Por el el DGP de enfermedades monogénicas, diseñados para anillar una base contrario, se ha sugerido como una nos encontramos con una problemática antes del sitio diana y elongar un posible causa de ADO y amplificación asociada inexistente en el análisis solo dideoxinucleótido. Los cuatro preferencial (PA) la degradación del genético convencional con esta misma diferentes dideoxinucleótidos están ADN, posiblemente más frecuente en los técnica: la cantidad y calidad de ADN marcados con diferentes fluorocromos embriones pobres en morfología y en obtenida de una sola célula (Harper y los productos de la minisecuenciación blastómeros con un núcleo claro (Cui y et al., 2002). Por este motivo ha sido pueden distinguirse en un sistema de Matthews, 1996; Thornhill et al, 2001; necesario invertir un largo periodo secuenciación de ADN automático. Piyamongkol et al., 2003, Goossens et de tiempo para lograr un protocolo Esta técnica es muy versátil y ha sido al., 2008b) de trabajo ajustado a las nuevas ampliamente utilizada en la detección condiciones de la PCR, sin perder de mutaciones y SNP (Cram et al., 2003; CONTAMINACIÓN de vista la contaminación con ADN Fiorentino et al., 2003, 2004; Spits et exógeno y problemas específicos como al., 2005). La PCR de una sola célula tiene un riesgo el allele drop out (ADO). elevado de contaminación debido La PCR cuantitativa a tiempo real es principalmente al alto número de ciclos A lo largo de estos años se han utilizado uno de los últimos desarrollos en PCR; que tienen que realizarse durante el numerosas variantes de la PCR y el principal uso de esta técnica es proceso de PCR y a la limitada cantidad detección alélica a nivel de una sola cuantificar con exactitud el nº de copias de ADN de partida. Por ello, para evitar célula. La mayoría de estos métodos, de un determinado amplicón presentes la contaminación, ha sido necesario como el análisis de heteroduplex en una muestra original. En el ámbito adoptar una serie de medidas en los tradicionalmente utilizado para la del DGP, esta tecnología se presenta laboratorios que trabajamos en DGP detección de la mutación c.1522 como prometedora para el diagnóstico mediante técnicas de PCR. Entre ellas, 1524del, de la Fibrosis Quística (FQ) de enfermedades mitocondriales, la separación física de los reactivos (Handyside et al., 1992; Ray et al., donde es crucial para determinar la y productos de la PCR de cualquier 1998, Lissens and Sermon, 1997), proporción del genoma mutado y del fuente de ADN, la esterilización de han quedando en desuso y han sido salvaje (Rice et al., 2002). los reactivos, hacer alícuotas de los reemplazados por la PCR fluorescente, reactivos de PCR para disminuir el técnica por excelencia utilizada en DGP ADO número de muestreos de un solo tubo, de enfermedades monogénicas desde trabajar en campanas de flujo laminar, hace varios años (Thornhill et al., Se define como ADO, a la no utilizar bata, mascarilla y guantes 2005). La PCR fluorescente se basa en amplificación al azar de uno de los desechables, limpieza de todas las el marcaje en su extremo 5’ de uno de dos alelos presentes en una muestra superficies de trabajo con detergentes los primers y el análisis del producto de heterocigota. Este fenómeno puede degradantes de ADN, utilizar UV en las la PCR en un secuenciador automático. acarrear errores diagnósticos en el campanas, y basarse en técnicas, como Es una técnica muy sensible que permite DGP si un embrión heterocigoto es la PCR multiplex, que permiten detectar la detección simultánea de varios diagnosticado como homocigoto. El ADO cualquier contaminación.
- 50. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Esther Fernández García. Estandarización de las técnicas de biología molecular al Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) 48 MARCADORES Y PCR MULTIPLEX El primer método de WGA fue embarazo previo o muestra de ADN de descrito en 1992 y estaba basado en un hijo afecto, con el estudio mediante La PCR multiplex es una co- el principio de la PCR. Zhang et al., MDA de un espermatozoide (Jiang et al., amplificación de diferentes loci en una desarrollan la PCR primer extensión 2005) o del corpúsculo polar. El mayor misma reacción de PCR. Esta técnica es (PEP). Telenius et al., desarrollan la inconveniente descrito del MDA es la la que se utiliza por excelencia en el PCR con oligos degenerados (DOP- alta frecuencia de ADO y la amplificación DGP de enfermedades monogénicas, PCR). La principal desventaja de la preferencial (AP) (Spits et al., 2006b), ya que incluye la amplificación de al WGA es la generación de artefactos de que se han estimado en un 25% (Burlet menos dos marcadores polimórficos amplificación no específicos (Cheung et al. ,2006; Renwick et al., 2006). localizados intragénicos o cercanos and Nelson, 1996), una cobertura al gen, pudiendo además incluir incompleta de los loci (Paunio et al., Presentamos la estandarización de la mutación. Los estudios de 1996), la ineficacia en la amplificación las técnicas de genética molecular informatividad realizados antes del de microsatélites (Wells et al., 2000), aplicadas al análisis del DGP, que nos DGP nos permiten determinar a priori así como la generación de ADN de permiten en la actualidad abordar el los alelos esperados en el embrión y menos de 1KB de longitud que limitan diagnóstico genético preimplantacional qué alelos están segregando con la su aplicación (Telenius et al., 1992; de cualquier enfermedad monogénica, mutación. La PCR multiplex nos da Zhang et al., 1992). únicamente con las limitaciones propias suficiente información para detectar de un estudio familiar de segregación los ADO, la posible contaminación Debido a estas limitaciones, se hacía de una enfermedad genética. (Pickering et al., 1994; Findlay et al., necesaria la incorporación de un 1995), y es perfecto para el diagnóstico, método de WGA que nos permitiera la MATERIAL Y MéTODOS ya que una vez tengamos el haplotipo amplificación del ADN de una sola célula, ligado a la mutación podemos realizar con una alta fiabilidad y el diagnóstico Presentamos los resultados obtenidos el diagnóstico de forma indirecta de cualquier enfermedad monogénica en 37 ciclos de DGP realizados analizando la presencia o ausencia del mediante una PCR multiplex. por 27 parejas portadoras de 11 alelo ligado en el embrión sin necesidad enfermedades monogénicas: Atrofia de detectar la mutación. Esta opción El MDA (Multiple displacement Muscular espinal; Hemofilia; CADASIL; abre la posibilidad de aplicar un mismo amplification) es el mejor método de 11 Enfermedad de Huntington; estudio a diferentes parejas que cursan WGA utilizado en la amplificación de Exostosis Múltiple Hereditaria; Fibrosis con mutaciones privadas para una muestras biológicas que contienen Quistica; Hiperglicinemia no cetósica; enfermedad genética, como puede ser muy poca cantidad de ADN (Dean mucopolisacaridosis tipo 1 (s. Hurler); la Neurofibromatosis tipo 1, sin tener et al., 2002), y ha supuesto toda 4 Neurofibromatosis tipo 1; Paraparesia que diseñar el estudio de la mutación una revolución en el diagnóstico espástica hereditaria; 2 Poliposis en cada caso. Aunque esto no signifique de una sola célula. Esta técnica no Adenomatosa Familiar. Todos los casos que utilicemos los mismos marcadores está basada en la PCR, sino en una han llegado al laboratorio entre el 3º para cada pareja, ya que dependerá amplificación isotérmica que utiliza y 4º día de cultivo embrionario y los del estudio previo de informatividad. hexámeros que anillan al azar en el resultados se han dado en un plazo Por otra parte, en la PCR multiplex, ADN desnaturalizado seguido de la de tiempo comprendido entre 6 y 36 utilizamos marcadores que flanquean síntesis a lo largo de la cadena de horas, con el fin de que los embriones a la mutación y podemos detectar ADN a una temperatura constante, pudieran ser transferidos al útero posibles eventos de recombinación. catalizado por la polimerasa Phi 29 que materno en día +5. En el caso de las mutaciones de novo, permite conseguir al final del proceso la pareja necesita tener un hijo afecto de 20-30 μg de ADN partiendo de 1 a 10 Salvo en los casos de “Test de exclusión” vivo, o en su defecto muestra de ADN copias de ADN (Handyside et al., 2004; correspondientes a la enfermedad de del aborto terapéutico (IVE), si es el Ali Hellani et al., 2004). Huntington, donde se han utilizado caso. Si no fuera así, el estudio se puede solamente marcadores polimórficos llevar a cabo analizando la mutación La principal ventaja del MDA es ligados o no ligados, en los ciclos que puntual junto con los marcadores. que posibilita la combinación de presentamos se ha llevado a cabo tanto diferentes indicaciones en un mismo el análisis de marcadores (STRs), con AMPLIFICACIÓN DE GENOMA COMPLETO O ciclo de DGP, como el análisis de la una media de 5 marcadores incluidos WHOLE GENOME AMPLIFICATION (WGA) mutación, de marcadores polimórficos y en cada estudio, como el análisis screening de aneuploidías (hibridación directo de la mutación responsable de La cantidad de ADN de partida de una sola genómica comparada (CGH), array- la enfermedad. En este periodo se han célula es un paso limitante en el DGP. Para CGH o el análisis de short tandem analizado mediante este protocolo poder solventar este problema, se utiliza repeat (STRs)), así como el estudio 315 blastómeras de 214 embriones la amplificación de genoma completo combinado de mutación y HLA en el biopsiados en día +3 mediante los 3 (WGA). El objetivo de introducir esta embrión (Handyside et al., 2004). Otra métodos de biopsia que se emplean de técnica es generar una nueva muestra ventaja del MDA, es que nos permite forma rutinaria: mecánica, Tyrode`s indistinguible de la original pero con una determinar los haplotipos parentales en y laser, siendo de 1,4 la media de mayor concentración de ADN. aquellas parejas que no cuenten con un blastómeras biopsiadas por embrión.
- 51. S E S I Ó N D IE G E N É t I C A t tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 49 Fig.1 Estudio Informatividad Se han realizado un total de 1.348 La finalidad de este diseño es poder Q-solution, cuya función es modificar la reacciones, 72 de ellas corresponden incluir en una misma reacción de curva de melting de los amplificados de a la técnica de Minisecuenciación PCR multiplex el mayor número ADN con el fin de facilitar la amplificación (mutación puntual) y 1.276 a de marcadores posibles, evitando conjunta de todos los fragmentos de marcadores tipo STRs, mutaciones coincidencias en los tamaños de los la PCR multiplex. La concentración de de tipo expansión de tripletes productos amplificados. primers que añadimos es de 4μM y 100 ng o deleciones. Para las distintas de ADN del probando y sus familiares. PCR multiplex diseñadas en estos La reacción en cadena de la polimerasa diagnósticos, se han empleado un total (PCR) se lleva a cabo en termocicladores Los marcadores que se emplean para de 85 marcadores tipo STR diferentes, Applied Biosystems Verity TM Thermal el estudio de mutaciones de expansión de los cuales 14 correspondían a Cycler. El volumen final de reacción es de de tripletes o deleciones se diseñan y marcadores empleados en el estudio 25 ml por tubo y se utilizó un kit comercial, estudian con la misma metodología de mutaciones de tipo expansión de QIAGEN Multiplex PCR (Cat no. 206145), que si fueran marcadores tipo STR. tripletes, deleciones o mutaciones que nos permite la amplificación de dos o Los marcadores para las mutaciones puntuales y 71 fueron marcadores más marcadores en una única reacción. El puntuales se basan en la reacción polimórficos de tipo STR. kit contiene una Master Mix que incluye de Minisecuenciacion (SNaPshot®, concentraciones pre-optimizadas de Applied Biosystems) y se diseñan La metodología se aplica en dos etapas: HotStarTaq DNA Polymerase y MgCl2, conforme al protocolo recomendado dNTPs y buffer de PCR. También contiene con algunas modificaciones. 1-Estudio de Informatividad: Etapa previa al ciclo de DGP en la que TABLA I se diseñan los marcadores que se Característica Valor emplearan posteriormente en el ciclo Cercanía al locus <2Mb de DGP y se realiza el estudio de estos Posición relativa al locus Teloméricos y Centroméricos marcadores en la familia, estableciendo Unidad de repetición Dinucleótidos, trinucleótidos, tetranucleótidos la segregación y clasificando los % CG <60% marcadores en informativos, semi- Longitud de los primers 17-23 informativos y no informativos. Los Tª melting <60º ( y <1º diferencia entre los primers forward y reverse) marcadores de tipo STR se seleccionan Producto amplificado <250 pb en función de las características que se Anillamientos alternativos Ausencia muestran en la TABLA I: Fluorocromos 6-FAM, VIC
- 52. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Esther Fernández García. Estandarización de las técnicas de biología molecular al Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) 50 TABLA II que los lavados del blastómero han sido Biopsia Lisis Pre- PCR amplificación de post-PCR insuficientes y no deberían darse como Embrionaria (1) PCR marcadores concluyentes los resultados obtenidos Laser Alcalina MDA n Multiplex-PCR (≤3 marcadores) Análisis de en este embrión. Tyrodes MINISECUENCIACION(2) fragmentos Mecánica La detección de alelos no paternos Realizada en todos los ciclos en día +3; Incluye el tubing (1) (2) Únicamente en ciclos que incluyen el análisis en los STRs analizados indica que la de mutaciones puntuales. contaminación no puede provenir ni de los espermatozoides, ni de las células Para el análisis de los fragmentos con pequeñas modificaciones. En la del cúmulo. En el caso de embriones amplificados por PCR y el análisis de etapa de DGP los protocolos empleados con tres o más alelos paternos, puede las mutaciones puntuales, se utilizó para la PCR multiplex son los descritos explicarse por contaminación de un secuenciador automático Applied en el apartado anterior aplicados a una alelos paternos o por la presencia de Biosystems 3130xl, de 16 capilares. El sola célula y adaptados al producto del un número anormal de cromosomas. proceso concluye con la selección de MDA. Con el producto del MDA se pueden Cualquiera de estos embriones debe los marcadores informativos y semi- realizar mediante este protocolo hasta excluirse de la transferencia. informativos para cada pareja (Fig. 1). 10 reacciones PCR-Multiplex, que en nuestra experiencia pueden incluir RESULTADOS 2-Diagnóstico Genético hasta 3 marcadores diferentes, lo que Preimplantacional: Todas las posibilitaría el análisis de hasta 30 Se analizaron 315 células blastómeras fueron biopsiadas en día marcadores, si fuera necesario. correspondientes a 214 embriones +3 post fecundación en medio libre de biopsiados, con un promedio de Ca+2 y Mg+2, cada blastómera se lava en Para cada una de las etapas se emplean 6 embriones biopsiados por ciclo, varias microgotas y se transfieren a un las metodologías descritas en la Tabla II, obteniendo diagnóstico en el 94,8% de tubo de PCR estéril de 0,2ml en no más siendo éste el protocolo estándar para los embriones (TABLA III). de 2μl del mismo medio utilizado para la todas las enfermedades monogénicas a biopsia (tubing). Se prepara entonces partir de la etapa de biopsia. El número total de marcadores un tubo como control negativo por cada utilizados en el estudio fue de 85 en un embrión biopsiado, que consiste en 2μl Criterios diagnósticos: Los controles total de 1.348 reacciones. La eficacia de la última gota de lavado. positivos deberán dar como resultado global de los marcadores utilizados los haplotipos esperados así como fue del 93,53%. Si separamos entre El traslado al laboratorio se lleva a la mutación/mutaciones paternas los marcadores STRs o empleados cabo a Tº ambiente (entrada en día+3, analizadas y la secuencia normal y el en el diagnóstico de deleciones o día+4), donde a su llegada y antes de control negativo compuesto por la mezcla (78) y marcadores utilizados en iniciar el proceso, se lleva a cabo la lisis de PCR únicamente, nos dará información minisecuenciación (7), la eficacia alcalina (200mM NaOH; 50mM DTT) y se sobre posibles contaminaciones de los encontrada en cada uno de ellos es del someten a una amplificación masiva del reactivos. La detección de amplificado 93,20% y del 97,7% respectivamente. ADN (MDA). El protocolo de MDA que en el tubo control del embrión preparado Por otro lado, en lo que respecta al ADO, empleamos es el recomendado para el en el momento del tubing, indican la el porcentaje de ADO global obtenido es GenomiPhi™ V2 DNA Amplification Kit presencia de contaminantes y demuestra de 19,11% siendo el porcentaje de ADO encontrado para los STRs del 20,46% TablaIII y para la minisecuenciación del 4,07% (TABLA IV). Número de Ciclos 37 Número de Embriones Biopsiados 214 Se ha llevado a cabo la transferencia Número de Células analizadas 315 embrionaria en 33 de los 37 ciclos Nº de embriones diagnosticados 203(94,8%) diagnosticados (89,2%) con una media de embrión transferido del 1,8, Número de Embriones sanos 69 obteniendo una tasa de embarazo por Número de Embriones afectos 74 transferencia del 30,3%. De los 4 ciclos Número de Embriones con riesgo 30 sin transferencia, en 2 de ellos todos Número de Embriones portadores sanos 18 sus embriones fueron diagnosticados como afectos y los otros dos no tuvieron Número de embriones recombinantes 12(5,9%) evolución embrionaria. Número de Embriones transferidos 60 Número de Transferencias 33 DISCUSIÓN Media de embriones transferidos 1,8 El Diagnóstico Genético Preimplantacional Nuero de embarazos 10 de enfermedades monogénicas, es una Tasa de embarazo por transferencia 30,3% técnica cada vez más solicitada por las
- 53. S E S I Ó N D IE G E N É t I C A t tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 51 parejas portadoras de enfermedades TABLA IV genéticas graves, ya que les ofrece la oportunidad de realizar el diagnóstico de Nº de Marcadores Eficacia del proceso % su descendencia antes de la implantación 85 Eficacia Global 93,53 en el útero materno, evitando así el 78 Eficacia STRs(1) 93,20 aborto terapéutico. 7 Eficacia Minisecuenciación 97,27 El DGP es una técnica que nos permite abordar el estudio de cualquier Nº de Marcadores ADO % enfermedad monogénica grave. 85 Global 19,11% Esta técnica se ha empleado en los 78 STRs(1) 20,46 últimos 20 años en el diagnóstico de 7 Minisecuenciación 4,07 diversas enfermedades que conforman (1) Marcadores tipo STR: Incluyen marcadores que se emplean para el estudio de mutaciones consistentes una lista cada vez más larga, sin en expansión de tripletes o deleciones y marcadores de tipo short tandem repeat (STRs) o microsatélites embargo también las metodologías empleadas en el diagnóstico de estas enfermedades son muy variadas y en diagnóstico consecuencia de este Cheung, V. G., and Nelson, S. F. Whole ocasiones, complejas. fenómeno se solventa con la inclusión genome amplification using a degenerate de una media de 5-6 marcadores oligonucleotide primer allows hundreds of El protocolo desarrollado en nuestro informativos o semi-informativos por genotypes to be performed on less than one laboratorio pretende establecer unas diagnóstico, lo que garantiza en un nanogram of genomic DNA. Proc.Natl.Acad. condiciones únicas de diagnóstico 94,8% el resultado diagnóstico del Sci.U.S.A. 1996,93:14676-14679. para cualquier enfermedad en el embrión. que únicamente varían los primers o Cohen, J., Wells, D., and Munne, S. Removal cebadores que serán dependientes La estandarización de los protocolos of 2 cells from cleavage stage embryos is del locus o enfermedad a estudiar. de diagnóstico genético utilizados likely to reduce the efficacy of chromosomal Esto permite simplificar todo el en el Diagnóstico Genético tests that are used to enhance implantation procedimiento en el diagnóstico Preimplantacional, nos permite rates. Fertil.Steril. 2007, 87:496-503. de enfermedades monogénicas, ofrecer unos resultados con una acortando los tiempos de respuesta en alta fiabilidad que queda reflejada Cram, D. S., Song, B., and Trounson, A. O. la fase de estudio de informatividad, en la eficacia conseguida con Preimplantation diagnosis of Lesch-Nyhan puesto que las condiciones son iguales esta metodología de trabajo. Esta using mini-sequencing primer extension. en el estudio de cualquier enfermedad estandarización tiene que empezar en Reprod.Biomed.Online. 2003,7:342-345. y permite comparar los parámetros la etapa del estudio de informatividad de éxito de los diagnósticos y desde el momento en que la célula Cui, K. H., and Matthews, C. D. Nuclear (tasa de eficiencia diagnóstica, embrionaria es introducida en el tubo structural conditions and PCR amplification tasa de allele drop-out y fallo de de PCR donde se llevará a cabo la lisis in human preimplantation diagnosis. Mol. amplificación) independientemente celular, la posterior amplificación Hum.Reprod. 1996, 2:63-71. del locus analizado. masiva del ADN mediante la técnica del MDA y las diferentes PCR multiplex que De Rycke, M., Van de Velde, H., Sermon, K., El empleo del MDA permite realizar nos permitirán llegar a seleccionar el Lissens, W., De Vos, A., Vandervorst, M., un gran número de reacciones con embrión “sano” para su transferencia Vanderfaeillie, A., Van Steirteghem, A., una tasa de eficiencia diagnóstica del al útero materno. and Liebaers, I. Preimplantation genetic 93,53%, superior a la descrita hasta diagnosis for sickle-cell anemia and for el momento en las recogidas de datos REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS beta-thalassemia. Prenat.Diagn. 2001, que lleva a cabo la ESHRE de ciclos de 21:214-222. DGP por enfermedades monogénicas. Bredenoord, A. L., Pennings, G., Smeets, Esto cobra especial importancia H. J., and de Wert, G. Dealing with De Vos, A., and Van Steirteghem, A. cuando se trata de realizar un DGP uncertainties: ethics of prenatal diagnosis Aspects of biopsy procedures prior to por HLA en combinación o no con el and preimplantation genetic diagnosis to preimplantation genetic diagnosis. Prenat. diagnóstico de una enfermedad, o prevent mitochondrial disorders. Hum. Diagn. 2001, 21:767-780. cuando en el DGP está indicado el Reprod.Update. 2008,14:83-94. estudio de dos o más patologías, ya Dean, F. B., Hosono, S., Fang, L., Wu, X., que esto requerirá la inclusión de Burlet, P., Frydman, N., Gigarel, N., Faruqi, A. F., Bray-Ward, P., Sun, Z., Zong, un gran número de marcadores. Las Kerbrat, V., Tachdjian, G., Feyereisen, Q., Du, Y., Du, J., Driscoll, M., Song, W., tasas de allele drop out asociadas E., Bonnefont, J. P., Frydman, R., Kingsmore, S. F., Egholm, M., and Lasken, a este protocolo son similares o Munnich, A., and Steffann, J. Multiple R. S. Comprehensive human genome incluso inferiores a las descritas en la displacement amplification improves PGD amplification using multiple displacement bibliografía hasta el momento (Spits for fragile X syndrome. Mol.Hum.Reprod. amplification. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. and Sermon, 2009) y el posible error 2006,12:647-652. 2002, 99:5261-5266.
- 54. S E S I Ó N t D t UG E N É t I C A I E l O Esther Fernández García. Estandarización de las técnicas de biología molecular al Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) 52 El-Hashemite, N., and Delhanty, J. Goossens, V., Sermon, K., Lissens, W., survival after human embryo biopsy D. A technique for eliminating allele Vandervorst, M., Vanderfaeillie, A., De and subsequent cryopreservation. Hum. specific amplification failure during DNA Rijcke, M., De Vos, A., Henderix, P., Van De Reprod. 1999,14:2833-2837. amplification of heterozygous cells for Velde, H., Van Steirteghem, A., and Liebaers, preimplantation diagnosis. Mol.Hum. I. Clinical application of preimplantation Liebaers, I., Sermon, K., Staessen, C., Reprod. 1997,3:975-978. genetic diagnosis for cystic fibrosis. Prenat. Joris, H., Lissens, W., Van Assche, E., Diagn. 2000,20:571-581. Nagy, P., Bonduelle, M., Vandervorst, Escriba, M. J., Zulategui, J. F., Galan, M., Devroey, P., and Van Steirteghem, A. A., Mercader, A., Remohi, J., and Handyside, A. H., Robinson, M. D., Simpson, Clinical experience with preimplantation de los Santos, M. J. Vitrification of R. J., Omar, M. B., Shaw, M. A., Grudzinskas, genetic diagnosis and intracytoplasmic preimplantation genetically diagnosed J. G., and Rutherford, A. Isothermal sperm injection. Hum.Reprod. 1998, 13 human blastocysts and its contribution whole genome amplification from single Suppl 1:186-195. to the cumulative ongoing pregnancy rate and small numbers of cells: a new era per cycle by using a closed device. Fertil. for preimplantation genetic diagnosis Lissens, W., and Sermon, K. Steril. 2008,89:840-846. of inherited disease. Mol.Hum.Reprod. Preimplantation genetic diagnosis: 2004,10:767-772. current status and new developments. Findlay, I., Urquhart, A., Quirke, P., Hum.Reprod. 1997,12:1756-1761. Sullivan, K., Rutherford, A. J., and Lilford, Handyside, A. H., Lesko, J. G., Tarin, J. J., R. J. 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- 55. S E S I Ó N D IE G E N É t I C A t tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 53 following in vitro fertilization. J.Reprod. Van Steirteghem, A., Liebaers, I., and and preimplantation genetic screening Fertil. 1995, 104:165-171. Sermon, K. Preimplantation genetic (PGS)’. Hum.Reprod. 2005,20:35-48. diagnosis for neurofibromatosis type 1. Renwick, P. J., Trussler, J., Ostad- Mol.Hum.Reprod. 2005,11:381-387. Thornhill, A. R., McGrath, J. A., Eady, R. Saffari, E., Fassihi, H., Black, C., A., Braude, P. R., and Handyside, A. H. A Braude, P., Ogilvie, C. M., and Abbs, S. Stachecki, J. J., Cohen, J., and Munne, comparison of different lysis buffers to Proof of principle and first cases using S. Cryopreservation of biopsied cleavage assess allele dropout from single cells preimplantation genetic haplotyping- stage human embryos. Reprod.Biomed. for preimplantation genetic diagnosis. -a paradigm shift for embryo diagnosis. Online. 2005,11:711-715. Prenat.Diagn. 2001, 21:490-497. Reprod.Biomed.Online. 2006,13:110-119. Staessen, C., Platteau, P., Van Assche, Van Landuyt, L., De Vos, A., Joris, H., Rice, J. E., Sanchez, J. A., Pierce, K. E., E., Michiels, A., Tournaye, H., Camus, Verheyen, G., Devroey, P., and Van and Wangh, L. J. Real-time PCR with M., Devroey, P., Liebaers, I., and Van Steirteghem, A. Blastocyst formation in in molecular beacons provides a highly Steirteghem, A. Comparison of blastocyst vitro fertilization versus intracytoplasmic accurate assay for detection of Tay-Sachs transfer with or without preimplantation sperm injection cycles: influence of the alleles in single cells. Prenat.Diagn. genetic diagnosis for aneuploidy fertilization procedure. Fertil.Steril. 2002, 22:1130-1134. screening in couples with advanced 2005,83:1397-1403. maternal age: a prospective randomized Sermon, K., Lissens, W., Nagy, Z. P., controlled trial. Hum.Reprod. 2004, Verlinsky, Y., and Kuliev, A. Current status Van Steirteghem, A., and Liebaers, I. 19:2849-2858. of preimplantation diagnosis for single Simultaneous amplification of the two gene disorders. Reprod.Biomed.Online. most frequent mutations of infantile Staessen, C., Camus, M., Clasen, K., 2003, 7:145-150. Tay-Sachs disease in single blastomeres. De Vos, A., and Van Steirteghem, A. Hum.Reprod. 1995,10:2214-2217. Conventional in-vitro fertilization versus Verlinsky, Y., Rechitsky, S., Schoolcraft, intracytoplasmic sperm injection in W., Strom, C., and Kuliev, A. Spits, C., and Sermon, K. PGD for sibling oocytes from couples with tubal Preimplantation diagnosis for Fanconi monogenic disorders: aspects of infertility and normozoospermic semen. anemia combined with HLA matching. molecular biology. Prenat.Diagn. Hum.Reprod. 1999,14:2474-2479. JAMA. 2001, 285:3130-3133. 2009,29:50-56. Telenius, H., Carter, N. P., Bebb, C. Verlinsky, Y., and Kuliev, A. Progress Spits, C., De Rycke, M., Verpoest, W., E., Nordenskjold, M., Ponder, B. in preimplantation genetics. J.Assist. Lissens, W., Van Steirteghem, A., Liebaers, A., and Tunnacliffe, A. Degenerate Reprod.Genet. 1998,15:9-11. I., and Sermon, K. Preimplantation oligonucleotide-primed PCR: general genetic diagnosis for Marfan syndrome. amplification of target DNA by a Wells, D., and Delhanty, J. D. Fertil.Steril. 2006, 86:310-320. single degenerate primer. Genomics. Comprehensive chromosomal analysis of 1992,13:718-725. human preimplantation embryos using Spits, C., Le Caignec, C., De Rycke, M., Van whole genome amplification and single Haute, L., Van Steirteghem, A., Liebaers, Thornhill, A. R., deDie-Smulders, C. E., cell comparative genomic hybridization. I., and Sermon, K. Optimization and Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. Mol.Hum.Reprod. 2000,6:1055-1062. evaluation of single-cell whole-genome L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, multiple displacement amplification. M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Zhang, L., Cui, X., Schmitt, K., Hubert, Hum.Mutat. 2006, 27:496-503. Sermon, K. D., Wilton, L., and ESHRE R., Navidi, W., and Arnheim, N. Whole PGD Consortium. ESHRE PGD Consortium genome amplification from a single cell: Spits, C., De Rycke, M., Van Ranst, N., Joris, ‘Best practice guidelines for clinical implications for genetic analysis. Proc. H., Verpoest, W., Lissens, W., Devroey, P., preimplantation genetic diagnosis (PGD) Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992, 89:5847-5851.
- 56. Eppendorf® is a registered trademark. All rights reserved, including graphics and pictures. Copyright © 2009 by Eppendorf AG ‡ ICSI ‡ IMSI ‡ Biopsia de cuerpo polar Ahora también Incubadores NBS Competencia en reproducción asistida Tanto para sus aplicaciones en ICSI, IMSI, diagnóstico Micromanipuladores TransferMan NK2 genético preimplatacional o biopsia de cuerpo polar, ‡ Sistema con joystick integrado con control proporcional ¡Eppendorf le ofrece un amplio rango de consumibles para ajuste fino y grueso y equipamiento para su laboratorio de reproducción! ‡ Almacenamiento de posiciones y tecla Home para cambio de capilares Tecnologías innovadoras combinadas con un funciona- miento sencillo para poder realizar complejas técnicas de Microinyectores CellTram micromanipulación de forma fácil, sencilla y fiable. ‡ Sistemas de émbolo libres de mantenimiento ‡ Ergonómicos, fáciles de usar y muy precisos Incubadores de CO2 ‡ Capacidades de 170, 48 y 14 litros Para más información visite ‡ Sistemas por calentamiento directo www.eppendorf.es/celltech ‡ Amplia gama de opciones Eppendorf Ibérica S.L.U. · Avenida Tenerife 2 · Edificio 1 · Madrid · Spain · Tel: +34 91 651 76 94 · Fax: +34 91 651 81 44 E-mail: iberica@eppendorf.es . www.eppendorf.es Application Support: Tel: +49 1803 666 789 · E-mail: support@eppendorf.com
- 57. A U l A V I R t U A l Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 55 CINEMAtOGRAFÍA PARA El EStUDIO DE lA CAlIDAD EMBRIONARIA: EMBRyOSCOPE Javier Herrero, Alberto Tejera, María Cruz, Marcos Meseguer IVI Valencia e-mail: marcos.meseguer@ivi.es INTRODUCCIÓN complejidades técnicas ni logísticas de la primera división embrionaria. (Cummins et al.,1986; Scott, 2003; Las razones por las que existen En las últimas décadas el número de Baczkowski et al, 2004; Lundin et al., variaciones en el momento en que niños nacidos gracias a la fecundación in 2001; Edwards et al 1984; Shoukir et se produce esta división no están vitro (FIV) ha aumentado gradualmente. al., 1997; Salumets et al., 2001). Son claras, podría estar relacionado con Este procedimiento se presenta como necesarios sistemas de clasificación determinadas condiciones del cultivo el tratamiento más eficaz para la fiables en cada etapa del desarrollo o factores intrínsecos del ovocito y del infertilidad, tanto femenina como para poder categorizar la calidad del espermatozoide (Sakkas, 2001). Para masculina (Bergh, 2005). embrión atendiendo a características entender estos artículos hay que definir morfológicas durante el desarrollo primero el término división temprana La mejora tecnológica de las embrionario. Las limitaciones que embrionaria, que es aquella que ocurre herramientas de trabajo junto con los presenta son la evidente subjetividad entre las 25-27 horas post-ICSI dando avances en nuestro conocimiento sobre asociada al criterio del observador y lugar a un embrión de dos células. El la reproducción asistida ha permitido el propio sistema de evaluación, que análisis de este parámetro y su impacto establecer unas tasas satisfactorias de concibe el desarrollo embrionario desde en la tasa de gestación en humanos fue gestación, pero seguimos arrastrando un enfoque estático y rígido. Puede que publicado por primera vez por el grupo una tasa de embarazo múltiple demasiado por este motivo sigamos encontrando de Edwards en 1984 (Edwards et al., elevada (Nyboe Andersen et al., 2004). muchos casos en los que la valoración 1984). Posteriormente muchos estudios En la última década, la reducción del del embrión no concuerda con los han hecho uso de este suceso como base número de embriones transferidos ha resultados clínicos obtenidos. de sus publicaciones (Sakkas, 2001; provocado un descenso en el número Fenwick et al., 2002; Van Montfoort et de embarazos múltiples. Parece obvio Esta tecnología aplicada a la fecundación al., 2004; Lemmen et al., 2008; Scott que los dos factores más influyentes in vitro nos ha permitido ver y analizar et al., 2008). Todos ellos coinciden en en la concepción de una gestación los eventos de la fecundación humana que la transferencia de embriones con múltiple son el número de embriones y la embriogénesis. Sin embargo, la división temprana da lugar a mayores transferidos unido a la calidad de los preocupación por el bienestar del tasas de implantación y embarazo; sin mismos. La transferencia de un único embrión ha limitado la intensidad de la embargo, la mayoría de los estudios embrión se traduce mayoritariamente observación, y el análisis del ritmo de no analizaron transferencias puras de en embarazos únicos pero también crecimiento y los cambios morfológicos embriones con este patrón de división, conlleva un descenso notable en la tasa se han deducido en gran medida a partir por lo que se incluyeron ciclos en los que global de embarazo alcanzada (Bergh, de la apariencia de los embriones en se transfirieron embriones con división 2005; Nyboe Andersen et al., 2004; Van momentos puntuales, generalmente temprana y sin ella. Esto nos lleva a no Royen et al., 1999; Scout et al., 2007). con muchas horas de diferencia. La poder afirmar con seguridad si las tasas Por este motivo necesitamos desarrollar evaluación a través de “fotogramas de implantación y embarazo obtenidas métodos más exactos y objetivos que nos congelados” de los procesos dinámicos pueden ser atribuidas al efecto de la permitan seleccionar el mejor embrión de crecimiento necesariamente división temprana. Varias de estas de la cohorte para transferir basándonos limitan la información disponible publicaciones han demostrado una en su calidad sin que esto suponga un para el observador e inevitablemente correlación positiva entre la división descenso en la tasa de gestación (Lopes puede implicar la pérdida completa de temprana y variables como el número et al., 2007). Algunas de las claves para algunos procesos efímeros. Además, de células y la morfología adecuada. estos nuevos procedimientos deben ser la naturaleza gradual de los cambios la no invasividad de la técnica así como en la morfología celular puede ocultar Cabe destacar el estudio llevado a la obtención de información objetiva y algunos procesos que se hacen evidentes cabo por el grupo de Van Montfoort cuantificable. cuando se condensan en una imagen con en el año 2004, en el que analizó 165 movimiento (Payne et al., 1997). transferencias únicas comparando El método no invasivo de rutina embriones con división temprana y más empleado hasta la fecha para Diversas publicaciones han analizado división tardía. En el grupo de división determinar la calidad de los embriones la calidad embrionaria apoyándose temprana la tasa de formación de es la evaluación morfológica mediante en el análisis del ritmo de división de blastocisto aumentó, obtuvo mayores microscopio óptico invertido. Esta los embriones como complemento a tasas de gestación y por el contrario técnica es específica, sensible e inocua la morfología, si bien la mayoría de la de aborto se redujo (Van Montfoort y además no conlleva demasiadas éstas se han centrado en el examen et al., 2004). El problema de este
- 58. A U lt I t UR t U A l A V I l O Javier Herrero et al. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías 56 estudio una vez más es que la selección del embrión para la transferencia se basó en la morfología y número de blastómeras el día de la transferencia y no en la condición de ser embriones con división temprana. La crítica a todos estos trabajos y por extrapolación a los métodos actuales de evaluación embrionaria radica en la observación del embrión en momentos predeterminados para confirmar si se ha producido un determinado fenómeno, pero no son capaces de establecer el momento exacto en que éste ha ocurrido. Por otro lado, estos métodos se basan en características cualitativas, de presencia o ausencia, pero no son capaces de utilizar el timing embrionario como una herramienta cuantitativa, es decir, establecer la importancia no sólo de que haya ocurrido el fenómeno Figura 1. Fotografía de la versión D de EmbryoScopeTM sino de en qué preciso momento haya ocurrido. La evaluación puntual del embrión, por tanto, se traduce en una y el pronúcleo masculino y femenino (Visiopharm, Hørsholm, Denmark), enorme pérdida de información de durante las observaciones. Además, no con el objetivo de identificar todo lo que ocurre antes y después del es posible determinar el momento exacto marcadores relacionados con momento analizado. La solución a esta de eventos como la descondensación calidad embrionaria e implantación. limitación en la información debido a las de la cabeza espermática, extrusión del Observaron que los embriones que herramientas estáticas que poseemos segundo corpúsculo polar y formación implantan tienen una desaparición pasa por el desarrollo de nuevas técnicas de los pronúcleos usando este sistema de pronúcleos y primera división más que sean capaces de registrar y concebir de observaciones de puntos fijos. La tempranas así como un mayor número todo el desarrollo embrionario como el cinematografía mediante video time- de células en día 2 de desarrollo proceso dinámico que es. lapse supera las limitaciones que presenta embrionario. Asimismo existía una la observación intermitente, gracias a asociación entre la sincronía en la TECNOLOGíA TIME-LAPSE APLICADA A LA la obtención de imágenes con mayor aparición de los núcleos en las dos EVALUACIóN EMBRIONARIA resolución y de forma continua en las blastómeras formadas después de la que los distintos componentes celulares primera división y una mayor tasa de Bajo el nombre de análisis de imagen, se pueden reconocer y seguir durante embarazo (Lemmen et al., 2008). time-lapse o cinematografía han todo el período grabado. Los autores aparecido en el mercado en los últimos desarrollaron un sistema que mantiene los Más recientemente se ha desarrollado años nuevos equipos de captura de ovocitos y embriones bajo condiciones de un sistema basado en los incubadores imagen acoplados de diferente manera cultivo convencionales y graba imágenes convencionales tri-gas que incorpora a microscopios. Paralelamente al de video time-lapse de alta calidad usando un sistema de captura de imagen cuyo avance digital se han desarrollado óptica de contraste interdiferencial nombre comercial es EmbryoScopeTM nuevos y más potentes programas de Nomarski. Los ovocitos inseminados (Unisense FertiliTech, Aarhus, Denmark) procesamiento de imágenes, facilitando por ICSI son ideales para este tipo de (figura 1). Los primeros modelos se el uso de este tipo de herramientas que estudios, ya que las células del cumulus basaban en la toma de imágenes en anteriormente estaban restringidas a han sido eliminadas previamente, los tiempo real y el registro de su consumo complejos y costosos equipos dotados tipos citoplasmáticos de los ovocitos de oxígeno mediante microsensores. de potentes ordenadores. son claramente visibles y el momento El conjunto de estas dos aplicaciones exacto de la penetración espermática es generaba unas determinaciones únicas Nagy et al. en 1994 describieron el conocido (Payne et al., 1997). relacionando la actividad metabólica con desarrollo temporal de la fecundación los tiempos de división. Las versiones en ovocitos humanos después de la El grupo de Lemmen, en el año 2008, actuales del sistema se centran en la microinyección intracitoplasmática. Los implementó el cultivo embrionario captura de imágenes con alta resolución ovocitos se observaron cada 2 horas, con un sistema de captura de mediante tecnología time-lapse. Se pero los investigadores reconocieron que imágenes time-lapse consistente en puede visualizar el estado actual del hubo problemas a la hora de identificar un microscopio Nikon Diaphot 300 embrión sin necesidad de sacar la placa el primer y segundo corpúsculo polar con cámara en un sistema cerrado del incubador minimizando de este
- 59. A U l A t IV I R t U A l tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 57 haber introducido las placas en el EmbryoScope. El tiempo se registra tomando como punto de partida el momento de la microinyección espermática. El programa busca automáticamente los pocillos de cada placa y los planos focales más informativos para obtener imágenes de cada embrión. Las imágenes son capturadas con una cámara monocromática de 1280 x 1024 pixels con óptica Leica de 200 aumentos, obteniendo una resolución final de 3 pixels por micra. La fuente de iluminación consiste en un led rojo, dado que la cámara está diseñada para trabajar con una longitud de onda de 635 nm durante 0,3 segundos por imagen. Figura 2. Análisis del desarrollo embrionario de 3 embriones de una cohorte embrionaria mediante El tiempo total de exposición a la luz es EmbryoScope. El programa permite realizar anotaciones en cada fotograma del vídeo quedando vinculadas a ese tiempo exacto. inferior a 50 segundos por día y embrión. El tiempo necesario por embrión para obtener una imagen es inferior a 10 modo la manipulación de los embriones, desventajas como la formación necesaria segundos incluido el enfoque. lo que podría ayudar a mantener intacto para reducir el tiempo requerido para el potencial de cada embrión. la preparación de las placas o para la El número de planos focales en cada realización de las anotaciones en el visor imagen tomada y el intervalo de La suma de fotogramas genera una de embriones, o bien problemas técnicos tiempo entre cada una de ellas es grabación que permite visualizar el como la eliminación de burbujas. preprogamable pero suele oscilar desarrollo embrionario de manera entorno a los 15 minutos. La suma continua (figura 2). De este modo se MATERIAL Y MéTODOS de fotogramas de cada embrión registra cada uno de los eventos que genera una grabación que permite suceden durante el cultivo, aportando Las condiciones de cultivo en el visualizar el desarrollo embrionario precisión, certeza y objetividad al EmbryoScope son programables de la de manera continua permitiendo criterio del observador (Lemmen et misma forma que en los incubadores evaluar los procesos como la aparición al., 2008). Esto supone un gran avance convencionales. Dispone de un programa y desaparición de pronúcleos, las conceptual en la valoración de la que registra continuamente los valores divisiones embrionarias, fragmentación calidad embrionaria, al permitir evaluar de temperatura y concentración de gases celular, multinucleación, mediciones procesos del desarrollo embrionario en tiempo real, generando una gráfica del diámetro del ovocito o embrión frente a estadios del embrión. que refleja sus fluctuaciones durante el y grosor de la zona pelúcida en cada tiempo de incubación. Los archivos con momento de la grabación. El uso de este sistema de trabajo en el los parámetros de incubación registrados laboratorio de fecundación in vitro implica de cada paciente son almacenados ESTUDIOS LLEVADOS A CABO mejoras en cuanto a las condiciones de automáticamente para poder ser cultivo de los embriones y la cantidad revisados en cualquier momento. 1. Validación clínica del uso del de información que obtenemos de ellos, EmbryoScope como incubador para los lo que debería traducirse en una mejora El EmbryoScope tiene una capacidad de ciclos de reproducción asistida de los resultados clínicos. No obstante 6 placas especiales con tapa estéril. Cada se presentan otra serie de beneficios en placa posee un pocillo central común que Nuestro grupo evaluó si el EmbryoScope lo que se refiere a la rutina de trabajo consta de 12 pocillos individualizados (ES) proporciona un ambiente adecuado del laboratorio como el ahorro de de 25 μl cada uno, pudiendo cultivarse para el desarrollo embrionario de tiempo al disminuir considerablemente y analizarse un máximo de 72 embriones calidad similar al proporcionado por el la manipulación de los embriones y no simultáneamente. Cada pocillo individual incubador convencional (IC). Para ello tener que acceder al laboratorio para su presenta una depresión central de unos comparamos un total de 77 ciclos de ICSI evaluación; la disminución de los costes 250 μm de diámetro llamada micropocillo. llevados a cabo en ES y se compararon de producción al reducir el consumo de con 279 ciclos de ICSI en IC, todos ellos medios, placas de cultivo, aceite mineral CAPTURA DE IMAGEN EN EL EMBRYOSCOPE realizados en el Instituto Valenciano y gases medicinales; y de espacio por de Infertilidad de Valencia. El análisis el tamaño del incubador. Sin embargo, La obtención de imágenes se consistió en un estudio retrospectivo esta tecnología plantea también algunas inicia inmediatamente después de de cohortes emparejadas, es decir,
- 60. A U lt I t UR t U A l A V I l O Javier Herrero et al. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías 58 por cada paciente cuyos embriones criterio de exclusión para los hombres de embriones transferidos; o 0% de obtenidos por ICSI se introdujeron en para este estudio fue la presencia implantación (n= 356) donde no se ES, se buscó otra u otras pacientes de factor masculino severo (menos alcanzó ni embarazo bioquímico. El con los mismos criterios de inclusión de 5 millones de espermatozoides tiempo se clasificó en cuartiles y se y exclusión cuyos embriones se habían móviles en el eyaculado). Las donantes agrupó en 2 categorías; la primera introducido en el IC. Se compararon tuvieron entre 18 y 35 años sin definida por los 2 cuartiles centrales las Tasas de Gestación Clínica (TGC) exposición a radiación actual en el (IN) y la segunda que incluye el resto y la Tasas de Gestación Evolutiva pasado o sustancias químicas nocivas, de datos (OUT). La implantación se (TGE) en las pacientes incluidas en sin consumo de drogas, sin historial comparó entre las 2 categorías por ambos sistemas. Se comprobó que familiar de enfermedades hereditarias un test Chi-cuadrado. Las variables los valores obtenidos de las variables o cromosómicas y con cariotipo normal. analizadas fueron; t2 (tiempo de la 1ª analizadas en ambos grupos no diferían Todas ellas tenían ciclos menstruales división), t3 (tiempo de la 2ª división), significativamente para evitar que normales de 26-34 días de duración, t4 (tiempo de la 3ª división), t5 (tiempo alteren las comparaciones de TGC y TGE peso normal (MCI 18-28 kg/m2) y sin de la 4ª división), cc2 (duración del 2º en ambas categorías. Estas variables tratamientos endocrinos (incluidas ciclo celular definido como cc2 = t3-t2) fueron: edad media de las pacientes, gonadotropinas y anticonceptivos y s2 (sincronía entre la 2ª y 3ª división número de ovocitos recuperados, orales) en los 3 meses precedentes al embrionaria definido como s2= t4-t3). tratamiento hormonal utilizado, estudio. número de embriones transferidos, 4. Construcción de un modelo porcentaje de abortos y porcentaje de Los eventos seleccionados del desarrollo multivariable para predecir la embriones de buena calidad. embrionario fueron las divisiones implantación basado en el análisis de Con los datos obtenidos se realizó embrionarias desde el cigoto hasta el la morfocinética por time-lapse. un análisis estadístico mediante el embrión de 8 células, la compactación test de Fischer, utilizando el paquete de la mórula y la formación del Se monitorizó el desarrollo de 247 estadístico SPSS 17. Se consideraron blastocisto. embriones transferidos de 286 parejas. estadísticamente significativos los Todas las parejas se encontraban bajo datos con p-valor <0,05. 3. Determinación de los rangos de su primer ciclo de ICSI. De los 522 tiempo óptimos de eventos clave embriones transferidos seleccionamos 2. Descripción de los tiempos durante el desarrollo embrionario por 247 basándonos de nuevo en que exactos de los principales eventos medio de cinematografía time-lapse. presentaran un 100% de implantación del desarrollo embrionario mediante (n= 61) o 0% de implantación (n= 192). el análisis por time-lapse de 1340 Se analizó el desarrollo de 885 Se identificaron los tiempos exactos de embriones humanos embriones transferidos de 487 parejas. la 1ª (paso a 2 células) (t2), 2ª (paso a Se seleccionaron 467 para realizar 3 células) (t3), 3ª (paso a 4 células) (t4) Se monitorizó el desarrollo de 1340 análisis detallados basándonos en que y 4ª (paso a 5 células) (t5) divisiones embriones de 210 parejas incluidas presentaran un 100% de implantación embrionarias. También se calcularon en nuestro programa de donación (n= 111) donde el número de sacos los valores de cc2 (t3-t2) y s2 (t4- de óvulos desde septiembre de 2009 gestacionales confirmados por t3). Asimismo definimos patrones hasta noviembre de 2010. El único ultrasonido cuadraba con el número morfológicos relacionados con el Variable analizada IC ES p-valor Test estadístico Nº tratamientos con transferencia 279 77 Edad media (años) 34.5±3.6 34.2±3.7 0.5 t- student Nº medio de ovocitos aspirados 11.1 11.7 0.17 Mann-whitney U-test. Nº transferencias únicas 65 (23%) 20 (26%) 0.65 Fisher Nº transferencias dobles 197 (71%) 53 (69%) 0.78 Fisher Nº transferencias triples 17 (6%) 4 (5%) 1 Fisher Abortos (%) 33 (12%) 11 (14%) 0.56 Fisher Dosis media FSH (pg/ml) 1777 1713 0.30 Mann-whitney U-test. Dosis media LH (pg/ml) 161 108 0.19 Mann-whitney U-test. Media de embriones de alta calidad 3.57 3.9 0.15 t- student Tabla I. Variables comparadas entre pacientes cuyos embriones fueron cultivados en el ES o en el IC.
- 61. A U l A t IV I R t U A l tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 59 desarrollo embrionario tales como; Variable Test IC ES p-valor analizada estadístico División directa de cigoto a embrión de TGC 165 (59%) 49 (64%) 0.51 Fisher 3 blastómeras, definido como t3-t2<5 horas. TGE 138 (49%) 42 (55%) 0.44 Fisher Tamaño desigual de las blastómeras en Tabla II. Resultados de los ciclos de ICSI en base a los datos de gestación conocidos. el estadio de 2 células. Multinucleación en el estadio de 4 células, cuando se distingue más de un núcleo en una o más blastómeras. RESULTADOS 1. Validación clínica del uso del EmbryoScope como incubador para los ciclos de reproducción asistida La tabla I muestra las medias, el p-valor y el test estadístico utilizado para las variables analizadas. No se observaron diferencias significativas para ninguna de las variables estudiadas entre los dos Gráfico 1. Valores de las TGC y TGE obtenidas con ambos incubadores. Se observa una ligera mayor grupos considerados (p-valor >0.05) TGC (59% IC vs 64% ES) y de TGE (49% IC vs 55% ES) para el EmbryoScope, aunque esta diferencia no es significativa. En la tabla II se muestran la comparación de la TGC y TGE para los embriones cultivados en ES y en IC. IC 95% Variable Media Límite Límite Mínimo Máximo No se observan diferencias significativas en los resultados de los ciclos de ICSI inferior superior realizados en ambos incubadores. 1ª división Sin embargo, sí que se observa en la 26,10 25,47 26,73 20,40 35,56 (a 2 células) siguiente figura (Gráfico 1) que tanto la TGC como la TGE tuvieron valores 2ª división 36,27 35,35 37,19 24,08 44,45 ligeramente superiores en el ES. (a 3 células) 3ª división 2. Descripción de los tiempos 38,02 37,05 38,99 24,74 48,23 (a 4 células) exactos de los principales eventos del desarrollo embrionario mediante 4ª división 48,95 47,56 50,33 35,64 64,44 el análisis por time-lapse de 1340 (a 5 células) embriones humanos 5th cleavage 52,05 50,78 53,32 39,55 66,41 (a 6 células) La tabla III incluye el mínimo, máximo y media con el intervalo de confianza 6th cleavage para las variables seleccionadas. 54,39 53,01 55,77 39,55 69,75 (a 7 células) 3. Determinación de los rangos de 7th cleavage 58,41 56,82 60,01 39,55 73,08 tiempo óptimos de eventos clave (a 8 células) durante el desarrollo embrionario por Compactación medio de cinematografía time-lapse. 85,61 84,80 86,42 70,22 99,65 de la mórula De los 885 embriones transferidos, un Formación del 97,68 96,65 98,71 79,94 115,65 total de 318 implantaron (35,9%). La blastocisto tasa de embarazo bioquímico fue 54,2% (n=264) y la tasa de embarazo evolutivo Tabla III. Resultados de los análisis realizados sobre las divisiones embrionarias desde el cigoto hasta el 46,8% (n=228). La tabla IV muestra embrión de 8 células, la compactación de la mórula y la formación del blastocisto
- 62. A U lt I t UR t U A l A V I l O Javier Herrero et al. Aplicación del array-CGH en el screening de aneuploidías 60 Evento t2 t3 t4 t5 cc2 s2 Rango (h) (IN) 24,49-28,3 35,58-40,6 36,65-41,9 49,51-56,7 <11,99 <0,67 Implantados (%) 28,9 29,6 28,1 32,2 28,2 28,2 p 0,008 0,003 0,036 < 0,001 0,032 0,039 N 111 111 111 106 111 111 Tabla IV. Valores obtenidos para las variables analizadas los valores límites del rango central Con estos datos definimos un modelo se asumían como verdades absolutas (IN), el porcentaje de los embriones jerárquico con el correspondiente árbol en embriología. Estamos convencidos implantados dentro de este rango así de decisión en el que categorizamos los de que en los próximos años vamos como el p valor de la comparación con embriones en 5 categorías de A a E con un a re-escribir la embriología clínica y los implantados en la categoría OUT símbolo extra positivo (+) o negativo (-). será difícil encontrar un laboratorio (p) y el tamaño muestral (N) para cada donde la tecnología del time-lapse en evento analizado. DISCUSIÓN cualquiera de sus presentaciones no esté disponible. 4. Construcción de un modelo Los sistemas de clasificación multivariable para predecir la embrionaria actuales están basados A partir de la aparición del time-lapse implantación basado en el análisis de en análisis puntuales realizados definimos dos conceptos nuevos, el la morfocinética por time-lapse. normalmente en horario vespertino y concepto de cinética y el concepto de que utilizan una valoración morfológica dinámica morfológica. En el primero Un total de 201 embriones sujeta a cierta subjetividad. Además (cinética) englobamos los tiempos en consiguieron una correcta el análisis morfológico actual implica los que se producen los eventos más implantación (saco gestacional), una “manipulación” embrionaria, importantes del desarrollo embrionario, dando lugar a un 38,5% de tasa de entendiendo como tal la necesidad de divisiones fundamentalmente. En implantación. La tasa de embarazo sacar el embrión del incubador para el segundo (dinámica morfológica) bioquímico fue un 55,1% (n=157) y su observación en el microscopio de incluimos todos aquellos fenómenos del la tasa de embarazo evolutivo 49,8% contraste de fases; este procedimiento desarrollo embrionario solo observables (n=142). Un total de 50 embriones sin duda alteraría las condiciones o ponderables con la tecnología presentaron división directa de cigoto de cultivo óptimas para el embrión, propuesta, como por ejemplo la división a 3 células (t3-t2<5 horas) (n=9) o con cambios en la temperatura y directa a tres células de un embrión. tamaño desigual de las blastómeras posiblemente en el pH del medio. en el estadio de 2 células (n=26) o Los datos generados hasta la fecha multinucleación en el estadio de 4 Gracias a los avances tecnológicos nos han permitido por un lado conocer células (n=28). De estos 50 embriones actuales, un gran número de técnicas cuáles son los tiempos habituales en sólo 4 implantaron (8%). Por medio están disponibles y muchas de ellas los que los fenómenos del desarrollo de análisis de regresión logística aplicables al proceso de selección embrionario más importantes se seleccionamos y organizamos aquellas embrionaria y su mejora. Entre ellas producen. Por otro lado hemos variables binarias relacionadas con destacan las ómicas, en su mayoría observado diferencias en los tiempos los tiempos exactos para ser usadas centradas en el estudio de los de las divisiones de los embriones junto con los criterios morfológicos metabolitos secretados o eliminados que implantaron y de los que no, es de exclusión. El modelo definió t5 por el embrión. Dentro de estos avances decir presentan un comportamiento OR=3,31 (IC 95% 1,65-6,66) seguido tecnológicos englobamos la tecnología diferencial que nos permite utilizar por cc2 OR= 1,84 (IC 95% 0,95-3,58) y del time-lapse o cinematografía estas variables para seleccionar el s2 OR=2,04 (IC 95% 1,03-4,07) como embrionaria. Esta no es una técnica mejor embrión. Gracias al desarrollo aquellas variables más relevantes nueva; al contrario, tiene años de de este proyecto presentamos un para identificar a los embriones existencia aunque recientemente se algoritmo de clasificación embrionaria implantados. han dado pasos importantes con la que combina los conceptos de cinética automatización, que han permitido y dinámica morfológica; éste nos Mediante el uso de las variables de generar casuísticas importantes en un permitirá seleccionar el mejor embrión. exclusión más t5, cc2 y s2 definimos corto periodo de tiempo. el modelo de regresión logística. El REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS análisis de la curva ROC para determinar Mediante la cinematografía estamos las propiedades predictivas de este aprendiendo nuevos conceptos ASEBIR 2008. Cuadernos de embriología modelo con respecto a la probabilidad relacionados con la embriología, a la clínica. Criterios ASEBIR de valoración de implantación presentó un valor ROC par que descartando o desestimando morfológica de oocitos, embriones de 0,720 (IC 95% 0,64-0,80). algunos conceptos que hasta ahora tempranos y blastocistos humanos. 2º Ed.
- 63. A U l A t IV I R t U A l tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 61 Baczkowski T, Kurzawa R, Glabowski W. bovine embryos produced in vivo and in of human embryo quality. Hum Reprod. Methods of embryo scoring in in vitro vitro and correlation with viability following 2001;16:2177-2181. fertilization. Reprod Biol. 2004;4:5-22. transfer. Hum Reprod. 2007;22:558-566. Scott L, Berntsen J, Davies D, et al. Bergh C. Single embryo transfer: A mini- Lundin K, Bergh C, Hardarson T. Early Symposium: Innovative techniques in review. Hum Reprod. 2005;20:323-327. embryo cleavage is a strong indicator of human embryo viability assessment. human embryo quality in human IVF. Hum Reprod. oocyte respiration-rate measurement-- Cummins JM, Breen TM, Harrison KL, et al. A 2001;16:2652-2657. potential to improve oocyte and embryo formula for scoring human embryo growth selection? Reprod Biomed Online. rates in in vitro fertilization: Its value in Nagy, Z.P., Liu, J., Joris, H. et al. (1994) Time- 2008;17:461-469. predicting pregnancy and in comparison course of oocyte activation, pronucleus with visual estimates of embryo quality. J In formation and cleveage in human oocytes Scott L, Finn A, O’Leary T, et al. Morphologic Vitro Fert Embryo Transf. 1986;3:284-295. fertilized by intracitoplasmic sperm parameters of early cleavage-stage embryos injection. Hum Reprod., 9, 1743-1748. that correlate with fetal development and Dianna Payne, Sean P.Flaherty, Michael delivery: Prospective and applied data for F.Barry and Colin D.Matthews Preliminary Nyboe Andersen A, Gianaroli L, increased pregnancy rates. Hum Reprod. observations on polar body extrusion and Nygren KG, European IVF-monitoring 2007;22:230-240. pronuclear formation in human oocytes using programme, European Society of Human time-lapse video cinematography. Human Reproduction and Embryology. Assisted Scott L. The biological basis of non- Reproduction 1997;12:532–541. reproductive technology in europe, invasive strategies for selection of human 2000. results generated from european oocytes and embryos. Hum Reprod Update. Edwards RG, Fishel SB, Cohen J, et al. Factors registers by ESHRE. Hum Reprod. 2003;9:237-249. influencing the success of in vitro fertilization 2004;19:490-503. for alleviating human infertility. J In Vitro Fert Shoukir Y, Campana A, Farley T, et al. Early Embryo Transf. 1984;1:3-23. Sakkas D, Percival G, D’Arcy Y, et al. cleavage of in-vitro fertilized human Assessment of early cleaving in vitro embryos to the 2-cell stage: A novel Fenwick J, Platteau P, Murdoch AP, et al. Time fertilized human embryos at the 2-cell indicator of embryo quality and viability. from insemination to first cleavage predicts stage before transfer improves embryo Hum Reprod. 1997;12:1531-1536. developmental competence of human selection. Fertil Steril. 2001;76:1150-1156. preimplantation embryos in vitro. Hum Van Montfoort AP, Dumoulin JC, Kester AD, Reprod. 2002;17:407-412. Sakkas D, Shoukir Y, Chardonnens D,et et al. Early cleavage is a valuable addition al. Early cleavage of human embryos to to existing embryo selection parameters: A Lemmen JG, Agerholm I, Ziebe S. Kinetic the two-cell stage after intracytoplasmic study using single embryo transfers. Hum markers of human embryo quality using time- sperm injection as an indicator of embryo Reprod. 2004;19:2103-2108. lapse recordings of IVF/ICSI-fertilized oocytes. viability. Hum Reprod. 1998;13:182-187. Reprod Biomed Online. 2008;17:385-391. Van Royen E, Mangelschots K, De Neubourg Salumets A, Hyden-Granskog C, Suikkari D, et al. Characterization of a top quality Lopes AS, Madsen SE, Ramsing NB, et al. AM, et al. The predictive value of pronuclear embryo, a step towards single-embryo Investigation of respiration of individual morphology of zygotes in the assessment transfer. Hum Reprod. 1999;14:2345-2349.
- 66. S E S I Ó t I t U lD E B A t E N D E O 64 EMBRIÓlOGOS ClÍNICOS: ¿SOMOS REAlMENtE lO qUE qUEREMOS SER? Antonio Urries Reproducción Asistida Quirón Zaragoza e-mail: aurries.zar@quiron.es Esta ponencia está realizada con el fin único de promover un Debate. Ni el planteamiento ni las conclusiones son en modo alguno oficiales de ninguna sociedad científica, ni colegio profesional, aunque están basadas en aspectos legales y estatutarios extraídos de ellas. A lo largo de la ponencia se presentarán los resultados de la encuesta enviada a los socios de ASEBIR sobre nuestra situación profesional. Por ello, el enfoque de esta charla es en una situación de vacío legal, de INTRODUCCIÓN doble. Por un lado intentar delimitar indeterminación. en qué situación nos encontramos Han pasado ya 23 años desde que dentro de nuestras unidades (para Pero ello no significa que debamos apareciera la primera ley española lo cual espero hayáis contestado a la renunciar a nuestras competencias. sobre Técnicas de Reproducción Asistida encuesta que os remitimos) y por otro Ningún tribunal podría negarle a un Humana, la Ley 35/1988 de 22 de lado analizar que es lo que podemos profesional con 20 años de experiencia Noviembre. esperar de la legislación actual, tanto en reproducción asistida humana, aún en positivo como en negativo. sin tener un diploma de cualificación ni Desde entonces muchas han sido especialidad definida, su competencia las Leyes y Reales Decretos que han DISCUSIÓN como facultativo en la materia. Esto ido apareciendo con la intención de incluso tiene su propio término legal. normalizar tanto los aspectos legislativos ¿QUé SOMOS, RATONES O CONEJOS? Y si se diera el caso, nuestros Colegios como ejecutivos de nuestra actividad. Profesionales deberían ser los que Somos Facultativos y Licenciados nos defendieran. Es su papel. No nos De igual modo las Sociedades Sanitarios. Se nos reconozca o no, olvidemos que son entidades públicas, Científicas, pero sobre todo los Colegios estamos ejerciendo de ello. reconocidas, que presentan en exclusiva Profesionales que nos representan a la representación de la profesión. nivel profesional, intentan desde sus Un concepto tan simple engloba un competencias normalizar y protocolizar significado muy complejo. No en cuanto ¿POR QUé QUIERO SER UN FACULTATIVO? nuestra actividad profesional mediante a la definición del término sino a lo que la emisión de estatutos y acreditaciones en sí puede llevar a significar nuestro De entrada porque no nos queda otro varias en un intento de defensa de reconocimiento como Facultativos remedio. nuestras atribuciones profesionales, como veremos más adelante. competencias y responsabilidades. El Real Decreto 1277/2003 de Por definición un Facultativo es el que tiene autorización de centros en su ANEXO El resultado final es un barullo facultad para ejercer una determinada II Definiciones de centros, unidades legislativo, ejecutivo, de competencias actividad y en la función pública está asistenciales y establecimientos y facultades, de distribución de reconocida administrativamente como sanitarios, Oferta asistencial, apartados responsabilidades, que nadie tiene aquellos licenciados universitarios que se U27 a U33, delimita claramente la claro, empezando por nosotros mismos, encuentran en posesión de un título oficial distribución de responsabilidades frente al que cada cual subsiste como de especialista en Ciencias de la Salud. dentro de cada Unidad Asistencial: sabe o puede. Y esto, en un campo con un marcado carácter multidisciplinar Hay facultativos con formación médica (textual) como es el nuestro, origina que cada pero también facultativos en biología, uno intente arrimar el ascua a su sardina química, física,… trabajando en el área U.27 Inseminación artificial: Unidad de una forma más o menos interesada. Sanitaria. asistencial que bajo la responsabilidad de un médico especialista en Obstetricia Conclusión: ¿sabéis realmente cada Todos coincidiremos en que, por y Ginecología, tiene como finalidad uno de vosotros cuales son vuestras concepto, nosotros seríamos uno de la fecundación humana mediante competencias? ¿Estáis seguros de no ellos y nuestros Colegios Profesionales inseminación artificial… estar cometiendo una dejación de nos avalarían en ello. funciones que pudieran tener incluso U.28 Fecundación in vitro: Unidad responsabilidad legal? ¿Tenéis claro de El problema reside en que al no tener asistencial que bajo la responsabilidad quién es la responsabilidad frente a una reconocida nuestra profesión ningún de un médico especialista en Obstetricia infracción dentro de la unidad? titulo de especialista, nos encontramos y Ginecología y un facultativo con
- 67. S E S I Ó N t ID E D E B A t E tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 65 formación y experiencia en biología de Pero la más importante, la U.28 nos han metido, queriendo o sin la reproducción, tiene como finalidad la Fecundación in vitro indica claramente querer, en un callejón sin salida, fecundación mediante transferencia de que es una unidad asistencial de indicándonos en sus estatutos embriones… responsabilidad compartida entre atribuciones y obligaciones un médico especialista en Obstetricia profesionales en nuestra actividad que U.29 Banco de semen: Unidad y Ginecología y un facultativo con muchas veces no venimos realizando de asistencial que, bajo la responsabilidad formación y experiencia en biología forma habitual, por desconocimiento o de un facultativo, tiene como finalidad de la reproducción. O sea, nosotros, simplemente porque “no nos dejan”. la obtención, evaluación, conservación ya que a mí ya no me cabe duda de y distribución de semen humano que somos claramente facultativos, Por ejemplo ¿Nunca os habéis para su utilización en las técnicas de ya que esa es la labor que estamos preguntado en quien recae la reproducción humana asistida… realizando. responsabilidad de algo tan simple como indicar si en un ciclo de FIV se U.30 Laboratorio de semen para ACORDAROS PARA EL FUTURO: realiza ICSI o no? Pues creo que os capacitación espermática: Unidad LEY 14/2006 SOBRE TéCNICAS DE sorprendería la respuesta emitida al asistencial que, bajo la responsabilidad REPRODUCCIÓN HUMANA ASISTIDA. respecto por la asesoría jurídica de de un facultativo, lleva a cabo la ASEBIR/SEF. adecuación de los espermatozoides Y hay otro aspecto de la actual para su función reproductora. legislación que, bajo mi punto de vista, ¿Sabíais que en los estatutos de la apoya esta tesis. mayoría de los Colegios Profesionales U.31 Banco de embriones: Unidad se indica la obligatoriedad de la asistencial que, bajo la responsabilidad La Ley 14/2006, en su Capítulo VIII, firma de los trabajos profesionales de un facultativo, se encarga de la artículo 25 indica claramente que de las realizados por parte de los colegiados, crioconservación de embriones para diferentes infracciones que se puedan responsabilizándose de su contenido transferencia… realizar será responsable su autor. y oportunidad, incluso cuando éste sea coautor del mismo junto a otros U.32 Recuperación de ovocitos: Unidad Si nosotros realizamos las técnicas profesionales de otras titulaciones? asistencial que, bajo la responsabilidad de biología de la reproducción de un facultativo, se encarga de la en las Unidades asistenciales ¿Conocíais que la Ley 41/2002 sobre realización de las actividades precisas U.28, evaluamos, conservamos y derechos y obligaciones en materia para la obtención y el tratamiento de distribuimos el semen humano en las de información y documentación gametos… U.29, capacitamos el semen en las clínica insiste en la obligatoriedad U.30, crioconservamos los embriones de que cada miembro de un equipo U.33 Planificación familiar: Unidad en las U.31 y tratamos los gametos multidisciplinar facilite al paciente asistencial que, bajo la responsabilidad en las U.32 y, además, la ley nos hace la información relativa de la técnica o de un médico especialista en Obstetricia responsables de cualquier infracción procedimiento que se vaya a realizar? y Ginecología es responsable de prestar que se pueda realizar…estamos ¿Informáis vosotros al paciente servicios de atención y asesoramiento ejerciendo de Facultativos. sobre lo que vais a hacer en vuestra relacionados con la reproducción, unidad asistencial, de la que sois concepción y contracepción humana. Y pensar…¿Qué pasaría si en estos responsables? ¿Firmáis los informes? momentos recibiéramos una inspección Si lo analizamos, resulta que sólo otorga de sanidad en nuestras unidades ¿Sabíais que como componentes responsabilidad única a un médico asistenciales y preguntaran dónde está el de un equipo biomédico somos especialista en Obstetricia y Ginecología Facultativo con formación y experiencia corresponsables de la violación en la U.27 Inseminación artificial. en biología de la reproducción? No estaría del secreto de identidad de los (obvio, ya que correspondería a una mal que ocurriera. O regularizaban donantes…, de una posible mala consulta de ginecología), aunque esta nuestra situación o deberían cerrarnos práctica en la realización de la T.R.A. unidad asistencial se complementaría los centros. o en el tratamiento de los materiales con la U.30 Laboratorio de semen para biológicos correspondientes…, en la capacitación espermática, en la que ya FACULTATIVOS A LA PLANCHA omisión de información de las técnicas no indica la obligatoriedad de que el a realizar…, en la posible transmisión responsable sea un ginecólogo, sino Realizamos la actividad, somos a los descendientes de enfermedades un facultativo. Lo mismo ocurre con la responsables frente a cualquier congénitas o hereditarias evitables… ? U.29 Banco de semen y la U.31 Banco de infracción,…y muchas veces sin embriones. tener el control de cómo realizamos Así que ojo con pensar que no tenemos esa actividad de la que somos ninguna responsabilidad sobre la Es curioso que en la U.32 Recuperación responsables. forma en que se realiza la actividad de ovocitos tampoco obligue que la en nuestra unidad y que sólo debe de responsabilidad recaiga sobre un Y allí nuestras propias Sociedades interesarnos lo que ocurre de puertas ginecólogo, sino sobre un facultativo. Científicas y Colegios Profesionales adentro de nuestro laboratorio.
- 68. S E S I Ó t I t U lD E B A t E N D E O Antonio Urries. Embriólogos Clínicos: ¿Somos realmente lo que queremos ser? 66 Todos nos atribuyen esas obligaciones y nos pueden decir que nunca lo hemos Biólogos de Aragón, y su publicación en el responsabilidades. La legislación actual hecho ni puesto la menor intención en “Boletín Oficial de Aragón”. en todas las leyes y reales decretos hacerlo. vigentes actualmente, el propio ASEBIR REAL DECRETO 413/1996, de 1 de marzo, por en su definición de Competencias No pretendo con esta charla indicar el que se establecen los requisitos técnicos dentro del proyecto de Especialidad a nadie cómo debe de realizar su y funcionales precisos para la autorización en Embriología Clínica y los Colegios trabajo, pero si mostraros como las y homologación de los centros y servicios Profesionales en sus estatutos actuales normativas, a pesar de lo que sanitarios relacionados con las técnicas de reguladores del ejercicio profesional, parece, son suficientemente claras reproducción humana asistida. dentro de los derechos y deberes de los sobre lo que podemos y debemos (o colegiados y de los principios básicos deberíamos) hacer. REAL DECRETO 1277/2003, de 10 de octubre, reguladores del ejercicio profesional. por el que se establecen las bases generales Por ello, mientras nuestros Colegios sobre autorización de centros, servicios y Y no nos olvidemos de que ASEBIR es Profesionales y Sociedades Científicas establecimientos sanitarios. una sociedad científica, privada, pero intentan conseguir una normativa, los Colegios Profesionales son entidades legislativa y ejecutiva, bien definida, LEY 35/1988, de 22 de noviembre, sobre públicas con total competencia a nivel deberíamos plantearnos cada uno Técnicas de Reproducción Asistida. profesional, con capacidad jurídica y de nosotros, embriólogos clínicos, sancionadora, que frente a infracciones especialistas en reproducción asistida LEY 41/2002, de 14 de noviembre, básica graves puede imponer sanciones sin especialidad, facultativos no reguladora de la autonomía del paciente y económicas y hasta suspender el reconocidos, si en estos momentos de derechos y obligaciones en materia de ejercicio profesional de un colegiado. somos realmente lo que queremos información y documentación clínica. ser. Y obrar en consecuencia. Estamos Si no hay problemas todo es perfecto, en una situación cambiante en la LEY 44/2003, de 21 de noviembre, de pero ojo, que frente a cualquier que tenemos muchas perspectivas de ordenación de las profesiones sanitarias. contratiempo podemos acabar a la mejorar, pero gran parte del cambio plancha. Vuelta y vuelta. se encuentra en lo que hagamos cada LEY 45/2003, de 21 de noviembre, por la uno y no tanto en esperar que nos que se modifica la Ley 35/1988, de 22 de YO TAMBIéN QUIERO PUPITRE…DE solucionen otros los problemas. noviembre, sobre Técnicas de Reproducción DIRECTOR DE UNIDAD Asistida. Posiblemente la encuesta (que espero Y si, podemos ser Directores/ hayáis contestado) nos dará alguna LEY 14/2006, de 26 de Mayo, sobre técnicas Jefes de Servicio de una Unidad de pista al respecto. de reproducción humana asistida. Reproducción Asistida. En la Sanidad Española existen múltiples ejemplos AGRADECIMIENTOS REAL DECRETO 42/2010, de 15 de enero, por de Jefes de Servicio con titulación de el que se regula la Comisión de Reproducción Facultativos en Biología o Bioquímica Jorge Abad. Decano Colegio Oficial de Humana Asistida. por poner dos ejemplos. Se encuentran Biólogos de Aragón fácilmente en el B.O.E. Agustín Peraita. Vice Decano Colegio Naturalmente son Facultativos…COMO Oficial de Biólogos de Aragón NOSOTROS, pero ya regulados. Mark Grossmann. Facultativo. Licenciado Pero no os lo recomiendo si no Sanitario. Embriólogo Clínico. controláis en su totalidad la actividad que se realice en ella, ya que en Joan Sarquella. Facultativo. Licenciado ese momento deberéis responder Sanitario. Embriólogo Clínico. solidariamente de las infracciones cometidas por vuestros equipos Esther Fernández. Facultativa. Licenciada biomédicos. ¿Seremos capaces de eso? Sanitaria. Embrióloga Clínica. CONCLUSIÓN REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Podemos seguir con los ojos cerrados BOA Número 35, ORDEN de 26 de febrero pensando que muchas de las cosas de 2008, del Departamento de Política que ocurren en nuestras unidades Territorial, Justicia e Interior, por la que no van con nuestras competencias se dispone la inscripción en el Registro y responsabilidades o…todo lo de Colegios Profesionales de Aragón y contrario. De nada servirá poner en de Consejos de Colegios de Aragón de un papel lo que queremos ser si luego los Estatutos del Colegio Profesional de
- 69. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 67 APlICACIÓN DE lA tECNOlOGÍA DEl EMBRyOSCOPE PARA lA CUANtIFICACIÓN DE lA CAlIDAD OVOCItARIA MEDIANtE El ANálISIS DE lOS PAtRONES DE RESPIRACIÓN Javier Herrero, Alberto Tejera, María Cruz, Marcos Meseguer IVI Valencia, Valencia e-mail: javier.herrero@ivi.es INTRODUCCIÓN que conlleva altos riesgos para la salud mejorar las tasas de implantación, ya tanto de la madre como de los fetos, sea en transferencias únicas o de más Con el creciente uso de las técnicas de incluyendo parto prematuro, bajo peso de un embrión, están promoviendo reproducción asistida, el número de niños del recién nacido, mortalidad perinatal el desarrollo de nuevas técnicas para concebidos por fecundación in vitro (FIV) y complicaciones obstétricas entre otros evaluar y seleccionar embriones más ha aumentando paulatinamente en todo (Pinborg, 2005). eficazmente que mediante el mero criterio el mundo y en la actualidad representa morfológico. Algunos de los elementos entre el 2 y el 4% de los nacimientos El principal motivo por el que ocurre claves para estos nuevos procedimientos anuales, incremento asociado a una una gestación múltiple en reproducción deben ser la no invasividad de la técnica, elevada tasa de embarazos múltiples asistida es la transferencia de más de un así como la obtención de información (Sakkas and Gardner, 2005). embrión. La manera más obvia y sencilla objetiva, cuantificable y rápida. de obtener embarazos únicos es realizar Los avances en las técnicas de reproducción transferencias únicas embrionarias o SET El método empleado de rutina en los asistida en los laboratorios, junto con los (del inglés, Single Embryo Transfer). La laboratorios de FIV para seleccionar los progresos en nuestro conocimiento sobre dificultad en el establecimiento del SET embriones a transferir es la evaluación la biología del desarrollo embrionario, es que suele traducirse mayoritariamente de la morfología mediante microscopio ha conseguido aumentar las tasas de en un descenso notable en la tasa de óptico invertido. Esta técnica es específica, gestación (Nyboe Andersen et al., 2004). embarazo (Bergh, 2005; Nyboe Andersen sensible e inocua y además no conlleva Sin embargo, menos del 5% de todos et al., 2004; Van Royen et al., 1999; demasiadas complejidades técnicas ni los ovocitos obtenidos y del 20% de los Scott et al., 2007) por lo que uno de los logísticas (Cummins et al.,1986; Scott, embriones transferidos se traducen en objetivos de la FIV debe ser realizar SET 2003; Baczkowski et al, 2004; Lundin et un embarazo a término, lo que demuestra de manera rutinaria manteniendo como al., 2001; Edwards et al 1984; Shoukir la discrepancia existente entre el número mínimo las tasas de embarazo alcanzadas et al., 1997; Salumets et al., 2001). La de ovocitos disponibles, el número de cuando transferimos más de un embrión. clasificación de la calidad embrionaria embriones transferidos y el número establecida se basa en observaciones de bebés nacidos. Esta baja eficiencia Una de las estrategias para realizar SET puntuales de características evidencia una enorme variabilidad en sin perder posibilidades de gestación por morfológicas durante el desarrollo términos de viabilidad incluso entre transferencia es el cultivo embrionario embrionario. Las limitaciones que se ovocitos y embriones de la misma cohorte hasta estadio de blastocisto, ya que presentan son la evidente subjetividad (Devroey and Van Steirteghem, 2004) se obtiene más información sobre los asociada al criterio del observador y embriones y esto se refleja en una el propio sistema de evaluación, que Uno de los principales objetivos de mayor implantación (Gadner and concibe el desarrollo embrionario desde la reproducción asistida desde sus Lane, 1997). La principal dificultad es un enfoque estático y rígido. comienzos, especialmente desde el punto que la capacidad de evolución no es de vista del laboratorio de FIV, ha sido el igual en todos los embriones, por lo A la hora de establecer la calidad intento de mejorar las tasas de embarazo que la tasa de cancelación, ya sea por embrionaria, el ovocito, con excepción de establecidas. Con este propósito muchas bloqueo embrionario, o por la ausencia algunas particularidades muy concretas, clínicas optan por transferir más de un de blastocistos de calidad suficiente, suele jugar un papel irrelevante por falta de embrión de acuerdo con la legislación también puede verse penalizada. Por marcadores morfológicos fiables. Hasta la vigente en cada país, con el consiguiente lo tanto, parece obvio que el hallazgo fecha se han planteado como marcadores problema del aumento de la tasa de de marcadores tempranos de calidad la morfología del corpúsculo polar (Ebner embarazos múltiples (Puissant et al., embrionaria sería enormemente útil como et al., 2000), la apariencia, grosor y 1987; Steer et al., 1992; Shulman et al., herramienta de selección, evitando los birrefringencia de la zona pelúcida (Shen 1993; Hu et al., 1998; Strandell et al., inconvenientes del cultivo prolongado. et al., 2005; Montag et al., 2006; Montag 2000). En la última década, la reducción Efectivamente, la legislación restrictiva and van der Ven, 2008) y la posición o en el número de embriones transferidos de algunos países, tanto en términos de forma del huso (Madaschi et al., 2008), por ciclo ha conseguido descender el fecundación como de criopreservación pero el valor predictivo de todos ellos aun número de este tipo de embarazos, pero embrionaria, las transferencias únicas no está claro y en cualquier caso parece aun seguimos arrastrando un elevado de embriones con carácter de obligación presumiblemente limitado. Algunos porcentaje de gestaciones gemelares en otros y sobre todo la búsqueda de dismorfismos ovocitarios también han
- 70. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I t U l O Javier Herrero et al. Aplicación de la tecnología del EmbryoScope 68 sido correlacionados con características requerimientos energéticos como significativamente mayores que las tasas concretas citogenéticas, bioquímicas y resultado de la recolocación y aumento en ciclos que no, y disminuyeron con metabólicas (Van Blerkom, 2000). En de actividad de la ATPasa Na+-K+ la edad materna avanzada y los niveles contraste con esta carencia de marcadores (MacPhee et al., 1994). elevados de FSH antes del tratamiento. de calidad ovocitarios, la viabilidad Desafortunadamente, la tasa de del material de base, los gametos, en Teniendo en cuenta el papel vital de la respiración nunca fue determinada a través particular el gameto femenino, determina mitocondria en la competencia ovocitaria de ovocitos o embriones que hubieran sido el posterior desarrollo de los embriones y y posterior desarrollo, se propuso que transferidos y nunca se ha establecido el éxito reproductivo del ciclo. medir en ovocitos aislados un aspecto de si hay alguna correlación entre la tasa la función mitocondrial, la respiración de respiración y el éxito reproductivo La experimentación animal ha (fosforilación oxidativa), puede indicar o si el uso de ciertos protocolos puede demostrado que las mediciones tanto la carga como la activación influir en el estado metabólico del específicas de varios aspectos de la mitocondrial y podría ser un procedimiento ovocito. Estudios recientes han mostrado actividad metabólica de los ovocitos válido para seleccionar los ovocitos con el diferencias en la calidad ovocitaria puede predecir el potencial de desarrollo mayor potencial de desarrollo. (basado en el análisis de la morfología y embrionario (Rieger and Loskutoff, 1994; el resultado reproductivo) para diferentes Lane and Gardner, 1996; Houghton et El consumo de O2 ha sido previamente regímenes de estimulación ovárica al., 2002). Con este fin, se han estudiado medido con técnicas cartesianas, basados en diferentes preparaciones de el consumo o liberación de hormonas, por microespectrofotometría y gonadotropinas, tal como hMG urinaria, factores de crecimiento, aminoácidos ultramicrofluorescencia, usando métodos menotropina altamente purificada (HP- (Lane and Gardner, 1996; Leese, 2003), electroquímicos, por escáner automático hMG) y FSH recombinante (rFSH) (Melo citoquinas y sustratos energéticos con electrodos y más recientemente por et al., 2010). Sin embargo, estos estudios como glucosa, piruvato y lactato. Entre microscopia de escáner electroquímico comparan morfología embrionaria las diversas técnicas descritas para (SCEM) (Houghton et al., 1996; Thompson y no hay información disponible de cuantificar el metabolismo, la medida et al., 1996; Trimarchi et al., 2000). Sin marcadores metabólicos de calidad del consumo de oxígeno o respiración embargo, la mayoría de estas técnicas ovocitaria en relación con los protocolos metabólica se presenta como un buen son difíciles, consumen gran cantidad de estimulación ovárica empleados. indicador ya que está directamente de tiempo y pueden requerir el uso de relacionado con la producción de ATP la iluminación UV, sondas radiactivas En los estudios que se presentan vía fosforilación oxidativa durante el o tinciones fluorescentes, lo que los empleamos una combinación de desarrollo embrionario. El consumo de hace inadecuados para la evaluación tecnologías; por un lado microsensores O2 se considera un buen indicador de de la viabilidad embrionaria. A nuestro de oxígeno para medir su consumo y la actividad metabólica global (Leese, entender no existen publicaciones de calcular tasas de respiración, y por otro 2003) y un parámetro válido para evaluar una aplicación de estas tecnologías captura de imágenes mediante time-lapse la calidad embrionaria (Barnett and en humanos en un ensayo clínico para para caracterizar ovocitos y embriones Bavister, 1996, Houghton et al., 1996). evaluar las posibles correlaciones entre humanos antes de la fecundación Está directamente relacionado con la la actividad metabólica y el potencial y transferencia, todo ello de forma capacidad de un ovocito de producir ATP, de implantación de los embriones que automatizada. El uso de estos indicadores un proceso que utiliza el 30% y el 60-70% han sido transferidos. En la literatura proporcionaría un método cuantitativo y del oxígeno consumido por el embrión en podemos encontrar artículos que objetivo de valorar la calidad ovocitaria las primeras divisiones y en el estadio de muestran resultados sobre esta aplicación y embrionaria sustituyendo los blastocisto, respectivamente (Trimarchi en bovino (Lopes et al., 2007; Lopes et al., métodos de clasificación morfológicos et al., 2000). Hasta ahora, sabemos que 2010); sólo el grupo de Scott ha trabajado subjetivos por un sistema automatizado en mamíferos, durante todas las fases del con ovocitos humanos y fue la primera que combina morfología, cinética de desarrollo, el metabolismo oxidativo es aproximación en este ámbito, pero el división y respiración. Por otro lado, la el mayor productor de ATP, haciendo una material utilizado fue ovocitos no viables implementación de esta nueva tecnología pequeña contribución la conversión de (ovocitos inmaduros o no fecundados) debería permitir mejorar las tasas de piruvato o glucosa a lactato (2,6-8,7% (Scott et al., 2008). implantación embrionaria gracias a del total de la producción) (Sturmey and la disminución de la manipulación de Leese, 2003; Thompson et al., 1996). Las mediciones de las tasas de los embriones y de la alteración de las Se producen dos moles de ATP por cada respiración de oxígeno en ovocitos condiciones de cultivo in vitro. mol de glucosa convertido a lactato; se que no tuvieron una fecundación generan seis moles de ATP por cada mol normal y en embriones donados para Nuestro objetivo es evaluar la de oxígeno consumido. La producción investigación han mostrado diferencias capacidad de diagnóstico del consumo total de ATP no difiere significativamente en las tasas de respiración durante la de oxígeno ovocitario y embrionario durante la fase de divisiones, pero maduración ovocitaria, fecundación y como marcador de calidad mediante se duplica en la fase de blastocisto desarrollo embrionario temprano (Scott el uso de la tecnología EmbryoScope, temprano (Sturmey and Leese, 2003). et al., 2008). Las tasas de respiración de correlacionando las tasas de respiración Este incremento en la producción de embriones de la misma cohorte en ciclos con parámetros de la estimulación y ATP coincide con el incremento en que dieron lugar a embarazo fueron resultados reproductivos.
- 71. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 69 MATERIAL Y MéTODOS de compactación (Alikani et al., 2000). los ovocitos analizados obtuvimos 3 Los embriones de buena calidad en día 2 y mediciones independientes. El sistema empleado (EmbryoScope™, 3 no deben tener células multinucleadas, Vers.C, Unisense FertiliTech, Aarhus, deben poseer entre 2 y 5 células en día Entre los 395 embriones estudiados Dinamarca) es un incubador tri-gas 2 y entre 6 y 10 en día 3, los fragmentos seleccionamos 54 de los transferidos con un microscopio y un microsensor no deben ocupar más de un 15% del en los que teníamos un resultado de de oxígeno incorporados que hace volumen del embrión y sus blastómeras implantación conocida por embrión para mediciones automáticamente en cada deben tener buena simetría. realizar análisis detallados, es decir, ovocito de manera individualizada. 100% (n=12) donde el número de sacos RESPIRACIÓN OVOCITARIA gestacionales confirmados por ecografía La sensibilidad y reproducibilidad de la coincide con el número de embriones técnica permite tomar medidas precisas El objetivo de los primeros estudios transferidos; o 0% (n=42) donde no se de tasas de respiración por debajo de fue evaluar la influencia de diferentes consiguió ni embarazo bioquímico. 0,05 nL hr -1 (=0,6 x 10-15 mole s-1). protocolos de estimulación sobre el consumo de oxígeno de los ovocitos, así RESPIRACIÓN EMBRIONARIA El ovocito se coloca en el fondo de un como analizar posibles relaciones entre micropocillo (0,5 mm diámetro, 1,5 la respiración ovocitaria y morfología En relación con la respiración mm profundidad) en placas especiales ovocitaria, fecundación e implantación embrionaria, hemos intentado (EmbryoSlide ™); los pocillos contienen embrionaria. correlacionar la tasa media de consumo gotas de 25 μL de medio de cultivo y se de oxígeno embrionaria con la cubren con una capa de aceite mineral Se incluyeron 395 ovocitos de 56 ciclos implantación y el embarazo evolutivo. para evitar la evaporación del medio. de nuestro programa de donación de En total se realizaron un total de 47741 Mientras el ovocito consume oxígeno, óvulos entre septiembre de 2009 y enero mediciones en 575 embriones de 56 la concentración del mismo en el fondo de 2010. Los 395 ovocitos dieron lugar a pacientes receptoras de primer ciclo de del pocillo disminuye, estableciendo un 349 ovocitos maduros (metafase II) que ovodonación con transferencia en día gradiente lineal de concentración de O2 fueron microinyectados. Los ciclos fueron 3, permaneciendo en el EmbryoScope descendente. La tasa de consumo de seleccionados aleatoriamente para medir durante 72h después del ICSI. Los oxígeno calculada se expresa en fmoles la tasa media de respiración de los ovocitos criterios de exclusión para las receptoras de O2 consumidos por hora considerando en fmol/seg. Los criterios de exclusión fueron los mismos que en los estudios una solubilidad en el medio de O2 200.4 para las receptoras fueron endometriosis, anteriores. Seleccionamos 57 de los μmol/l a 37ºC y 9% de salinidad. hydrosalpynx, IMC>30, patologías uterinas embriones transferidos basándonos de (miomas, adenomiosis, endocrinopatías, nuevo en el 0% de implantación (n=48) El aparato mide automáticamente trombofilia, patologías crónicas, anomalías o 100% (n=9). El número de embarazos la respiración en cada ovocito en uterinas congénitas o adquiridas), aborto obtenidos en el estudio fue 28 (50,0%). intervalos de tiempo regulares durante de repetición, edad por encima de 45 años la maduración ovocitaria y el desarrollo o factor masculino severo (<5 millones de RESULTADOS embrionario. El tiempo entre dos células espermáticas móviles en total en el mediciones consecutivas en el mismo eyaculado). La tasa media de consumo de oxígeno ovocito es de aproximadamente 20 para todos los ovocitos en el estudio fue minutos. Las donantes fueron asignadas a uno de los de 5,41 fmol/seg (CI 95% 5.02-5.83). tres regímenes diferentes de estimulación Las EmbryoSlides son impermeables con gonadotropinas; el grupo 1 (n=14) 225 Como se muestra en la figura 1A, al intercambio de gases y el UI de rFSH (Gonal-f; Merck Serono, Madrid, hay una ligera correlación negativa microelectrodo para oxígeno se recalibra Spain); el grupo 2 (n=28) 225 UI de HP- estadísticamente significativa entre el automáticamente al inicio de cada nuevo hMG (Menopur; Ferring Pharmaceuticals, consumo de O2 de los ovocitos y la dosis ciclo de medición, haciendo mediciones Madrid, Spain); el grupo 3 (n=14) 150 total de gonadotropinas administradas en un medio estéril saturado de oxígeno UI de rFSH (Gonal-f; Merck Serono) más en el ciclo (r = -0.133, p = 0.006). También y una solución anóxica alcalina de 75 UI de HP-hMG (Menopur; Ferring). observamos una correlación negativa ascorbato sódico (pH 13). La ovulación fue inducida mediante la entre el consumo de oxígeno y los niveles inyección subcutánea de hCG (Ovitrelle, medidos de E2 el día de la administración En cada experimento se usaron pocillos Serono Laboratories, Madrid, Spain). Se de la hCG (figura 1B, r = -0.141, p = 0.004). con medio pero sin ovocitos como midieron los niveles séricos de E2 y P4 la controles negativos para corregir las mañana de la administración de la hCG. El estudio usó tres diferentes fuentes tasas de respiración. de gonadotropinas para los ciclos de El consumo de oxígeno fue registrado las donantes incluidas y encontramos La morfología embrionaria se evaluó en 3 horas después de la punción, diferencias significativas en la tasa de días 2 y 3 basándonos en número, simetría durante una hora, de forma previa a la respiración media ovocitaria entre los y granulosidad de las blastómeras, tipo y microinyección. Dado que el sistema grupos con diferentes protocolos de porcentaje de fragmentación, presencia hace una medición en cada pocillo estimulación. Los ovocitos provenientes de blastómeras multinucleadas y grado cada 20 minutos, en la mayoría de de ciclos en los que sólo se administró
- 72. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I t U l O Javier Herrero et al. Aplicación de la tecnología del EmbryoScope 70 Figuras 1A y B. Gráfica de dispersión del consumo de oxígeno ovocitario en función de la dosis total de gonadotropinas (A) y el estradiol sérico el día de la hCG (B). La línea trazada representa la tendencia calculada mediante un análisis de regresión lineal. rFSH (N=86) obtuvieron una mayor tasa de comparado con los que no 5,54±1,27 vs punto de vista, la primera información consumo de oxígeno comparado con los 5,10±0,61, respectivamente (p=0,047). acerca de tasas de respiración en ciclos en los que se usó una combinación Usando el promedio de respiración ovocitos y embriones humanos viables de HP-hMG y FSH (N=96) o en los que se embrionaria como herramienta de en clínica dentro del marco de las usó sólo HP-hMG (N=156) (figura 2). clasificación para determinar la técnicas de reproducción asistida. implantación, AUC (área bajo la curva) Se han presentado usando la misma Cuando se compararon las tasas de fue 0,692 (CI 0.556-0.808), este tecnología otros datos en ovocitos respiración con la fecundación obtenida análisis determinó un valor de corte humanos no viables (Scott et al., en los ovocitos analizados, encontramos >5,89 mol/seg (Sensibilidad 55,6%, 2008). Lógicamente ninguno de estos diferencias significativas entre los ovocitos Especificidad 87,5%). embriones fue transferido y el estudio que fecundaron correctamente y los que no puede comparar tasas de respiración no OR=1,34 (CI95% 1,04-1,73) (p=0,014) DISCUSIÓN y resultados reproductivos. Otro estudio (figura 3). El consumo medio de oxígeno de respiración ovocitaria empleó micro- fue aproximadamente un 10% mayor para Los datos mostrados son, bajo nuestro espectrofotometría con una tecnología los ovocitos que fecundaron comparado con los que no de la misma cohorte. Coincidiendo con esto, el consumo medio de oxígeno fue significativamente mayor en ovocitos que implantaron comparado con los que no, tal y como se muestra en la figura 4 (p=0,03). Sin embargo, no encontramos ninguna diferencia significativa en la tasa media de consumo de oxígeno entre ovocitos de buena y mala calidad tanto en día 2 (48h del ICSI) como en día 3 (72h del ICSI), aunque los ovocitos de buena calidad tuvieron un mayor promedio de consumo de oxígeno ambos días (figura 5). En lo referente a respiración embrionaria encontramos niveles de respiración diferentes en los embriones que implantaron comparado con los que no, 6,21 fmol/sec SD=0,849 vs 5,23 fmol/sec SD=0,345, respectivamente (p< 0,0001). La tasa de respiración también fue mayor en los embriones Figura 2. Representación del consumo de oxígeno ovocitario en función del protocolo de estimulación que consiguieron embarazo evolutivo ovárica empleado. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p<0.05).
- 73. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 71 la salud de los gametos (Meseguer et al., 2010), un potencial marcador de calidad ovocitaria como la respiración podría usarse como indicador de la futura calidad embrionaria. El régimen de estimulación ovárica empleado parece tener efecto sobre la tasa de respiración ovocitaria. La controversia acerca de la mejor preparación con gonadotropinas para inducir la maduración folicular en FIV, aun continúa (Daya et al., Figura 3. Influencia del consumo de oxígeno ovocitario sobre la fecundación. El consumo de oxígeno 1995, Agrawal et al., 2000). Diversos se representa en dos grupos según la fecundación de los ovocitos. El asterisco (*) indica diferencias estudios han demostrado que el perfil significativas (p<0.05). de estimulación en mujeres a las que se les administra HP-hMG difiere del alternativa (Magnusson et al., 1986) II en el folículo de Graaf (Krisher, de aquellas con rFSH (Bjercke et al., pero con el principal inconveniente 2004). Pero el consumo de oxígeno 2010) y nosotros confirmamos que el de la invasividad. Fue llevado a cabo y la consiguiente carga mitocondrial consumo de oxígeno se ve afectado en ovocitos y blastocistos humanos podría ser importante además en la también por los diferentes protocolos. maduros sobrantes de ciclos naturales, organización cromosómica así como Es evidente que el precio de la rFSH sin transferencia ni posibilidad de durante el desarrollo embrionario tiene un impacto en el presupuesto de correlacionarlo con resultados clínicos. sirviendo de sustento (Shoubridge las pacientes y en el coste final de las and Wai, 2007). En la misma línea técnicas de reproducción, pero si se El consumo de oxígeno puede ser de argumentación, si el consumo asocia a una respiración más activa por relacionado con la carga y actividad de oxígeno está relacionado con parte de los ovocitos comparado con la mitocondrial presente en el ovocito la actividad mitocondrial, esto HP-hMG, su uso podría estar justificado. (Dumollard et al., 2007). El metabolismo está directamente relacionado con mitocondrial es importante para la producción de ATP que puede Curiosamente, la respiración ovocitaria la posterior maduración durante la comprometer la fecundación y el no se asocia con la morfología foliculogénesis, desde el estadio desarrollo embrionario (Van Blerkom, embrionaria en día 2 y 3, lo que indica de vesícula germinal en el folículo 2000). Como el desarrollo embrionario que o bien los parámetros actuales primordial hasta el estadio de metafase está directamente relacionado con de clasificación de la morfología embrionaria no son lo suficientemente sensibles para detectar en el embrión las diferencias metabólicas que encontramos en el ovocito o bien la división embrionaria en los primeros estadios no es dependiente de la actividad mitocondrial inicial del ovocito. Por tanto, la respiración se muestra como una herramienta válida y útil para la selección de ovocitos antes de la fecundación, especialmente importante en aquellos países cuyas leyes restrictivas en reproducción asistida sólo permiten microinyectar unos pocos ovocitos. Los resultados obtenidos indican que sería posible construir un perfil ovocitario de respiración que se asocie con una correcta fecundación y posterior implantación. El siguiente paso será demostrar y establecer un umbral de consumo de oxígeno para seleccionar ovocitos con la mayor Figura 4. Gráficas de cajas y bigotes de los niveles de consumo de oxígeno en ovocitos que dieron lugar a competencia reproductiva. Para llevar embriones que implantaron y que no implantaron. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p<0.05) a cabo este objetivo necesitaremos
- 74. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I t U l O Javier Herrero et al. Aplicación de la tecnología del EmbryoScope 72 Cummins JM, Breen TM, Harrison KL, et al. A formula for scoring human embryo growth rates in in vitro fertilization: Its value in predicting pregnancy and in comparison with visual estimates of embryo quality. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1986; 3:284-295. Devroey, P. and Van Steirteghem, A. A review of ten years experience of ICSI. Hum. Reprod. Update 2004; 10: 19-28. Dumollard, R., Duchen, M. and Carroll, J. The role of mitochondrial function in the oocyte and embryo. Curr. Top. Dev. Biol. 2007; 77: 21-49. Ebner, T., Yaman, C., Moser, M., Sommergruber, M., Feichtinger, O. and Tews, G. Prognostic value of first polar body morphology on fertilization rate and embryo quality in intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod. 2000; 15: 427-430. Edwards RG, Fishel SB, Cohen J, Fehilly CB, Purdy JM, Slater JM, et al. Factors influencing Figura 5. Consumo de oxígeno ovocitario en función de la calidad embrionaria obtenida por los ovocitos 48 the success of in vitro fertilization for horas (día 2) y 72h (día 3) después del ICSI. alleviating human infertility. J.In.Vitro. Fert.Embryo.Transf. 1984 1(1):3-23. realizar estudios prospectivos El consumo de oxígeno en ovocitos y randomizados. embriones se muestra como un buen Gadner, D.K. and Lane, M. Culture and indicador de la calidad embrionaria. selection of viable blastocyst: a feasible En lo referente a la respiración Es evidente que en lo que podríamos proposition for human IVF? Hum. Reprod. embrionaria, también encontramos denominar potencial implantatorio de Update 1997; 3: 367-382 diferencias en el consumo de oxígeno un embrión influyen múltiples factores, cuando comparamos embriones pero la búsqueda de marcadores Houghton, F.D., Thompson, J.G., Kennedy, en función de su implantación. Los fiables, no invasivos, que impliquen C.J. and Leese, H.J. Oxygen consumption resultados obtenidos indican que, una tecnología rápida y sencilla, y sobre and energy metabolism of the early mouse al igual que ocurría con los ovocitos todo objetiva, marca claramente el embryo. Mol. Reprod. Dev. 1996, 44: 476-485. que fecundan correctamente, los camino a seguir. La combinación de las embriones que consiguen implantar tasas de respiración con el análisis de Houghton, F.D., Hawkhead, J.A., y dar lugar a un embarazo evolutivo la morfocinética embrionaria obtenida Humpherson, P.G., Hogg, J.E., Balen, A.H., también obtienen mayores tasas de mediante time-lapse, más objetivo y veraz Rutherford, A.J. and Leese, H.J. Non- respiración media durante los 3 días que la simple evaluación de la morfología invasive amino acid turnover predicts de cultivo. Sería interesante analizar convencional, aporta una información human embryo developmental capacity. el consumo de oxígeno en cada etapa única a la hora de seleccionar embriones Hum. Reprod. 2002; 17: 999-1005. del desarrollo para saber si estas con el mayor potencial de implantación. diferencias están más influenciadas Hu, Y., Maxson, W.S., Hoffman, D.I., Ory, S.J., por los estadios iniciales del desarrollo REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Eager, S., Dupre, J. and Lu, C. Maximizing o por las etapas más tardías. En este pregnancy rates and limiting higher-order sentido, en la literatura encontramos Baczkowski T, Kurzawa R, Glabowski W. multiple conceptions by determining the algunos estudios en animales que han Methods of embryo scoring in in vitro optimal number of embryos to transfer based mostrado picos de consumo de oxígeno fertilization. Reprod Biol. 2004; 4:5-22. on quality. Fertil. Steril., 1998; 69: 650-657. en el momento de la fecundación (Lopes et al., 2010) y un aumento de dos veces Barnett, D.K. and Bavister, B.D. What is Krisher, R.L. The effect of oocyte quality en el consumo durante el estadio de the relationship between the metabolism on development. J. Anim. Sci. 2004; 82 blastocisto comparado con los estadios of preimplantation embryos and their E-Suppl: E14-23. tempranos (Trimarchi et al., 2000). La developmental competence? Mol. Reprod. caracterización del perfil del consumo Dev. 1996; 43:105-133. Lane, M. and Gardner, D.K. Selection of de 02 por etapas del desarrollo podría viable mouse blastocysts prior to transfer ser de mayor utilidad aun a la hora de Bergh C. Single embryo transfer: A mini- using a metabolic criterion. Hum. Reprod. categorizar la calidad de los embriones. review. Hum Reprod. 2005; 20:323-327. 1996, 11: 1975-1978.
- 75. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 73 Leese, H.J. What does an embryo need? Montag, M., Schimming, T. and van der Ven, delivery: Prospective and applied data for Hum. Fertil. 2003, 6: 180-185. H. Spindle imaging in human oocytes: the increased pregnancy rates. Hum Reprod. impact of the meiotic cell cycle. Reprod. 2007; 22:230-240. Lopes, A.S., Greve, T. and Callesen, H. Biomed. Online 2006, 12: 442-446. Quantification of embryo quality by Shen, Y., Betzendahl, I., Sun, F., Tinneberg, respirometry. Theriogenology 2007, 67: Montag, M. and van der Ven, H. Symposium: H.R. and Eichenlaub-Ritter, U. Non- 21-31. innovative techniques in human embryo invasive method to assess genotoxicity viability assessment. Oocyte assessment of nocodazole interfering with spindle Lopes, A.S., Madsen, S.E., Ramsing, N.B., and embryo viability prediction: formation in mammalian oocytes. Reprod. 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- 76. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I t U l O 74 hIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA EN CÉlUlA úNICA (SC CGh): NUEVA hERRAMIENtA PARA El SGP Belén Lledó(1), José Antonio Ortiz(1) , Ruth Morales(1), Rafael Bernabeu(1 y 2). (1) IB Biotech Alicante. España. (2) Instituto Bernabeu. Alicante. España. e-mail: blledo@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN eficiencia de hibridación de las sondas, así ADN en la reacción de hibridación o bien como se requiere de la fijación de la célula optimizar las condiciones de hibridación El Diagnóstico Genético Preimplantacional en un portaobjetos con las dificultades (Rius et al., 2010). (DGP), se utiliza en Medicina Reproductiva que conlleva (Harper y Harton, 2010). con fines asistenciales, siendo al mismo Todo ello, conduce a que la capacidad Con el objetivo de incrementar la tiempo una de las principales vías de de la FISH de distinguir con precisión cantidad de ADN, diversas técnicas innovación e investigación. embriones euploides es limitada. de WGA, DOP-PCR y PEP-PCR se han propuesto como posibles métodos para El DGP se ofrece a parejas portadoras o Por otro lado, la Hibridación Genómica obtener suficiente cantidad de una sola afectas de una determinada enfermedad Comparada (CGH; Comparative Genomic célula (Peng et al., 2006). Sin embargo, genética o cromosómica, que se enfrentan Hybridization) permite detectar, en estos métodos poseen una serie de a un importante riesgo reproductivo. La todo el genoma, cambios en el número inconvenientes metodológicos. Se ha selección de embriones histocompatibles de copias de las secuencias de ADN descrito una nueva técnica de WGA que para beneficio de un tercero es una (Kallionemi et al., 1993). Mediante la CGH permite amplificar todo el genoma a reciente aplicación del DGP no exenta de se obtiene una representación de todos temperatura constante, denominada implicaciones éticas. los cromosomas pudiendo identificar MDA (Multiple Displacement ganancias o pérdidas en grandes regiones Amplification) (Dean et al., 2002). La En el caso de las parejas que se someten cromosómicas. De modo que, a diferencia reacción de MDA está catalizada por la a DGP para evitar la transmisión de de la FISH, no se ve limitada a una parte ADN polimerasa del bacteriofago f29 anomalías cromosómicas, se pueden del genoma. Por tanto, esta técnica que posee una elevada procesividad diferenciar dos grandes grupos: sería una herramienta diagnóstica muy permitiendo obtener una amplificación aquellas en las que uno de los miembros útil si se pudiera aplicar a una sola célula de 6.5 x106-veces a partir de una sola de la pareja es portador sano de porque permitiría obtener el cariotipo célula, convirtiéndose en una valiosa una alteración estructural en sus molecular de una célula y no únicamente herramienta para el DGP (Paez et al., cromosomas (Escudero et al., 2008) o los cromosomas estudiados en la FISH. 2004). parejas que poseen un cariotipo normal pero no consiguen alcanzar gestaciones Para la CGH en célula única (SC CGH), es La principal aplicación de la MDA en DGP evolutivas debido a aneuploidías imprescindible disponer de suficiente es como paso previo para el diagnóstico embrionarias (Kuliev y Verlinsky, 2008). cantidad de DNA, al menos 200 ng, de enfermedades monogénicas lo que requiere aplicar técnicas de (Helliani et al., 2004). Desde que se El estudio del DGP de aneuploidías, amplificación de todo el genoma, en publicó la primera aplicación clínica de denominado SGP (screening genético una única célula (WGA; Whole Genome la MDA en DGP (Helliani et al., 2005), preimplantacional), se ha indicado en Amplification) (Wells et al., 1999). Una son numerosas las enfermedades pacientes con: edad materna avanzada vez resuelta esta limitación inicial, otro monogénicas: retinosquisis ligada al (Platteau et al., 2005), fallos de aspecto importante desde un punto cromosoma X (Lledo et al., 2008), implantación (Pagidas et al., 2008), de vista clínico es el tiempo requerido síndrome de Marfan (Lledo et al., factor masculino (Gianaroli et al., 2005) para obtener los resultados, de al 2006), adrenoleucodistrofia (Lledo y abortos de repetición (Findikli et al., menos 4 días, obligando a criopreservar et al., 2007), etc., que pueden ser 2006). En la actualidad, se mantiene los embriones tras la biopsia (Wilton, diagnosticadas mediante el empleo de una viva controversia sobre su utilidad 2005). Como consecuencia, se vería la MDA como primer paso previo (Lledo clínica, en algunas de ellas. afectada la viabilidad y el potencial et al., 2008). implantatorio del embrión, aún La técnica universalmente utilizada teniendo en cuenta las mejorías Nuestro objetivo ha sido evaluar la para el SGP es la hibridación in situ aportadas por la vitrificación. Además, fiabilidad, sensibilidad y limitaciones fluorescente (FISH), que permite el sigue siendo necesario un segundo ciclo de un nuevo protocolo de SC CGH que análisis de determinados cromosomas en para poder realizar la transferencia y la emplea el MDA como técnica de WGA una única célula biopsiada del embrión sincronización útero-embrión. para poder estudiar la totalidad de a diagnosticar. Existen limitaciones para cromosomas en una única célula en el empleo de esta técnica en el SGP. Por Para intentar solventar esta importante 48h y así utilizarse esta metodología un lado, la FISH no está diseñada para limitación, se han propuesto diferentes como alternativa a la FISH en el SGP el análisis de una sola célula, debido a la estrategias: incrementar la cantidad de de embriones.
- 77. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 75 MATERIALES Y MéTODOS - REACCIóN CGH blastómeras procedentes de 20 embriones aneuploides de 3 ciclos de SGP por abortos - OBTENCIóN DE LíNEAS CELULARES En primer lugar realizamos el marcaje de repetición empleando el protocolo de EUPLOIDES Y ANEUPLOIDES. del ADN amplificado mediante MDA SC CGH previamente optimizado. de una sola célula. Se comprobó la Se emplearon cultivos de células consistencia del ADN en un gel 0,8% - RESULTADOS trofoblásticas euploides (46,XY y 46,XX) y 1% de agarosa y se cuantificó mediante aneuploides (47, XYY; 47, XY+15; 47, XY+16; espectrofotometría. Empleando la enzima Los principales factores limitantes de la 47, XY+21). Se cultivaron en medios de Nick traslation (Vysis) marcamos en rojo SC-CGH son el tiempo en llevar a cabo la cultivo adecuados a cada tipo celular. El (fluorocromo Texas Red) el ADN control, técnica y la cantidad de ADN. Se emplearon cultivo celular se empleó para obtener que se trató de ADN de una sola célula con dos kits comerciales para llevar a cabo la el cariotipo mediante bandas Giemsa, cariotipo XY amplificado mediante MDA, y WGA con el objetivo de seleccionar aquel obtener ADN (siguiendo las instrucciones en verde (fluorocromo FITC) marcamos el que proporcionara mayor cantidad de ADN del kit comercial Genomic DNA purification ADN problema, amplificado de una célula en el menor tiempo de amplificación. La kit, Promega) e individualizar células. mediante MDA. Se realizaron diferentes versión HY permite obtener cantidades de ensayos con distintas cantidades de ADN hasta 50 μg, mientras que el rendimiento La individualización de las células se realizó (100, 200 y 400 ng) y tiempos de digestión de la V2 es de 4 μg. Por otro lado, los empleando técnicas de micromanipulación (1h, 1h y 15’, 1h y 30’ y 2h). tiempos de reacción son de toda la noche en un microscopio invertido. Se o 2-3h respectivamente. Se realizaron dispensaron en tubos de PCR de 0,2 ml en Una vez marcado el ADN se llevó a cabo combinaciones para los diferentes kits y los que se llevó a cabo la lisis celular. la precipitación de las mezclas de ADN condiciones. El kit HY con una incubación rojo-verde conjuntamente, en presencia de toda la noche proporcionó una mayor - AMPLIFICACIóN DE TODO EL GENOMA (MDA) de Cot-1 ADN (Vysis). La sonda preparada cantidad de ADN a partir de una sola se añadió a portas en los que se había célula, sin embargo se obtuvo una mayor La lisis alcalina se neutralizó para poder extendido metafases XY normales. Se proporción de productos inespecíficos. realizar la amplificación con la ADN incubaron a 73ºC durante 2 minutos y Este inconveniente junto con el hecho del polimerasa del bacteriofago f29. Una posteriormente a 37ºC durante 36 horas tiempo tan extenso de reacción descartó vez equilibrado el pH y disponible la en una cámara húmeda. Tras la hibridación esta versión para realizar la MDA. molécula de ADN de la célula, se llevó a se realizaron los lavados estándar y se cabo la amplificación del ADN con una observaron al microscopio de fluorescencia Por otro lado, con el kit V2 se obtuvieron incubación a temperatura constante empleando DAPI como contraste. hasta 10 μg de ADN empleando una (30ºC). Se emplearon dos versiones del incubación de toda la noche y una media kit comercial Ilustra Genomiphi® (GE Para la captura de las imágenes empleamos de 2,5 μg en 3h de reacción por célula healthcare): HY y V2. Así como diferentes el software Cytovision que captura cada individualizada, así como una mayor tiempos de incubación de la reacción de fluorocromo de forma independiente especificidad (estudio de polimorfismos) la amplificación. e integra los niveles de fluorescencia. en estas últimas condiciones. El resultado final lo representa junto al Considerando la limitación de tiempo El producto de la amplificación se ideograma de cada cromosoma, pudiendo y que la cantidad de 2,5 μg es más que purificó para eliminar sales o reactivos identificar regiones cromosómicas suficiente para realizar la CGH así como que puedan interferir en el análisis duplicadas/delecionadas mediante una los análisis de polimorfismos se eligió posterior, empleando el kit comercial GFX variación en el ratio 0,8 – 1,2. como método de WGA para la SC-CGH una PCR purification kit® (GE healthcare). reacción de 3h empleando la versión V2. La calidad y cantidad del ADN obtenido -VALIDACIóN DE LA TéCNICA EN se verificó mediante electroforesis de BLASTóMERAS El ADN obtenido de la reacción de MDA agarosa al 1% en tampón TAE. se validó mediante la amplificación de Una vez comprobada y puesta a punto la polimorfismos de diferentes loci. De este - AMPLIFICACIóN DE POLIMORFISMOS. técnica en células únicas, para poder llevar modo comprobamos que en la amplificación a cabo la aplicación clínica de la misma, se encuentra representado todo el genoma, Como resultado de la reacción de corroboramos su validez en blastómeras así como identificamos la presencia MDA se obtuvo ADN suficiente para procedentes de la biopsia de embriones de productos inespecíficos (Tabla I). poder amplificar de la misma célula en cultivo in vitro. Para ello, empleamos polimorfismos repartidos por diferentes embriones procedentes de ciclos de La reacción de CGH consiste en la loci así como poder realizar la SGP que hayan sido diagnosticados cohibridación en presencia de Cot-1 hibridación CGH. como aneuploides mediante la técnica (ADN humano placentario altamente de FISH y que por tanto no son aptos ni repetitivo) del ADN problema y control Mediante el análisis de polimorfismos para transferir al útero materno ni para marcado con diferentes fluorocromos. (STRs) del ADN amplificado comprobamos criopreservar. Dichos embriones fueron Este marcaje se realiza empleando una la especificidad del ADN amplificado. Los rebiopsiados para confirmar mediante enzima (DNA pol I) que incorpora a la polimorfismos se identificaron empleando FISH el diagnóstico y sometidos a SC CGH cadena de ADN nucleótidos marcados un secuenciador ABI PRISM 310. para validar la técnica. Se analizaron las con los fluorocromos, simultáneamente
- 78. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I t U l O Belén Lledó et al. Hibridación genómica comparada en célula única (SC CGH): Nueva herramienta para el SGP 76 se digiere la molécula de ADN por acción Eficiencia de L1 L2 L3 L4 ADO de la ADNasa I. El tiempo de digestión amplificación debe ser optimizado para asegurar X-22 223 - 207 223 - 207 223 - 207 223 - 207 12/12 NO un tamaño de sondas adecuado que compense una hibridación homogénea HD 165 - 226 165 - 226 165 - 226 165 12/12 SI y el menor ruido de fondo posible. El X Fragile 248 - 234 248 - 234 248 - 234 248 - 234 12/12 NO tamaño de digestión debe estar entre DMPK 112 - 118 112 - 118 112 - 118 112 - 118 12/12 NO 300-3000pb para ADN genómico y SCA3 223 - 229 223 - 229 223 - 229 223 - 229 12/12 NO entre 100 y 300 para construcciones mts-2 132 - 149 132 - 149 132 - 149 132 12/12 SI BACs. El tamaño ideal resultó ser 500- 1000pb y sin fragmentos por debajo mts-4 117 - 121 117 - 121 117 - 121 117 - 121 12/12 NO de 100 pb. Un tiempo de digestión G6P 189 - 186 189 - 186 189 - 186 189 - 186 12/12 NO de 1h permitió obtener sondas de las DXS1073 126 - 124 126 - 124 126 - 124 126 - 124 12/12 NO características anteriormente descritas. DXS9901 136 - 141 141 136 - 141 136 - 141 12/12 SI D19S219 164 - 146 164 - 146 164 - 146 146 12/12 SI Como se ha mencionado, otro factor limitante para la reacción de CGH es la D19S559 186- 196 186- 196 186- 196 186- 196 12/12 NO cantidad de ADN. Se probaron varias D11S129 157 - 155 157 - 155 157 - 155 157 - 155 12/12 NO combinaciones para cada ADN (problema D11S4132 189 198 - 186 198 - 186 198 - 186 12/12 SI y control) y tiempos de digestión. Como CA6 168 - 174 168 - 174 168 - 174 168 - 174 12/12 NO resultado se obtuvo que la cantidad TAAA2 211 - 207 211 - 207 211 - 207 211 - 207 12/12 NO adecuada de ADN problema y control es de 400ng y el tiempo de digestión de 1h. D15S1028 176 - 190 176 - 190 176 - 190 176 - 190 12/12 NO D15S1024 248 - 254 248 - 254 248 - 254 248 12/12 SI Mediante el software Cytovision STR50 238 - 230 238 - 230 238 - 230 238 - 230 12/12 NO realizamos la captura de cada fluorocromo 3’CA 126 - 130 126 - 130 126 - 130 126 - 130 12/12 NO y la integración de los niveles de 5’CA 96 - 92 96 - 92 96 - 92 96 - 92 12/12 NO fluorescencia. El resultado final quedó representado junto al ideograma. Al D17S789 161 - 152 161 - 152 161 - 152 161 - 152 12/12 NO menos 15 metafases fueron capturadas D17S821 156 - 149 156 - 149 156 - 149 156 - 149 12/ 12 NO e integradas en el análisis. Se consiguió D11S1344 279 - 273 279 279 - 273 279 - 273 12/12 SI identificar la aneuploidía correspondiente D11S1983 220 - 228 220 220 - 228 220 12/12 SI a cada tipo celular empleado en el estudio a partir de una sola célula (Figura1). Tabla I. Resultado de los análisis de polimorfismos. A partir de las blastómeras procedentes 13, 15, 18 y los cromosomas sexuales con Sin embargo, el SGP se encuentra en de embriones desechados de ciclos de SGP la misma importancia entre ellos. torno a un debate abierto por parte empleando el kit de MDA V2 y 3h de reacción de la comunidad científica desde se obtuvo una media de ADN amplificado DISCUSIÓN diferentes perspectivas. Desde un punto de 64 ng/μl. Empleando el protocolo de SC de vista clínico se requieren estudios CGH optimizado se obtuvo resultado en el Una de las principales limitaciones de randomizados con suficiente potencia 85% de las blastómeras analizadas. En el las técnicas de reproducción asistida es para demostrar su efecto beneficioso resto de los casos la baja concentración de la tasa de implantación. Seleccionando en ciertos tipos de pacientes (Harper ADN obtenida (<20 ng/μl) podría explicar el los embriones con mejor capacidad et al., 2010). En cuanto a la propia fallo en la reacción SC CGH. Considerando la implantatoria conseguiremos incrementar biología del embrión en división existen concordancia entre los resultados de FISH las tasas de éxito y disminuir los embarazos en la actualidad dos aspectos que y SC CGH: el 42% de los resultados de SC múltiples. En la actualidad el método pueden afectar al éxito del SGP como CGH tuvieron una concordancia completa, universalmente empleado es la selección son el mosaicismo y la capacidad de el 52% tuvieron una concordancia morfológica. Sin embargo, hay parejas autocorrección. El mosaicismo afecta parcial, es decir, mostraron además de las en las que aún transfiriendo embriones al 14% de los embriones (Bielanska aneuploidías detectadas por FISH otras morfológicamente de buena calidad no et al., 2005) y únicamente se podría que no se pudieron detectar mediante se consiguen gestaciones evolutivas, identificar mediante la biopsia y análisis FISH y solo en un caso (6%) se observó pudiendo ser debido a aneuploidías de dos células. A pesar de que la propia una discordancia (Tabla II). Teniendo embrionarias. En estas parejas, el capacidad de autocorrección del en cuenta estos resultados el 94% de objetivo es identificar los embriones embrión podría revertir aneuploidías, los resultados de SC CGH serían total o con mayor capacidad implantatoria en la bibliografía únicamente se han parcialmente concordantes y por tanto mediante SGP. El SGP empleando la descrito un 9% de embriones en los que quedaría validada su utilidad clínica. El técnica de FISH permite el análisis de tras ser diagnósticados en D+3 como cromosoma más frecuentemente implicado determinados cromosomas en una única aneuploides se identifican en D+5 líneas en aneuploidias fue el 16, seguido por el célula biopsiada del embrión a estudiar. euploides (Barbash-Hazan et al., 2009).
- 79. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 77 Figura 1. Resultado de SC CGH de una sola célula aneuploide. Estos embriones serían mosaicos y en La hibridación genómica comparada sin diagnosticar. Los esfuerzos actuales ningún caso transferibles por tanto la (CGH) es una técnica de citogenética están dirigidos a disminuir el tiempo posible capacidad de autocorrección no molecular desarrollada para el análisis de de hibridación o bien emplear técnicas afectaría al éxito del SGP. Finalmente, ganancias y pérdidas de ADN. Está basada alternativas como el array-CGH (Harper y desde una perspectiva de la técnica de en el análisis de ADN genómico, de modo Harton, 2010). análisis genético empleada, la FISH en que no requiere cromosomas en metafase SGP únicamente proporciona información y por tanto tampoco cultivos celulares. Otra indicación para la SC CGH son las del número de cromosomas analizados Esta técnica sería idónea para el SGP si se parejas portadoras de alteraciones mediante sondas centroméricas o locus pudiera aplicar a una única célula, lo que cromosómicas estructurales. El DGP específicos, de modo que solo se tiene requiere la amplificación de ADN a partir mediante la técnica de FISH permite información de esta región sin hacer de dicha célula para obtener suficiente seleccionar los embriones que carecen referencia al resto del cromosoma. Esta cantidad para el estudio. La principal de desequilibrios, sin embargo es incapaz información no se corresponde con la desventaja de esta técnica es el tiempo de de identificar el efecto intercrosómico dotación cromosómica completa de la hibridación para obtener el diagnóstico (Gianaroli et al., 2002). Por ello, la célula y por lo tanto algunos embriones de los embriones, ya que éste supera puesta a punto de la SC CGH permitirá aneuploides son diagnosticados el tiempo máximo de cultivo in Vitro del no sólo identificar aquellos embriones erróneamente como normales ya embrión. De modo que, para utilizar balanceados para la alteración que tienen aneuploidías para otros la SC CGH en blastómeras procedentes cromosómica que porta esa pareja sino cromosomas que no están incluidos en de embriones en D+3 es imprescindible también la dotación para el resto de el test. Por todo ello, se han desarrollado la criopreservación de los mismos cromosomas del cariotipo, aportando un numerosos intentos por alcanzar la (Voullaire et al., 2000). Otra alternativa diagnóstico de certeza e incrementando información de la dotación completa consistiría en emplear el corpúsculo las tasas de implantación y embarazo y como por ejemplo técnicas de obtención polar, sin embargo las aneuploidías post- las posibilidades de lograr un embarazo de metafases (Shkumatov et al., 2007). zigóticas o de origen paterno quedarían evolutivo a término.
- 80. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I t U l O Belén Lledó et al. Hibridación genómica comparada en célula única (SC CGH): Nueva herramienta para el SGP 78 CONCORDANCIA Findikli N, Kahraman S, Saglam Y, Beyazyurek ADN RESULTADO RESULTADO (T: TOTAL, P: PACIENTE EMBRIÓN obtenido C, Sertyel S, Karlikaya G, Karagozoglu H, Aygun FISH SC CGH PARCIAL, D: (ng/µl) DISCORDANCIA) B. (2006) Embryo aneuploidy screening for 2 20 XY+18 XY+18+14 P repeated implantation failure and unexplained 5 52 XY-15 XY-15 T recurrent miscarriage Reprod Biomed Online. 13, 38-46. 6 17 XX-21 -- SIN RESULTADO 7 20 XXYY-21 XY D Gianaroli L, Magli MC, Cavallini G, Crippa A, 1 9 10 XY-13 -- SIN RESULTADO Nadalini M, Bernardini L, Menchini Fabris GF, 13 32 XY-16 XY-16-8 P Voliani S, Ferraretti AP. (2005). Frequency 14 16 XY-13-15 -- SIN RESULTADO of aneuploidy in sperm from patients with extremely severe male factor infertility. Hum 16 20 XX+16 XX+16 T Reprod. 20:2140-52. 20 86 XX+21 XX+21 T 2 42 X0 X0+11 P Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP, Munné XX-13-16- XX+7-9-13- S, Balicchia B, Escudero T, Crippa A. (2002). 3 112 P 18-22 16-18-22 Possible interchromosomal effect in embryos 2 4 107 XY+13+15 XY+13+15 T generated by gametes from translocation 8 104 XY+15-16 XY+15-16-20 P carriers. Hum Reprod. 17:3201-7. 10 772 XX+21 XX+21 T Harper J, Coonen E, De Rycke M, Fiorentino 12 53 X0-16 X0+5-16 P F, Geraedts J, Goossens V, Harton G, Moutou 3 27 XX-13 XX-13 T C, Pehlivan Budak T, Renwick P, Sengupta S, 4 34 XY-22 XY-22 T Traeger-Synodinos J, Vesela K. (2010). What 3 9 62 XY-18 XY-12-18 P next for preimplantation genetic screening 12 108 X0 X0 T (PGS)? A position statement from the ESHRE PGD Consortium steering committee. Hum 14 107 XX-16 XX-16-18 P Reprod. 25:821-3. Tabla II. Resultado de la comparación entre los resultados de FISH y SC CGH. Harper JC, Harton G. (2010). The use of arrays Finalmente, existe una nueva línea las tasas de aborto, evitando la in preimplantation genetic diagnosis and para el SGP que se está desarrollando criopreservación de los embriones screening. Fertil Steril. 94:1173-7. en los últimos años e intenta salvar estudiados, eximiéndoles del proceso de los principales inconvenientes del SGP congelación-descongelación y con todo Hellani A, Coskun S, Tbakhi A, Al-Hassan como es la biopsia de trofoectodermo. ello, optimizar los resultados clínicos. S. (2004). Clinical application of multiple Numerosos estudios evidencian una displacement amplification in preimplantation mejoría en los resultados del SGP tras REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS genetic diagnosis. Reprod Biomed Online. el empleo de la CGH o array-CGH sobre 10:376-80. células del trofoectodermo (Sher et al., Barbash-Hazan S, Frumkin T, Malcov M, Yaron 2009; Schoolcraft et al., 2010). Y, Cohen T, Azem F, Amit A, Ben-Yosef D. 2009. Hellani A, Coskun S, Benkhalifa M, Tbakhi A, Preimplantation aneuploid embryos undergo Sakati N, Al-Odaib A, Ozand P. (2004) Multiple Hemos conseguido desarrollar un self-correction in correlation with their displacement amplification on single cell and protocolo que permite obtener el cariotipo developmental potential. Fertil Steril. 92:890-6. possible PGD applications. Mol Hum Reprod. molecular de una sola célula en un tiempo 10:847-52. máximo de 48h. Empleando la técnica de Bielanska M, Jin S, Bernier M, Tan SL, Ao A. MDA hemos obtenido suficiente cantidad (2005). Diploid-aneuploid mosaicism in Kallionemi, OP, Kallionemi A, Sudar, D, et al. de ADN para llevar a cabo la hibridación en human embryos cultured to the blastocyst (1993). Comparative Genomic hybridisation: a 36h permitiendo identificar la aneuploidía stage. Fertil Steril.; 84:336-42. rapid new method for detecting and mapping propia de cada célula, así como un DNA amplification in tumours. Cancer Biol. 4, análisis de polimorfismos evidenciando Dean FB, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi AF, 41-46. conjuntamente una representación Bray-Ward P, Sun Z, Zong Q, Du Y, Du J, Driscoll homogénea del genoma. M, Song W, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken Kuliev A, y Verlinsky Y. (2008). Preimplantation RS. (2002) Comprehensive human genome genetic diagnosis: technological advances to La validación de este protocolo en amplification using multiple displacement improve accuracy and range of applications. blastómeras permite su posterior amplification. Proc Natl Acad Sci.. 99, 5261-6. Reprod Biomed Online.. 16, 532-8. aplicación clínica consiguiendo transferir embriones euploides, completamente Escudero T, Estop A, Fischer J, Munne S. (2008) Lledó B, Ten J, Rodriguez-Arnedo D, Llácer J, estudiados, seleccionando con criterios Preimplantation genetic diagnosis for complex Bernabeu R. (2008). Preimplantation genetic más estrictos y fiables los embriones chromosome rearrangements. Am J Med Genet diagnosis of X-linked retinoschisis. Reprod cromosómicamente sanos, disminuir A. 13, 1662-9. Biomed Online. 16, 886-92.
- 81. EXPOSIC IÓN PREMIOS ASEBIR-EMB 2 0 09 t I tUlO Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 79 Lledó B, Bernabeu R, Ten J, Galán FM, Cioffi L. Preimplantation genetic diagnosis for for PGD of chromosomal rearrangements. (2007). Preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy screening in women older than 37 Reprod Biomed Online. 14:4 98-503. X-linked adrenoleukodystrophy with gender years. Fertil Steril. 84, 319-24. determination using multiple displacement Schoolcraft WB, Fragouli E, Stevens J, Munne amplification. Fertil Steril. 88:1327-33. Rius M, Obradors A, Daina G, Cuzzi J, Marquès S, Katz-Jaffe MG, Wells D. (2010). Clinical L, Calderón G, Velilla E, Martínez-Passarell O, application of comprehensive chromosomal Lledó B, Ten J, Galán FM, Bernabeu R. (2006). Oliver-Bonet M, Benet J, Navarro J. (2010) screening at the blastocyst stage Fertil Steril. Preimplantation genetic diagnosis of Marfan Reliability of short comparative genomic 94:1700-6. syndrome using multiple displacement hybridization in fibroblasts and blastomeres amplification. Fertil Steril. 86: 949-55. for a comprehensive aneuploidy screening: Voullaire L, Slater H, Williamson R, first clinical application. Hum Reprod. Wilton L. (2000)Chromosome analysis of Paez JG, Lin M, Beroukhim R, Lee JC, Zhao X, 25:1824-35. blastomeres from human embryos by using Richter DJ, et al. (2004) Genome coverage and comparative genomic hybridization. Hum sequence fidelity of phi29 polymerase-based Sher G, Keskintepe L, Keskintepe M, Genet. 106:210-7. multiple strand displacement whole genome Maassarani G, Tortoriello D, Brody S. amplification. Nucleic Acids Res. 32, e71 (2009). Genetic analysis of human embryos Wells D, Sherlock, JK, Handyside, AH by metaphase comparative genomic and Delhanty, J.D.A. (1999). Detailed Pagidas K, Ying Y, Keefe D. (2008) Predictive hybridization (mCGH) improves efficiency chromosomal and molecular genetic analysis value of preimplantation genetic diagnosis of IVF by increasing embryo implantation of single cells by whole genome amplification for aneuploidy screening in repeated IVF- rate and reducing multiple pregnancies and and comparative genomic hynridisation. ET cycles among women with recurrent spontaneous miscarriages. Fertil Steril. Nucleic Acids Res., 27, 1214-1218. implantation failure. J Assist Reprod Genet. 92:1886-94. 25, 103-6. Wilton L. (2005) Preimplantation genetic Shkumatov A, Kuznyetsov V, Cieslak J, diagnosis and chromosome analysis of Platteau P, Staessen C, Michiels A, Van Ilkevitch Y, Verlinsky Y. (2007) Obtaining blastomeres using comparative genomic Steirteghem A, Liebaers I, Devroey P. (2005). metaphase spreads from single blastomeres hybridization. Hum Reprod Update. 11, 33-41.
- 82. 80
- 83. Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 81 cOMUNIc AcIONES ORALES
- 84. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 82 001: APLIcAcIÓN DE LAS REDES NEURONALES AL ESTUDIO DE LA INFLUENcIA DE LOS FAcTORES AMBIENTALES EN LA cALIDAD SEMINAL JL Girela1, D Gil2, MJ Gómez-Torres1, M Johnsson3, J De Juan1 1 Departamento de Biotecnología, Universidad de Alicante, España. 2Departamento de Tecnología informática y computación, Universidad de Alicante, España. 3Departamento de Ciencias Cognitivas, Universidad de Lund, Suecia. e-mail: girela@ua.es INTRODUCCIÓN Tras ser debidamente informados se positiva del 88,89% y de predicción les solicitó una muestra seminal tras negativa del 83,78%. Al analizar los índices de demanda de los un periodo de abstinencia de entre 3 y tratamientos de reproducción asistida, 6 días, realizándose un seminograma CONCLUSIONES se observa que cada vez son más a cada una de las muestras recibidas. frecuentes las consultas por problemas El día del análisis, se solicitó también La MLP desarrollada en el presente reproductivos en los que el factor a los voluntarios que rellenaran un estudio muestra un gran nivel de masculino está alterado. Durante las cuestionario sobre hábitos de vida y su precisión en base a los diferentes últimas décadas se mantiene abierto un estado de salud. parámetros medidos, pudiendo debate ante la posibilidad de un declive destacar dos conclusiones principales: en la calidad seminal. En cuanto a las Se han utilizado redes neuronales por una parte, el uso de las técnicas causas de este posible descenso de la artificiales para determinar la capacidad de inteligencia artificial puede calidad seminal que afecta a la fertilidad de los datos del cuestionario para resultar muy interesante en la toma de masculina, se han barajado diferentes predecir los parámetros seminales del decisiones sobre el diagnóstico de los factores, desde un aumento en la individuo. Para ello se ha desarrollado parámetros seminales, y por otra que incidencia de patologías del aparato una red neuronal artificial del tipo supone una ayuda fundamental en el reproductor masculino, pasando por Multi-Layer Perceptron (MLP), que futuro estudio de la influencia de los factores ambientales y ocupacionales, consiste en tres capas de neuronas: la factores ambientales en los parámetros hasta determinados hábitos de vida. El capa de entrada que recibe los datos seminales. análisis de semen es la piedra angular del externos, una capa oculta, y una capa estudio del varón; pese a que por sí solo de salida que genera la clasificación de no es capaz de determinar si un varón los resultados. En el caso del presente puede tener descendencia, es un buen estudio, la capa 1 está formada por cada predictor del potencial fértil del varón. una de las variables del cuestionario analizadas. La capa oculta es la más OBJETIVO importante en la realización del MLP, y supone un balance entre el rendimiento En este trabajo se pretende profundizar y el riesgo de sobreajuste. De esta forma en los problemas de fertilidad masculina la red será capaz de generalizar ante desde la perspectiva de la posible nuevos casos en lugar de únicamente influencia de los factores ambientales repetir los registros conocidos. En y los hábitos de vida en la calidad del este estudio se estimó que el número semen. También responde a la necesidad de neuronas más adecuado era de de desarrollar una metodología que 21. La capa de salida estaba formada permita un diagnóstico más eficaz del por dos categorías correspondientes potencial fértil del varón, evitando el a la clasificación de los parámetros tratamiento innecesario o diagnósticos seminales como normales o alterados. erróneos. Para ello utilizamos técnicas de inteligencia artificial para producir RESULTADOS un Sistema de Ayuda a la decisión o Decision Support Systems (DSS). Tras someter los datos a varias pruebas de validación y de aprendizaje por MATERIAL Y MÉTODOS parte de la red neuronal, se obtuvieron los siguientes resultados. El sistema Para la realización del estudio se clasificó correctamente el 87% de las contó con la participación de 123 muestras, mostrando una sensibilidad voluntarios de entre 18 y 36 años, sin del 90,32%, una especificidad del problemas reproductivos conocidos. 81,58%, y unos valores de predicción
- 85. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 83 002: EFEcTO DEL POLIMORFISMO (TA)N DEL PROMOTOR DEL REcEPTOR DE ESTRÓGENOS ALFA (ERA) SOBRE EL REcUENTO ESPERMÁTIcO. J. A. Ortiz 1, B. Lledó1, R. Morales1, J. Llácer2 y R. Bernabeu1,3. 1 Instituto Bernabeu Biotech, 2Instituto Bernabeu Elche, 3Instituto Bernabeu Alicante e-mail: blledo@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN El ADN de los pacientes se obtiene a partir de linfocitos en sangre periférica La infertilidad masculina es un proceso empleando el kit comercial (Wizard® que involucra múltiples componentes y Genomic DNA purification kit. Promega). en el que la genética participa de forma notable. La región de repetición TA en el promotor de ERa es amplificada mediante PCR en Los estrógenos desempeñan un papel la que el oligonucleótido forward está importante en la diferenciación, marcado fluorescentemente en posición maduración, y función del sistema 5’ con 6-FAM. La longitud del producto reproductor humano, sobre todo en el amplificado y por consiguiente el femenino, pero en la actualidad ya está número de repeticiones TA se determina claramente aceptada y establecida la mediante electroforesis capilar (ABI función que desempeñan los estrógenos PRISM 310, Applied Biosystems). durante la espermatogénesis. RESULTADOS La acción de los estrógenos es mediada principalmente por dos isotipos del Existe una gran variabilidad en el receptor de estrógenos (ER): a y b. número de repeticiones TA en la región Ambos isotipos son codificados por dos promotora del gen. El rango varía genes diferentes. entre 7 y 24 repeticiones. Existe una distribución similar en la longitud de Se han descrito en la literatura las repeticiones en ambos grupos de diferentes mutaciones y polimorfismos estudio. en ambos receptores, pero en algunos casos se ignora su posible influencia CONCLUSIONES sobre la calidad seminal. La longitud de las repeticiones TA OBJETIVOS del promotor del receptor ERa no determina la inclusión del varón en el Determinar la posible asociación entre el grupo control (nomozoospérmicos) o en recuento espermático y el polimorfismo el grupo pacientes (oligozoospérmicos (TA)n del promotor de ERa. y criptozoospérmicos). Se ha analizado también el efecto del número de MATERIAL Y MÉTODOS repeticiones sobre el recuento espermático dentro de cada uno de los Estudio retrospectivo en el que se grupos de estudio. determina el número de repeticiones TA en el promotor del gen ERa en dos grupos de estudio: Control: Normozoospérmicos (n=50) Pacientes: Oligozoospérmicos o criptozoospérmicos (n=150). Las muestras seminales son obtenidas mediante masturbación (3-5 días de abstinencia). El análisis seminal se lleva a cabo de acuerdo a las guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS).
- 86. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 84 003: PATRONES DE DISTRIBUcIÓN DE LOS REcEPTORES DE cANABINOIDES, cB1 Y cB2, EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS FREScOS, cAPAcITADOS Y REAccIONADOS AcROSÓMIcAMENTE M. M. Francou, E. García-Hernández, J. L. Girela, M.J. Gómez-Torres, J. Ten, R. Bernabeu, J. De Juan Departamento de Biotecnología, Universidad de Alicante e-mail: manuelafrancou@gmail.com “swim-up”. Una vez capacitados, la estados fisiológicos estudiados: fresco, INTRODUCCIÓN reacción acrosómica fue inducida “in capacitado y reacción acrosómica. vitro” mediante el ionóforo de calcio Los endocanabinoides son un grupo A23187. Los espermatozoides fueron CONCLUSIONES de derivados de ácidos grasos fijados en cubreobjetos con metanol poliinsaturados que imitan el efecto (-20ºC). Las células espermáticas El porcentaje de espermatozoides con del Δ9-tetrahidrocanabinol (THC), fueron estudiadas en los tres estados marcaje en la cola fue significativamente principal componente activo de la fisiológicos: fresco, capacitado y con mayor en aquellos que sufrieron reacción marihuana (“cannabis sativa”). Los reacción acrosómica. Las muestras acrosómica que en los frescos, para endocanabinoides actúan uniéndose a fueron incubadas con anticuerpos ambos tipos de receptores CB1 y CB2. dos tipos de receptores de membrana: primarios anti-CB1 y anti-CB2 y Por otra parte, durante la capacitación receptor de canabinoide tipo 1 (CB1) y detectados mediante fluorescencia y reacción acrosómica, el porcentaje receptor de canabinoide tipo 2 (CB2). indirecta. El marcaje fluorescente de espermatozoides marcados en la En la naturaleza la distribución del fue analizado mediante microscopía cabeza decrece significativamente, CB1 y CB2 es muy diversa: mamíferos, confocal. especialmente en el CB1. Nuestros peces, invertebrados, microorganismos resultados sugieren que hay una y plantas superiores. En humanos, RESULTADOS clara correlación entre la expresión el CB1 es el más abundante en el de los receptores de canabinoides, la sistema nervioso central y en tejidos La distribución de los receptores capacitación y la reacción acrosómica. periféricos: hígado, corazón, testículos CB1 y CB2, en la superficie de los y útero; en cambio el CB2 está presente espermatozoides, fue evaluada principalmente en el sistema inmune. El estableciendo los siguientes patrones espermatozoide humano expresa ambos de marcaje: cola, pieza intermedia, tipos de receptores. La activación del región post-acrosomal y región CB1 tiene efectos sobre la motilidad, acrosomal. Así, a cada espermatozoide capacitación y reacción acrosómica. le fue asignando el/los patrones En cambio, la función del CB2 en los anteriormente mencionados. En la espermatozoides aún no está clara, cola, el porcentaje de expresión del CB1 aunque hay estudios que muestran que (10%) fue significativamente mayor que su activación incrementa la motilidad el CB2 (5%). Además, la expresión del progresiva. CB1 en las colas de espermatozoides en fresco (10%), fue significativamente OBJETIVO menor que en aquellos que sufrieron la reacción acrosómica (40 %). De El principal objetivo de este trabajo fue igual forma, la expresión del CB2 en determinar la distribución del CB1 y CB2 las colas de espermatozoides en fresco en los diferentes estados fisiológicos (5%) fue menor que en aquellos que del espermatozoide: fresco, capacitado sufrieron reacción acrosómica (15%). y con reacción acrosómica. El porcentaje de espermatozoides marcados en la pieza intermedia MATERIAL Y MÉTODOS y región acrosomal, fue muy bajo, y no se encontraron diferencias Para este estudio se analizaron estadísticamente significativas entre 15 muestras de donantes los grupos estudiados. En la región normozoospérmicos (25-35 años), post-acrosomal, tanto para el CB1 según los criterios de la OMS como para el CB2, el porcentaje de (Organización Mundial de la Salud, espermatozoides marcados disminuyó 2010). Cada muestra fue sometida a progresivamente a medida que el capacitación, mediante la técnica de espermatozoide fue pasando por los tres
- 87. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 85 004: EL EFEcTO NEGATIVO DE LA FRAGMENTAcIÓN DEL DNA ESPERMÁTIcO SOBRE LA cALIDAD EMBRIONARIA J. L. de Pablo1, C. Anarte1, A. Domingo1, I. Ausin1, J. A. Agirregoikoa1,2, G. Barrenetxea 1,2 . 1 Quirón Bilbao, Unidad de Reproducción Asistida, Vizcaya, España. 2 Universidad del País Vasco (UPV), Vizcaya, España. e-mail: jdepablo.bil@quiron.es INTRODUCCIÓN La transferencia se realizó en día 3 del diferentes tipos celulares y podría ser desarrollo embrionario. una técnica alternativa en este tipo de Muchos estudios sugieren que las pacientes. alteraciones en el genoma paterno El estudio estadístico se llevó a cabo comprometen la tasa de fecundación, con el programa SPSS V.16 para Mac. la calidad embrionaria y viabilidad, lo que lleva a abortos espontáneos. RESULTADOS El ADN porta la información genética y por ello el espermatozoide debe No se encontraron diferencias contener la molécula de ADN íntegra significativas entre los dos grupos e intacta cuando fecunda al ovocito. ni en la edad ni en el número de Se sabe que la fragmentación de ADN ovocitos obtenidos (p>0,05). Sin de los espermatozoides es una de las embargo la calidad embrionaria sí principales causas de esterilidad en mostró diferencias estadísticamente el hombre y provoca en ocasiones el significativas, siendo mayor el número fracaso en las Técnicas de Reproducción de embriones de calidad óptima (A) en Asistida. el grupo 2, (p=0,004). OBJETIVO La tasa de embarazo fue similar en ambos grupos, no mostrando Valorar el efecto de la fragmentación diferencias significativas (p>0,05) del DNA espermático (FDE) en la entre ambos grupos. fecundación, calidad embrionaria y tasa de éxito en los resultados. CONCLUSIONES MATERIALES Y MÉTODOS Está demostrado que los espermatozoides con el DNA Estudio retrospectivo donde se fragmentado pueden fecundar incluyeron 121 ciclos de parejas a las que el ovocito con la misma eficacia se les había realizado uno o más ciclos que los espermatozoides sin DNA de FIV/ICSI previos fallidos. Quedan fragmentado. Sin embargo, en este excluidos los ciclos del programa de estudio la calidad embrionaria sí se donación ovocitaria. ve afectada por la fragmentación, ya que se observa un mayor número de La FDE se evaluó mediante TUNEL embriones de calidad óptima en día 3 de (Terminal deoxynucleotidyl transferase desarrollo embrionario en el grupo de dUTP nick end labeling). fragmentación normal, aunque no tiene repercusión en las tasas de embarazo. Los pacientes se dividieron en dos grupos. El grupo 1 con alto porcentaje Aunque el ovocito maduro tiene la de fragmentación del DNA (≥20) y el capacidad de reparar el daño moderado grupo 2 con fragmentación normal del en el DNA del espermatozoide, DNA (<20). realmente no sabemos bien qué solución se le puede dar a las pacientes con alto Los embriones fueron evaluados porcentaje de fragmentación de DNA. según los criterios de la Asociación La selección celular mediante la técnica para el Estudio de la Biología de la de separación magnética o técnica Reproducción (ASEBIR), siendo A la MACS (magnetic activated cell sorting) calidad embrionaria óptima, B buena utilizando Anexina V se ha empelado en calidad, C calidad regular y D mala muchos campos con el fin de eliminar calidad embrionaria. el porcentaje de células apoptóticas en
- 88. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 86 005: EL USO DE LAS cOLUMNAS DE ANEXINA (MAcS) EN PAcIENTES cON FRAGMENTAcIÓN DE ADN EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS MEJORA LA cALIDAD EMBRIONARIA Y LA TASA DE EMBARAZO Y. Franco, MJ. Lázaro, I. Lizaso, M. García, S. Cornago, N. Maiz, I. Alzola Centro Sanitario Virgen Del Pilar e-mail: josufranco@hotmail.es INTRODUCCIÓN RESULTADOS La fragmentación de ADN espermático Tras realizar 10 ciclos de FIV empleando (>30%) está asociada con un pobre las MACS, hemos observado una desarrollo de blastocisto, división mejora en la calidad embrionaria en desigual, fallos de implantación o el momento de la transferencia: 52% pérdida temprana del embarazo. de embriones de calidad A, 39% de B y La fragmentación del ADN en 9% de tipo C, no habiendo embriones espermatozoides es un marcador de calidad D. Además, en 3 casos se apoptótico expresado mediante la realizó congelación de los embriones externalización de fosfatidilserina (PS). sobrantes. Obtuvimos embarazo La Anexina V es una proteína fosfolípido- en 6 parejas (60%), de las cuales 2 dependiente con alta afinidad por la PS. abortaron. En otros 2 casos se realizó un ciclo posterior de criotransferencia OBJETIVOS con resultado positivo. Evaluar la eficiencia y beneficios del uso CONCLUSIONES de las MACS para la preparación seminal en pacientes con fragmentación de ADN El uso de las columnas de Anexina V elevada y fallos previos de FIV. antes de la realización del ICSI, en pacientes con un elevado porcentaje MÉTODOS de fragmentación, resulta efectivo ya que se logra una mejora en la calidad Desde Abril de 2010, en las parejas que embrionaria. A la vista de nuestros acuden a nuestro servicio valoramos resultados, la identificación de no sólo el resultado del seminograma, marcadores apoptóticos y el uso de las sino también el diagnóstico de la MACS sería beneficioso para pacientes fragmentación de ADN espermático. de FIV con elevada fragmentación y en Después de evaluar la fragmentación en parejas con fallos previos de ICSI. 88 parejas, encontramos en 12 de ellas un resultado mayor del 30% (14% de diagnósticos alterados). De estas 12 parejas, 4 se habían realizado tratamientos de ICSI previos sin resultado de niño en casa. La calidad embrionaria de estos 4 ciclos, siguiendo los criterios de ASEBIR, fue: 16% de calidad A, 25% de B, 42% de tipo C y 17% de calidad D. A partir de los resultados obtenidos de la fragmentación espermática, se realizó un ciclo de ICSI a 10 de las 12 parejas, preparando el semen mediante swim-up y posteriormente procesando la muestra mediante la técnica de las MACS antes de la realización del ICSI.
- 89. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 87 006: cAMBIOS cITOMORFOLÓGIcOS TRAS LA cONGELAcIÓN/ DEScONGELAcIÓN EN SUJETOS NORMOS, ASTENOS Y OLIGOZOOSPÉRMIcOS. 1 MJ. Gómez-Torres, 1LL. Medrano-López, 1,2A. García, 1EM. García, 2PJ Fernández-Colom, 1J. De Juan. 1 Deparmento de Biotecnología, Universidad de Alicante. 2 Servicio de Ginecología (Reproducción Humana), Hospital Universitario y Politécnico La Fe de Valencia. e-mail: mjose.gomez@ua.es INTRODUCCIÓN (MEB); el citoesqueleto mediante En cuanto al patrón discontinuo, la detección de α-tubulina con una éste fue mayor tanto en normos La técnica de criopreservación por inmunocitoquímica indirecta; la como en astenozoospérmicos versus congelación lenta para espermatozoides integridad del DNA con la técnica TUNEL; oligozoospérmicos (p<0,05). Por el humanos es utilizada habitualmente la reacción acrosómica espontánea por contrario, tras la descongelación no se en las clínicas de fertilidad, ya que inmunocitoquímica directa marcando la encuentran diferencias intergrupales. permite preservar la capacidad lectina PSA conjugada con FITC. Además se observó que, tanto antes fecundante del espermatozoide. Pero como después de la congelación, el es necesario estudiar los efectos que RESULTADOS patrón más abundante fue el total. produce el proceso de congelación/ Sin embargo previa congelación el descongelación en la ultraestructura En cuanto a la morfología, se observó segundo patrón más abundante fue la del espermatozoide y ver si puede haber que en muestras en fresco no se dan fluorescencia discontinua, mientras que correlación con las alteraciones del diferencias significativas entre las tres en las descongeladas fue el marcaje final. seminograma. Algunos estudios han patologías, sin embargo la alteración demostrado que disminuye la motilidad, más abundante que observamos tras Con respecto al núcleo, antes de la la viabilidad y la morfología tras dicho congelación/descongelación fue la congelación no encontramos diferencias proceso. presencia de colas enrolladas, hecho que significativas en el porcentaje de se corrobora con imágenes obtenidas células TUNEL positivas en las tres OBJETIVOS con MEB. Además, en muestras patologías estudiadas. Sin embargo oligozoospérmicas descongeladas, se tras la descongelación observamos un Evaluar los daños citomorfológicos que observa un mayor porcentaje de daños aumento significativo en el porcentaje produce la congelación/descongelación en la pieza intermedia que podría ser de células con el ADN dañado solo en las en el espermatozoide humano y debido a que la baja concentración muestras oligo y astenozoospérmicas. comprobar si existe correlación entre las de células hace que la concentración alteraciones observadas y la patología de crioprotector sea mayor en estas CONCLUSIÓN seminal. muestras. El índice de teratozoospermia reveló que las muestras que presentan Según los resultados obtenidos, el MATERIAL Y MÉTODOS oligozoospermia tienen un mayor proceso de congelación/descongelación número de defectos combinados tanto afecta en mayor medida al acrosoma, en Para este estudio se utilizaron 33 muestras en fresco como en descongelado. segundo lugar a la integridad del ADN y seminales (16 normozoospérmicos, por último a la morfología. Estos daños 12 astenozoospérmicos y 5 Tras la descongelación observamos un citomorfológicos fueron mayores en oligozoospérmicos) entre voluntarios mayor porcentaje de espermatozoides que las muestras oligozoospérmicas tras y pacientes incluidos en el Programa de han sufrido la reacción acrosómica tanto congelación/descongelación. Reproducción Asistida del Servicio de en normos, astenos y oligozoospérmicos. Ginecología del Hospital Universitario Los cambios a nivel del acrosoma también y Politécnico La Fe de Valencia. Cada se observaron en MEB. muestra se dividió en dos alícuotas; una se sometió al estudio en fresco Al estudiar el citoesqueleto, se y otra al análisis tras congelación/ establecieron tres patrones diferentes descongelación. El tiempo de para la inmunolocalización de la crioconservación fue de 7 días en α-tubulina: marcaje total, discontinuo nitrógeno líquido y la descongelación y segmento final de la cola. En las se realizó a temperatura ambiente. Pre muestras previas a la congelación en y post congelación se evaluaron los los casos de oligozoospermia, el patrón siguientes parámetros: morfología con más abundante fue el marcaje total al la técnica de Papanicolau y mediante compararlo con los normozoospérmicos microscopia electrónica de barrido y los astenozoospérmicos (p<0,05).
- 90. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 88 007: PREDIccIÓN DE LA IMPLANTAcIÓN MEDIANTE ANÁLISIS MULTIVARIABLE BASADO EN LA MORFOcINÉTIcA EMBRIONARIA UTILIZANDO UN SISTEMA AUTOMÁTIcO DE cINEMATOGRAFÍA. M. Meseguer, J. Herrero, A. Tejera, T. Viloria, A. Delgado, M.J. De Los Santos IVI Valencia e-mail: marcos.meseguer@ivi.es INTRODUCCIÓN evolutivo del 49,8% (n=142). Un total de de los 5 grados (A a E) sea casi igual. 50 embriones transferidos presentaron Para resolver aquellos casos donde los La observación embrionaria mediante el siguiente comportamiento mejores embriones pertenecen a la cinematografía permite optimizar la anormal: división directa de zigoto misma categoría, los grados de A a D clasificación morfológica y también a 3 blastómeras (t3-t2<5hrs) (n=9); se subdividieron por la variable cc2; proporcionar nuevos parámetros tamaño de blastómeras asimétrico positiva si cc2 ≤ 12 hr, negativa en caso cinéticos que pueden ayudar a la en estadio de dos células (volumen contrario. En resumen utilizando este selección de embriones viables. de blastómera A ≥ 2x el volumen de modelo se obtuvieron 9 grados, donde A+ la B) (N=26); o multinucleación en el es la categoría con mayores expectativas OBJETIVO estadio de 4 células (> de 1 núcleo en de TI (70%) y E la menor (8%). una blastómera) (n=28). De estos 50 Identificar los parámetros morfocinéticos embriones solo 4 implantaron (8%). En CONCLUSIONES como los tiempos y los intervalos entre consecuencia estos comportamientos divisiones celulares y las diferencias anómalos se utilizaron como criterios Los parámetros de time-lapse se entre éstos y los embriones que de exclusión morfológica. relacionan con la TI en el presente implantaron o no. análisis, generándose un modelo Los embriones fueron clasificados en multivariable para estimar la METODOLOGÍA cuartiles con respecto a cada uno de probabilidad de implantación que los siguientes parámetros de tiempo t2, mejoraría considerablemente el proceso La monitorización embrionaria se t3, t4, t5, s2 y cc2. Aquellos embriones de selección embrionaria. realizó con imágenes tomadas cada que se situaron en los 2 cuartiles con 15 minutos en 5 planos focales las mayores tasas de implantación (TI) diferentes durante al menos 68 horas se agruparon generándose 6 variables en un incubador con una cámara binarias. Un análisis de regresión incorporada (EmbryoScope™, Unisense logística aplicada para seleccionar FertiliTech, Aarhus Denmark). De los y organizar estas variables binarias 285 tratamientos de ICSI con 522 encontró que t5 OR=3.31 (CI95% embriones transferidos seleccionamos 1.65-6.66) seguida de s2 OR=2.04 247 para un análisis detallado (CI95% 1.03-4.07) y cc2 OR=1.84 basado en la implantación: 100% (CI95% 0.95-3.58) fueron las variables implantación (n=61) (el número de más relevantes para identificar los sacos gestacionales coincidió con el embriones implantados. número de embriones transferidos); o 0% de implantación (n=186) (no Se generó un modelo jerárquico para hubo embarazo bioquímico). El clasificar a los embriones en función tiempo se expresó en horas tras ICSI e de su potencial de implantación. El identificamos los tiempos de división a grado menor E cumplía uno o más de dos células (t2), 3 (t3), 4, (t4) y 5 (t5). los criterios de exclusión y tenía las La duración del segundo ciclo celular se menores posibilidades de implantar. definió como cc2=t3-t2. La sincronía se La aplicación jerárquica de la variable definió como la duración de la división primaria; t5 (si 49.4 ≤ t5 ≤ 56.5 hr de 2 a 4 células; s2=t4-t3. grado A o B, si no grado C o D) y la variable secundaria: s2 (si s2 ≤ 0.75 RESULTADOS hr grado A o C, si no el B o D) divide los embriones restantes en 4 grados De los 522 embriones transferidos, en orden decreciente de TI. Utilizando un total de 201 implantaron (38,5%). los criterios basados en cuartiles La tasa de embarazo bioquímico fue aseguramos que el número de los del 55,1% (n=157) y la de embarazo embriones transferidos en cada uno
- 91. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 89 0 08: ¿PUEDE LA RESPIRAcIÓN EMBRIONARIA PREDEcIR LA IMPLANTAcIÓN? A. Tejera1, J. Herrero1, N. Ramsing2, M. J. De los Santos1, M. Meseguer1. 1 IVI Valencia, Laboratorio FIV, Valencia. 2 Unisense Fertilitech, Designand Development, Aahrus, Dinamarca. e-mail: alberto.tejera@ivi.es INTRODUCCIÓN creando un gradiente de concentración (T o C) y los de peor (NV), siendo éstas de O2 dentro del pocillo, que es medido más acusadas a partir de las 52,2 horas La clasificación embrionaria actual por un microelectrodo resultando una hasta el momento de la transferencia: que se usa de forma rutinaria en el tasa de respiración en fentomoles de 4,96 fmol/sec para los T, 4,94 fmol/ laboratorio está basaba exclusivamente oxígeno por segundo (fmol/sec). sec para los C y 4,57 fmol/sec para los en la evaluación morfológica, siendo NV. Los embriones que implantaron subjetiva y poco efectiva. Aunque los Las tasas de respiración fueron presentaron una mayor tasa de RE embriones transferidos en estadio de analizadas por intervalos de tiempo, comparados con los que no (p<0.001), blastocisto son capaces de implantar tomando como referencia el momento encontrando las mayores diferencias en aproximadamente el 50% de los de la microinyección. Los intervalos a partir de las 52 horas post-ICSI, que casos, no todos los embriones pueden vienen determinados por los cuartiles: podría coincidir con el momento de alcanzar dicho estadio in vitro, por I1= <17.2 h; I2= 17.2-35.0 h, I3=35.0- transición de activación del genoma lo que la utilización de marcadores 52.1 h, I4= > 52.1 h. El consumo de ovocitario a embrionario. tempranos de evolución podría oxígeno obtenido fue comparado servir como herramienta útil en la entre los diferentes intervalos, y CONCLUSIONES selección embrionaria. El consumo correlacionado tanto con el destino final de oxígeno está considerado como del embrión (transferido, T; congelado, La medición del consumo de oxígeno uno de los métodos no invasivos más C; o no viable, NV), como con la tasa de se plantea como un marcador objetivo representativos acerca del metabolismo implantación. De todos los embriones de calidad embrionaria pudiendo embrionario, pues está directamente transferidos nos centramos en 57 emplearse como criterio de selección relacionado con la producción de ATP embriones en los cuales conocimos temprano. La tasa de respiración de los durante el desarrollo embrionario, no con exactitud su implantación, ya sea embriones varía en función del estadio existiendo antecedentes descritos en la 100% (n=9) donde el número de sacos evolutivo, de la calidad de éstos, y de su literatura de su uso clínico. gestacionales coincidía con el número capacidad para implantar. de embriones transferidos o 0% (n=48). OBJETIVO Por otro lado la respiración embrionaria RESULTADOS en torno al tercer día de desarrollo se Analizar la variación en la tasa de correlaciona más fuertemente con el consumo de oxígeno durante todo el La tasa de respiración embrionaria (RE) potencial de implantación del embrión. desarrollo embrionario e identificar fue decayendo de forma significativa diferencias en los perfiles de respiración (p<0.0001) para cada intervalo de Hará falta realizar estudios prospectivos entre los embriones implantados vs no tiempo analizado, siendo I1 = 5.34 que corroboren la utilidad de este implantados con el fin de encontrar fmol/sec (CI95% 5.31-5.36), I2 = parámetro como una buena herramienta marcadores tempranos de predicción de 5.17 fmol/sec (CI95% 5.15-5.20), I3 de selección embrionaria. implantación. = 4.81 fmol/sec (CI95% 4.78-4.84) e I4 = 4.59 fmol/sec (CI95% 4.56-4.62). MATERIAL Y MÉTODOS Atendiendo al destino final del embrión, en las primeras fases de desarrollo las Estudio prospectivo observacional tasas de RE fueron muy similares para donde realizamos un total de 47741 las 3 categorías, pero a medida que mediciones de consumo de oxígeno continúa su desarrollo encontramos embrionario en 575 embriones en un diferencias entre los de mayor calidad programa de donación de ovocitos de 1er ciclo con transferencia a las 72 Intervalos de tiempo I1=<= 17,2 I2=17,2 - 35,0 I3=35,0 - 52,1 I4=>52,2 h post-ICSI. Las tasas de respiración fueron obtenidas mediante el cultivo Embriones no implantados 5,75 5,38 4,98 4,86 (fmol/sec) individual de los embriones en un incubador especial (EmbryoScope, Embriones implantados 6,27* 5,84* 5,55* 5,75* Unisense FertiliTech). A medida que el (fmol/sec) embrión va consumiendo oxígeno se va
- 92. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 90 0 09: FALLOS DE FEcUNDAcIÓN TRAS FIV/IcSI: NUEVAS ESTRATEGIAS DE INTERPRETAcIÓN PARA EL DIAGNÓSTIcO M. Ferrer, E. Ferrer, M. Muñoz, M. Vila, V. Y. Rawe CREA, Centro Médico de Reproducción Asistida; Valencia e-mail: minerva.ferrer@creavalencia.com INTRODUCCIÓN acetilada (flagelo espermático) se ausencia de espermatozoide en el realizó con anticuerpos primarios y citoplasma ovocitario. Tras un ICSI La entrada del espermatozoide al secundarios Invitrogen-Molecular la causa principal es la no activación citoplasma del ovocito maduro debe Probes. El DNA se visualizó usando ovocitaria acompañada de fallos provocar la activación ovocitaria, que se Hoescht 33342 Invitrogen-Molecular de descondensación del núcleo inicia con eventos como la reacción cortical Probes. Se realizó análisis bajo espermático, mientras que la extrusión y el reensamblaje de los microtúbulos de microscopio de epifluorescencia. del espermatozoide por el surco de tubulina en el citoplasma, entre otros. Se microinyección es la menos frecuente. producirán oscilaciones de niveles de Ca+2 RESULTADOS intracelular y una consecuente inhibición Según la bibliografía la falta de del MPF citoplasmático (Mitosis Promoting De 124 ovocitos no fecundados, 16 activación ovocitaria puede deberse Factor). Éstas son las claves para liberar ovocitos fueron informativos tras FIV a una incompetencia citoplasmática, al ovocito del bloqueo en Metafase II y (72,7%) y 88 ovocitos tras ICSI (86,3%). probablemente debida a defectos en reanudar el proceso meiótico que culmina la homeostasis del Ca2+ y/o a defectos con un ovocito de dotación haploide tras la Se observó ausencia de espermatozoide en la inhibición del MPF. En el análisis extrusión de su segundo corpúsculo polar. en el ovocito tras la inseminación en un inmunocitoquímico, esta situación se El proceso de fecundación continuará 43,8 % en los casos de FIV y en un 14,8% manifiesta como una condensación con la formación y correcta aposición de los casos de ICSI. prematura de cromosomas paternos (PCC). de pronúcleos y el inicio del desarrollo embrionario temprano. El uso de Tras la entrada del espermatozoide, En otras ocasiones la falta de activación métodos de fluorescencia para visualizar el fallo de activación ovocitaria sin ovocitaria aparece combinada con estructuras intracelulares se introduce formación de pronúcleos ni extrusión defectos en la descondesación del en el laboratorio de embriología como del segundo corpúsculo polar se observó núcleo espermático, sobre todo en casos una nueva estrategia de diagnóstico de en un 31,2% de casos de FIV y en un 53,4 de baja calidad de los espermatozoides. las causas del fallo de fecundación. % de casos de ICSI. La inmunofluorescencia es una OBJETIVOS Situaciones de fallo de activación herramienta útil para el estudio ovocitaria combinadas con de alteraciones citoesqueléticas y Interpretación y definición de las condensación prematura de nucleares en ovocitos y espermatozoides distintas causas de un fallo de cromosomas (PCC) aparecen en el que no fecundaron. fecundación mediante técnicas 14,8% de los casos, con fallo parcial inmunocitoquímicas para el diagnóstico de descondensación del núcleo en casos de fecundación subóptima (tasa espermático en un 20,5% y un 18,2% de fecundación < 50 %) o fallos totales. mostró fallo total de descondensación del núcleo espermático. MATERIAL Y MÉTODOS Se observan otras situaciones menos Se estudiaron 124 ovocitos que no frecuentes como defectos en la mostraron pronúcleos dentro del formación y aposición de pronúcleos intervalo de 16 a 20 horas post (8,6%), detención en la primera inseminación/microinyección, ni división división mitótica (2,8%), activación celular transcurridas al menos 27 horas partenogenética derivada de la post inseminación/microinyección. manipulación (3,8%) y rotura de la inserción cabeza-flagelo espermático Tras la eliminación de la zona pelúcida o microinyección sobre la placa con ácido tyrodes, los ovocitos se fijaron metafásica del ovocito (0,96%) y permeabilizaron con una solución de formaldehído 2% y Triton-X. CONCLUSIONES El marcaje de tubulina total La causa mayoritaria de fallo (citoesqueleto del ovocito) y tubulina de fecundación tras un FIV es la
- 93. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 91 010: MARcAJE DIREcTO DE EMBRIONES DE RATÓN PARA SU IDENTIFIcAcIÓN MEDIANTE ADHESIÓN DE MIcROcÓDIGOS A LA ZONA PELÚcIDA S. Novo1, O. Penon2,3, R. Gómez4, Ll. Barrios1, M. Duch4, J. Esteve4, J. Santaló1, C. Nogués1, J. A. Plaza4, Ll. Pérez-García 2,3, E. Ibáñez1 1 Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193, Bellaterra. 2 Departament de Farmacologia i Química terapèutica, Facultat de Farmàcia. 3 Institut de Nanociència i Nanotecnologia, Universitat de Barcelona. 4 Institut de Microelectrònica de Barcelona IMB-CNM (CSIC). e-mail: sergio.novo@uab.cat e-mail: elena.ibanez@uab.cat INTRODUCCIÓN Tanto la viabilidad (comparada con en la retención, la tasa de identificación un grupo no codificado) como la tasa no se vio afectada y se mantuvo en La correcta identificación de las de retención de los códigos fueron porcentajes similares (n= 171; 97.1%) a muestras durante la aplicación de determinadas durante las 96h de cultivo. los del grupo no criopreservado. técnicas de reproducción asistida Se realizaron test de identificación humana es primordial para evitar cada 24h bajo un microscopio CONCLUSIÓN errores de trazabilidad. Nuestro grupo invertido sin la manipulación del trabaja en el desarrollo de un sistema embrión, con el objetivo de simular Con el sistema descrito en este trabajo, de identificación directo para ovocitos/ un sistema automático de lectura. establecemos un método más sencillo de embriones. En un trabajo anterior Además, la efectividad del sistema de incorporación de códigos a embriones, presentamos un sistema basado en la codificación fue testada tras procesos con una tasa de identificación (96.5%) incorporación de códigos de polisilicio de criopreservación. equivalente a la del método anterior en el espacio perivitelino (1), logrando (97%) y que soluciona las limitaciones resultados satisfactorios. No obstante, RESULTADOS descritas. El siguiente paso será analizar este sistema muestra limitaciones la viabilidad in vivo de los embriones tales como el uso imprescindible de El desarrollo in vitro hasta blastocisto de de ratón codificados y optimizar este micromanipulación y que algunos los embriones codificados (n= 140; 90%) sistema de codificación para otras códigos quedan adheridos a la superficie fue equivalente al del grupo control (n= especies de interés, con el objetivo de del embrión después de eclosionar. 60; 88.3%). Una media de 9.56 ± 0.7 mejorar la trazabilidad de las muestras Con el objetivo de superar estas códigos por embrión se mantuvieron asociada a la aplicación de las técnicas limitaciones, en el presente trabajo unidos a la ZP después de 96 h de cultivo de reproducción asistida. se plantea una posible alternativa: un (10 códigos: 65.9%; 9 códigos: 26.2%; sistema de identificación basado en la 8 códigos: 6.3%; 7 códigos: 1.6%). La [1] S. Novo, L. Barrios, J. Santaló, R. Gómez- incorporación de códigos de polisilicio tasa de identificación fue evaluada en Martínez, M. Duch, J. Esteve, J.A. Plaza, C. biofuncionalizados para su adhesión a 100 embriones, obteniendo valores del Nogués, E. Ibáñez. Human Reproduction, la zona pelúcida (ZP). 95.7% al 97.9% en los diferentes puntos 26: 96-105 (2011). de análisis (cada 24 h). En total, 470 de MATERIAL Y MÉTODOS los 487 procesos identificatorios fueron positivos (96.5%). Se codificaron embriones en estadio de pronúcleo de la cepa B6CBAF1 Finalmente, se evaluó la validez del con códigos de polisilicio (10 x 6 x 1 sistema de identificación tras procesos μm), fabricados utilizando técnicas de criopreservación. Se codificaron de microelectrónica (1). Los códigos 44 embriones en estadio de pronúcleo fueron biofuncionalizados utilizando y a las 24h de cultivo se congelaron la técnica de autoensamblaje de (estadio de 2 células). La viabilidad monocapas con la lectina del germen de los embriones codificados después del trigo, la cual se une específicamente de la descongelación (95.5%) fue a monosacáridos presentes en las equivalente a la del grupo control (n=30; glicoproteínas que forman la ZP. 90%). La tasa de retención disminuyó a Los embriones fueron codificados 8.8 ± 1.2 códigos por embrión después individualmente mediante el contacto de la descongelación, y hasta 8.7 ± 1.2 con 10 códigos biofuncionalizados, al final del periodo de cultivo in vitro previamente colocados de forma (10 códigos: 33.2%; 9 códigos: 28.6%; estratégica para lograr una distribución 8 códigos: 16.7%; 7 códigos: 16.7%; 6 uniforme sobre la superficie de la ZP. códigos: 4.8%). A pesar del descenso
- 94. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 92 011: PRESERVAcIÓN DE LA FERTILIDAD EN PAcIENTES ONcOLÓGIcAS: cOMBINAcIÓN DE cRIOPRESERVAcIÓN DE TEJIDO OVÁRIcO Y MADURAcIÓN IN VITRO DE OVOcITOS P. Torres1, E. Novella-Maestre2, J.M. Rubio1, I. Peinado1, P.Polo1, M. Romeu1, M. Andrés3, A. Pellicer1. 1 Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología), Hospital Universitario La Fe, Valencia. 2 Unidad de Genética, Hospital Universitario La Fe, Valencia. 3 Unidad de Oncología Pediátrica, Hospital Universitario La Fe, Valencia. e-mail: patriblanc81@hotmail.com INTRODUCCIÓN RESULTADOS La criopreservación de tejido ovárico En las pacientes adultas, los niveles (CTO) ofrece la posibilidad de preservar séricos de FSH y AMH antes de la CTO-IVM gametos en pacientes con riesgo a fueron de 4.7±2.3 mU/mL y 27.7±21.7 desarrollar fallo ovárico precoz (FOP). ng/mL respectivamente, y se recuperó Debido a que los folículos antrales un total de 77 (5.9±5.2) ovocitos: El presentes en el ovario no sobreviven 83.1 % (4.9±4.3) Vesícula germinal al protocolo de criopreservación, es (VG), el 7.8 % (0.5±1.1) Metafase I (MI), posible recuperarlos y complementar la el 3.9 % (0.2±0.6) Metafase II (MII) y CTO con la Maduración in Vitro (MIV) de el 5.2 % (0.3±0.6) ovocitos atrésicos. ovocitos. En las pacientes pediátricas, los niveles séricos de FSH y AMH antes de la CTO-IVM OBJETIVO fueron de 2.3±1.0 mU/mL y 4.9±4.7 ng/ mL respectivamente y se recuperaron Obtener un mayor rendimiento un total de 24 (4.0±2.7) ovocitos: 54.2 del protocolo de CTO, combinando % (2.2±1.6) VG, 4.2 % (0.2±1.6) MI, 0 dicha técnica con la MIV de ovocitos % MII y 41.7 % (1.7±2.7) de atrésicos. recuperados del tejido ovárico. Tras 36 horas de cultivo en medio MIV, se obtuvo un 27.1 % (1.5±1.2) de MII en MATERIAL Y MÉTODOS pacientes adultas y un 14.3 % (0.5±0.8) MII en pacientes pediátricas. La tasa de Se incluyeron 13 pacientes adultas en ovocitos degenerados durante el cultivo el programa CTO-MIV: 10 pacientes con in vitro fue de 22.9 % (1.2±1.8) en cáncer de mama (CM) en etapas I-III, pacientes adultas y de 21.4 % (0.3±0.5) con edad media: 31,5 años (26-40) y 3 en pacientes pediátricas. pacientes con linfoma de Hodgkin (LH), de edad media: 23,7 años (18-33). CONCLUSIÓN Ninguna de las pacientes anteriores había recibido quimioterapia previa La combinación de CTO y MIV de al protocolo CTO-IVM. Además, se ovocitos inmaduros puede considerarse incluyeron 6 pacientes pediátricas con una opción accesible que amplía las Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) posibilidades de preservación de la con media de edad de 8,7 años (3-15), fertilidad en pacientes oncológicas con 4 de las cuales habían sido tratadas con riesgo de fallo ovárico post-tratamiento. quimioterapia antes de llevarse a cabo Son necesarios futuros estudios para la técnica de CTO-IVM. Previamente a optimizar la formulación de los medios la criopreservación, se aspiraron los de cultivo de MIV y conseguir disminuir folículos antrales visibles (<10 mm) de la tasa de degeneración ovocitaria en la superficie cortical ovárica utilizando estos casos. una aguja de 20g conectada a una jeringa de 1 mL y se cultivaron durante 30-36 h en medio IVM suplementado con FSH, hCG y suero humano inactivado. Se vitrificaron los ovocitos que alcanzaron el estadio de Metafase II tras el periodo de cultivo in vitro.
- 95. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 93 012: INFLUENcIA DE LAS UNIONES ADHERENTES MEDIADAS POR E-cADHERINA EN LA DERIVAcIÓN DE cÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS DE RATÓN S. González, E. Ibáñez, J. Santaló Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia. Unitat de Biologia Cel·lular. Facultat de Biociències. Universitat Autònoma de Barcelona. e-mail: Josep.Santalo@uab.cat INTRODUCCIÓN producida por la E-cadherina nativa a las 24 h y la derivación de mESCs cuando dos o más blastómeros (33.6%; p<0.0001) respecto al grupo La derivación de líneas de células contactan a través de ella. control sin E-cad-Fc (2.2%), igualando madre embrionarias (ESCs) a partir de las tasas producidas por el grupo de dos blastómeros aislados se inició con el El análisis del efecto de la E-cad-Fc se blastómeros aislados en estadio de 8 objetivo de minimizar los problemas analizó en la tasa de proliferación de los células (2/8) que presentan uniones de éticos derivados de la destrucción de blastómeros 1/8 y en la derivación de E-cadherina nativa (23.3%). embriones humanos y para incrementar mESCs y de células madre trofoblásticas las posibilidades de derivar una línea de ratón (mTSCs). CONCLUSIONES a partir de un embrión valioso por sus características biológicas. RESULTADOS: La E-cad-Fc durante una exposición de 24 h incrementa la tasa de división de Las uniones adherentes mediadas por Unión de la e-cad-Fc los blastómeros 1/8 y la derivación de E-cadherina aparecen en el estadio líneas de mESCs. Este incremento podría de 8 células y son importantes en la La E-cad-Fc se unió a la superficie ser consecuencia de la distribución proliferación. Se ha determinado su de los blastómeros 1/8 durante una simétrica de la E-cad-Fc que favorecería importancia en el mantenimiento de las incubación en medio de cultivo DMEM la formación de células con un fenotipo líneas de ESCs tanto murinas (mESCs) estándar en presencia de calcio, similar al de la masa celular interna como humanas (hESCs). mostrando una distribución simétrica tal como sucede durante el desarrollo por toda la superficie. embrionario. Una estrategia de este Resultados previos en nuestro tipo aplicada a embriones de especial laboratorio demostraron un bajo eFecTo de Una exPosición larga a la interés podría incrementar la eficiencia porcentaje de división de los e-cad-Fc de derivación de ESC hasta tasas blastómeros únicos aislados en estadio próximas al 95%. de 8 células (1/8) una vez iniciado el A las 24 h del inicio del proceso proceso de derivación de mESCs y una de derivación, se observó que los AGRADECIMIENTOS baja eficiencia de líneas derivadas a blastómeros en presencia de la E-cad-Fc partir de dicho grupo. incrementaban significativamente la tasa Este trabajo se ha realizado con la de división (67%; p=0.003) respecto al financiación de los proyectos del OBJETIVOS grupo control sin E-cad-Fc (44.6%). Por Ministerio de Educación y Ciencia (MEC) el contrario, se observó que las colonias BIO 2006-11792 y de la Generalitat de El objetivo del presente estudio consiste que se formaban durante el proceso de Catalunya #2009SGR-00282. en determinar la influencia de las derivación eran de tipo trofoblástico y no uniones mediadas por E-cadherina en la embrionario, y además, la producción de tasa de proliferación de los blastómeros mESCs fue equivalente al grupo control 1/8 y en la derivación de mESCs a partir sin E-cad-Fc. del mismo grupo. La producción de líneas de mTSCs MATERIAL Y MÉTODOS también confirmó el incremento en la producción de células trofoblásticas en La importancia de la E-cadherina se el proceso de derivación. analizó a través de la utilización de una proteína quimérica constituida por el eFecTo de Una exPosición corTa a la dominio extracelular de la E-cadherina e-cad-Fc unido a la región Fc de la IgG1 humana (E-cad-Fc). La E-cad-Fc fue unida a la La restricción de la exposición a la superficie de los blastómeros 1/8 con E-cad-Fc a 24 h de nuevo incrementó el objetivo de simular la señalización significativamente la tasa de división
- 96. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 94 013: REDUcIR LOS ERRORES EN FIV: WITNESSING ELEcTRÓNIcO X. Orriols Brunetti1, S. Bird1, K. Bennett1, S. Rogers1, C. Ottolini1,2, L. Muriel Rios1, J. Taylor1, A. Thornhill1 1 The London Bridge Fertility, Gynaecology and Genetics Centre, Londres, Reino Unido 2 Department of Biosciences, University of Kent, Canterbury, Reino Unido. e-mail: x.brunetti@thebridgecentre.co.uk INTRODUCCIÓN permitiendo a los lectores registrar el actividades similares entre 0,21% y contenido y la identidad del paciente. 5%, la tasa de error real fue 0,11%. Tras varios incidentes que resultaron en Además, la mayor discrepancia de tiempo la asignación incorrecta de embriones, RESULTADOS registrada para un mismo procedimiento en 2002 la Autoridad reguladora para (12 minutos) podría ser la diferencia la Fecundación Humana y Embriología 420 pacientes fueron tratados entre entre el éxito y el fracaso a la hora de (HFEA, UK) impuso el doble witnessing, diciembre 2010/marzo 2011, generando efectuar un procedimiento condicionado es decir, 2 personas necesarias para 3694 pasos de witness. por el tiempo, como un ICSI. identificar gametos/embriones en todos los procedimientos de FIV. Sin Tiempo de procedimientos: Una muestra En resumen, RI Witness registra con TM embargo, el witnessing manual, puede aleatoria de ciclos (n=18) fue analizada exactitud todos los procedimientos generar errores humanos e incrementa para comparar el tiempo empleado según del laboratorio y detectó una tasa real la carga de trabajo y distracciones el witnessing manual vs. electrónico. de error baja. Otros beneficios son de los embriólogos. Además, la La discrepancia media entre ambos la reducción de la carga de trabajo y automaticidad involuntaria podría registros fue de 4 minutos y 28 segundos, distracciones, un mayor cumplimiento afectar negativamente a la seguridad encontrando la mayor diferencia en una de los PNTs a la vez que mejora la debido a la repetitividad, el exceso de IAC (12 minutos en 3 pasos de witnessing). precisión y eficiencia del witnessing, confianza en la otra persona y en la trazabilidad, productividad y auditorías. reducción de la atención. Asignación manual: Un total de En un futuro se espera, incluso, ahorrar 48/3694 (1,39%) acciones requirieron tiempo por procedimiento al no Para evitar estos problemas, se han la asignación manual de RFID por un necesitar la presencia de un segundo desarrollado sistemas automatizados administrador (ej. procedimientos fuera witness y determinar la verdadera de witnessing basados en códigos de del sistema prediseñado). Los errores tasa de error de nuestro laboratorio barras (Matcher y Trusty ) o Etiquetas TM TM relacionados con la manipulación para identificar maneras de reducir o de Identificación de Radio Frecuencia por embriólogos fueron 17 (35%), eliminar dichos errores. (RFID) (RI Witness ). Después de TM probablemente debidos a que el personal valorar los tres sistemas, en diciembre se centraba en el witnessing manual. 2010 RI Witness fue instalado en The TM 19 (40%) sucesos de etiquetado se Bridge Centre. relacionan con cortes de luz, fallos del servidor y procedimientos excepcionales OBJETIVO fuera de los PNTs. Los 12 sucesos restantes (25%) fueron errores del En este estudio, el witnessing manual sistema (ej. configuración incorrecta del y electrónico fueron empleados diseño del sistema y RFID dañadas). simultáneamente durante 4 meses para: (a) validar el sistema, (b) evaluar Errores: La tasa total de error fue de la tasa de error (ej. manipulación de dos 0,43% (16/3694). Excluyendo 8 errores placas de distintos pacientes en una relacionados con el diseño del sistema misma área de trabajo) y (c) analizar la (entre ellos, fallos en la configuración precisión y tiempo por procedimiento inicial del sistema; ej. ciclos que incluyen del witnessing electrónico. donación de ovocitos) y etiquetas RFID situadas involuntariamente dentro del MATERIALES Y MÉTODOS radio de lectura pero fuera del área de trabajo (4/3694), la tasa real de error, RI Witness usa tecnología RFID para TM producida por errores humanos, fue rastrear y registrar muestras de pacientes 0,11% (4/3694). en cada proceso de FIV. Campanas equipadas con lectores de RFID y pantallas CONCLUSIONES táctiles registran cada acción. Las etiquetas RFID autoadhesivas se colocan Comparando con datos de error en todos los tubos y placas de cultivo, publicados por laboratorios con
- 97. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 95 014: PAPEL DEL FUNGIBLE EN LA GENERAcIÓN DE cOMPONENTES VOLÁTILES ORGÁNIcOS (cVO) EN EL LABORATORIO DE FIV F. Marina, N. Pérez, N. Fosas, P. Martín, N. García, S. González, I. Mansilla, M. Rodero, A. Mauri, S. Marina Instituto de Reproducción CEFER. ANACER e-mail: info@institutocefer.com INTRODUCCIÓN RESULTADOS A finales de los años 90, descubrimos la importancia de la toxicidad de los llamados componentes volátiles orgánicos sobre nuestros cultivos embrionarios. A raíz de este descubrimiento, los laboratorios se lanzaron a equiparse con toda una serie de filtros para eliminar estos CVOs. La cromatografía de gases puede detectar e identificar qué tipo de CVOs contaminan nuestros laboratorios, pero es un método complejo para emplearlo de rutina. En la actualidad, disponemos de detectores de CVOs de fácil manejo que nos permiten medir la cantidad total de CVOs. En este trabajo pretendemos identificar el papel del material fungible utilizado en los laboratorios de FIV en la generación de CVOs. MATERIAL Y MÉTODO Hemos empleado el método de detección por fotoionización (ppbRAE-plus, RAE Systems) para detectar, en tiempo real, partes por mil millones de CVOs. Las medidas se han realizado en el momento de la apertura del paquete conteniendo el fungible y a los 5’, 30’, 1hora, 4h, 6h y 8h. Se dejó de medir cuando el resultado fue 0 o inferior a 10. DISCUSIÓN Los resultados muestran que casi todos los elementos testados emiten CVOs en el momento de la apertura del paquete, pero que rápidamente, con una simple ventilación, son eliminados. Existen importantes excepciones como los tapones de los tubos Falcon de 10 y 5 mL o las jeringas de 1 mL. Los laboratorios de FIV deberían tratar de eliminar todo tipo de fungible que emita CVOs y sustituirlos por material previamente aireado y embriotestado.
- 98. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 96 015: LA ELEccIÓN DEL MEDIO DE cULTIVO cOMO ESTRATEGIA DE MEJORA DE RESULTADOS C. Bou, D. Becerra, M. Testillano, A. Martínez, A. Rodríguez, F. Bronet IVI Madrid e-mail: carmen.bou@ivi.es INTRODUCCIÓN En las receptoras de ovocitos no vimos diferencia en tasa de fecundación (75,7 Los embriones in vitro están expuestos vs 75,8), ni de cancelación (25,1 vs a un mayor estrés que in vivo y su 27,2), pero detectamos diferencias en viabilidad depende de la composición, tasa de gestación clínica (63,0 vs 48,1. calidad y características físico químicas p=0.0043); de implantación (42,8 vs del medio de cultivo, así como de las 32,3. p=0,0046); y de gestaciones condiciones de cultivo. La elección del en curso (49,1 vs 36,4. p=0,0152). medio de cultivo a utilizar debe ser Separamos este grupo en dos subgrupos, dictada por los resultados dentro de su ovocitos frescos y vitrificados. entorno de laboratorio. Encontramos diferencias significativas entre Global y Sage en el grupo de OBJETIVOS ovocitos vitrificados en tasa de gestación clínica (69,5 vs 39,7. p=0,0003), Comparar resultados en nuestro implantación (46,5 vs 26,2. p=0,0006) programa de ovodonación y en y gestación en curso (57,9 vs 31 p= pacientes con ovocitos propios 0,0012). En cambio no había diferencias utilizando dos tipos de medios cuando comparamos los medios en las complejos de cultivo embrionario: receptoras de ovocitos frescos. LIFEGLOBAL y SAGE con el objetivo de sustituir al medio simple HTF utilizado CONCLUSIONES hasta el momento. Aunque los resultados no son MATERIAL Y MÉTODOS significativos cuando comparamos medios de cultivo en pacientes con Estudio prospectivo y randomizado ovocitos propios, la utilización de los realizado entre Septiembre 2009 medios de Sage muestra una tendencia y Febrero 2010 de 409 ciclos del de mejora en particular en la tasa de programa de ovodonación y 573 ciclos gestación en curso. En cambio en de pacientes con ovocitos propios. receptoras de ovocitos la diferencia En todos los casos la técnica de es claramente significativa a favor del inseminación ha sido la microinyección medio Global, sobre todo en ovocitos y el origen de los ovocitos podía ser vitrificados. Por esta razón en nuestro tanto fresco como vitrificado. laboratorio decidimos utilizar medios diferentes según el grupo de pacientes. El análisis estadístico se realizó con Chi cuadrado y t de Student siendo significativa si p<0,005 RESULTADOS En el grupo de pacientes con ovocitos propios comparamos 332 ciclos con Global y 241 con Sage. No observamos diferencias significativas en tasas de fecundación (71,6 vs 72,0), de gestación clínica (41,3 vs 44,5), de implantación (30,8 vs 33,42) y gestaciones en curso (34,4 vs 37,9), pero sí diferencia significativa en tasa de cancelación (3,92 vs 12,45. p=0,0001).
- 99. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 97 016: USO DE LA TEcNOLOGÍA DE LA LUZ POLARIZADA PARA LA cORREccIÓN DE LA POSIcIÓN DEL HUSO AcROMÁTIcO PREVIO AL IcSI A. Farreras1, M. Asensio1, P. Fernández1, C. Castelló1, B. Peramo1, M. López-Teijón1,2, Velilla E1 1 Institut Marquès, Barcelona; 2Fundación Leonardo Marquès, Barcelona. e-mail: silvia.fernandez@institutomarques.com INTRODUCCIÓN presencia o ausencia de huso meiótico así como su desviación respecto al El uso de la luz polarizada en técnicas corpúsculo polar. Se observó una de reproducción asistida permite la desviación del huso respecto al visualización in vivo del huso meiótico corpúsculo polar en el 82,8% de los y la birrefringencia de la zona pelúcida ovocitos, que se corrigió colocándolo en ovocitos. Se ha descrito que dichos a las 12h antes del ICSI. En el grupo II parámetros pueden ser indicativos se incluyeron 309 ovocitos que se les indirectos de la calidad ovocitaria, realizó ICSI sin utilizar el polarizador. elevadas tasas de fecundación y del Se compararon los resultados potencial de desarrollo del futuro obtenidos de tasa de fecundación, embrión. La aplicación de la técnica de competencia embrionaria y de en la visualización de ultraestructuras embarazo en ambos grupos. ovocitarias tales como el huso meiótico que nos permite localizar y corregir RESULTADOS la desviación del huso respecto la posición del corpúsculo polar para Se analizaron un total de 465 ovocitos realizar la técnica de la ICSI podría ser maduros, a 156 de los cuales se les aplicó una herramienta útil para mejorar el luz polarizada para la visualización del pronóstico del ciclo. Se ha descrito huso previo al ICSI (GI) y a 309 se les que la corrección del huso aumenta las realizó ICSI sin utilizar el polarizador tasas de fecundación y competencia (GII). No se observaron diferencias embrionaria en los casos en que se estadísticamente significativas en la analizan ovocitos propios y se mantienen tasa de fecundación, 77,7% (GI) vs a cultivo largo, pero se desconoce su 78,8% (GII)), de división embrionaria utilidad en ovocitos procedentes de en D+2, 97,9 % (GI) vs 98,4% (GII), donantes para la optimización del de embarazo/transfer en D+2, 50,0% programa de donación. (GI) vs 50,0% (GII)). La media de embriones transferidos por caso fue OBJETIVO estadísticamente equivalente en ambos grupos, 2,1 (GI) vs 2,3 (GII). Valorar la aplicación de la luz polarizada para la visualización y corrección de la CONCLUSIONES posición del huso meiótico previo a la microinyección en el programa de En base a nuestros resultados obtenidos donación de ovocitos de Institut Marquès podemos concluir que, en el programa en términos de tasa de fecundación, de de donación de ovocitos con cultivo competencia embrionaria en D+2 y de embrionario hasta D+2, la aplicación de embarazo evolutivo. la luz polarizada para la visualización del huso acromático previo al ICSI y la MATERIAL Y MÉTODOS posterior corrección del huso, no parece mejorar el pronóstico del ciclo. Se incluyeron un total de 71 donantes del programa de donación de Institut Marquès. Se establecieron dos grupos en función de si se aplicó o no la luz polarizada para la visualización del huso meiótico antes de realizar el ICSI: GI-luz polarizada-ICSI (P-ICSI), GII-Sin luz polarizada (ICSI). En el grupo I se incluyeron 156 ovocitos y se valoró la
- 100. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 98 017: ESTUDIO ALEATORIZADO PARA cOMPARAR LA EFIcAcIA DE DOS ESTRATEGIAS DE TRANSFERENcIA EMBRIONARIA EN UN HOSPITAL PÚBLIcO: RESULTADOS PRELIMINARES A. Clavero, J.A. Castilla, I. Molina, E.R. Palacios, A.P. Ortiz, S. Carrillo, J. Fontes Unidad de Reproducción. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada e-mail: ana.clavero.sspa@juntadeandalucia.es INTRODUCCIÓN Se considera embarazo clínico la CONCLUSIONES observación ecográfica de saco La transferencia electiva de un embrionario con latido cardiaco a Las tasas de embarazo obtenidas son embrión (SET) se postula como el las siete semanas gestacionales. Los elevadas en los dos grupos, lo que medio más eficaz en la reducción de los datos se analizan mediante test de indica que los criterios de inclusión embarazos gemelares en Reproducción Chi-cuadrado. parecen ser adecuados. Asistida. Sin embargo, queda mucho camino para su implantación RESULTADOS Dado que el tamaño muestral requerido definitiva en nuestro medio, ya que para alcanzar la significación estadística constituyeron sólo un 3,6% de las Se han incluido a 54 parejas hasta la en la tasa de gestación múltiple es transferencias embrionarias (TE) en fecha, habiéndose realizado ICSI, test de 11 embarazos en cada grupo, si la hospitales públicos, frente al 21,6% de β-hCG y ecografía a las 7 semanas tendencia a la elevada tasa de embarazos de centros privados. Por ello, creemos a 24 parejas. Además se excluyeron múltiples en el grupo 2 se confirma en necesaria la realización de estudios del estudio a 7 parejas (4 por obtener los siguientes ciclos realizados, nos aleatorizados que apoyen el uso de un solo embrión, 2 por gestación plantearíamos la finalización del estudio esta estrategia. espontánea y 1 por cancelarse dos por motivos éticos. ciclos). La aleatorización incluyó en OBJETIVOS el grupo 1 a 10 parejas y en el grupo 2 La acentuada diferencia en las tasas de a 14 parejas. Las tasas de embarazo/ embarazos múltiples parece confirmar la Comparar la tasa de embarazo y de TE fueron de 60% (6 embarazos) en el adecuada utilización de la transferencia embarazo múltiple de dos estrategias grupo 1 y 42,8% (6 embarazos) en el de un embrión en parejas de buen de TE: SET más criotransferencia de un grupo 2, no encontrándose diferencias pronóstico, dado que la tasa de embarazo embrión criopreservado y transferencia estadísticamente significativas. es elevada, y evitamos la principal de dos embriones. Respecto a los embarazos múltiples, en complicación de la Reproducción el grupo 1 la tasa fue del 0% y en el grupo Asistida: el embarazo múltiple. MATERIAL Y MÉTODOS 2 del 50% (3 embarazos múltiples), lo que debido al escaso tamaño muestral Estudio prospectivo aleatorizado, de tampoco resultó estadísticamente tres años de duración, durante los significativo. Calculando el tamaño que incluiremos a parejas de nuestra muestral requerido para alcanzar la Unidad de Reproducción que cumplan significación estadística en este punto, criterios de buen pronóstico. Todas las se necesitarían al menos 11 embarazos pacientes seguirán un tratamiento de en cada grupo. estimulación de la ovulación mediante protocolo de análogo largo. Tras la Tras la realización de cuatro recuperación ovocitaria se realiza desvitrificaciones, la tasa de microinseminación espermática (ICSI), supervivencia embrionaria fue transfiriéndose el/los embriones del 75%, realizándose por tanto 3 obtenidos al tercer día. Las parejas se criotransferencias que resultaron en asignarán aleatoriamente a uno de los una gestación (tasa gestación/crioTE siguientes grupos: del 33,3%). La tasa acumulada de gestación/ciclo en el grupo 1 ha sido -Grupo 1: SET. El mejor embrión no del 70% y un 14,2% de abortos. En transferido se crioconserva mediante el grupo 2 no se registraron abortos. vitrificación. En caso de no quedar Las tasas de implantación fueron gestante, se realizará un ciclo de del 53,8% en el grupo 1 y del 32,1% criotransferencia de un único embrión. en el grupo 2. En ninguno de estos parámetros encontramos diferencias -Grupo 2: DET. estadísticamente significativas.
- 101. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 99 018: TRANSFERENcIA DIFERIDA: ¿PRÁcTIcA RUTINARIA? M. Lierta, C. Roméu, J. Sánchez Rubio, A. Chueca, A. Urries. Reproducción Asistida Quirón Zaragoza, Grupo Hospitalario Quirón. e-mail: mlierta.zar@quiron.es INTRODUCCIÓN ha llevado a cabo en parejas que se CONCLUSIÓN sometieron a un ciclo de fecundación La transferencia diferida de embriones in vitro y en los que criopreservamos La criopreservación embrionaria resulta una alternativa altamente todos los embriones obtenidos. La en Día+1 y posterior transferencia recomendable en pacientes que criopreservación se realizó mediante diferida es una técnica que realizamos por diversas razones no se realizan congelación lenta siguiendo los actualmente de forma rutinaria en la transferencia en fresco, como procedimientos habituales de los casos de SHO y mala preparación en los casos de: Síndrome de nuestro laboratorio (Sydney IVF endometrial. Como observamos en hiperestimulación ovárica (SHO), Criopreservation Kit. COOK, Ireland). los resultados, todas las pacientes mala respuesta endometrial, en Los motivos por los que se congelaron que incluimos en el estudio llegaron a casos de DGP donde no se obtienen la zigotos a estas pacientes fueron realizarse transferencia de embriones. cantidad adecuada de embriones y es diversos: Riesgo a desarrollar Las tasas de supervivencia de los necesario acumularlos de varios ciclos Síndrome de hiperestimulación zigotos, próximas a un 80% y las para asegurar el éxito de la biopsia ovárica (SHO), mala respuesta tasas de gestación cercanas a un 60% embrionaria, o incluso en el caso de que endometrial y decisión de la propia nos permiten realizar transferencias la propia pareja por motivos personales pareja de retrasar la transferencia. diferidas sin comprometer la calidad decida aplazar la transferencia. embrionaria ni las tasas de embarazo. Actualmente, de las 43 pacientes En base a ello, se puede concluir OBJETIVOS incluidas en el estudio, se le ha que la congelación y descongelación realizado transferencias asíncronas de zigotos es una buena opción El objetivo de este trabajo es comprobar la a 38 de ellas, permaneciendo para aquellas pacientes que por efectividad de las transferencias diferidas criopreservados los zigotos de diversas razones deben posponer de embriones procedentes de congelación 5 pacientes a la espera de la la transferencia de embriones, lenta de zigotos en estos supuestos. transferencia embrionaria. convirtiendo la transferencia diferida en una práctica rutinaria en el MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS laboratorio de reproducción asistida. Estudio retrospectivo realizado Los resultados se han analizado en base sobre 43 pacientes. El análisis se a la edad de las pacientes (tabla 1). < 30 años 30-35 años >35 años TOTAL Nº parejas incluidas 19 15 9 43 Nº parejas con descongelación embr. 18 13 7 38 Edad (media ± DE) 24,7±3,1 33,7± 1,2 38,2 ± 2,4 30,7±6,1 Emb.cong. D+1 (N,media ± DE) 158(9,9±3,7) 126(9,7±3,7) 64(8±2,1) 348(9,4±3,4) Emb. descong.D+1 (N,media ± DE) 113(7,5±3,4) 91(7,5±2,2) 46(8±1,9) 250(7,6±2,7) nº de emb. que sobreviven 95 58 38 191 Tasa de supervivencia 88% 64% 82% 76% nº transferencias 18 13 7 38 Emb. transfer/pac. (media ± DE) 2,1±0,6 2,2±0,4 2,3±0,5 2,1±0,5 nº de emb. re-congelados 28 17 20 65 nº gestaciones 12 7 3 22 Tasa de gestación 67% 54% 43% 58% Tabla 1
- 102. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 100 019: EL DGP MOLEcULAR cOMBINADO cON MIcROARRAYS DE cGH: UNA NUEVA ESTRATEGIA DIAGNÓSTIcA T M Alberola, R Bautista-Llàcer, C Sánchez-Matamoros, M Pardo, E García-Mengual, X Vendrell Sistemas Genómicos e-mail: javier.vendrell@sistemasgenomicos.com INTRODUCCIÓN enriquecida en las regiones moleculares los cromosomas simultáneamente y a estudiar. A partir de la amplificación en un solo blastómero. La principal El DGP de enfermedades monogénicas obtenida, con una parte del producto se ventaja de esta nueva aproximación permite identificar embriones libres de realiza una PCR “heminested” específica diagnóstica es que se determinan los ellas, pero no ofrece información sobre la de las regiones moleculares a analizar embriones no afectos y euploides, ploidía del embrión. Existen evidencias (mutación y microsatélites de apoyo en aumentando al máximo la probabilidad de elevadas tasas de aneuploidía en el diagnóstico) con oligonucleótidos de implantación. Además, el estudio embriones humanos preimplantación. fluorescentes, seguida de una es compatible con la transferencia Algunos autores registran tasas de hasta electroforesis capilar y el análisis de en fresco, sin necesidad de vitrificar, el 60%. Históricamente, la literatura fragmentos. Por otro lado, otra parte rebiopsiar en diferentes estadios o recoge resultados combinados de DGP del ADN amplificado se marca e hibrida biopsiar más de una célula. de enfermedades monogénicas y de junto con un ADN de referencia de varón aneuploidías en células embrionarias en los microarrays 24Sure o 24Sure+ diferentes (biopsiando dos células en (BlueGnome). La lectura se realiza con D+3), en estudios realizados sobre el el DNA Microarray Scanner G2565CA de mismo embrión en diferentes estadios Agilent a una resolución de 10μm y se de división (biopsia de corpúsculo polar analizan con el software BlueFuse Multi combinada con biopsia de blastómeros de BlueGnome®. El resultado conjunto y/o trofectodermo) y para un número está disponible en 24-28h. limitado de cromosomas. No obstante, no existen registros publicados de Antes de proceder al DGP se requiere casos de un estudio genético molecular un estudio de informatividad para combinado con microarrays de CGH en determinar el éxito de la amplificación D+3 y en una sola célula. conjunta y la detección de la/s mutación/ es causante/s de la enfermedad OBJETIVOS monogénica. Esta validación se realiza en linfocitos aislados de ambos miembros Presentar una nueva aproximación de la pareja. diagnóstica que combina las técnicas de PCR y microarrays de CGH RESULTADOS simultáneamente y en la misma célula embrionaria, permitiendo así obtener Esta metodología se ha puesto a el diagnóstico genético molecular punto para el análisis conjunto de de la enfermedad monogénica y el 24 cromosomas con la Distrofia estudio de aneuploidías para los Miotónica de Steinert, la enfermedad 24 cromosomas. También se puede de Charcot-Marie-Tooth, la Hemofilia aplicar a las parejas portadoras de dos A y el Síndrome de Marfan. Además, anomalías genéticas, una molecular y también se ha puesto a punto para una otra cromosómica (reordenamientos pareja en la que la mujer es portadora cromosómicos equilibrados). del Síndrome de Alport ligado al X y su pareja es portador de la translocación MATERIAL Y MÉTODOS equilibrada 46,XY t(9;22)(q34;q11.2). La amplificación del genoma de una CONCLUSIONES única célula (amniocitos, linfocitos o blastómeros de embriones en El DGP molecular combinado con D+3) se realiza con el “Sureplex microarrays de CGH permite estudiar Amplification System” de BlueGnome cualquier enfermedad monogénica en con modificaciones. Los cambios la que esté determinada la mutación introducidos consiguen una causal, reordenamientos cromosómicos amplificación conjunta del genoma total, estructurales y la ploidía de todos
- 103. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 101 020: DGP PARA ESTUDIO DE ANEUPLOIDÍAS DE 24 cROMOSOMAS MEDIANTE AcGH: DIAGNÓSTIcO EN cÉLULA ÚNIcA DE DÍA 3 VS. BIOPSIA DE TROFOEcTODERMO DE DÍA 5 L. Rodrigo, P. Mir, E. Mateu, A. Mercader, A. Cervero, P. Buendía, J. Martín, C. Rubio Departamento de Diagnóstico Genético Preimplantacional. Instituto Universitario IVI-Valencia. Valencia, España. e-mail: Lorena.Rodrigo@ivi.es INTRODUCCIÓN En día 5 de desarrollo, 39 embriones gestación evolutiva en 14 ciclos (50% diagnosticados como anormales en por ciclo; 66,7% por transfer), con una La aparición de los array de CGH (aCGH, día 3 fueron reanalizados mediante tasa de implantación del 50%. Hibridación Genómica Comparada de FISH (hibridación in situ fluorescente) alta resolución) junto al desarrollo de utilizando sondas de ADN fluorescentes El reanálisis en día 5 confirmó el técnicas de amplificación del genoma dirigidas a los cromosomas alterados diagnóstico obtenido mediante aCGH completo de célula única, han abierto (Vysis Inc. Downers Grove, IL, USA). en día 3 en 38 embriones (97,4%). las puertas a una nueva tecnología Adicionalmente, a un grupo de 15 El análisis mediante aCGH en biopsia para el estudio de alteraciones en el blastocistos de calidad óptima se les de trofoectodermo mostró un 93,3% contenido cromosómico completo realizó biopsia de trofoectodermo para (14/15) de concordancia con el en embriones humanos antes de su análisis mediante aCGH y posterior diagnóstico mediante aCGH en día 3. El producirse la implantación. fijación del resto del blastocisto para embrión discordante fue diagnosticado reanalizarlo mediante FISH. como aneuploide caótico en día 3 pero OBJETIVOS como normal en día 5 sobre biopsia RESULTADOS de trofoectodermo. En este caso, el Describir los resultados clínicos del reanálisis mediante FISH en día 5 programa de Diagnóstico Genético Un total de 135 células de día 3 del resto del blastocisto confirmó Preimplantacional (DGP) para estudio amplificaron correctamente (97,1%). el diagnóstico obtenido en día 3, de aneuploidías de 24 cromosomas De los 135 embriones analizados, 91 mostrando un patrón de aneuploidías mediante aCGH en célula única de día 3 fueron diagnosticados como anormales caótico en las células de todo el de desarrollo. Comparar la calidad del mediante aCGH (67,4%); el 31,9% de embrión. diagnóstico con el obtenido mediante los embriones (29/91) presentaron aCGH en biopsia de trofoectodermo de aneuploidías únicamente para CONCLUSIONES día 5. alguno de los cromosomas analizados rutinariamente en nuestro programa La técnica de aCGH resulta adecuada MATERIAL Y MÉTODOS de FISH (cromosomas 13, 15, 16, 17, para el diagnóstico de célula única en 18, 21, 22, X, Y); el 47,3% (43/91) día 3 de desarrollo, ofreciendo buenas Entre Febrero de 2010 y Mayo de 2011, presentaron además aneuploidías para tasas de amplificación y de diagnóstico se analizaron los resultados de 28 otros cromosomas; y un 20,9% (19/91) fiable. En este estudio, la biopsia de ciclos de DGP mediante aCGH en parejas tuvieron aneuploidías únicamente trofoectodermo en día 5 no mejora la con edad materna avanzada (n=5), para cromosomas diferentes a los 9 calidad del diagnóstico en comparación aborto de repetición (n=13), fallo de analizados rutinariamente en nuestro con el día 3. implantación (n=7) y otras causas programa de FISH. Concretamente, las (n=3). La edad media de las pacientes pacientes ≥41 años presentaron una fue 38,3±3,4. incidencia más baja de embriones con anomalías sólo para cromosomas no Se realizó biopsia embrionaria en día analizados por FISH (17,1%) comparado 3 de desarrollo en 139 embriones, con las pacientes ≤40 años (23,2%), y amplificación genómica en célula siendo especialmente baja (13%) única utilizando el kit comercial en pacientes cuya única indicación Sureplex®. Para el estudio de para realizarse DGP fue edad materna aneuploidías de los 24 cromosomas avanzada (edad media: 42,6±1,5). mediante aCGH se utilizó la plataforma Además, esta incidencia fue más alta comercial 24sure®, realizando un (44,4%) en pacientes ≤40 años con protocolo de 24 horas que incluye factor masculino severo (concentración la amplificación, marcaje del ADN, ≤5x106 espermatozoides/ml) hibridación, lavados, escaneo y análisis de datos (BlueGnome Ltd., Se realizó transferencia embrionaria Cambridge, UK). en 21 ciclos (75%), observándose
- 104. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 102 021: ERROR DE DIAGNÓSTIcO DE LA TÉcNIcA DE DIAGNÓSTIcO GENÉTIcO PREIMPLANTAcIONAL PARA 24 cROMOSOMAS MEDIANTE FISH E. Toro1; S. Fernández1, 2; A. Colomar1,2; S. Chamosa1; M. López Teijón3, E. Velilla1,2 1 Institut Marquès, Barcelona; 2 Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona-Madrid; 3 Fundación Leonardo Marquès, Barcelona. silvia.fernandez@institutomarques.com INTRODUCCIÓN transferidos o vitrificados, se fijaron CONCLUSIONES y se analizaron mediante FISH para Hasta ahora, el Diagnóstico Genético las mismas sondas utilizadas en día 3 Estos son los primeros datos reportados Preimplantacional (DGP) mediante (n= 185). Se establecieron dos grupos de reanálisis de todos los cromosomas FISH (hibridación in situ) analizaba según el número de cromosomas del embrión en día 5 mediante FISH. 9 o 12 cromosomas. Recientemente, incluidos en el reanálisis: DGP-9 Estos resultados indican: (i) el error nuestro grupo ha solventado las cromosomas y DGP-24 cromosomas. de diagnóstico de la técnica de DGP limitaciones de la técnica de FISH para 24 cromosomas mediante FISH para poder realizar DGP de todos los El análisis de los embriones se es equivalente a la establecida para cromosomas. El error de diagnóstico de realizó mediante hibridación in el DGP de 9 cromosomas, por tanto FISH en blastómero, puede ser debido situ fluorescente (FISH) utilizando es independiente del número de a dos factores, el propio de la técnica sondas oligonucleótidos (Cellay), cromosomas a estudiar (ii) el error de y el debido a mosaicismo embrionario. centroméricas y locus específicas diagnóstico de DGP mediante FISH para Este error de diagnóstico debe ser (Vysis). La técnica de DGP-9 se realizó 24 cromosomas es del 5,1% (iii) el error optimizado por cada laboratorio y mediante 2 rondas de hibridación y la de diagnóstico de DGP-24 establecido debe estar bajo permanente control de DGP-24 se realizó mediante 6 rondas valida totalmente la técnica de DGP- mediante el reanálisis de todas de hibridación consecutivas. Siempre 24 mediante FISH, valor muy inferior las células del embrión, siendo un que fue necesario se realizaron una o al aceptado por los diferentes PGD marcador de calidad del laboratorio. dos rondas con sondas subteloméricas guidelines (iv) la determinación del Los trabajos publicados hasta el (Vysis; Kreatech) para reanalizar las error de diagnóstico mediante el momento para la validación de DGP de monosomías tanto en DGP-9 como en reanálisis de todos los cromosomas 24 cromosomas, analizan un número DGP-24. en día +5 utilizando la misma técnica limitado de cromosomas en día +5 utilizada en día +3, debería ser la única mediante FISH para establecer el error Posteriormente se determinó como estrategia válida para determinar de diagnóstico de la técnica utilizada error de diagnóstico aquel resultado dicho error. en el DGP (CGH o aCGH). no concordante de normalidad o anormalidad en día 5 respecto al OBJETIVOS diagnóstico de día 3. Determinar el error de diagnóstico real RESULTADOS del DGP para 24 cromosomas (DGP-24) mediante FISH y compararlo con el del Se analizaron 185 embriones a día análisis clásico de 9 cromosomas (DGP-9). 5 de desarrollo (107 DGP-9 y 78 DGP-24) con una media de 25,4 MATERIAL Y MÉTODOS núcleos analizados por embrión. Se descartaron del estudio aquellos Se incluyeron en este estudio 58 embriones que presentaban menos pacientes con ciclos de DGP-9 y de 6 núcleos. El error de diagnóstico 22 pacientes con ciclos de DGP-24 obtenido, es decir discrepancia en los indicados por presentar alguno o varios resultados entre día 3 y día 5, fue de un de los siguientes factores de riesgo: 3,7% (4/107) en DGP-9 y en un 5,1% abortos de repetición, edad materna (4/78) en DGP-24 siendo en todos ellos avanzada (>37), factor masculino falsos positivos. Estas diferencias no genético y fallo de FIV. son estadísticamente significativas (P=0,92) y por tanto el error de Todos los embriones alterados o los diagnóstico de DGP-24 es equivalente normales que en día +5 no fueron al de DGP-9.
- 105. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 103 022: DIAGNÓSTIcO PRENATAL NO INVASIVO (DPNI) EN SANGRE DE GESTANTE: UNA NUEVA OPcIÓN TRAS DGP A. Bustamante-Aragonés, S. Perlado, M.J. Trujillo-Tiebas, J. Gallego, L. Rodríguez*, C. Linares*, M. Rodríguez de Alba, I. Lorda, J. Plaza*, C. Hernández*, C. Ramos. Servicios de Genética y Ginecología y Obstetricia*. Fundación Jiménez Díaz. Madrid e-mail: abustamante@fjd.es INTRODUCCIÓN OBJETIVOS al DP invasivo. Uno se confirmó al nacimiento y el otro finalizó en un En 1997 Lo y cols. descubrieron la Incorporación del DPNI a la confirmación aborto espontáneo. presencia de ADN fetal circulando de resultados tras embarazo por DGP. en el torrente sanguíneo materno. En 2/29 (7%) casos hubo ausencia de Desde entonces varios grupos han MATERIAL Y MÉTODOS diagnóstico en plasma materno. estado trabajando y poniendo a punto diferentes técnicas para el diagnóstico La metodología de estos diagnósticos CONCLUSIONES de diversas enfermedades fetales en incluye la obtención del plasma materno sangre de gestante. para la posterior extracción del ADN fetal, El diagnóstico fetal en sangre materna así como obtención de ADN genómico de es posible y su aplicación en el DGP es Como fruto de estas investigaciones, ambos miembros de la pareja. muy prometedora, ya que ofrece una numerosas unidades de diagnóstico nueva opción diagnóstica a parejas prenatal ya han incorporado en la Actualmente hemos realizado 203 en las que está recomendado realizar práctica clínica la determinación del determinaciones no invasivas en 30 un diagnóstico prenatal, pero que no sexo y RhD fetal en la sangre materna. patologías de distinta base genética. quieren poner en riesgo la gestación con pruebas invasivas. Sin embargo, el estudio de enfermedades La aproximación para las patologías monogénicas sigue en el plano de la ligadas al X se realizó mediante Nuestro agradecimiento a Marisa Pérez- investigación. Además, la peculiaridad determinación del sexo fetal en sangre Bellot por su esfuerzo y dedicación en la de la muestra a estudiar limita estos materna, por PCR a tiempo real. Éstas recogida de las muestras. estudios a enfermedades dominantes suponen un total de 174 DPNI, incluyendo de origen paterno, recesivas en las 5 casos de gestaciones tras DGP. Este proyecto está financiado por que la mutación portada por ambos ISCIII-PI081456. S. Perlado es becaria progenitores sea distinta o riesgo de La aproximación al estudio de patologías de la Fundación Conchita Rábago de mutaciones de novo. con herencia autosómica supone un Jiménez Díaz. total de 29 casos. En función de su base Según las indicaciones reflejadas en molecular se realiza el estudio mediante las guías de buena praxis de la ESHRE, minisecuenciación y/o QF-PCR. Entre en embarazos tras un proceso de FIV- las patologías estudiadas están la ICSI con DGP, se debe recomendar la Enfermedad de Huntington, Fibrosis realización de un diagnóstico prenatal Quística, Acondroplasia, Acidemia (DP). El asesoramiento debe realizarlo Propiónica, Epidermolisis Bullosa, E. una persona cualificada y exponer McKusick, Amaurosis Congénita de a la pareja las distintas opciones Leber. disponibles tanto invasivas (biopsia de corion y amniocentesis) como no RESULTADOS invasivas (ecografía y diagnóstico no invasivo en sangre materna). No hubo errores diagnósticos en las determinaciones del sexo fetal. Cinco Las parejas que consiguen un embarazo gestantes de DGP por enfermedad tras el duro y largo proceso físico ligada al X optaron por el DPNI evitando y emocional que conlleva un DGP, estudios invasivos posteriores. revocan la confirmación del estatus fetal mediante las pruebas invasivas de En 27/29 (93%) casos de enfermedades diagnóstico prenatal. Es por ello que la con herencia autosómica se llegó a aplicación del DPNI en sangre materna un correcto diagnóstico ya que los representa para algunos pacientes de resultados en plasma materno fueron DGP una nueva opción diagnóstica sin concordantes con los obtenidos en DP poner en peligro la gestación. invasivo. Dos de estos casos, rehusaron
- 106. c O M U N I c A c I O N E S O R A L E S 104 023: MOSAIcISMO EN PAcIENTES cON SÍNDROME DE KLINEFELTER: IMPLIcAcIONES EN EL cONSEJO GENÉTIcO REPRODUcTIVO L. Garcia-Quevedo1; J. Blanco1; Z. Sarrate1; Ll. Bassas2; V. Català3; F. Vidal1 1 Unitat Biologia Cel·lular. Universitat Autònoma Barcelona. Bellaterra, Barcelona. 2 Laboratori d’Andrologia, Fundació Puigvert. Barcelona. 3 Prenatal Genetics, SL. Barcelona. e-mail: lydia.garcia@uab.cat INTRODUCCIÓN un análisis citogenético siguiendo los 28.2%(KS5), 63.7%(KS6), 14.6%(KS7), protocolos estandarizados en nuestro 30.4%(KS8). El síndrome de Klinefelter es la anomalía laboratorio. cromosómica más común en hombres Se observaron coeficientes de infértiles. Se estima que el 9-11% de Se evaluó la presencia de células correlación elevados entre el porcentaje los pacientes azoospérmicos presentan 46,XY y 47,XXY mediante hibridación de células 46,XY de mucosa y de Sertoli, este tipo de aneuploidía. El diagnóstico in situ fluorescente (FISH) con sondas y entre el de mucosa y el de células citogenético se realiza mediante centroméricas para los cromosomas X, Y,18. germinales. el cariotipo de 20-50 metafases En las extensiones de células testiculares procedentes de linfocitos de sangre se aplicó la misma combinación de sondas En cuatro de los ocho pacientes periférica y determina que alrededor y además un pintado cromosómico analizados se identificaron profases I y del 80% de los pacientes presentan un para los cromosomas sexuales con la metafases I (KS1, KS2, KS5, KS8) que cariotipo homogéneo 47,XXY. A pesar finalidad de evaluar su comportamiento en todos los casos fueron 46,XY. Todos de que la mayoría de los pacientes son y la competencia meiótica de las células los pacientes mostraron un incremento azoospérmicos, algunos presentan aneuploides. significativo de hiperhaploidías XY. focos aislados de espermatogénesis y producen espermatozoides. Estas Para cada individuo estudiado se analizaron CONCLUSIONES trazas de espermatogénesis se han 500 linfocitos, 200 células epiteliales y 1000 relacionado con la presencia de células células testiculares (células germinales En individuos KS, la determinación 46,XY en tejido testicular. La estrategia pre- y post-meióticas y células de Sertoli). del cariotipo en linfocitos se debería asistencial consiste en la extracción de Además fueron evaluadas todas las figuras contrastar con los resultados de otros espermatozoides testiculares (TESE) meióticas observadas. tejidos. La mucosa bucal es un tipo celular para la aplicación posterior de ICSI. fácil de obtener que muestra resultados RESULTADOS de mosaicismo más representativos del El objetivo de este estudio ha sido estatus testicular. evaluar la presencia de mosaicismo Se observaron dos poblaciones celulares en diferentes tejidos de pacientes (46,XY y 47,XXY) en los ocho pacientes para Los individuos Klinefelter que presentan diagnosticados como Klinefelter puros los 3 tejidos analizados. El porcentaje de focos de espermatogénesis son mosaicos. candidatos a TESE/ICSI. Paralelamente células 46,XY fue claramente diferente Nuestros datos refuerzan la hipótesis de se ha determinado la competencia entre tejidos, siendo el porcentaje más incompetencia meiótica de la línea 47,XXY, meiótica del linaje 47,XXY así como bajo el de linfocitos y el más alto el de tejido y confirman que la espermatogénesis el riesgo genético reproductivo que testicular. Los resultados del porcentaje de observada está relacionada con la presentan los individuos afectos. células 46,XY fueron los siguientes: presencia de células 46,XY. MATERIAL Y MÉTODOS Linfocitos: 2.7%(KS1), 3%(KS2), Las células post-meióticas hiperhaploides 8%(KS3), 5.5%(KS4), 8.6%(KS6), proceden de células 46,XY. Un Se analizaron ocho pacientes con 5.5%(KS7), 3%(KS8). microambiente testicular anormal podría síndrome de Klinefelter (KS1-KS8) ser la causa subyacente del incremento de diagnosticados como puros mediante Células de la mucosa bucal: 18.2%(KS1), células cromosómicamente anormales. cariotipo en sangre periférica. De cada 33.3%(KS2), 33.2%(KS3), 16.2%(KS4), paciente obtuvimos tres tipos de material 8.7%(KS5), 12.4%(KS6), 12%(KS7), AGRADECIMIENTOS de estudio: biopsia testicular, frotis bucal 10.3%(KS8). y sangre periférica (excepto KS5). Estudio financiado por los proyectos Células de Sertoli: 45.5%(KS1), SGR2009-282 (Generalitat de Las biopsias testiculares se obtuvieron 54%(KS2), 24.3%(KS3), 41.4%(KS4), Catalunya) y CF-180034 (Universitat bajo evaluación andrológica con el 46.5%(KS5), 69.4%(KS6), 60.9%(KS7), Autònoma Barcelona). Agradecemos objetivo de congelar el tejido para realizar 68.8%(KS8). al laboratorio de Andrología de la un tratamiento de ICSI. Una parte de Fundación Puigvert (Barcelona) y a cada biopsia fue derivada a este estudio. Células Pre-meióticas: 45.2%(KS1), Prenatal Genetics, SL (Barcelona) el Las muestras se procesaron para realizar 42.5%(KS2), 40.2%(KS3), 26%(KS4), suministro de las muestras.
- 107. c O M U N I c A c IITULO E S T O N O R A L E S Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 105 024: DETEccIÓN MEDIANTE SNAPSHOT DE LA DELEcIÓN EN HOMOcIGOSIS DEL GEN SMN1 EN EL DIAGNÓSTIcO GENÉTIcO PREIMPLANTAcIONAL DE ATROFIA MUScULAR ESPINAL M. Martínez-Fresno1, A. Gómez Duro1, P. Eibes Peteiro1, A. Sotillo1, E. Gomez2, E. Fernández1 1 Geniality Diagnóstico Genético 2 Instituto Tahe de Fertilidad y Ginecología, Murcia e-mail: mmfresno@geniality.es INTRODUCCIÓN La Atrofia Muscular Espinal tipo I (AME) también conocida como síndrome de Figura 1a. loci sMn1y sMn2 en cromosoma 5 (5q11.2–13.3) Werding-Hoffman, es una enfermedad genética de carácter autosómico recesivo de SMN1 en heterocigosis. Tras un ciclo Se incluyó en el análisis, el estudio de 5 causada por la deleción de los exones 7 y de fecundación in vitro se biopsiaron marcadores polimórficos que flanquean 8 en homocigosis en el gen SMN1 (> 92% 6 blastómeros de cinco embriones en los loci SMN1 y SMN2: D5S2019, de los casos), situado en el brazo largo día +3 post –inseminación. La lisis D5S610, D5S435, D5S1491 y D5S637, del cromosoma 5 en 5q11.2–13.3. Es la celular (lisis alcalina), la amplificación lo que permitió establecer en la pareja segunda causa principal de enfermedad directa del genoma (mediante “Multiple y su hija, el haplotipo asociado a la neuromuscular con una incidencia de Displacement Amplification”) y las PCRs deleción. Los fragmentos amplificación 1:10000. Presentamos el caso de una Multiplex se realizaron usando los de los marcadores mediante Multiplex pareja que consulta porque han tenido protocolos validados con anterioridad en PCR y el estudio de la deleción mediante una niña, fallecida y diagnosticada el laboratorio. SNaPshot se analizaron posteriormente posteriormente como afecta de AME. La en secuenciador ABI 3130xl. dificultad en el desarrollo del diagnóstico Las secuencias SMN1 y SMN2 se alinearon molecular de AME reside en que el gen con el software “MegAlign” para detectar RESULTADOS causal, SMN (survival motor neuron), cambios nucleotídicos entre ellas. Estas posee dos copias altamente homólogas, dos copias difieren únicamente en cinco Los 5 embriones analizados en el SMN1 (copia telomérica) y SMN2 (copia nucleótidos intrónicos y tres exónicos. DGP pudieron diagnosticarse, siendo centromérica). El análisis de la deleción Se seleccionó un nucleótido en el exón dos portadores sanos de la deleción, de los exones 7 y 8 en SMN1 implicados 7, citosina (c) en SMN1 y timina (t) en dos afectos y uno sano. La técnica en la AME produciría una amplificación SMN2, que se puede analizar mediante de SNaPshot diseñada tuvo una positiva y homóloga en SMN2, cuyos minisecuenciación. Esta diferencia eficiencia de amplificación del 100%. exones no se encuentran delecionados permite detectar la deleción en los Se transfirieron dos embriones sin en la AME y como consecuencia no pacientes afectos (solo amplifica gen resultado de embarazo positivo. sería posible discriminar la presencia o SMN2) y discriminar entre afectos y sanos ausencia de deleciones en SMN1. Por otro o portadores/sanos (Figura 1a y 1b). CONCLUSIONES lado la deleción en SMN1 se detecta como una ausencia de amplificación que puede La complejidad existente en el confundirse con un allele drop-out o un diagnóstico de la AME reside en fallo de amplificación total. la presencia de un gen homólogo (SMN2) y deleciones de gran tamaño, OBJETIVO elementos que dificultan en gran medida el diagnóstico genético Desarrollo de un método basado en en una sola célula. El protocolo minisecuenciación o SNaPshot (técnica desarrollado basado en la combinación usada en la detección de mutaciones del SNaPshot y el análisis de STRs puntuales) para la detección en solventa esta problemática y permite homocigosis de la deleción de los exones el correcto diagnóstico de los tres 7 y 8 del gen SMN1empleando como genotipos posibles: embriones afectos, control de amplificación el gen SMN2. embriones sanos y portadores sanos. Este método permite además evitar MATERIAL Y MÉTODOS errores diagnósticos que se producirían Figura 1b. electroferogramas de por la ausencia de amplificación que El Diagnóstico Genético Preimplantacional snaPshot obtenidos de los distintos produce la deleción y la amplificación se realizó en una pareja en la que genotipos posibles en la aMe: sano, del gen homólogo, empleado aquí ambos eran portadores de la deleción portador-sano y afecto como control positivo.
- 108. 106 cOMUNIc AcIONES PÓStEr
- 109. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 107 001: APlIcAcIÓN DE lA cGH rÁPIDA EN El DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl DE trANSlOcAcIONES: cASO DE UN POrtADOr DE UNA DOBlE trANSlOcAcIÓN M. Rius1*, A. Obradors2, G. Daina1, L. Ramos1, A. Pujol2, R. Vidal2, M. Oliver3, J. Benet1,4 y J. Navarro1,4* 1 Unitat de Biologia Cel·lular i Genètica Mèdica, Facultat de Medicina, Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193, Bellaterra. 2 Clínica Eugin, 08029, Barcelona. 3 Hospital Universitari Son Dureta, 07014, Palma de Mallorca. 4 Càtedra de Recerca Eugin-UAB. e-mail: *Mariona.Rius@uab.cat; Joaquima.Navarro@uab.cat INTRODUCCIÓN translocaciones en el que no solamente embriones). Aparte de desequilibrios se estudiaran los cromosomas cromosómicos relacionados con las Los portadores de translocaciones implicados en la reorganización, sino reorganizaciones, se detectaron presentan un elevado riesgo de todo el complemento cromosómico. múltiples aneuploidías y alteraciones infertilidad, de aborto o de tener Para ello se aplicó la técnica de la CGH estructurales que afectaban a otros descendencia con alteraciones físicas rápida, que permite analizar todos los cromosomas. Teniendo en cuenta la y/o psíquicas debido a la producción cromosomas y en toda su longitud con segregación de las dos translocaciones de gametos desequilibrados. Con el fin un límite de resolución de 10-20Mb. y el resto de alteraciones, solamente de seleccionar embriones normales o Además, con este método se evita la un embrión en el tercer ciclo de FIV- equilibrados para la transferencia al criopreservación de los embriones PGD mostró perfiles de CGH rápida útero materno, habitualmente se aplica el biopsiados. compatibles con un complemento diagnóstico genético preimplantacional cromosómico equilibrado; éste se (PGD) mediante hibridación in situ MATERIAL Y MÉTODOS transfirió al útero materno el día+4 y fluorescente (FISH) con sondas produjo un embarazo actualmente en específicas para los cromosomas Se realizaron tres ciclos de fecundación curso, del que el diagnóstico prenatal implicados en la translocación. Aún in vitro (FIV) y PGD para un portador ha confirmado el cariotipo equilibrado. así, según la última recopilación de de dos translocaciones con cariotipo datos de la European Society of Human 45,XY,t(2;17)(q14.2;q23)/t(14;21) CONCLUSIONES Reproduction and Embryology (ESHRE) (q10;q10). En el primer ciclo, debido PGD Consortium la tasa de implantación al reducido tamaño del fragmento Implementada la CGH rápida de los embriones transferidos es del 17q translocado, se utilizó tanto desarrollada en nuestro grupo al PGD 17% en portadores de translocaciones la FISH como la CGH rápida para el de una pareja cuyo varón es portador Robertsonianas y del 14% en portadores diagnóstico. Una vez comprobado que equilibrado de dos translocaciones, de translocaciones recíprocas. la CGH rápida era capaz de detectar 45XY,t(2;17)(q14.2;q23)/ t(14;21) desequilibrios que involucrasen (q10,q10), se ha conseguido Además de alteraciones cromosómicas dicho fragmento, en los dos ciclos detectar no sólo desequilibrios de directamente relacionadas con el tipo posteriores se utilizó únicamente la los cromosomas involucrados en la de segregación, se ha postulado que CGH rápida. reorganización, sino también del resto la conformación del trivalente o del de cromosomas. El análisis mediante cuadrivalente formado en la meiosis RESULTADOS CGH rápida permitió la transferencia I para conseguir el apareamiento de en fresco, el día+4, del único embrión los cromosomas translocados y de sus Evaluando conjuntamente los tres diagnosticado como exento de homólogos podría tener una influencia ciclos de FIV-PGD, se biopsiaron desequilibrios cromosómicos. Por en la sinapsis y la disyunción del resto 18 embriones en día+3 y se obtuvo primera vez, se ha conseguido el de bivalentes, que causaría otras diagnóstico de 16 de ellos. La embarazo en un caso tan complejo aneuploidías. Partiendo de esta base y con segregación predominante de la t(2;17) después de tres ciclos de PGD mediante el objetivo de detectar también posibles fue la 2:2 alternante (46,7% de los CGH rápida. errores cromosómicos postzigóticos, el embriones), seguida de la 3:1 (26,7% cribado de aneuploidías simultáneo al PGD de los embriones), la 2:2 adyacente-1 AGRADECIMIENTOS para la translocación sería recomendable. (20% de los embriones) y, finalmente, de la 2:2 adyacente-2 (6,7% de FIS-ISCIII (PI080012), Grup de Suport OBJETIVO los embriones). Para la t(14;21) la a la Recerca, Generalitat de Catalunya segregación 2:1 alternante fue más (2009SGR1107), Càtedra de Recerca El objetivo de este trabajo era llevar a frecuente (62,5% de los embriones) Eugin-UAB, Beca FPU del Ministerio de cabo un PGD para un portador de dos que la 2:1 adyacente (37,5% de los Educación y Ciencia (AP2006-02211).
- 110. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 108 002: DESEQUIlIBrIOS crOMOSÓMIcOS EN ESPErMAtOZOIDES DE INDIVIDUOS POrtADOrES DE trANSlOcAcIONES rEcÍPrOcAS A. Godo, F. Vidal, J. Blanco, E. Anton Unidad de Biología Celular. Facultad de Biociencias. Universidad Autónoma de Barcelona. 08193 Bellaterra (Cerdanyola del Vallès) e-mail: anna.gp10@gmail.com INTRODUCCIÓN fueron seleccionadas por presentar El análisis de segregación en las en estudios previos un ICE positivo y poblaciones de espermatozoides La frecuencia de portadores de un patrón de segregación estándar: con anomalías numéricas mostró translocaciones recíprocas en la Alternante (46.5% ± 6.5); adyacente diferencias significativas respecto población de individuos infértiles I (33.6% ± 4.4); adyacente II (11.7% ± el recuento general de la muestra, supera hasta seis veces la de la 6.9); 3:1 (6.8% ± 3.5) y 4:0 (0.6% ± 0.6). en el cual predominó la segregación población general. Los portadores de alternante seguida de la adyacente translocaciones recíprocas presentan Se desarrolló un protocolo de FISH I. En los individuos P1 y P3, las un riesgo genético reproductivo secuencial que consistió en aplicar dos segregaciones mayoritarias fueron incrementado debido a la producción rondas de hibridación sobre los mismos la 4:0 (40.8%; 48.5%) y 3:1 (26.3%; de gametos portadores de anomalías espermatozoides: En la primera ronda 24.3%), seguidas de alternante cromosómicas. Las anomalías se se realizó el estudio de ICE mediante dos (11.1%; 6.3%), adyacente I (9.9%; originan como consecuencia de las hibridaciones paralelas, utilizando una 5.5%) y adyacente II (2.8%; 4.74%). segregaciones adyacente I, II, 3:1 y 4:0 combinación de sondas centroméricas En el individuo P2 predominó la de los cromosomas reorganizados y a la de los cromosomas X, Y, 18; y otra segregación 3:1 (39.2%), seguida presencia de efectos intercromosómicos combinación de sondas específicas de de alternante (16.3%), adyacente I (ICE), es decir, incrementos de locus 13 y 21. La localización de todos (13%), adyacente II (8%) y 4:0 (6.9%). anomalías numéricas de cromosomas los espermatozoides portadores de En todos los individuos se detectó un no implicados en la reorganización. aneuploidías y diploidías fue registrada importante porcentaje de productos mediante la captura de coordenadas de segregación con combinaciones La metodología de evaluación del riesgo para su posterior relocalización. La de sondas no esperadas: 9.1% (P1), genético en estos individuos consiste segunda ronda de hibridación permitió 16.6% (P2) y 10.5% (P3). en analizar de forma independiente la valoración de la segregación de los segregación e ICE. En consecuencia, cromosomas reorganizados. En este caso CONCLUSIONES las anomalías detectadas en estas dos se utilizó una combinación de sondas aproximaciones de estudio no pueden específica para cada individuo que El fenómeno de ICE y las segregaciones relacionarse directamente. identificaba los cromosomas implicados desequilibradas 3:1 y 4:0 son sucesos de forma diferencial. Se valoró el patrón dependientes, que están condicionados OBJETIVO de segregación en dos poblaciones de por las interacciones cromosómicas espermatozoides: (a) recuento general que se establecen durante el proceso Determinar si existe relación entre de la muestra y (b) espermatozoides meiótico (heterosinapsis) y la eficacia los diferentes modos de segregación relocalizados previamente clasificados de los puntos de control. Como del tetravalente y la producción de como aneuploides o diploides. Los consecuencia, los portadores de anomalías cromosómicas numéricas resultados de las frecuencias estudiadas translocaciones recíprocas producen en espermatozoides de portadores de se analizaron mediante el test c2, espermatozoides que acumulan translocaciones recíprocas. considerando un intervalo de confianza anomalías cromosómicas. del 99%. MATERIAL Y MÉTODOS AGRADECIMIENTOS RESULTADOS Se analizaron espermatozoides Este trabajo se ha financiado con los procedentes de tres individuos Se analizaron un total de 22550 (P1), proyectos SAF2010-22241, SGR2009- portadores de las siguientes 9373 (P2) y 22805 (P3) espermatozoides. 282 y UAB CF-180034. Agradecemos translocaciones recíprocas: t(5;8) El número de gametos detectados con a los centros I.B.Q. Flor de Maig (q33;q13) (P1), t(8;14)(q22;q32) (P2) anomalías numéricas fue 762, 329 y (Barcelona) y CPC (Barcelona) el y t(9;19)(q10;p10) (P3). Las muestras 401, respectivamente. suministro de las muestras.
- 111. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 109 003: ANÁlISIS DE tODOS lOS crOMOSOMAS EN EMBrIONES PrEIMPlANtAcIONAlES MEDIANtE AcGH. M. Sandalinas, E. García-Guixé, A. Jiménez-Macedo, C. Giménez REPROGENETICS, Barcelona e-mail: pgdteam@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN Las biopsias se someten al proceso de 19 (7.1%) y 15 (6.1%), mientras amplificación total del genoma (WGA), que los cromosomas con menor No todos los problemas de esterilidad marcaje fluorescente e hibridación frecuencia de aneuploidía fueron el y/o infertilidad son atribuibles a sobre arrays de BAC. Posteriormente 8 (1.7%), 1 (2.2%) y el cromosoma anomalías cromosómicas, pero, hay se procede al análisis de los perfiles 6 (2.2%). Del total de aneuploidías un elevado porcentaje de parejas con obtenidos. diagnosticadas, el 48,3% implicaba a un riesgo identificado de generar cromosomas no estudiados en el test embriones cromosómicamente RESULTADOS de 9 aneuploidías y la aplicación de la anormales. La técnica habitual aCGH permitió detectar un 24,1% de de detección de estos embriones Entre Septiembre de 2009 y marzo embriones aneuploides (de entre 1 y anormales era hasta hace poco la FISH de 2011, se han realizado un total de hasta 6 aneuploidías) que se hubiesen (hibridación in situ de fluorescencia) 54 ciclos de FIV-DGP para análisis de diagnosticado como normales y en la que se utilizaban sondas para aneuploidía mediante el análisis de probablemente transferido mediante los nueve cromosomas más implicados todos los cromosomas. el test de 9 sondas. en abortos y embarazos a término afectos. La aparición reciente de La edad media de las pacientes es de CONCLUSIONES la técnica de aCGH nos permite 37.7 (rango: 19-43a) con una media analizar todos los cromosomas en de embriones biopsiados por paciente Mediante aCGH ha sido posible detectar embriones de estas parejas con riesgo de 6.02. Se ha obtenido resultado en un 48,3% más de aneuploidía y un incrementado. el 94.5% de los embriones biopsiados 24,1% más de embriones aneuploides (n=325) resultando el 33.7% que mediante la FISH de 9 cromosomas. OBJETIVO normales para todos los cromosomas. Estos resultados representan, por un Del 66.3% restantes, el 48.5% fueron lado, una mejora en las herramientas Estudiar la frecuencia de anomalías aneuploides (1-3 aneuploidías), el diagnósticas al evitar la transferencia cromosómicas obtenida mediante 11.5% anormales complejos (4-11 de embriones que por otros métodos la aplicación de aCGH para el aneuploidías) y el 6.3% restante hubieran sido diagnosticados como análisis de todos los cromosomas en correspondió a perfil caótico (más de normales y, del otro, observar qué blastómeros de embriones humanos 12 aneuploidías). cromosomas presentan aneuploidía preimplantacionales provenientes de con mayor o menor frecuencia. FIV-DGP. Dentro del grupo de los embriones Esperamos, a medida que vayamos aneuploides el porcentaje de ampliando la serie, poder detectar MATERIAL Y MÉTODOS monosomías observado fue del 57,4% si los cromosomas implicados varían mientras que el de trisomías fue del según el tipo de indicación, puesto Se realiza biopsia de una sola célula 42,6%. Todos los cromosomas estaban que los mecanismos de origen de de embriones en día 3 de desarrollo in implicados en eventos aneuploides aneuploidía son diferentes según la vitro de parejas que acuden a centros pero la frecuencia de aneuploidía indicación. de reproducción asistida por diferentes observada no fue la misma para indicaciones: abortos de repetición todos ellos: los cromosomas Los arrays de CGH permiten analizar (RAB), edad materna avanzada (AMA), principalmente involucrados en todos los cromosomas en biopsias fallos repetidos de implantación (RIF) y aneuploidías fueron los cromosomas embrionarias con elevada eficiencia y factor masculino (MF). 22 (8.6%), 16 (8.1%), 21 (7.9%), fiabilidad.
- 112. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 110 004: cOrrElAcIÓN ENtrE lOS VAlOrES DE rEFErENcIA DEl MANUAl DE lA OMS DEl 2010 Y El EStUDIO DE ANEUPlOIDÍAS ESPErMÁtIcAS MEDIANtE HIBrIDAcIÓN IN SItU FlUOrEScENtE (FISH) EN PAcIENtES EStÉrIlES cON cArIOtIPO NOrMAl. F. Marina, R. Alcolea, M. Rafael, M. Domínguez, L. Jiménez, A. Hernández, S. Marina. CENTRO: Instituto de Reproducción CEFER. ANACER e-mail: info@institutocefer.com INTRODUCCIÓN cabezas con DTT (dithiotreitol). Se utilizó y morfología normal publicados en el el kit Vysis® Aneuvision compuesto por manual de la OMS del 2010. Diferentes estudios han correlacionado tres sondas centroméricas (para los los parámetros seminales con cromosomas 18, X e Y) y dos específicas CONCLUSIONES la incidencia de aneuploidías de loci (para los cromosomas 13 y 21). espermáticas. En este estudio Se estudiaron un mínimo de 1.000 Existe una relación muy clara entre pretendemos hacer una actualización espermatozoides para cada grupo de los parámetros estudiados y la de la incidencia de los estudios de sondas siempre que la calidad de la incidencia de alteraciones en el FISH, FISH espermáticos alterados según los muestra seminal lo permitiera. Para el especialmente en el caso del recuento nuevos parámetros de referencia de la grupo control se estudiaron 10 donantes espermático total. Esto apunta a OMS (2010). con fertilidad probada en los que se que los mecanismos que originan las contaron 10.000 espermatozoides para no disyunciones durante el proceso MATERIAL Y MÉTODO cada grupo de sondas. meiótico tienen un efecto directo sobre el recuento espermático. Este efecto Realizamos el estudio de FISH RESULTADOS puede ser detectado con el estudio espermático en 1693 pacientes con de FISH en espermatozoides. Estos cariotipo normal que acudieron a nuestro En las siguientes tablas se muestran resultados pueden ayudar al clínico a centro con deseo gestacional. Los los porcentajes de pacientes con FISH decidir en qué casos solicitar el estudio espermatozoides se fijaron con Carnoy alterados según los percentiles de de FISH y qué probabilidad de encontrar y posteriormente se descondensaron las recuento total, movilidad progresiva anomalías hay en cada caso. Percentil Parámetros (unidades) N 2.5 5 10 25 50 75 90 95 97.5 Número total de espermatozoides 1859 23 39 69 142 255 422 647 802 928 (106 por eyaculado) FISH alterado (%) 1693 28,0 17,5 17,0 12,0 7,0 7,1 5,8 3,6 0 Percentil Parámetros (unidades) N 2.5 5 10 25 50 75 90 95 97.5 Movilidad progresiva (%) 1780 28 32 39 47 55 62 69 72 75 FISH alterado (%) 1693 25 15,9 12,1 11,6 10,4 7,1 11,5 0 0 Percentil Parámetros (unidades) N 2.5 5 10 25 50 75 90 95 97.5 Morfología normal (%) 1851 3 4 5.5 9 15 24.5 36 44 48 FISH alterado (%) 1693 26,9 25 20 11,8 15,2 8,7 5,3 10,9 3,4
- 113. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 111 005: FISH EN ESPErMAtOZOIDES: ¿cUÁNtOS crOMOSOMAS DEBEMOS ANAlIZAr? E. García-Mengual, R. Claramunt, C. Sánchez-Matamoros, S. Tomás, M. Pardo, R. Bautista-Llácer, T. Alberola, X. Vendrell Sistemas Genómicos e-mail: elena.garcia@sistemasgenomicos.com INTRODUCCIÓN OBJETIVOS RESULTADOS La aparición de las técnicas de Comparar la capacidad de diagnóstico El estudio simultáneo de las dos series de hibridación in situ fluorescente (FISH) de la FISH en espermatozoides en hibridación mostró que el 35.6% (62/174) ha permitido ampliar el estudio del función del número de cromosomas de los casos presentaban alteraciones en gameto masculino a lo largo de todo el analizados, observando la incidencia de alguno de los 9 cromosomas analizados. proceso espermatogénico. Actualmente, aneuploidías (disomías y nulisomías) en El análisis reveló un 8.6% (15/174) y un la mayoría de los protocolos de estudio la misma población, estudiada de forma 21.8% (38/174) de muestras aneuploides, del varón infértil/subfértil incorporan simultánea; una fracción de la muestra en la serie de 5 (13, 18, 21, X, Y) y 4 (15, estudios citogenéticos que resultan se hibrida con sondas específicas para 5 16, 17, 22) cromosomas respectivamente de gran ayuda para el asesoramiento cromosomas (13, 18, 21, X e Y) y otra con (P<0.05). Un 5.2% (9/174) de los pacientes genético reproductivo. Los estudios sondas para 4 cromosomas adicionales presentó aneuploidías en más de un publicados presentan gran variabilidad. (15, 16, 17 y 22). cromosoma en ambas series. El 61.3% de No obstante, han demostrado una los casos patológicos (38/62) mostraron asociación entre alteraciones del MATERIAL Y MÉTODOS alteración únicamente en la serie de 4 seminograma, fallos previos de FIV y/o cromosomas (15, 16, 17, 22). Las tasas de abortos de repetición, y el incremento Se estudiaron 174 muestras de eyaculado aneuploidías detectadas por cromosoma de aneuploidías en espermatozoides de varones infértiles con diversa etiología analizado son: 0.57% (1/174) para el de individuos con cariotipo somático (O, OA, OAT, fallo de FIV, y/o abortos de cromosoma 13; 1.15% (2/174) para el 18; normal. En este contexto, está repetición). El procesado de la muestra 1.72%(3/174) para el 21; 10.92% (19/174) indicado el estudio de las aneuploidías incluye: lavado, permeabilización, para X e Y; 7.47% (13/174) para el 15; espermáticas en varones pertenecientes fijación, extensión, e hibridación in situ 1.72% (3/174) para el 16; 4.02% (7/174) a alguno de estos grupos de riesgo. fluorescente con sondas centroméricas para el 17 y 14.94%(26/174) para el 22. Pero, ¿cuántos y qué cromosomas para los cromosomas 15, 16, 17, 18, X, Y debemos analizar? (Vysis®) y sondas locus específicas para CONCLUSIONES los cromosomas 13, 21 y 22 (Vysis®). El La mayoría de los centros que han análisis de las señales de hibridación se El estudio de los cromosomas 15, incorporado la técnica, basan sus realizó mediante un sistema fluorescente 16, 17 y 22 en espermatozoides resultados en el análisis de nulisomías, automatizado basado en la digitalización de varones procedentes de parejas y disomías para 5 cromosomas (13, 18, de las imágenes mediante un algoritmo con problemas de fertilidad revela 21, X e Y). Sin embargo el rastreo de estadístico (sistema Metafer-MetaCyte® tasas elevadas de aneuploidías no aneuploidías en embriones procedentes de MetaSystems®). Se estudiaron unos detectadas en el estudio básico de 5 de FIV (PGS) revela una elevada 1.200 espermatozoides por cromosoma/ cromosomas. El análisis automatizado incidencia de aneuploidías para los sonda y unos 11.000 por muestra, de 9 cromosomas resulta rápido, coste- cromosomas 15, 16, 17 y 22, lo que resultando un total de 1.809.912 efectivo, y reduce la subjetividad inter e justificaría la incorporación de estos espermatozoides analizados. Para el intraobservador, convirtiéndolo en una cromosomas al análisis espermático análisis estadístico se aplicó el test de estrategia especialmente útil para el ampliándolo hasta 9 cromosomas. Chi-cuadrado. asesoramiento genético reproductivo.
- 114. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 112 006: HIBrIDAcIÓN GENÓMIcA cOMPArADA: rESUltADOS PrElIMINArES D. Tuñón1*, M. Parriego1, M. Boada1, T. Alberola2, J. Navarro3, V. Coroleu1 y A. Veiga1,4. 1 Servicio de Medicina de la Reproducción. Departamento de Obstetricia, Ginecología y Reproducción. Institut Universitari Dexeus. 2 Unidad de Genética Reproductiva. Sistemas Genómicos, S.L. Ronda G. Marconi, 6. 46980 Paterna, Valencia. 3 Unidad de Biología Celular y Genética Médica. Facultad de Medicina. UAB. Plaça Cívica. 08193 Bellaterra. 4 Unidad Banco de Líneas Celulares. Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona. Dr Aiguader, 88. 08003 Barcelona. e-mail: doltun@dexeus.com INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS cuatro blastómeros 5.4 %. La selección embrionaria mediante Estudio retrospectivo de los ciclos de El 53.7% de los embriones caracterizados cribaje de aneuploidías (PGS) en PGS-CGH realizados entre mayo de 2010 como anormales (29/54) presentaban parejas con cariotipos normales y marzo de 2011. Las indicaciones para aneuploidías simples mientras que el para la mejora de los resultados de someterse a un ciclo de FIV con CGH 46.3% (25/74) mostraban aneuploidías Fecundación in Vitro (FIV) es una fueron: fallo repetido de FIV (n=4), numéricas complejas. técnica de aplicación controvertida. presencia de un factor masculino de Aunque la hipótesis parece origen genético (n=4) y abortos de En 26 de los 54 embriones anormales razonable, los estudios prospectivos repetición de causa desconocida (n=3). (35.1%) se detectaron alteraciones que randomizados realizados hasta el afectaban a cromosomas o regiones que momento no han mostrado una mejora En el tercer día de desarrollo in Vitro se no habrían sido analizadas mediante PGS- en la tasa de niño vivo nacido en casa biopsió una única célula de los embriones FISH. Consecuentemente, estos embriones mediante su uso respecto a los ciclos con buenas características morfológicas. hubieran sido considerados como realizados con selección morfológica. Los blastómeros fueron procesados transferibles aplicando FISH como técnica para array-CGH (n=9) o metaphase-CGH diagnóstica, pudiendo dar lugar a fallos de Uno de los factores que parece más (n=2). La transferencia de los embriones implantación o bien a abortos precoces. limitante es el uso de la técnica de diagnosticados como normales se realizó Hibridación In Situ Fluorescente en el quinto día de desarrollo. En dos pacientes (18.2%) no fue posible (FISH) que limita a un máximo de 9 los realizar la transferencia embrionaria al cromosomas que pueden analizarse. Los embriones diagnosticados como no disponer de embriones euploides. Se Mejoras en los protocolos de Hibridación anormales fueron clasificados en dos transfirieron una media de 1.3 embriones Genómica Comparada (CGH) han grupos: aneuploides simples o aneuploides por paciente, alcanzándose una tasa permitido que esta técnica pueda complejos. Éste último grupo está de embarazo por ciclo del 36.4%, por aplicarse en células únicas embrionarias constituido por aquellos embriones en los transferencia del 44.4% y una tasa de y tener un resultado cromosómico que se observaron anomalías numéricas implantación del 33.3%. En todos los completo en 48 horas, permitiendo la para al menos tres cromosomas. casos se trata de gestaciones únicas. De transferencia en el ciclo en fresco. los 4 embarazos alcanzados, 1 ha sido RESULTADOS parto a término y 3 siguen en curso. OBJETIVO Durante el periodo analizado se han CONCLUSIONES Evaluar los resultados obtenidos en realizado 11 ciclos de PGS-CGH. La media los ciclos de PGS-CGH. Se pretende de edad de las pacientes fue de 36.1 La CGH nos ha permitido detectar un analizar el porcentaje de embriones (rango 32-41). 35.1% más de embriones aneuploides normales, anormales, sin diagnóstico y respecto a la FISH para 9 cromosomas. el de ciclos sin transferencia. Asimismo Se analizaron un total de 74 embriones Aunque los resultados son preliminares, se determinará el porcentaje de (X=6.7 embriones/paciente). Dieciséis la determinación de la dotación embriones anormales que no hubieran de los 74 (21.6%) fueron diagnosticados cromosómica completa de los embriones sido detectados mediante un PGS-FISH como normales, 54 (73%) como parece una mejor aproximación para los para 9 cromosomas. anormales y no se obtuvo diagnóstico de casos de FIV-PGS.
- 115. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 113 007: EFEctO INtErcrOMOSÓMIcO: EStUDIO DE ANEUPlOIDÍAS EN ESPErMAtOZOIDES DE POrtADOrES DE rEOrGANIZAcIONES crOMOSÓMIcAS. E. García-Guixé, A.R. Jiménez-Macedo, C. Giménez, M. Sandalinas Reprogenetics, Barcelona. e-mail: pgdteam@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN Las muestras fueron fijadas en en cromosomas no implicados en la metanol:ácido acético (3:1) y se realizaron reorganización. Las anomalías más Los pacientes portadores de extensiones sobre portaobjetos. frecuentemente encontradas fueron reorganizaciones cromosómicas disomías de los cromosomas sexuales presentan dos riesgos genéticos para La descondensación de los núcleos y del cromosoma 21. En solamente la descendencia: por la formación de espermáticos y la desnaturalización 1 caso se observó un porcentaje gametos desequilibrados debido a la de la cromatina se llevaron a cabo incrementado de espermatozoides propia reorganización y por aneuploidías siguiendo protocolos estandarizados. diploides (individuo portador de una debidas al efecto intercromosómico Se aplicaron sondas de FISH para un translocación robertsoniana). (EIC). Los cromosomas implicados máximo de 9 cromosomas (XY 13 14 en reorganizaciones muestran 15 18 20 21 22) no implicados en la CONCLUSIONES frecuentemente regiones asinápticas reorganización cromosómica. Para cada durante la meiosis I, pudiendo interferir paciente se determinó la frecuencia de Se observa efecto intercromosómico en la segregación de otros cromosomas disomías y diploidías y los resultados se en un 59% de los pacientes portadores (fenómeno conocido como EIC). compararon con una población control de reorganizaciones. Así pues, el (10 donantes de semen con cariotipo riesgo reproductivo de aneuploidía en OBJETIVOS normal, normozoospérmicos y de estos pacientes se añade al riesgo de fertilidad probada). generar embriones desequilibrados. Estudiar el posible EIC en hombres El riesgo añadido de aneuploidía varía portadores de reorganizaciones RESULTADOS en función del tipo de reorganización. cromosómicas mediante el Diagnóstico El grupo de pacientes más afectados Genético en Espermatozoides (DGE), que Se observó un aumento significativo son los portadores de translocaciones consiste en la aplicación de la técnica de de anomalías cromosómicas en los robertsonianas, seguido de los portadores FISH (Hibridación in situ de fluorescencia) espermatozoides del 59% de los de recíprocas y finalmente las inversiones. para detección de anomalías individuos estudiados (13 de 22). En Se aconseja realizar un estudio de cromosómicas en espermatozoides. función del tipo de reorganización aneuploidías en espermatozoides previo el porcentaje de pacientes con DGE al ciclo de FIV-DGP-Reorganizaciones para MATERIAL Y MÉTODOS alterado obtenido varía: el 29% poder determinar si el individuo portador de los pacientes portadores de de reorganización cromosómica tiene, Se procesaron 22 muestras de pacientes inversiones, el 57% de los portadores además, riesgo de aneuploidía. El DGE es con reorganizaciones cromosómicas (7 de translocaciones recíprocas, y el 87% una herramienta eficaz para el estudio del portadores de translocaciones recíprocas, de los portadores de translocaciones efecto intercromosómico, permitiendo 8 de translocaciones robertsonianas y 7 robertsonianas presentan un realizar un asesoramiento genético de inversiones peri y paracéntricas). incremento significativo de anomalías reproductivo más completo. 008: lA PrESENcIA DE BMN NO ES DEtErMINANtE PArA DEScArtAr UN EMBrIÓN cOMO crOMOSÓMIcAMENtE ANOrMAl M. Riqueros, J.M. Molina, M. Bellés, A. Ballesteros, G. Calderón IVI Barcelona e-mail: amaia.mugica@ivi.es INTRODUCCIÓN ampliamente estudiada pero poco se sabe blastómeras multinucleadas (BMN) de su origen y consecuencias. Son muchos han de ser descartados. Sin embargo, La multinucleación (MN) ha sido los que sugieren que los embriones con el nacimiento de niños procedentes de
- 116. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 114 embriones multinucleados indica que no todos lo embriones con BMN han de ser Tasa de anormalidad p-valor descartados. MN D2 (%) 328/415 (79,03) No MN D2 (%) 1489/2278 (65,36) p<0,05 Debido a que las BMN frecuentemente MN D3 (%) 303/403 (75,19) presentan una constitución No MN D3 (%) 1514/2290 (66,11) p<0,05 cromosómica diferente a la de sus Tabla 1. Correlación entre MN y anormalidad blastómeras hermanas mononucleadas, se sabe que las BMN no son aptas para realizar el diagnóstico genético Gestación preimplantacional (DGP). No Si 224 (51,85) 208 (48,15) OBJETIVOS Aborto Si No Los objetivos del estudio contemplan (1) determinar si los embriones con 43 (20,67) 165 (69,33) BMN presentan un mayor índice de Media de ET± SD 1,46a±0,52 1,81b±0,59 1,91b±0,65 anormalidad cromosómica y (2) hacer Nº embr MN D2 T/nº de embr T % 13,17a 5,66b 8,14b un seguimiento de los embarazos Nº embr MN D3 T/nº de embr T % 11,53a 9,76a 13,57a obtenidos a partir de la transferencia de Tabla 2. Correlación entre MN y gestación/aborto embriones normales con BMN. MATERIALES Y MÉTODOS realizaron en D+5 según el resultado de dotación cromosómica anormal en el la FISH y las características morfológicas. resto del embrión. Sin embargo, los Estudio retrospectivo de 432 ciclos embriones con BMN presentan un índice (2693 embriones) de DGP realizados Los resultados se analizaron con el test de anormalidad significativamente entre 2004 y 2010 en IVI Barcelona. de c2 y la U de Mann-Whitney. superior respecto a aquellos que no las La indicación para el DGP de los casos presentan. Además, la transferencia incluidos en el estudio fue el fallo de RESULTADOS de embriones con BMN y con una implantación, aborto de repetición, edad dotación cromosómica normal para y factor masculino severo (FISH anormal La tasa de anormalidad cromosómica los cromosomas analizados da lugar de espermatozoides y meiosis alterada). es significativamente superior en los a embarazos a término. Cuando la embriones con BMN (tabla 1). MN aparece en día 2 del desarrollo, La morfología embrionaria fue descrita a pesar de que los embriones sean en D+2 (44-47 horas post inseminación/ El embarazo clínico se consiguió en un cromosómicamente normales tienen un inyección) y en D+3 (67-71 horas post 48,15% de los casos y de éstos, el 69,33% poder implantatorio menor, pero cuando inseminación/inyección) siguiendo finalizan en embarazo a término. la MN aparece en día 3 parece no afectar los criterios de ASEBIR. La biopsia La tabla 2 muestra el porcentaje de a la implantación. El hecho de que embrionaria se realizó en D+3 siempre embriones MN transferidos en los embriones MN con dotación cromosómica y cuando el embrión presentara un grupos de no gestación, aborto y normal de lugar a embarazos a término mínimo de 6 células y menos de un gestación a término. indica que no todos los embriones MN 20% de fragmentación. El estudio de han de ser descartados como anormales aneuploidías para los cromosomas 13, CONCLUSIONES ya que o bien el embrión es capaz de 15, 16, 17, 18, 21, 22, X e Y se llevó a aislar esa blastómera de la masa celular cabo en una única célula mononucleada. La mera presencia de MN en una interna o bien no siempre las BMN tiene Las transferencias embrionarias se blastómera no es indicativa de una una dotación cromosómica anormal.
- 117. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 115 009: cIGOtOS MONOPrONUclEArES DE IcSI: DESArrOllO EMBrIONArIO Y cONStItUcIÓN crOMOSÓMIcA S. Mateo1, M. Parriego1, M. Boada1, F. Vidal2, A. Veiga1,3 1 Instituto Universitario Dexeus, Servicio de Medicina de la Reproducción 2 Universidad Autónoma de Barcelona 3 Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona e-maill: silmat@dexeus.com INTRODUCCIÓN de fecundación in vitro (FIV). Los analizados (media 30,4; rango: embriones se mantuvieron en cultivo 8-133). Todos los embriones fueron La observación de un único pronúcleo hasta un máximo de 7 días a 37oC, 6% cromosómicamente anormales y dos corpúsculos polares a las 18+2h de CO2 y 95% de humedad. Se fijaron presentando más de una línea celular: posteriores a la microinyección en el momento en que se observó el 9 mosaicos (36%) y 16 caóticos intracitoplasmática (ICSI) se considera bloqueo de la división embrionaria o (64%). Diecinueve embriones (76%) un patrón anómalo de fecundación en cuando habían alcanzado el estadio presentaron células diploides en la especie humana. Se postulan tres de blastocisto. Se procesaron para porcentajes variables (6-83%). Se mecanismos como posibles causas del FISH utilizando sondas comerciales observó presencia del cromosoma Y origen de estos cigotos: la asincronía especificas para los cromosomas 13, en 10 embriones (40%). Solo un 5% de la formación/desmantelamiento 18, 21, X e Y (MultiVysion PGT Multi- de los cigotos formó un blastocisto de los pronúcleos, la singamia y color Probe, Vysis®, AbbotMolecular). de buena morfología. El estudio del la activación partenogenética del Los embriones se clasificaron según desarrollo embrionario en relación a ovocito. Datos procedentes de estudios los criterios propuestos por Delhanty la constitución cromosómica mostró previos describen bajos porcentajes de et al. (1997) ligeramente modificados: que los embriones mosaicos llegaron euploidía en los embriones derivados de embriones normales (≥90% núcleos al estadio de blastocisto en mayor estos cigotos aunque existen grandes cromosómicamente normales), proporción que los embriones caóticos. variaciones entre estudios. embriones anormales (<90% núcleos cromosómicamente normales). Entre CONCLUSIONES OBJETIVO los embriones anormales se distinguió entre: no mosaicos (≥90% núcleos con El estudio cromosómico demostró que Se estudio la constitución cromosómica la misma anomalía), mosaicos (≥50% el 40% de los embriones procedentes de los embriones derivados de núcleos con la misma anomalía) y de cigotos 1PN de ICSI presentaron cigotos con estas características y se caóticos (<50% núcleos con la misma una señal perteneciente al cromosoma buscaron relaciones entre la dotación anomalía). Los embriones con menos Y, lo que parece indicar que el origen cromosómica y la capacidad de alcanzar de 8 núcleos analizables no fueron de estos cigotos no fue la activación el estadio de blastocisto con el fin de incluidos en el estudio de la constitución partenogenética sino la fecundación valorar su posible uso en tratamientos cromosómica debido a la limitada por parte de un espermatozoide. Todos de reproducción humana asistida. información que podían proporcionar. los embriones procedentes de cigotos monopronucleares tras ICSI de nuestro MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS estudio han sido diagnosticados como cromosómicamente anormales por Se incluyeron 58 cigotos Se obtuvo diagnóstico de un mínimo lo que, independientemente de su monopronucleares de ICSI que de 8 núcleos en 25 embriones morfología, se desaconseja su uso con provenían de 84 ciclos del programa (43,1%), con un total de 761 núcleos finalidades reproductivas.
- 118. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 116 010: PrIMErA APlIcAcIÓN DEl DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl DE DOBlE FActOr PArA SÍNDrOME DE lYNcH O cÁNcEr cOlOrEctAl HErEDItArIO NO POlIPÓSIcO (ccHNP) L. Ramos*1, G. Daina*1,2, M. Rius1,2, A. Polo3, J. Benet1, O. Martínez-Pasarell3, A. Obradors2,4, J. Navarro1 *Los dos primeros autores han contribuido de la misma forma en este trabajo. 1 Unitat de Biologia Cel·lular i Genètica Mèdica, Facultat de Medicina, Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193, Bellaterra. 2 Càtedra de Recerca Eugin-UAB. 3 Fundació Puigvert-Hospital de Sant Pau i de la Santa Creu, 08025, Barcelona. 4 Clínica Eugin, 08029, Barcelona. e-mail: MariaEulalia.Ramos@uab.cat, Gemma.Daina@uab.cat, Joaquima.Navarro@uab.cat INTRODUCCIÓN OBJETIVOS la Multiple Displacement Amplification modificada y posteriormente se Las enfermedades más ampliamente Conseguir un embarazo libre de amplificaron los fragmentos de indicadas para el Diagnóstico Genético Síndrome de Lynch o Cáncer Colorectal interés por PCR multiplex. Cada PCR se Preimplantacional (DGP) son aquellas Hereditario No Polipósico (CCHNP) en leyó por electroforesis capilar en un con una elevada penetrancia y una una familia de riesgo mediante un DF- secuenciador ABIPrism 3730 (Applied aparición temprana en la infancia. Hoy DGP, una vez autorizado por la Comisión Biosystems). El segundo blastómero en día, aunque no exento de debate, el Nacional de Reproducción Humana biopsiado se utilizó para el análisis DGP para síndromes de predisposición a Asistida. citogenético siguiendo el protocolo de cáncer ya es una realidad, habiéndose CGH rápida según Rius et al., 2010. descrito DGPs para poliposis MATERIAL Y MÉTODOS adenomatosa familiar (FAP) y cáncer de RESULTADOS mama y ovario causados por mutaciones Una pareja con el cónyuge masculino en los genes BRCA1 y 2. afectado de Síndrome de Lynch, En 12 de los 14 embriones biopsiados portador de la mutación p.Lys616del (85,7%) se consiguió el diagnóstico Según la European Society of Human en el gen MLH1, fue incluida en un monogénico: 7 de ellos eran Reproduction and Embryology programa de DF-DGP en colaboración heterocigotos afectados para el (ESHRE), sólo el 15% de los embriones con la Fundació Puigvert-Hospital de Síndrome de Lynch (58,3%), mientras transferidos después de un DGP dan Sant Pau i de la Santa Creu de Barcelona. que 5 eran homocigotos sanos (41,6%). lugar a embarazo. Se cree que una de las Los 14 embriones biopsiados fueron razones de esta baja tasa de implantación Se diseñaron los cebadores para la diagnosticados citogenéticamente es la presencia de aneuploidías en los detección directa e indirecta de la (100%): 8 eran euploides (57,1%) y 6 embriones transferidos. A pesar de ello, mutación, mediante seis Short Tandem presentaban alteraciones (42,9%). no se suelen analizar las aneuploidías Repeats (STRs) cercanos al gen MLH1. en los casos de DGP para enfermedades Dos embriones evolutivos, que eran monogénicas. Se realizaron dos ciclos de FIV. En el tanto libres de la mutación como primero, tras la inducción hormonal euploides, se transfirieron en día+5 y Recientemente se ha propuesto la ovocitaria se obtuvieron 7 ovocitos han dado lugar a un embarazo en curso. realización de un DGP de doble factor maduros que se inseminaron mediante (DF-DGP) en el que se realiza el estudio ICSI, de los cuales 4 se fecundaron y CONCLUSIONES de mutaciones en un blastómero del fueron congelados en estadio 2PN. En el embrión y el análisis del complemento segundo ciclo, de 14 ovocitos maduros Se ha conseguido por primera vez un cromosómico en otro blastómero, inseminados, 12 se fecundaron y 11 embarazo libre de Síndrome de Lynch mediante la Hibridación Genómica resultaron evolutivos a día+3. Tres de o Cáncer Colorectal Hereditario No Comparada (CGH) rápida desarrollada los embriones congelados en el primer Polipósico (CCHNP) consecuencia de un en nuestro grupo. El DF-DGP permite ciclo sobrevivieron a la descongelación. diagnóstico genético preimplantacional seleccionar para su transferencia dentro de doble factor. Se ha puesto en del mismo ciclo de FIV, los embriones Se biopsiaron dos blastómeros de evidencia la utilidad del DF-DGP, que libres de la enfermedad monogénica un total de 14 embriones. Uno de puede representar una mejora en la y euploides, que tendrán una mayor los blastómeros fue sometido a una tasa de implantación del DGP para probabilidad de implantación. amplificación del genoma mediante enfermedades monogénicas.
- 119. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 117 011: DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl DE trANSlOcAcIONES MEDIANtE AcGH. rESUltADOS PrElIMINArES. C. Giménez, E. Garcia-Guixé, A. Jiménez-Macedo, M. Sandalinas Reprogenetics, Barcelona e-mail: litus@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN anormales que con la técnica de FISH De los 22 embriones analizados, 2 (9.1%) convencional. resultaron ser normales o equilibrados, 3 Las parejas portadoras de translocaciones (13.6%) fueron normales o equilibrados tienen un elevado riesgo de producir MATERIAL Y MÉTODOS pero presentaban, además, aneuploidía, gametos con desequilibrios cromosómicos 3 (13.6%) resultaron desequilibrados, 10 que pueden dar lugar a embriones no Se analizaron embriones obtenidos de (45.5%) eran desequilibrados y además viables, abortos o descendencia afecta. parejas portadoras de translocaciones presentaban aneuploidía y los 4 (18.2%) El DGP de translocaciones mediante mediante la técnica de FIV o FIV- últimos fueron caóticos. FISH ha permitido disminuir hasta un ICSI a los que se les biopsió una 10% el riesgo de aborto en parejas única célula en D+3 de desarrollo La utilización del aCGH permitió portadoras. No obstante, sabemos embrionario. Las células biopsiadas detectar entre los embriones que que, por un lado, con la edad materna fueron introducidas en un tubo de PCR presentaban aneuploidía, un 38.5% aumenta el riesgo de aneuploidías para donde fueron sometidas al proceso de más que si se hubiera utilizado una FISH otros cromosomas que pueden no estar amplificación total del genoma (WGA). adicional de 9 cromosomas (XY, 13, 15, involucrados en la translocación y, del Posteriormente se procedió al marcaje 16, 17, 18, 21 y 22). otro, independientemente de la edad de fluorescente e hibridación sobre la paciente, el efecto intercromosómico arrays de BAC (24Sure, BlueGnome, Si definimos el término conversión puede dar lugar a anomalías numéricas Cambridge, UK). Los arrays fueron como el porcentaje de embriones en otros cromosomas no implicados en la leídos en un escáner y los perfiles normales o equilibrados que pasan a anomalía estructural. obtenidos analizados mediante ser no transferibles por la presencia de software específico. La transferencia de aneuploidía detectada mediante aCGH, Para evitar la transferencia de los embriones normales/equilibrados y ésta fue del 66% (2 de 3). embriones normales/equilibrados euploides se realizó en día +5. para la translocación pero portadores CONCLUSIONES de aneuploidías se pueden analizar RESULTADOS otros cromosomas mediante FISH, Los resultados obtenidos muestran que pero esta técnica únicamente permite Entre Julio de 2010 y Marzo de 2011, los aCGH pueden ser utilizados para analizar unos pocos cromosomas más, se realizaron un total de 5 ciclos de el análisis de translocaciones, lo que simultáneamente con la translocación. FIV-DGP para análisis de translocación permite, además, el análisis simultáneo La aparición de la aCGH permite el análisis más aneuploidía mediante aCGH, de todos los cromosomas. De los 22 de todos los cromosomas junto con correspondientes a 3 y 2 pacientes embriones analizados, 13 presentaban aquellos implicados en la translocación, portadores de translocaciones anomalías numéricas y, de éstos, 5 siempre que los fragmentos translocados recíprocas y robertsonianas, hubieran pasado desapercibidos si tengan un tamaño superior a 6Mb. Para respectivamente. no se hubieran analizado todos los tamaños inferiores, la técnica aún no ha cromosomas. Existe un elevado grado sido validada. La edad media de las pacientes fue de de aneuploidía en pacientes portadores 34a (rango: 29-37a) con una media de translocaciones, por lo que es OBJETIVOS de embriones biopsiados por paciente recomendable analizar, además de de 4,4 (rango: 3-6). Se ha obtenido aquellos cromosomas implicados en la Analizar si los aCGH permiten observar resultado en todos los embriones anomalía estructural, el resto de los más embriones cromosómicamente biopsiados (n=22). cromosomas.
- 120. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 118 012: DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl EN VArONES cON MEIOSIS AltErADA. rESUltADOS SEGÚN lOS rESUltADOS DEl EStUDIO DE FISH EN ESPErMAtOZOIDES M. Esbert, F. Vidal, M. Florensa, M. Riqueros, A. Ballesteros, G. Calderón IVI-Barcelona e-mail: marga.esbert@ivi.es INTRODUCCIÓN puede reflejar con mejor fidelidad la T-student, considerando estadísticamente correlación con las aneuploidías presentes significativos valores de p<0,05. La alteración en el proceso de la meiosis en los embriones. puede originar aneuploidías en los RESULTADOS espermatozoides. Dichas alteraciones OBJETIVOS pueden ser observadas indirectamente 28 de los 48 pacientes con anomalías mediante la técnica de FISH (Fluorescence Los objetivos de nuestro estudio fueron: meióticas tuvieron un diagnóstico de In Situ Hybridization) en espermatozoides, 1) analizar la correlación existente entre FISH anormal (58,33%) y en los restantes o directamente mediante el estudio de las ambas pruebas diagnósticas; 2) comparar el FISH resultó normal (41,67%). figuras meióticas obtenidas a partir del el porcentaje de embriones aneuploides tejido testicular. presente en ambos grupos; 3) comparar El porcentaje de embriones haploides los resultados clínicos de ambos grupos y poliploides, así como el índice de El estudio de la meiosis en tejido de estudio tras un ciclo de FIV con DGP anomalías por cromosoma, fueron testicular tiene como inconvenientes en (Diagnóstico Genético Preimplantacional). comparados y tampoco se hallaron primer lugar que la obtención de tejido diferencias entre los dos grupos. testicular requiere una biopsia, a la que MATERIAL Y MÉTODOS no todos los pacientes están dispuestos DISCUSIÓN y además el diagnóstico no siempre es El estudio incluyó 48 pacientes cuyo claro ni concluyente. Por otro lado, la estudio meiótico resultó anormal y a los El 41,67% de los pacientes con FISH en espermatozoides eyaculados que también se les solicitó un estudio de anomalías en la meiosis tienen un suele dirigirse a valorar las anomalías de FISH en espermatozoides. Los pacientes se resultado normal en el estudio del FISH 5 cromosomas (13,18,21,X,Y). sometieron a 57 ciclos de FIV con DGP. en espermatozoides. El porcentaje de embriones anormales La población se dividió en dos grupos Los pacientes con anomalías en la derivados de pacientes que han de estudio en función del resultado meiosis presentan un alto porcentaje presentado alteraciones meióticas o del FISH en espermatozoides. La de embriones cromosómicamente anomalías en el estudio de FISH en biopsia embrionaria se realizó en día anormales, independientemente del espermatozoides es superior a los 3 de desarrollo, y se analizaron los resultado del FISH en espermatozoides. derivados de pacientes con resultados cromosomas 13,15,16,17,18,21,22, X e El DGP debería ser recomendado a meióticos y de FISH en espermatozoides Y. La transferencia tuvo lugar el 5º día de estos pacientes, ya que se pueden normales. No obstante aun queda por desarrollo. Para el análisis estadístico se obtener altas tasas de embarazo y de demostrar cual de las dos herramientas realizaron la prueba de Chi-cuadrado y implantación. Meiosis anormal + FISH normal Meiosis anormal + FISH anormal p Num. Ciclos 32 25 edad mujer (95% IC) 33,91 (32,05-35,76) 32,60 (30,72-34,48) NS ovocitos (95%IC) 13,75 (11,28-16,22) 11,24 (9,01-13,47) NS embriones biopsiados (95%IC) 4,19 (3,15-5,23) 5,24 (4,01-6,47) NS embriones informativos (95%IC) 4,09 (3,05-5,14) 5,12 (3,95-6,29) NS embriones anormales (%) 2,44 (61,21%) 2,80 (52,90%) NS embriones transferidos (95%IC) 1,67 (1,37-1,96) 1,95 (1,67-2,23) NS Num. transferencias (%) 24 (75,00%) 20 (80,00%) NS Num. gestaciones (%) 11 (45,83) 12 (60,00%) NS Num. abortos (%) 1 (9,09%) 2 (16,67%) NS Tasa de implantación 36,81 % 42,50% NS Tabla 1: Resultados de los ciclos de DGP.
- 121. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 119 013: PErFIl MEtABOlÓMIcO EN lOS MEDIOS DE cUltIVO DE EMBrIONES BAJO cONDIcIONES DE HIPOXIA P. Gámiz, F. Domínguez, S. Pérez, J. LL. Romero, T. Viloria, M.J. De Los Santos. Instituto Valenciano de Infertilidad. IVI Valencia e-mail: Pilar.Gamiz@ivi.es INTRODUCCIÓN pertenecientes a 23 pacientes de cultivados en condiciones atmosféricas nuestro programa de ovodonación con de oxígeno, no reveló diferencias En muchos casos, las técnicas de un 100% de tasa de implantación. Los significativas entre ambos grupos. A Fecundación in vitro obligan a ovocitos y medios de cultivo y sus controles blancos pesar de no observarse diferencias embriones a crecer en diferentes medios fueron recogidos en día 3 de desarrollo en el perfil global, mediante análisis de cultivo con diferentes formulaciones, embrionario y almacenados a -186º univariante, dos metabolitos así como en condiciones de oxígeno C hasta su posterior análisis. No se definidos por su relación masa /carga atmosféricas (20%) muy distintas a observaron diferencias en la media de y tiempo de retención, aparecieron las encontradas in vivo. Los estudios edad de las donantes en ambos grupos significativamente elevados, mientras de metabolómica permiten analizar (26.2 y 25.8 respectivamente), así como que un tercero aparecía disminuido en de forma global, ínfimos cambios en en la calidad de los embriones en día el grupo de embriones que se había las concentraciones de los diferentes +2 y +3 de desarrollo. Las muestras cultivado en bajas tensiones de metabolitos en el medio donde crecen fueron descongeladas, se extrajeron oxígeno. los embriones, dando información acerca los metabolitos y fueron inyectadas en de la utilización por parte del embrión de el cromatógrafo líquido de alta presión CONCLUSIÓN diferentes sustancias presentes en el cultivo. (UPLC) acoplado a espectrómetro de masas (MS). Se midieron todos los El cultivo de los preembriones humanos OBJETIVO metabolitos endógenos presentes en las en baja tensión de oxígeno no pareció muestras definidos por su relación masa/ modificar de forma significativa El objetivo del presente trabajo fue carga y su tiempo de retención. Para el sus rutas metabólicas durante el analizar si los preembriones humanos análisis estadístico se realizaron análisis crecimiento in vitro. cultivados en distintas concentraciones univariantes (comparación de medias) de oxígeno (5% y 20%) sufren algún de cada metabolito encontrado entre No se observaron cambios en el perfil tipo de cambio en su metabolismo que ambos grupos y multivariante (análisis de de consumo de piruvato, lactato o pueda reflejarse en la composición final componentes principales) para encontrar glucosa, así como tampoco en los del medio de cultivo. diferencias globales entre grupos. niveles de aminoácidos como Asn, Gly o Leu utilizados como marcadores de MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS implantación. Estos resultados puede ser interpretados como un ejemplo más Se analizaron un total de 41 muestras El análisis multivariante del perfil de la plasticidad del embrión humano de medio de cultivo (n=24 en 5% de O2 metabolómico global de los embriones a los condicionamientos externos del y n= 17 en 20% de O2) de embriones cultivados en hipoxia versus los cultivo in vitro. 014: EFIcAcIA DE lA VItrIFIcAcIÓN DE EMBrIONES EN DÍA 4 J. Guerrero, J. Ten, M. Pérez, J. Llácer, R. Bernabeu Instituto Bernabeu Alicante e-mail: jguerrero@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN contribuir a reducir el embarazo múltiple, de la vitrificación de embriones en día 3 en la medida en la que la disponibilidad y en estadio de blastocisto, mientras que El desarrollo de un programa de de los embriones para congelar es testimonial en el caso de embriones criopreservación embrionaria eficaz favorece la decisión de transferir en día 4. El objetivo de este estudio es es fundamental para cualquier menos embriones. No cabe duda de analizar los resultados obtenidos con unidad de Reproducción Asistida, que la incorporación de la vitrificación la vitrificación de embriones en día 4 y ya que la congelación de embriones como técnica de rutina ha contribuido valorar su eficacia comparándolos con supernumerarios permite optimizar enormemente a mejorar los resultados. los obtenidos en día 5. el tratamiento aumentando la tasa En la literatura encontramos numerosos de embarazo por punción, además de trabajos en los que se evalúa la eficacia
- 122. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 120 MATERIAL Y MÉTODOS embrionaria, tasa de β-hCG positiva, y CONCLUSIONES tasas de embarazo e implantación. Los Se analizaron retrospectivamente 131 resultados se analizaron mediante el La menor tasa de supervivencia ciclos de criotransferencia realizados test de t-student y el test chi-cuadrado. observada en blastocisto se debe en nuestro Centro de los cuales 21 son Se consideró estadísticamente probablemente al elevado volumen de ciclos de embriones vitrificados en día 4 significativa una P valor <.05. fluido contenido en el blastocele, que (grupo I) y 110 en día 5 (grupo II). Se favorece la formación de cristales de incluyeron criotransferencias derivadas RESULTADOS hielo. De acuerdo con nuestros datos, tanto de ciclos de estimulación ovárica la vitrificación de embriones en día 4 es como de donación de ovocitos. Los Los resultados más relevantes se al menos tan eficaz como la vitrificación parámetros más relevantes analizados muestran en la siguiente tabla. en día 5, presentándose como una fueron la tasa de supervivencia alternativa viable. DÍA 4 (21) DÍA 5 (110) P valor % de pacientes con transferencia 95,2 86,4 NS Tasa de supervivencia (%) 94,8 82,2 0,012 Embriones transferidos (media±SD) 2,25±0,5 2,19±0,5 NS β-hCG + (%) 60,0 58,9 NS Tasa de embarazo clínico (%) 60,0 44,2 NS Tasa de implantación (%) 30 26,5 NS Aborto clínico (%) 33,3 21,4 0,042 Embarazo múltiple (%) 0 21,4 0,021 015: EStUDIO DE lA EXPrESIÓN DE cUAtrO mirNAs EN INDIVIDUOS FÉrtIlES E INFÉrtIlES: IMPlIcAcIONES rEPrODUctIVAS A. Salas-Huetos, J. Blanco, F. Vidal, E. Anton Unidad de Biología Celular, Facultad de Biociencias, Universidad Autónoma de Barcelona (UAB). 08193 Bellaterra. e-mail: albert.salas@uab.cat; ester.anton@uab.cat INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS Se realizó una RT-PCR de las muestras de RNA y seguidamente una PCR Los miRNAs son moléculas de 22- Se obtuvieron cuatro muestras con cebadores exón-exón para el 24nt implicadas en la regulación de de semen procedentes de cuatro gen de la Protamina-1. Con esta la expresión génica de numerosos individuos control y cuatro muestras de estrategia los productos resultantes procesos biológicos. Se han identificado individuos con problemas de fertilidad de la amplificación del RNA podrían ser perfiles alterados de expresión de de origen idiopático.La fracción celular diferenciados de los resultantes de la miRNAs en varios casos de infertilidad espermática fue separada de las células amplificación del DNA. masculina poniendo de manifiesto el somáticas mediante el método de papel fundamental de estas moléculas Somatic Cell Lysis. Seguidamente, se realizó una RT-PCR en la regulación de la fertilidad. para cuatro miRNAs: hsa-miR-23a, hsa- El RNA de los espermatozoides fue miR-744, hsa-let-7f y hsa-miR-1 junto OBJETIVOS extraído mediante el método TRIzol con el gen normalizador Mamm-U6 y seguidamente, purificado mediante utilizando TaqMan MicroRNA Reverse Caracterizar los patrones de expresión un tratamiento con DNasa. La calidad Transcription Kit (Applied Biosystems). de cuatro miRNAs en RNA espermático y cantidad extraída se determinó El cDNA se diluyó con los cebadores procedente de individuos fértiles e utilizando un espectrofotómetro correspondientes (TaqMan MicroRNA infértiles, y relacionar las posibles UV/visible (Nanodrop-2000; Assays) y se realizó la PCR a tiempo diferencias de expresión con la ThermoScientific). real con el kitTaqMan Universal PCR presencia del fenotipo infértil. Master MixII(Applied Biosystems). Se
- 123. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 121 analizaron 3 réplicas para cada muestra RESULTADOS de la expresión en tres de los cuatro mediante la plataforma 7900HT Fast individuos problemas. Real-Time PCR (Applied Biosystems). El método TRIzol permitió obtener una media de 2.6*10-5ng d’RNA por CONCLUSIONES La cuantificación de las diferencias espermatozoide. La pureza media de de expresión se determinó mediante todas las muestras se situó en torno Nuestros resultados, aunque el cálculo del estadístico Fold Change a 1.72 (±0.05). Ambos resultados se preliminares debido al número de a partir de la variable Ct normalizada ajustan a lo descrito en la bibliografía. muestras y miRNAs analizados, (ΔCt). La variable Ct indica el ciclo de sugieren la existencia de diferencias PCR en que los miRNAs son detectados; Los resultados de las PCRs para el gen de de expresión para algunos miRNAs es por tanto un reflejo de la cantidad o Protamina-1 confirmaron la ausencia de entre individuos fértiles e infértiles. la expresión. El valor de Fold Change se DNA genómico. Estos resultados verifican Estos datos serían de gran interés para calcula a partir de la relación numérica que la extracción de RNA y el tratamiento ayudar al esclarecimiento de las bases entre la media de los valores ΔCt de los con DNasa permiten la obtención de un genéticas de la infertilidad masculina cuatro controles con cada uno de los RNA libre de contaminaciones de DNA. de origen idiopático. ΔCt obtenidos en individuos problema. Valores de Fold Change<1 indican una Los resultados del ensayo TaqMan AGRADECIMIENTOS menor expresión, el incremento de identificaron tres de los cuatro miRNA expresión se refleja mediante valores analizados: let-7f, miR-23a y miR-744. Este trabajo ha sido posible gracias a >1. Estas diferencias de expresión se En cambio, ninguna de las muestras la aportación de muestras del Instituto consideraron significativas cuando mostró resultados de Ct para miR-1 Valenciano de Infertilidad de Valencia el valor de ΔCt se situaba fuera del compatibles con la presencia de esta y la Unidad de Reproducción Asistida intervalo de confianza calculado partir molécula en espermatozoides. En Centro Médico Teknon de Barcelona. El de la media (±1.96*DE) de ΔCt en las dos de los tres miRNA identificados trabajo se ha desarrollado mediante la muestras control. (miR-23a y miR-744) se observaron financiación de los proyectos FIS PS- cantidades equivalentes entre muestras 09-00330 y 2009/SGR00282. AS-H es control y problema. En cambio, let- el beneficiario de una beca predoctoral 7f mostró una reducción significativa PIF de la UAB456-01-1/E2010. 016: rESUltADOS PrElIMINArES DEl cUltIVO EMBrIONArIO EN HIPOXIA B. Ramos, I. Moragues, A. Montoya, N. Wegmann, J. Aizpurua IVF SPAIN e-mail: b.r_m@hotmail.com INTRODUCCIÓN Estudiar el efecto de la concentración (D1 hasta D3 o D5) se trasladan a 5%O2, de oxígeno sobre el ovocito desde D0 6%CO2, 37ºC. Los medios de cultivo Numerosos trabajos han estudiado la hasta D1. utilizados son de la serie G5 de Vitrolife importancia de la concentración de (Vitrolife, Sweden AB) y los incubadores oxígeno en el cultivo embrionario. Evaluar la concentración de oxígeno son Labotect C60 (Göttingen, Germany). Varios autores han mostrado tasas para obtener el mayor rendimiento de Las muestras seminales se capacitan superiores de embarazo clínico, blastocistos/ciclo. utilizando gradientes de densidad. El implantación y nacidos vivos. La análisis estadístico con un índice de mayoría de los estudios sobre la hipoxia MATERIAL Y MÉTODOS confianza del 95% se realiza mediante comparan la concentración atmosférica el test t de Student para muestras (20%) y la fisiológica (5%), pero muy Se diseña un estudio prospectivo pareadas y variables continuas, y pocos estudian una concentración aleatorio de 56 pacientes para un mediante el χ2 con corrección de Yates intermedia (10%). tratamiento de ovodonación. Se para muestras porcentuales. comparan tres protocolos de cultivo OBJETIVOS ovocitario/embrionario: A) D0 RESULTADOS (punción) a D1 (fecundación) a 5%O2, Estudiar el efecto de la concentración 6%CO2, 37ºC (N=14); B) D0 (punción) Se aplican los test estadísticos de oxígeno en las tasas de fecundación, a D1 (fecundación) a 10%O2, 6%CO2, comparando entre los tres grupos calidad embrionaria en D3/D5 37ºC (N=14); C) D0 (punción) a D1 de forma pareada (A y B, B y C, A y (blastulación) y gestación química. (fecundación) a 20%O2, 6%CO2, 37ºC C). Los datos de mayor interés y con (N=14). El resto del cultivo embrionario mayor índice de significación son: las
- 124. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 122 tasas de fecundación entre 5%-10% CONCLUSIONES significativas, siendo el cultivo a 5% (P=0.0001) y 5%-20% (P=0.0004), O2 entre D1-D5. Al igual que multitud las tasas de calidad embrionaria/ El oxígeno es uno de los parámetros de autores, obtenemos diferencias blastulación entre 5%-20% (P=0.0241). con mayor diferencia entre el exterior importantes de blastulación entre 5% Obtenemos significación, entre el tipo e interior del útero, siendo así, y 20%, siendo la mayoría de nuestras de tratamiento y en el número total numerosos autores han obtenido transferencias embrionarias en D5. de CCO y ovocitos maduros, entre 5%- diferencias en calidad embrionaria y Cuando utilizamos valores de oxígeno 20%. Aunque no hallamos diferencias tasas de gestación entre 5% y 20% (en situados entre los convencionales significativas en la tasa de gestación todo el cultivo embrionario o solo entre (utilizando O2 al 10%), conseguimos química entre los tres grupos, existe D0-D3-D5), aunque no existen apenas mejorar significativamente (respecto una ligera tendencia de aumento a comparativas con el 10%. Halicigil y col. a 5%) nuestros resultados en tasa de 10% de O2. Futuras investigaciones con (Halicigil et al. 2007, O-054, ESRHE, fecundación y gestación. mayor tamaño muestral nos ayudará 2007) no halló diferencias significativas a obtener las condiciones óptimas de entre 5 y 10% en el cultivo hasta D3. cultivo embrionario. Nuestros datos sí muestran diferencias Protocolo A Protocolo B Protocolo C P valor 5%O2 10%O2 20%O2 A-B (5%-10%) B-C (10%-20%) A-C (5%-20%) No. Ciclos analizados 14 14 14 No. CCO obtenidos, N (x±SD) Total 156 (11.14±3.66) 176 (12.57±4.16) 212 0.1891 0.3261 0.0428 (15,14±7.93) No. Ovocitos maduros 137 158 (11.29±3,15) 193 0.1484 0.2842 0.0401 (9.79±2,81) (13.79±7.51) No. Tratamientos, N (%) ICSI 7 (50%) 2 (14,29%) 1 (7,14%) 0.1055 0.5412 0.0365 PICSI 4 (28,57%) 0 (0%) 1 (7,14%) 0.1052 0.3085 0.3237 FIV 0 (0%) 4 (28,57%) 1 (7,14%) 0.1052 0.3237 0.3085 MIXTO* 3 (21,43%) 8 (57,14%) 11 (78,58%) 0.1217 0.4183 0.0082 Tasa de fecundación, n/N (%) 76/137 (55,47%) 123/158 (77.85%) 144/193 0.0001 0.5610 0.0004 (74,61%) Embriones de buena calidad**, n/N (%) 33/75 (44%) 40/121 (33,06%) 37/134 (27,61%) 0.1651 0.4183 0.0241 No. De transferencias*** 14 14 13 No. Embriones transferidos, N (x±SD) 28 (2.00±0.55) 26 (1.86±0.53) 25 (1.92±0.49) 0.5470 0.6727 0.7533 Tasa de gestación químico, n/N (%) 8/14 (57,14%) 10/14 (71,43%) 7/13 (53,85%) 0.6933 0.5847 0.8632 No. Muestras normozoospérmicas****, N (%) 10/14 (71,43%) 12/14 (85,71%) 12/14 (85,71%) 0.6451 1,0000 0.6451 Procedencia muestra seminal, N (%) Donante 1 (7,14%) 1 (7,14%) 4 (28,57%) 1,0000. 0.3237 0.3237 * Mixto: FIV+ (ICSI/PICSI) ** Embriones de buena calidad: 8 células G1 en D3 o Blastocisto en D5 *** 20%O2: un caso no tuvo transferencia **** Según OMS 2010 017: INFlUENcIA DE lA VItrIFIcAcIÓN EN lA VIABIlIDAD DE lOS OVOcItOS: EStUDIO cOMPArAtIVO rEtrOSPEctIVO ENtrE lA DONAcIÓN DE OVOcItOS EN FrEScO VErSUS OVOcItOS VItrIFIcADOS M. Solé, J. Santaló, M. Boada, B. Coroleu, PN. Barri, A. Veiga Institut Universitari Dexeus e-mail: miqsol@dexeus.com INTRODUCCIÓN nacimiento tras la congelación/ hasta la optimización de las técnicas descongelación de ovocitos humanos de criopreservación con este tipo de A pesar de que hace ya más de 20 (Chen et al., 1986), no se han células. años desde la consecución del primer alcanzado resultados satisfactorios
- 125. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 123 Hasta el momento la técnica que La media de edad de las receptoras asincrónica se redujo a 8.4±2.0 parece ofrecer mayor eficiencia es la sincrónicas y asincrónicas fue de siendo significativamente más baja desarrollada por el grupo de Kuwayama 42.6±5.0 y 41.4±4.5 respectivamente. que los donados/inseminados en (Kuwayama et al., 2005), confirmados La media de edad de las donantes fue el grupo de receptoras sincrónicas posteriormente (Nagy et al., 2009; de 26.1±5.8. Los ovocitos en fresco se (p<0.01). No se observaron diferencias Rienzi et al., 2010; Cobo et al., 2010). inseminaron a las 4 horas de la punción estadísticamente significativas entre folicular mientras que los ovocitos para las receptoras de ovocitos en fresco y A pesar de ello, son necesarios estudios el Banco se vitrificaron inmediatamente vitrificados en las diferentes variables comparativos entre la utilización de después de la denudación de los mismos estudiadas: tasa de fecundación (78.1% ovocitos en fresco y ovocitos vitrificados (dos horas post-punción folicular). El versus 77.2%), tasa de embriones para poder evaluar realmente la método empleado para la vitrificación evolutivos (71.1% versus 67.6%) ni en eficiencia de la técnica. de ovocitos se basa en el descrito por la tasa de embriones óptimos (50.0% Kuwayama (Kuwayama et al., 2005). versus 46.1%). OBJETIVO Tras la desvitrificación se cultivaron los ovocitos durante dos horas, momento La media de embriones transferidos por En el presente estudio se pretende en el que se realizó la microinyección receptora fue similar entre el grupo de comparar los resultados obtenidos intracitoplasmática. receptoras sincrónicas y asincrónicas (supervivencia, tasa de embarazo e (1.82±0.47 y 1.91±0.34). La tasa implantación) con ovocitos en fresco Se determinó el embarazo clínico de embarazo por transferencia fue y tras vitrificación en el programa mediante la observación de saco estadísticamente equivalente entre los de donación del Institut Universitari gestacional a las 6 semanas de dos grupos (47.4% versus 56.1%). De Dexeus. gestación. Se usaron test pareados igual modo, la tasa de implantación para las comparaciones de las muestras fue similar entre el grupo de receptoras MATERIAL Y MÉTODOS de acuerdo con la donante de ovocitos sincrónicas y asincrónicas (35.6% común. Se aplicó el test de Wilcoxon versus 34.9%). Estudio retrospectivo que incluye 57 para comparar medias y el test de donaciones de ovocitos (periodo entre McNeamar para proporciones. Todos los CONCLUSIONES junio-2009 y abril-2010). Se han incluido test fueron bilaterales estableciendo el todas las donaciones de ovocitos que nivel de significancia en =0.05. Basándonos en los resultados obtenidos han respondido a la estimulación en el presente estudio podemos otorgar con suficientes ovocitos para ser RESULTADOS a los ovocitos vitrificados el mismo compartidos entre dos receptoras: una potencial de viabilidad y desarrollo que parte de los ovocitos fueron donados Las receptoras sincrónicas recibieron los ovocitos en fresco. La donación de en fresco a una receptora sincrónica y un total de 625 ovocitos maduros ovocitos procedentes de Banco, tras el resto se vitrificaron para una futura (11.0±2.8) y las receptoras del Banco vitrificación puede ser considerada donación (Banco de ovocitos). Los de ovocitos, 584 (10.3±2.1). La tasa de una alternativa real a la donación criterios de inclusión de las donantes supervivencia tras la desvitrificación sincrónica de ovocitos en los programas han sido descritos recientemente (Clua fue del 82.0% (479/584). La media de de donación de ovocitos. et al., 2010). ovocitos inseminados por receptora 018: AltErAcIÓN DE lA cAlIDAD SEMINAl EN UNA POBlAcIÓN DE JÓVENES ESPAÑOlES DUrANtE lOS AÑOS 1999 Y 2010 A. Yoldi; A. Vaquero; JP. Ramírez y JA. Castilla. Banco de semen CEIFER, Granada e-mail: alberto.yoldi@ceifer.com INTRODUCCIÓN han acudido a nuestro centro entre los MATERIAL Y MÉTODOS años 1999 a 2010. Dado el debate científico establecido en Las muestras se han obtenido por relación a la disminución de la calidad OBJETIVOS masturbación con un período de seminal anual y su referencia como abstinencia sexual de 3 a 5 días. Han marcador de un descenso de la capacidad Analizar diferentes parámetros de sido analizadas con microscopio de reproductiva humana, presentamos un calidad seminal en una población joven contraste de fases atemperado a 37ºC y estudio retrospectivo en el que hemos granadina durante los años 1999 y metodología definida por el Manual OMS analizado la calidad seminal de todos 2010 y valorar su posible disminución en sus diferentes ediciones. El personal los aspirantes a donante de semen que durante el período de años indicado. investigador está inscrito desde el año
- 126. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 124 1999 al Programa de Control de Calidad tiene una edad media de 22.17 años RESULTADOS Externo de Análisis de Semen del Grupo (+4.26 SD). de Interés en Andrología de la ESHRE y Tras la eliminación de los outliers, por de ASEBIR. Las características seminales analizadas el método del recorrido intercuartílico, han sido: concentración, volumen, nº hemos obtenido la siguiente estadística Se ha estudiado una sola muestra total de espermatozoides en eyaculado descriptiva: seminal por candidato a donante (n = y % espermatozoides progresivos (A+B). 2287). La población objeto de estudio n s.d. x Concentración 2218 75.6x106/ml 46.97 Volumen 2208 3.7 ml 1.46 Total 2201 361.8x106 171.95 % Progresivos 2238 45.5 % 14.16 Al aplicar un análisis de regresión y CONCLUSIONES Dada la naturaleza de nuestra correlación al período de 12 años que serie, los resultados obtenidos son abarca nuestra serie, obtenemos unas Tras estudiar una población de 2287 representativos de la población joven rectas de regresión lineal en las que se aspirantes a donante de semen durante granadina y no de la población en aprecia una disminución significativa los años 1999 a 2010, se evidencia general. Este estudio se complementará (p<0.01) en tres de las cuatro variables una disminución estadísticamente con otros, en sucesivos años, para estudiadas (concentración, nº total de significativa en los siguientes valorar si este descenso sigue una espermatozoides eyaculados y % de parámetros: concentración, nº total tendencia generalizada o si obedece a espermatozoides progresivos A+B). La de espermatozoides eyaculados y % de un patrón aislado. única variable que ha experimentado espermatozoides progresivos (A+B). Sin un aumento significativo durante el embargo, el volumen seminal aumenta período de años estudiado, ha sido el significativamente durante los años que volumen seminal (p<0.01). abarca el estudio. 019: MEJOrA DE lA EFIcAcIA DE lA VItrIFIcAcIÓN DE BlAStOcIStOS EXPANDIDOS MEDIANtE lA INDUccIÓN DEl cOlAPSO DEl BlAStOcElE cON UN SIStEMA lÁSEr E, Ferrer, M, Ferrer, P, Muñoz, M, Vila. CREA, Centro Médico de Reproducción Asisitida, Valencia e-mail: empar.ferrer@creavalencia.com INTRODUCCIÓN supervivencia a la vitrificación. Una de MATERIAL Y MÉTODOS las técnicas propuestas para mejorar la Desde el primer embarazo con efectividad de la técnica es el Colapso Se vitrificaron 53 blastocistos blastocistos vitrificados en 2000, del Blastocele, previo a la vitrificación expandidos procedentes de se han realizado numerosos del Blastocisto. fecundaciones anómalas. El grupo estudios para mejorar el uso, control fueron 27 blastocistos que se seguridad y aplicación de la técnica, OBJETIVOS vitrificaron sin intervención adicional. valorándose las concentraciones y Los 26 restantes se les indujo el colapso tipos de crioprotectores, soportes, Valoración de la efectividad del colapso del blastocele mediante Láser. temperaturas de enfriamiento y del blastocele, previo a la vitrificación calentamiento. A pesar de los avances de blastocistos expandidos, inducido Cada blastocisto expandido se valoró que se han ido produciendo, existen mediante un sistema Láser. Análisis siguiendo los parámetros de Veeck numerosas publicaciones que refieren de las tasas de supervivencia a la (2003), clasificándolos según su calidad una correlación negativa entre el grado vitrificación y de eclosión tras 24 horas en Óptimo o Sub-óptimo. Se valoraron de expansión del blastocele y la tasa de de cultivo. la masa celular interna (MCI) y el
- 127. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 125 trofoectodermo (TE). Se consideraron embrionario se realizó bajo hipoxia Si diferenciamos según las calidades Sub-óptimos aquellos con MCI y TE tipo controlada, en incubadores K-Systems morfológicas, obtuvimos en C o D, y Óptimos aquellos con MCI y/o TE G-185 con una atmósfera de un 6% de Blastocistos Óptimos unas tasas del tipo A o B. CO2 y 5% de O2. 69,2% vs 20,8% y en Sub-óptimos una tasa del 54,5% vs 0%, siendo en ambos Previamente a la vitrificación se indujo RESULTADOS: Se ha observado una casos las diferencias estadísticamente el colapso del blastocele utilizando el mejora significativa en la supervivencia significativas. sistema Láser Saturn Active, disparando a la vitrificación en aquellos blastocistos uno o dos pulsos (de 0,500 a 0,752mS, a los que se les realizó previamente el CONCLUSIONES: El uso del Láser para con una potencia fija de 400mw) colapso del blastocele mediante Láser realizar el colapso del blastocele en entre la unión de dos blastómeras del (96,0%), respecto al grupo control blastocistos expandidos es una técnica trofoectodermo, en el lado opuesto a la (66,7%). rápida y eficaz. MCI. Esta diferencia es aun más clara en En blastocistos expandidos Sub- Los pasos de equilibrado y vitrificación Blastocistos Sub-óptimos (100% óptimos, el colapso del blastocele se realizaron a temperatura ambiente supervivencia con colapso vs 36,4% mediante un sistema Láser previamente utilizando concentraciones de sin colapso), mientras que en los a su vitrificación, mejora las tasas de crioprotectores de 7,5% etilenglicol Blastocistos Óptimos la diferencia no supervivencia. (EG), 7,5% dimetilsulfóxido (DMSO) y alcanza la significancia estadística 15% EG con 15% DMSO. Como soporte (93,3% vs 87.5%). La realización del colapso del blastocele se utilizó el sistema Cryotop. en blastocistos expandidos mediante un También se observa una mejora sistema Láser antes de la vitrificación, Post desvitrificación se valoraron las significativa en las tasas de eclosión tras mejora la probabilidad de eclosión tasas de supervivencia y eclosión tras 24 horas de cultivo post desvitrificación tanto en blastocistos Óptimos como en 24 horas de cultivo, según las calidades (69,2% en los colapsados vs 20,8% en Sub-óptimos, proceso necesario para la de los blastocistos. Todo el cultivo los no colapsados). posterior implantación. 020: ¿DISMINUYEN lAS tASAS DE GEStAcIÓN E IMPlANtAcIÓN EN lOS cIclOS VItrIFIcADOS FrENtE A lOS cIclOS EN FrEScO? M. De Las Heras, T. Ganzabal, A. López de Larrucea, JA. Agirregoikoa, G. Barrenetxea, JL. De Pablo Unidad de Reproducción Asistida Quirón Bilbao e-mail: mariadlhm@gmail.com INTRODUCCIÓN OBJETIVO fueron clasificados de acuerdo al score de la Asociación para el Estudio de la La mejora en los protocolos de Evaluar la efectividad de la vitrificación Biología de la Reproducción (ASEBIR) estimulación y en los métodos de cultivo de embriones comparando las tasas y las transferencias incluidas en el embrionario y la disminución en el número de embarazo e implantación entre estudio fueron aquellas en las que de embriones transferidos ha provocado transferencias de embriones en se transfirieron dos embriones de la que el número de embriones sobrantes fresco y transferencias de embriones misma calidad o transferencias únicas. de buena calidad por paciente tras un vitrificados. El embarazo clínico se determinó ciclo de FIV haya aumentado. Este hecho 4 semanas post- transferencia con hace necesaria la existencia de un método MATERIAL Y MÉTODOS presencia de saco gestacional. eficiente de criopreservación que permita el almacenamiento de estos embriones Se incluyeron en el estudio un total RESULTADOS maximizando así la efectividad acumulada de 453 transferencias en fresco tras de un ciclo de FIV. En los últimos años ciclos de fecundación in vitro (FIV/ En las transferencias de embriones la vitrificación se está convirtiendo ICSI) y 252 transferencias de embriones vitrificados la tasa de embarazo tras en el método de elección para la vitrificados. La media de edad de las la transferencia de dos embriones de criopreservación de embriones humanos pacientes era de 35,6 años. En los ciclos muy buena calidad (AA) fue 46%, 31% debido a su alta tasa de supervivencia y en fresco la transferencia se llevo a cabo cuando se transfirió un único embrión embarazo. Se basa en el uso combinado de en D+3 de desarrollo embrionario. En de muy buena calidad (A), 28% tras elevadas concentraciones de crioprotector los ciclos de vitrificación, los embriones la transferencia de dos embriones de con el mínimo volumen de medio y tasas se vitrificaron en D+3 y se desvitrificaron buena calidad (BB) y 24% cuando se de enfriamiento ultrarrápido, evitando la mañana de la transferencia usando transfirieron dos embriones de calidad así la formación de hielo y con ello el daño el método de cryotop de Kitazato media (CC). Las tasas de embarazo celular. (BioPharma.CO.,Ltd). Los embriones en los ciclos en fresco fueron 41%,
- 128. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 126 28%, 32% y 18% respectivamente, no fresco de embriones de la misma calidad. que la técnica de criopreservación mostrando diferencias significativas La vitrificación no sólo debería ser la minimice la pérdida embrionaria y entre ambos grupos (p>0.05). Las tasas técnica de criopreservación de elección mantenga tasas de éxito comparables a de implantación tampoco mostraron en la rutina del laboratorio de FIV para las obtenidas con embriones en fresco. diferencias significativas (32% vs. 27%; la criopreservación de los embriones 31% vs. 28%; 17% vs. 21% y 12% vs. sobrantes, sino también en los casos En los últimos años se ha debatido 9%) (p>0,05). en los que la transferencia tenga que sobre los efectos deletéreos sobre el posponerse. En estos casos, como endometrio y los embriones de los CONCLUSIONES pueden ser pacientes que presentan niveles suprafisiológicos de estradiol síndrome de hiperestimulación ovárica, en los ciclos de FIV. La vitrificación Las tasas de gestación e implantación sangrados, ciclos de diagnóstico permitiría posponer la transferencia sin no muestran diferencias significativas genético preimplantacional en los disminuir la probabilidad de embarazo y tras la transferencia de embriones cuales es necesario acumular embriones evitar así los posibles efectos adversos. vitrificados frente a la transferencia en o ciclos de donación, es imprescindible 021: EFEctO DE lA MUltINUclEAcIÓN EN DIVISIÓN tEMPrANA EN El POtENcIAl DE IMPlANtAcIÓN DE EMBrIONES cON rItMO ÓPtIMO DE DIVISIÓN MC. Pons, I. Solvas, M. Grossmann, R. Noblom, J. Nadal Centro Médico Teknon. Unidad de Reproducción Asistida e-mail: ura@cmteknon.com INTRODUCCIÓN ó 5-células y además habían presentado de ellos podemos constatar la presencia DT (observación temprana a las 26,2h de un único núcleo en cada blastómero Tanto la clasificación ASEBIR 2007 post-fecundación de promedio). (48%). como el reciente trabajo del grupo de consenso en clasificación embrionaria Evaluamos la tasa de implantación Comparando la tasa de implantación (Alpha-ESHRE) penalizan fuertemente a partir de transferencias con 100% cuando se estudian transferencias aquellos embriones que presenten implantación. homogéneas no se observan diferencias algun blastómero multinucleado. significativas entre los dos grupos El promedio de edad de las mujeres estudiados (DT-no MNB vs DT- MNB) En un trabajo previo habíamos estudiado cuyos ciclos de FIV incluimos fue de (tabla 2). la incidencia de multinucleación en 34,6 años [rango: 20-47]. Análisis división temprana (DT) y observamos estadístico: χ2test, P<0,01. DT-no MNB DT- MNB que la multinucleación detectada en Día+2-no MNB 1121 175 este estadio es un fenómeno temporal RESULTADOS Embriones que en día+2 desaparecía en el 75% de descartados 230 (20%) 49 (28%) ns los embriones, aunque desconocíamos De los 1490 embriones analizados, la Embriones en su significado clínico-biológico. incidencia de multinucleación en DT es transferencias 554 47 homogéneas del 17%, se observa en 256 embriones OBJETIVO (tabla 1). Implantación 165 (29,8%)% 9 (19,1%) ns evolutiva El objetivo del presente trabajo será DT Tabla 2 valorar el efecto de la multinucleación DT-no MNB DT- MNB n en DT en el potencial de implantación 1234 256 1490 de estos embriones (no multinucleados Día+2-no MNB 1121 175 1296 CONCLUSIONES en día+2), comparando los que Día+2- MNB 113 81 194 presentaban multinucleación en DT Tabla 1 1/ Se confirma que la multinucleación frente a los que no la presentaban. detectada en DT es un fenómeno temporal y reversible. MATERIAL Y MÉTODOS Corroborando nuestro estudio previo, en día+2 detectamos el fenómeno de 2/ La multinucleación en DT no afecta Se analiza retrospectivamente (años reversión: no se observa presencia de negativamente a la tasa de implantación 2005- 2010) la nucleación de 1490 multinucleación en 175 (68,3 %) de los de los embriones con ritmo óptimo embriones con ritmo óptimo de 256 embriones que sí la presentaban en de división (embriones en los que no división, es decir que en día+2 tenían 4- DT y, lo que es más sorprendente, en 123 observamos multinucleación en día+2).
- 129. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 127 022: PrIMErA SErIE DE rESUltADOS DEl PrOGrAMA DE DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl DE 24 crOMOSOMAS MEDIANtE FISH S. Fernández1,2; A. Colomar1,2; E. Toro1; S. Chamosa1; JG. Álvarez3; B. Peramo2; M. López Teijón3; E. Velilla 1,2 1 Institut Marquès, Barcelona; 2Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona-Madrid; 3Fundación Leonardo Marquès, Barcelona; e-mail: silvia.fernandez@institutomarques.com INTRODUCCIÓN y se analizaron mediante FISH con En los ciclos de DGP-24 se obtuvo sondas de oligonucleótidos (Cellay), una tasa de embarazo por transfer de Con el objetivo de mejorar los resultados centroméricas y/o locus específicas 48% (36/75). La tasa de embarazo de los ciclos de FIV-DGP, se han utilizado (Vysis) para todos los cromosomas. La evolutivo en DGP-24 fue 32% (24/75). diferentes aproximaciones, siendo técnica de DGP-24 se realizó mediante Actualmente, ya han nacido 6 bebés una de ellas el estudio de todos los 6 rondas de hibridación consecutivas sanos procedentes de 5 embarazos de cromosomas en blastómero mediante y una o dos rondas con sondas DGP-24. diferentes técnicas. Nuestro grupo ha subteloméricas (Vysis; Kreatech) para optimizado una técnica con elevada reanalizar todas las monosomías y Si valoramos la tasa de embarazo en los eficiencia y bajo coste, la técnica de FISH poder diferenciar una monosomía real ciclos de DGP-24 en función del número para 24 cromosomas. Tras su puesta a de un solapamiento de señales así como de embriones analizados observamos punto y validación, es necesario valorar evitar los cromosomas no informativos. una tasa de un 66,7% (24/36) en la primera serie de resultados clínicos. Los embriones cromosómicamente aquellos casos en que se analizaron normales y morfológicamente aptos 6 o más embriones y una tasa de OBJETIVOS fueron transferidos en día + 5. 30,8% (12/39) en los casos de menos de 6 embriones. Estas diferencias Analizar los resultados obtenidos tras RESULTADOS son estadísticamente significativas el FIV-DGP de 24 cromosomas (DGP-24) p=0.004. en cuanto a porcentaje de embriones Un 75,7% de los ciclos (75/99) cromosómicamente alterados, tuvieron embriones normales para CONCLUSIONES porcentaje de ciclos sin transferencia, realizar la transferencia con una media tasa de embarazo y tasa de embarazo de embriones transferidos de 1,3. De Tras el análisis de los datos obtenidos evolutivo. los 538 embriones analizados, 377 en la primera serie de casos realizados resultaron alterados (70 %). El 80 % de DGP-24 podemos concluir que: (i) el MATERIAL Y MÉTODOS (300/377) de los embriones alterados DGP-24 detecta un 20% de embriones hubieran sido detectados con el DGP cromosómicamente alterados que Se realizó DGP-24 a 99 ciclos que se estándar de 9 cromosomas (DGP-9) se hubieran transferido con el DGP indicaron por presentar alguno o y un 20 % de embriones (77/300) estándar de 9 cromosomas, (ii) analizar varios de los siguientes factores de presentaron alteraciones solo 6 o más embriones duplica la tasa de riesgo: abortos de repetición, edad detectables mediante DGP-24. Estos embarazo con significancia estadística materna avanzada (>37), factor embriones se hubieran considerado (P=0.004) (iii) los primeros bebés masculino genético y fallo de FIV. normales en un DGP-9 y por tanto nacidos mediante DGP-24, así como las Todos los ciclos de DGP-24 fueron hubieran sido transferidos, dando buenas tasas de embarazo evolutivo incluidos independientemente del lugar en la mayoría de casos a no obtenidas muestran el potencial que número de embriones analizados. Se embarazo o aborto. tiene dicha técnica en pacientes con biopsiaron 538 embriones en día +3 riesgo de alteraciones cromosómicas. 023: EStABIlIDAD EPIGENÉtIcA EN GEStAcIONES trA Camprubí C, Iglesias-Platas I, Martín-Trujillo A, Guillaumet-Adkins A, Rodríguez MA, Rodríguez D, Court F, Monk D Programa de Epigenética y Biología del Cáncer (PEBC), Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) e-mail: ccamprubi@idibell.cat INTRODUCCIÓN la incidencia de restricción del que regula la expresión monoalélica crecimiento intrauterino (RCIU) así de aproximadamente 50 genes en En los últimos años se han publicado como de síndromes causados por humanos, mediante modificaciones informes que relacionan las técnicas anomalías en la impronta genómica. epigenéticas (metilación del DNA y de reproducción asistida (TRA) La impronta genómica es un sistema modificaciones de las histonas). con un incremento moderado en de control de la expresión génica
- 130. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 128 Estas marcas específicas del alelo diferencial en las DMR después de la MATERIAL Y MÉTODOS paterno y materno, se presentan fecundación, tanto en el alelo materno en las denominadas Regiones como paterno, como ha sido demostrado El DNA genómico extraído de placenta Diferencialmente Metiladas en modelos animales. Estudios en el y cordón umbilical será analizado (Differentially Methylated Region- modelo murino han demostrado que mediante la tecnología de arrays de DMR) del genoma, siendo la expresión células con anomalías en la impronta microesferas basada en la tecnología monoalélica resultante de los genes pueden quedar confinadas a la placenta Illumina Goldengate. Este array permite regulados por estas DMR crucial para (Mann et al., 2004), recordando el cuantificar de forma simultánea la el correcto desarrollo neurológico, fenómeno de rescate observado en metilación de todas las DMR conocidas embrionario y de los tejidos el caso de anomalías cromosómicas. del genoma humano, así como de extraembrionarios. La metilación En mamíferos, la placenta es crucial regiones promotoras de 150 genes diferencial presente en las DMR en para el crecimiento fetal intrauterino relacionados con crecimiento y las células diploides, se borra en las y los genes regulados por impronta metabolismo. células germinales primordiales y la tienen un papel en la funcionalidad de metilación específica del alelo paterno este tejido, por lo que anomalías de RESULTADOS o materno se establece de nuevo en las la impronta presentes en la placenta espermatogonias del individuo adulto podrían alterar su función normal, Se compararán los perfiles de metilación o durante el período de maduración reflejarse en anomalías del crecimiento obtenidos del análisis de una serie de 74 de los ovocitos, respectivamente. y apuntar así una correlación entre los muestras (12 gestaciones gemelares, 4 Considerando que el proceso de datos epidemiológicos y un posible gestaciones de trillizos y 38 gestaciones establecimiento de la metilación mecanismo. únicas) con aquellos obtenidos de una en ovocitos es coincidente con la serie control y se discutirá la correlación estimulación hormonal, planteamos OBJETIVOS de estos resultados con los parámetros que la estimulación ovárica y reclusión del ciclo de reproducción así como con de numerosos ovocitos podría alterar el Obtener y valorar los perfiles de los datos clínicos de la gestación y del correcto establecimiento de la impronta metilación de las DMR en niños de recién nacido. materna. Asimismo, el cultivo in vitro de concepción espontánea y niños embriones preimplantacionales fuera concebidos por TRA (estimulación del ambiente uterino, podría alterar ovárica, donación de ovocitos, FIV, el mantenimiento de la metilación ICSI). 024: EStUDIO DEl PAtrÓN DE MOVIlIZAcIÓN DE [cA2+]I Y DEl PAPEl DE lA ActINA EN lA rEAccIÓN AcrOSÓMIcA DE PAcIENtES AStENOZOOPÉrMIcOS G. Lozano, A. Ortiz, F. Monllor, M. Jiménez, J. Espino, I. Bejarano, JF. García, JA. Pariente, AB. Rodríguez Centro Extremeño de Reproducción Humana Asistida. Hospital Materno e Infantil de Badajoz e-mail: laoliventina@hotmail.com INTRODUCCIÓN en espermatozoides con problemas en Se les realiza seminograma analizando la motilidad. morfología, concentración y movilidad Es conocido el papel del calcio mediante CASA, siguiendo las intracitosólico [Ca2+]i en la OBJETIVOS indicaciones de la OMS. fisiología del espermatozoide, estando estrechamente relacionado Comparar la señal de [Ca2+]i provocada A las muestras tras incubarlas con con procesos de hiperactivación, por PRG y el papel del citoesqueleto 1 µM de PRG, 1µM de Thapsigargina quimiotaxis, control de la movilidad y su de actina en la ECC en el eyaculado (inhibidor de la recaptación de [Ca2+] participación en la reacción acrosómica de pacientes normozoospérmicos y i por la mitocondria), Citocalasina (RA) astenozoospérmicos. D y Jasplakinolide (inhibidor y activador de la polimerización de También es conocido el papel que MATERIALES Y MÉTODOS actina, respectivamente) se mide juega la Progesterona (PRG) en la la movilización de [Ca2+]i mediante inducción de la reacción acrosómica Muestras de semen (n= 25) de pacientes un espectrofluorímetro y la sonda y actividad flagelar movilizando las que acuden al C.E.R.H.A del H.M.I de fluorescente Fura 2-AM. reservas de [Ca2+]i y favoreciendo la Badajoz. Entrada Capacitativa de Calcio (ECC), Los datos se tratan estadísticamente observándose niveles bajos de [Ca2+]i mediante SPSS utilizando T-Student.
- 131. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 129 RESULTADOS 3.- Al incubar las células con CONCLUSIONES antagonistas de los receptores de la MovILIzaCIóN DE [Ca2+ I PRG (RU-38486) o con anticuerpos de Los espermatozoides de pacientes EN NoRMozooSPéRMICoS y los receptores de PRG (PR c262), la ECC astenozoospérmicos presentan reducida aSTENozooPéRMICoS EN RESPuESTa a se reduce significativamente. su respuesta a la PRG, no permitiendo PRG realizar una ECC tan elevada como la EFECTo DE La CyToCaLaSINa D y que se produce en espermatozoides 1.- La PRG moviliza el [Ca2+]i JaSPLakINoLIDE EN La ECC sin alteración en su movimiento. Un déficit en los receptores de la PRG y su 2.- Las células incubadas con 20 1.- Las células estimuladas con PRG incapacidad para movilizar sus reservas µM de PRG + 1µM de Thapsigargina se incuban con Cytocalasina D y de [Ca2+]i convenientemente puede (inhibidor de la recaptación de [Ca2+]i Jasplakinolide observándose inhibida ser el responsable de sus problemas de por la mitocondria) muestran una ECC la ECC en las mismas. movilidad. significativamente menor en pacientes astenozoospérmicos e independiente de la Thapsigargina. 025: EFEctO DE lA SUPlEMENtAcIÓN DIEtÉtIcA cON DHA SOBrE lA cAlIDAD SEMINAl J.C. Martínez, J.C. Domingo, Cordovilla, M. Nicolás, L. Fernández, P. Albero, J. Landeras IVI Murcia e-mail: juancarlos.martinez@ivi.es INTRODUCCIÓN ejerce sobre la calidad seminal, RESULTADOS capacidad antioxidante y niveles de Los ácidos grasos omega 3 son fragmentación de ADN de varones con En las características seminales componentes fundamentales de las alteración en los valores espermáticos. iniciales se observa una diferencia membranas celulares. De ellos el ácido significativa entre el grupo placebo y docosahexanoico (DHA) se encuentra MATERIAL Y MÉTODOS el grupo suplementado con DHA tanto en una alta proporción en la membrana en el porcentaje de espermatozoides de los espermatozoides y está implicado Se realizó un estudio prospectivo, con motilidad total (46,30±2,41 en numerosos procesos funcionales aleatorizado, doble ciego con grupo vs 37,97±2,99) (p=0.02) como con como son la reacción acrosómica, control con 64 pacientes que acudieron motilidad progresiva (42,95±2,37 vs la fusión espermatozoide-ovocito o a la clínica IVI Murcia para evaluación 34,02±2,90) (p=0.04). Estas diferencias la motilidad espermática. Existen por problemas de infertilidad. Los entre grupos desaparecieron tras 10 numerosos estudios que correlacionan pacientes incluidos en el grupo placebo semanas de ingesta de DHA. la concentración de este ácido graso (29) ingirieron 1050mg/día de con la calidad espermática así como con aceite de girasol durante 10 semanas. Tras 10 semanas de tratamiento se la fertilidad masculina. Por otra parte Los pacientes del grupo DHA (35) observa una mejora significativa en el diversos estudios coinciden en que los ingirieron 1050mg de DHA durante el grupo suplementado con DHA tanto en ácidos grasos omega-3 presentan una mismo periodo. la capacidad antioxidante del plasma alta capacidad antioxidante, llegando seminal, pasando de unos niveles incluso a modular la expresión génica de Se determinó volumen, concentración, iniciales de 1.627,88 ±26,1 equivalentes ciertas enzimas antioxidantes así como motilidad, morfología, capacidad de Trolox a 1.794,84±37,44 (p<0,1) un excelente perfil de seguridad lo cual antioxidante total (TAC), composición como en los niveles de fragmentación posibilita su uso como nutracéuticos lipídica tanto en la membrana de ADN pasando de 26,89±3,38% a con distintos campos de actuación. espermática como en el plasma 11,01±1,65 % (p< 0,1). seminal, así como la fragmentación OBJETIVOS de ADN mediante test TUNEL. Todos En el resto de parámetros espermáticos estos parámetros fueron evaluados analizados no se observa variación El objetivo del presente estudio previamente al comienzo de la ingesta significativa tras la conclusión del es determinar el efecto que la así como a las 5 y 10 semanas de iniciar estudio. suplementación dietética con DHA la suplementación.
- 132. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 130 La suplementación con DHA no originó CONCLUSIONES Bajo nuestro conocimiento este es el cambios en la composición lipídica de primer estudio que evalúa la utilidad la membrana de los espermatozoides, La suplementación dietética con ácido terapéutica del ácido docosahexanoico sin embargo se observó un incremento docosahexanoico presenta un marcado en el tratamiento de varones con esta significativo en los niveles de DHA y efecto antioxidante y ocasiona una patología seminal ácidos grasos omega 3 en el plasma disminución significativa en los valores seminal pasando respectivamente de de fragmentación de ADN espermático. Futuros estudios son necesarios para 3,47±0,21 y 5,35±0,36 a 4,75±0,27 y evaluar la eficacia de la ingesta de 6,69±0,24 (p<0,5) Es una herramienta terapéutica útil DHA en el éxito de los tratamientos de en el tratamiento de varones con reproducción. altos niveles de fragmentación de ADN espermático. 026: UtIlIDAD DE lA AltA MAGNIFIcAcIÓN PArA SElEccIONAr ESPErMAtOZOIDES NOrMAlES GENÉtIcAMENtE M Dorado, M Hebles, B Migueles, M. González, L Aguilera, P Sánchez, F Sánchez Clínicas Ginemed e-mail: mdorado@ginemed.es INTRODUCCIÓN Los espermatozoides fueron depositados grupo de espermatozoides con cabeza en una placa de microinyección grande encontramos mayoritariamente La imagen que obtenemos de los específica para el microscopio de alta espermatozoides con carga genética espermatozoides a alta magnificación magnificación en gotas de HTF. diploide, aunque también observamos permite observar anomalías la presencia de espermatozoides con estructurales indetectables a los Los espermatozoides se observaron disomías y con carga genética normal. El aumentos convencionales, lo que permite y captaron uno a uno con el sistema grupo de espermatozoides con cabezas seleccionar espermatozoides con mejor de micromanipulación y depositados elongadas mostraban espermatozoides morfología. Es por ello por lo que algunos en un portaobjeto para su posterior con disomías en un número superior autores han demostrado que la selección análisis en cuatro grupos: grupo 1 al que presentaba el grupo control no de espermatozoides con microscopio de (espermatozoides con cabezas grandes), encontrando diferencias significativas alta magnificación (6000x) mejora los grupo 2 (espermatozoides con cabezas entre ambos grupos. En los grupos de resultados de ICSI, sobre todo en aquellos elongadas), grupo 3 (espermatozoides espermatozoides normales, tanto en el casos en los que existe daño testicular. con cabezas normales y grandes grupo control como en el que portaban vacuolas) y grupo 4 (espermatozoides vacuolas, el número de alteraciones La alta magnificación nos permite con cabeza normal sin vacuolas). genéticas era menor que en los otros hacer un estudio morfológico a 6000x y grupos no obteniendo tampoco seleccionar a su vez los espermatozoides. Cada espermatozoide fue colocado en diferencias significativas. Ya sea para hacer pruebas adicionales, una parte específica del portaobjeto por ejemplo: estudio de aneuploidías, en un 1µl de HTF y fijado con Carnoy CONCLUSIONES como para microinyectar con los de mejor posteriormente. El proceso se repitió morfología. para cada uno de los espermatozoides Dado que nuestro estudio mostró seleccionados obteniendo poblaciones presencia de alteraciones en todos OBJETIVO de espermatozoides para cada grupo los grupos estudiados podemos estudio. pensar que el tamaño y la forma de la El objetivo de nuestro estudio fue evaluar cabeza no son condición suficiente la eficacia de la alta magnificación Se utilizaron las sondas comerciales del para asegurar la carga genética para seleccionar espermatozoides kit AneuvysionTM (Vysis) con las pruebas del espermatozoide, y por tanto la genéticamente normales a partir de la específicas para el cromosoma 18 (CEP 18 alta magnificación no nos sería útil morfología observada a esos aumentos. spectrumAquaTM 18p11-1-q11.1), para para asegurarnos espermatozoides el cromosoma X (CEP X spectrumGreenTM genéticamente normales. A pesar de MATERIAL Y MÉTODOS Xp11-1-q11.1) y para el cromosoma Y ello, esta herramienta nos permitió (CEP Y SpectrumOrangeTM Yp11.1-q11.1) seleccionar distintos tipos que Las muestras de semen usadas para la mostraron diferencias entre ellos selección se prepararon por gradiente RESULTADOS aunque no llegaron a ser significativas. de densidad en capas de 0,3 a 1 mL de No obstante sería necesario aumentar 40% y de 0,3 a 1 mL de 80% de Sperm El FISH de espermatozoides realizado el tamaño muestral y estudiar cada Grad (Vitrolife ®) y Ham F-10 (Gibco) reveló presencia de alteraciones en grupo más ampliamente. con gentamicina. todos los grupos estudiados. En el
- 133. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 131 027: DIFErENcIAS ENtrE EMBrIONES DE rAtÓN OBtENIDOS DIrEctAMENtE DEl ÚtErO Y lOS cONSEGUIDOS POr FEcUNDAcIÓN IN VItrO M. J. Perianes1, V. Casas-Rua1, J. Mijares2, F. M. Sánchez-Margallo2, I. S. Alvarez-Miguel1. 1 Departamento de Biología Celular. Facultad de Ciencias. Universidad de Extremadura. Badajoz. 2Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón, Cáceres. e-mail: mariojpc@unex.es INTRODUCCIÓN Para contar el número de células Los embriones obtenidos in vivo alcanzado por los embriones, se experimentan un ligero aumento en la La fecundación in vitro (FIV) y el utilizó la tinción nuclear con DAPI actividad de su metabolismo (aumento posterior cultivo en el laboratorio, (4,6-diaminidino-2-phenylindole). en la reducción del Alamar Blue) pueden afectar el curso normal del respecto al conjunto de los embriones desarrollo embrionario y por lo Con el fin de calcular el % de células obtenidos por fecundación in vitro. tanto la viabilidad de los embriones apoptóticas a partir del Nº de células obtenidos mediante esta técnica. Sin teñidas con DAPI, se realizó la técnica El volumen medio de los embriones embargo, no existen muchos estudios TUNEL. obtenidos en condiciones fisiológicas que comparen aspectos fisiológicos y (478 x 103 µm3) es significativamente celulares entre los embriones obtenidos La estimación de la actividad metabólica mayor (p<0,001) respecto al volumen por este procedimiento y los que se han de los embriones, se llevó a cabo con un de los embriones desarrollados in vitro desarrollado en el ambiente uterino. En ensayo con Alamar Blue® (AB). (304 x 103 µm3). este trabajo nos proponemos abordar esta cuestión utilizando embriones de El volumen embrionario y el grosor de Por otra parte el grosor de la zona ratón en fase de blastocisto. la zona pelúcida, se evaluaron con un pelúcida disminuye significativamente software adecuado de análisis científico (p<0,001) en los embriones OBJETIVOS de imagen. obtenidos en condiciones fisiológicas (5,7±1,5µm2) respecto a los embriones Comprobar si una serie de parámetros, Todos los datos fueron analizados obtenidos por FIV (7,6±1,4µm2). posibles indicadores de la viabilidad empleando el paquete estadístico SPSS embrionaria (volumen, nº de células, 17.0. CONCLUSIONES grosor de la zona pelúcida, % de muerte celular y actividad metabólica) RESULTADOS Según hemos podido comprobar, varios son diferentes entre los blastocistos de los parámetros estudiados en los obtenidos mediante FIV con su El número de células, que por término blastocistos de ratón se ven afectados posterior cultivo embrionario (in medio, alcanzan los embriones por el cultivo in vitro, indicando que vitro) y blastocistos de la misma edad desarrollados en condiciones el manejo en el laboratorio condiciona conseguidos directamente del útero (in fisiológicas (Céls: 110,19), supera en el desarrollo de los embriones. Las vivo). un 27,5% a la media de los embriones consecuencias que acarrean estas obtenidos por fecundación in vitro diferencias, respecto a los embriones MATERIAL Y MÉTODOS (Céls: 86,42). obtenidos en condiciones fisiológicas, pueden tener relevancia en la futura Los blastocistos in vivo se recuperaron El conjunto de los embriones mejora de las técnicas de reproducción a partir de ratonas adultas y preñadas, desarrollados en condiciones asistida. en día 4 de desarrollo embrionario. Por fisiológicas muestra un porcentaje de otra parte, los embriones desarrollados células apoptóticas (1,24 %) inferior al in vitro, se obtuvieron por fecundación presentado por los embriones obtenidos in vitro convencional. por FIV (4,81%).
- 134. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 132 028: ¿AFEctAN lOS NIVElES AltOS DE EStrADIOl A lAS tASAS DE ÉXItO DE lAS trANSFErENcIAS DE lOS EMBrIONES VItrIFIcADOS? E. Martínez1, M. de las Heras1, J. A. Agirregoikoa1,2, J. L De Pablo1, y G. Barrenetxea 1,2 . 1 Quirón Bilbao, Unidad de reproducción Asistida, Vizcaya, España. 2 Universidad del País Vasco (UPV), Vizcaya, España. e-mail: emartinez.bil@quiron.es INTRODUCCIÓN vitrificaron los embriones viables en D3 RESULTADOS en sistema de Cryotop®. El síndrome de hiperestimulación (SHEO) No se encontraron diferencias es la complicación aguda más grave de Los embriones que fueron vitrificados significativas entre los grupos 1, 2 y 3 en una estimulación ovárica. Consiste en un eran de calidades A, B y C según edad (32,46 vs 33,00 vs 34,16), número crecimiento de los ovarios junto con una los criterios de ASEBIR (Asociación de ovocitos recuperados (19,96 vs hiperproducción hormonal esteroidea a para el Estudio de la Biología de 20,50 vs 23,79), número de embriones nivel de los mismos. La mejor manera de la Reproducción). En los 62 ciclos transferidos (2,04 vs 1,89 vs 1,89), tasa evitar la SHEO es prevenirla, eliminando se llevó a cabo microinyección de fecundación (65,65% vs 64,08% la transferencia embrionaria, lo cual intracitoplasmática de espermatozoides vs 67,03%), tasa de implantación implica la vitrificación de los embriones. (ICSI) o fecundación in Vitro (FIV), (31,25% vs 36,11% vs 28,95%) y tasa de excluyendo aquellos pacientes con gestación (54% vs 52% vs 42%) p>0.05. Pero, ¿Se ven afectadas las tasas de criptozoospermia, biopsia de testículo y Se encontraron diferencias significativas implantación y embarazo en estas semen de donante. en el número de ovocitos maduros pacientes? ¿Afectan los niveles de obtenidos (15,46 vs 18 vs 20,79) p<0,05. estradiol a la viabilidad y capacidad de Para comparar la capacidad implantación de los embriones? implantatoria en función del estradiol CONCLUSIONES los pacientes se han dividido en 3 OBJETIVOS grupos. El primer grupo lo ocupan 24 Aunque se han encontrado diferencias pacientes con niveles de estradiol entre significativas en el número de ovocitos Determinar si los distintos 1300-3000 pg/ml (Grupo 1) el segundo maduros, no es relevante, puesto que niveles de estradiol en pacientes 19 pacientes con estradiol entre 3000- a mayor E2 sérico mayor número de hiperestimuladas disminuyen la 6000 pg/ml (Grupo 2) y el tercero 19 ovocitos maduros. tasa de fecundación y afectan a la pacientes con estradiol entre 6000- capacidad implantatoria embrionaria 11000 pg/ml (Grupo 3). Los niveles de estradiol, aunque disminuyendo la tasa de éxito. sean altos, no reducen el potencial Los embriones fueron desvitrificados implantatorio de los embriones obtenidos MATERIAL Y MÉTODOS la misma mañana de la transferencia durante ese ciclo. Tampoco disminuyen la mediante el kit de desvitrificación de tasa de fecundación ovocitaria. Por lo que En el estudio se han incluido 62 Kitazato®. vitrificar los embriones y transferirlos en pacientes que presentaron síntomas de un ciclo posterior sigue siendo la mejor hipestimulación durante el tratamiento Para el análisis estadístico se ha estrategia para evitar el síndrome de de fecundación in vitro. Se pospuso utilizado SPSS (versión 17 para Mac). hiperestimulación ovárica sin reducir la la transferencia embrionaria y se tasa de éxito. 029: ¿cUÁNDO INDIcAr UN tESE POr AltA tASA DE FrAGMENtAcIÓN? S. Camacho, M. De la Casa, V. Badajoz, MC. Cañadas, AR. Díaz, J. Gijón, J. Gragera, I. Lozano, L. Martínez, T. Sánchez, C. Urda, A. Martínez de Arenaza GINEFIV e-mail: s.camacho@ginefiv.com INTRODUCCIÓN fragmentación de ADN elevada. Se ha es importante conocer el grado de la estudiado que cuando el ADN de los fragmentación del ADN espermático. La fragmentación del ADN espermático espermatozoides está fragmentado, la El tratamiento oral con antioxidantes es un factor de gran importancia en la tasa de fecundación del óvulo es menor durante 3-6 meses puede ser eficaz en la infertilidad masculina, aproximadamente y el número de ciclos de Reproducción reducción de la fragmentación del ADN el 25% de los hombres infértiles tienen Asistida fallidos mayor. Por todo ello, espermático reduciéndola hasta un 20%,
- 135. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 133 pero en muchos casos no es suficiente, RESULTADOS debido a que la fragmentación no es causada por un estrés oxidativo, sino N T. Fecund T. Gest.Clin T. Aborto T. Implant que es debido a otros factores. A su vez, el grado de fragmentación del ADN en 30-39% frg 10 59,1 20 0 10,5 los espermatozoides de eyaculado es >40% frg 15 **69,9 40 0 **26,7 más alto que en los espermatozoides (**= p-valor <0,05) obtenidos de tejido testicular (1,2). Por todo ello, en ocasiones, se recomienda la realización de una biopsia de tejido testicular (TESE) el mismo día Al analizar estadísticamente los obtención de espermatozoides para la de la punción ovárica para mejorar resultados, se observa que existen microinyección, podría estar indicada los resultados de la microinyección, diferencias significativas tanto en la en los casos de elevado porcentaje de pero, ¿a partir de qué porcentaje de tasa de fecundación como en la de fragmentación (superior al 40%). fragmentación debería indicarse? implantación de ambos grupos (59,1% vs 69,9% y 10,5% vs 26,7%). Respecto REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS OBJETIVOS a la tasa de gestación, las diferencias no son significativas, tal vez debido al 1.- Greco E, Scarselli F, Iacobelli M, Determinar el grado de fragmentación a bajo número de casos, pero se observa Rienzi L, Ubaldi F, Ferrero S, partir del cual mejoran los resultados de un claro aumento de la misma (20% et al. Efficient treatment of infertility los ciclos de Reproducción Asistida tras vs 40%) cuando el TESE se realiza en due to sperm DNA damage by ICSI with la realización de una biopsia testicular pacientes con marcado porcentaje de testicular spermatozoa. Hum Reprod. al paciente el mismo día de la punción fragmentación. 2005;20:226–230. ovárica. Para ello, estudiaremos si hay diferencias significativas entre CONCLUSIONES 2.- Steele EK, McClure N, Maxwell RJ, las tasas de fecundación, gestación, Lewis SE. A comparison of DNA aborto e implantación entre ciclos con A la vista de los resultados, la damage in testicular and proximal diferentes niveles de fragmentación realización de una biopsia testicular epididymal spermatozoa in obstructive espermática, tras la microinyección con al paciente el mismo día de la azoospermia. Mol Hum Reprod. espermatozoides procedentes de TESE punción ovárica de su pareja para la 1999;5:831–835. el mismo día de la punción ovárica MATERIAL Y MÉTODOS Estudio retrospectivo, aleatorizado, 70 de 25 ciclos de microinyección tras TESE realizados en el año 2010 en 60 la Clínica Ginefiv. Se incluyen en el estudio pacientes con al menos un 50 ciclo de RA fallido y que, tras realizarse un test de fragmentación del ADN espermático, para el cual el periodo 40 de abstinencia fue inferior a 48 horas, éste dio valores superiores al 30% 30 y que tras el tratamiento durante al menos 4 meses con antioxidantes, 20 el valor de la fragmentación del ADN espermático sigue siendo patológico. Los ciclos estudiados tienen en 10 común la realización de una biopsia testicular al paciente el mismo día de 0 la punción ovárica, de manera que se microinyectan los ovocitos con 30-39% FRG >40% FRG espermatozoides procedentes del TESE. Se dividen los resultados obtenidos en 2 grupos: Grupo1: pacientes con grado de fragmentación entre 30 y 40%. Grupo 2: pacientes con grado de fragmentación superior al 40% y se comparan estadísticamente los resultados.
- 136. c O M U N I c A c I O N E S O Ó S t E r P r A l S 134 030: trANSFErENcIA DE EMBrIÓN ÚNIcO. UNA rEAlIDAD B. González, I. Herrero, I. Rossier, M.I. Rivas Hospital Nuestra Señora de Fátima e-mail: reproduccionasistida@hospitalfatima.nehos.com INTRODUCCIÓN OBJETIVO Calculamos también la tasa de embarazo acumulada con ciclos de congelación/ Las técnicas de FIV/ICSI son en la El objetivo de este estudio es determinar descongelación. actualidad los tratamientos más si la transferencia electiva de un único exitosos para solventar los casos de embrión es una estrategia a seguir con En esta revisión incluimos aquellos infertilidad tanto masculina como la finalidad de reducir las elevadas tasas ciclos en los que los pacientes tenían al femenina. de embarazo múltiple que existen en la menos 2 embriones de buena calidad en actualidad en las pacientes sometidas a día +3, una edad igual o inferior a 37 A pesar de las altas tasas de éxito técnicas de Reproducción Asistida. años en los ciclos de ovocitos propios y que presentan estas técnicas, tanto era su primer o segundo ciclo. el registro de Reproducción Asistida Al mismo tiempo, es importante Europeo como el Americano hacen determinar qué pacientes son Se excluyeron los ciclos en los que la referencia al elevado índice de candidatas a este tipo de transferencia transferencia de embrión único era por embarazos múltiples como consecuencia para que al tiempo que se evita el indicación médica. de estas técnicas. embarazo múltiple, no se vean reducidas las tasas de embarazo evolutivo y niño Todas las transferencias se realizaron en Existen numerosas publicaciones en en casa. día+3. las que se hace referencia a un peor pronóstico en el desarrollo fetal y MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS un mayor número de complicaciones obstétricas en niños resultantes de Se lleva a cabo una revisión de los ciclos Se seleccionaron 30 ciclos de FIV/ICSI y técnicas de reproducción asistida que en realizados en el periodo desde Enero 50 ciclos de donación de ovocitos. niños concebidos de manera espontánea de 2010 a Marzo de 2011. Incluimos y esto es debido principalmente al gran tanto ciclos de FIV/ICSI como ciclos de Los resultados obtenidos se exponen en aumento de los embarazos múltiples. donación de ovocitos. las siguientes tablas: FIV/ICSI FIV/ICSI Número de ciclos 30 Número de ciclos 50 Media de edad ± SD (años) 33,1±2,8 Media de edad ± SD (años) 41,7±3,9 % Tasa de fecundación 85,4 % Tasa de fecundación 82,1 Tasa de B-HCG positiva (%) 16/30 (53,3) Tasa de B-HCG positiva (%) 27/50 (54) Tasa de embarazo (%) 16/30 (53,3) Tasa de embarazo (%) 24/50 (48) Tasa de implantación (%) 16/30 (53,3) Tasa de implantación (%) 24/50 (48) Tasa de aborto (%) 3/16 (18,7) Tasa de aborto (%) 1/24 (4,1) Tasa de embarazo acumulada (%) 22/30 (73,3) Tasa de embarazo acumulada (%) 30/50 (60) Tasa de embarazo múltiple (%) 0/30 (0) Tasa de embarazo múltiple (%) 0/50 (0) Tabla 1. Estadística ciclos de FIV/ICSI Tabla 2. Estadística ciclos de donación de ovocitos CONCLUSIÓN nos permite observar que la tasa Es importante hacer una buena de embarazo es muy aceptable y selección de las pacientes candidatas a A pesar de que el número de ciclos disminuimos al 0% la tasa de embarazo transferencia de embrión único para no incluidos no es muy elevado, sí que múltiple. disminuir la tasa de embarazo.
- 137. c O M U N I c A c IItUlO E S t O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 135 031: EXPrESIÓN DE lA MOlÉcUlA DE ADHESIÓN DEl ESPErMAtOZOIDE 1 (SPAM1) EN lA trOMPA DE FAlOPIO O. S. Acuña, C. Moros, E. Rodríguez, F. Meseguer, M.J. Izquierdo-Rico, L. Fernández-González, P. Coy y M. Avilés. Dpto. Biología Celular e Histología Facultad de Medicina Universidad de Murcia e-mail: maviles@um.es La fecundación y el desarrollo de esta glicoproteína era exclusiva del Se diseñó un cebador directo embrionario temprano in vivo tienen tracto genital masculino (testículo (3´-GGGTAAACCAAAGTGTGTAGG-5´) lugar en la trompa de Falopio. En ese y epidídimo); sin embargo, estudios y uno reverso órgano se encuentra un fluido de realizados en ratón, demostraron que (3´-GCAACTTCCATTGTAACCGG-5´), para naturaleza compleja, cuya composición también es sintetizada en el tracto llevar a cabo la amplificación. El producto no es del todo conocida, que interacciona genital femenino (vagina, útero y obtenido correspondió a un fragmento con los gametos y el embrión. La oviducto). En la especie humana se de 771 pb, que coincide con el tamaño identificación de los componentes de ha descrito la expresión de SPAM1 del producto esperado. El producto de este fluido implicados en la fecundación en testículo, epidídimo y conducto PCR fue secuenciado y analizado por y desarrollo embrionario puede ser de deferente. Dado el papel relevante BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ gran utilidad para el diseño y mejora desempeñado por esta proteína en Blast.cgi). La secuencia del producto de los medios de cultivo empleados diferentes mamíferos, nos planteamos amplificado tuvo una identidad máxima en las técnicas de fecundación in determinar la expresión génica de SPAM1 de 100% con la secuencia de referencia. vitro. El presente estudio se centra en la trompa de Falopio. La muestra Concluimos que la transcripción en la identificación de uno de estos se obtuvo mediante salpinguectomía de SPAM1 no solo es en testículo y componentes, la proteína de adhesión bilateral en el transcurso de una epidídimo, sino también en la trompa de del espermatozoide 1 (SPAM1). La histerectomía abdominal total con Falopio. Este hecho implica que la trompa penetración del espermatozoide a través doble anexectomía por útero miomatoso de Falopio podría estar involucrada del cumulus oophorus y la interacción de una paciente mujer de 49 años, en en cambios a nivel de los gametos del espermatozoide con la zona pelúcida fase folicular, en la que al momento de masculino y femenino participando en (ZP) del ovocito son algunos de los la extracción de la muestra se visualizó procesos como la maduración oviductal acontecimientos esenciales para que la un folículo pre-ovulatorio en el ovario del espermatozoide, además de la fecundación tenga lugar. La molécula de izquierdo. Una vez fuera del campo maduración epididimaria. Esta proteína adhesión del espermatozoide 1 (SPAM1) quirúrgico, la muestra fue transportada podría estar involucrada igualmente en también conocida como PH20 es una hasta el laboratorio donde se seccionó la la disgregación del cumulus oophorus in glicoproteína presente en la superficie zona ampular de la trompa contralateral vivo. Son necesarios más estudios para del espermatozoide y ampliamente del ovario izquierdo que fue la incluida investigar el papel de SPAM1 expresado conservada en los mamíferos. SPAM1 en este estudio. Tras la extracción de en el tracto reproductor femenino. es multifuncional. Así, posee actividad ARN total del tejido ampular, el ADNc Estudio financiado por Fundación Séneca hialuronidasa a pH neutro, capacidad obtenido se utilizó como molde para de la Región de Murcia (0452/GERM/06) de unión a la ZP y capacidad de la amplificación por reacción en cadena y el Ministerio de Ciencia e Innovación y señalización del calcio asociado a la de la polimerasa (PCR), utilizando el FEDER (AGL2009-12512-C02-01-02). reacción acrosómica. Inicialmente se como referencia la secuencia de consideró que la expresión y síntesis SPAM1 humano (NM_001174044.1). 032: MEJOrA DE lA tASA DE GEStAcIÓN MEDIANtE lA tÉcNIcA DE SEPArAcIÓN MAGNÉtIcA EN MUEStrAS DE SEMEN cONGElADAS UtIlIZADAS EN cIclOS DE DONAcIÓN DE OVOcItOS MS Carchenilla1, D. Agudo1, M. Alonso1, P. Sanjurjo1, D. Becerra1, F. Bronet1, JA García-Velasco1,2 A. Pacheco1,3 1 IVI Madrid, Avenida del Talgo 68, 28023 Madrid 2Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, 3 Universidad Alfonso X, Madrid. e-mail: marta.sancelestino@ivi.es INTRODUCCIÓN tratamientos de reproducción asistida. que puede generar esta técnica, El inconveniente reside en el daño influyendo por tanto en la tasa de La criopreservación de semen en una funcional y en la inducción del proceso gestación. Por otro lado, las técnicas técnica cada vez más utilizada en los de apoptosis en los espermatozoides de capacitación espermática como el
- 138. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r cOMUNIcAcIONES OrAlES 136 swim-up y los gradientes de densidad, de densidad y posteriormente se se realizó con el programa SPSS, no son efectivas a la hora de eliminar incubaron (excepto las muestras considerándose valores significativos a los espermatozoides apoptóticos y de control) con Anexina V MicroBeads p < 0.05. aquellos que tienen el ADN fragmentado. durante 30 minutos en oscuridad. Tras Ésta podría ser la razón de la disminuida la incubación se realizó la separación RESULTADOS tasa de gestación en los tratamientos magnética con MACS y la muestra eluida de reproducción asistida en los que se se utilizó para realizar el ICSI. Todos En el estudio se incluyeron 56 muestras utiliza semen congelado. los ciclos incluidos en el estudio fueron de semen congeladas (35 de pacientes ciclos de donación de ovocitos para y 21 de donantes). Todas las muestras Recientemente se ha desarrollado así poder descartar el factor femenino se descongelaron siguiendo el mismo un nuevo método para aislar como posible causa de infertilidad. protocolo y se capacitaron mediante magnéticamente células que reaccionan gradientes de densidad. 28 muestras frente a la Anexina V. Se trata de una Para analizar la fragmentación de (controles) se utilizaron directamente técnica no invasiva utilizada para reducir ADN espermático y el porcentaje de en los ciclos de ICSI y 27 muestras el porcentaje de espermatozoides espermatozoides Anexina V positivos (población de estudio) siguieron el apoptóticos de una muestra de semen. (apoptóticos) se recogieron 3 alícuotas protocolo de separación magnética de semen (muestra descongelada, antes de realizar el ICSI. En ambos casos, OBJETIVOS capacitada y tras ser pasada por la la media de embriones transferidos fue columna (elución)). similar (1,8). La tasa de gestación en El objetivo de este estudio fue analizar los ciclos realizados con las muestras la utilidad de la técnica MACS (magnetic Para determinar el porcentaje de control fue de 45,8% mientras que la activated cell sorting) para mejorar Anexina V/IP, las muestras se incubaron tasa en ciclos con muestras separadas la tasa de gestación en ciclos de con Anexina V- FITC durante 15 mediante MACS incrementó a un 58,3%. reproducción asistida en los que se minutos. Tras la incubación se lavaron utilice muestra de semen congelado. y resuspendieron en 0,5 ml de Binding CONCLUSIONES Buffer. La fragmentación de ADN MATERIAL Y MÉTODOS espermático se determinó mediante la La separación magnética de técnica TUNEL utilizando el kit comercial espermatozoides podría ser una buena En este estudio se utilizaron muestras (Roche) y siguiendo el protocolo de la técnica para mejorar la tasa de gestación de semen congeladas tanto de pacientes casa comercial. Ambos porcentajes, en aquellos ciclos de reproducción como de donantes. Después de la fragmentación de ADN y Anexina V asistida en los que se utilicen muestras descongelación, las muestras fueron se analizaron por citometría de flujo de semen congeladas. capacitadas mediante gradientes (FACScan). El estudio estadístico 033: rESUltADOS clINIcOS PrElIMINArES cON EMBrYOScOPE J. Muñoz, A. Silván, C. Zonza, M. Brandt, J.L. García Fernández, L. García Bernardo, E. Garijo, F. Galera. Instituto Madrileño de Fertilidad (IMF) e-mail: jmunoz@imfertilidad.com INTRODUCCIÓN de 12 pocillos con medio Global (Life tarde se confirmó el embarazo clínico Global) cubiertas de aceite mineral Lite mediante ecografía vaginal. Evaluar los resultados de la utilización Oil (Life Global) y con un 6 % de CO2. de un incubador time-lapse: el RESULTADOS EmbryoScope (Unisense, Fertilitech). Tras la microinyección se lavaron los ovocitos en una placa de gotas con medio La edad media fue de 37±4,4 años, MATERIAL Y MÉTODOS Global y posteriormente se colocaron de 9,85±4,2 ovocitos en punción, 7,6±3,5 uno en uno en cada pocillo de la placa MII, 6,1±3,2 fecundados, 1,8±0,7 El EmbryoScope está dotado de una de EmbryoScope. Si la transferencia embriones transferidos y 2,7±2,6 cámara infrarroja que fotografía 9 se realizó en día 3, los embriones se vitrificados. planos de cada embrión cada 30 minutos sacan justo antes de la transferencia; sin necesidad de sacar los mismos del si la transferencia se realizó en día 5, Gracias a la visualización de los embriones incubador, por tanto, conseguimos los embriones se cambian a una placa podemos ver la hora media post- mantener estables las condiciones de nueva en el día 3. fecundación de: aparición de pronúcleos cultivo. Durante los meses de marzo y (8,0±2,6 horas), desaparición de abril de 2011 se cultivaron en nuestro Se realizó la prueba de embarazo 15 pronúcleos (23,9±9,8 horas), división EmbryoScope 32 pacientes en placas días después de la punción y 10 días más en 2 células (25,9±3,2 horas), división
- 139. c O M U N I c A ctItUlO E S I O N P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 137 en 4 células (38,8±6,1 horas) y división De estos 32 casos, sólo en 25 transcurrió parecen indicar una mejora en las en 8 células (58,1±7,5 horas). No tiempo suficiente para hacer la tasas de embarazo propiciada por el se observaron diferencias en estos ecografía y confirmar presencia de saco. mantenimiento de las condiciones parámetros de división embrionaria Las tasas de embarazo clínico fueron de cultivo en este tipo de incubador entre los embriones de buena calidad (A de un 52 % (13/25), 47,1% en ovocitos sumado a la optimización de la y B de ASEBIR) y embriones de media o propios (8/17) y 62,5% en receptoras selección embrionaria conseguida con mala calidad (C y D). de ovocitos (5/8). la monitorización. La prueba de embarazo fue positiva en CONCLUSIONES un 71,8% de los casos (23/32), 77,3% en pacientes de ovocitos propios (17/22) Los resultados clínicos observados y 60 % en pacientes de Ovodonación en estas pacientes cuyos embriones (6/10). fueron cultivados en el EmbryoScope 034: DEtErMINAcIÓN DE ANOMAlÍAS EN lA FEcUNDAcIÓN DE OVOcItOS FUErA DEl PErIODO DE OBSErVAcIÓN DE PrONÚclEOS MEDIANtE lA tEcNOlOGÍA TIME-LAPSE J. Aguilar, E. Táboas, M. Mollá, M. Ojeda, E. Muñoz IVI Vigo e-mail: jesus.aguilar@ivi.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS embriones con fecundación normal, experimentaron la aparición de un La valoración de la fecundación de los Estudio descriptivo de 47 casos de tercer PN fuera de ese rango horario. ovocitos inseminados, bien mediante ICSI durante el periodo de enero a 8 de ellos se desarrollaron hasta día 3 fecundación in vitro (FIV) o mediante mayo de 2011, en el que los ovocitos y fueron catalogados como 2 embriones microinyección espermática (ICSI), microinyectados fueron incubados tipo A, 2 tipo B, 2 tipo C, y 2 tipo D de es un proceso fundamental para durante todo su desarrollo embrionario acuerdo con la clasificación de ASEBIR. determinar la correcta fecundación in vitro en el incubador EmbryoScope, de los mismos, y evitar de ese modo el cual permitió la monitorización de CONCLUSIONES la transferencia de embriones todo el desarrollo embrionario gracias aneuploides. Tradicionalmente se a la tecnología time-lapse que permite La aparición de anomalías en la ha valorado la fecundación entre las visualizar imágenes de los ovocitos fecundación fuera del rango de las 17 y 20 horas post-inseminación, y preembriones cada 20 minutos, 17-20h, puede no ser valorada en el considerando un ovocito correctamente sin alteraciones en la temperatura y cultivo embrionario en incubadores fecundado aquel que en esa franja concentración de CO2 de los mismos. tradicionales, y existir la posibilidad de horaria, presenta 2 pronúcleos (PN) en transferir embriones aneuploides a la el citoplasma y 2 corpúsculos polares RESULTADOS paciente. (CP) en el espacio perivitelino. Tras esta valoración, la siguiente observación de Se obtuvieron un total de 447 ovocitos La incubación de los preembriones los preembriones se realiza a las 27h de las 47 pacientes sometidas a la en el EmbryoScope permite una post-inseminación y se valora la división punción folicular. valoración mucho más exhaustiva de temprana, habiendo desaparecido los la fecundación embrionaria al poder PN para este momento en la mayoría Un total de 349 ovocitos en observar los acontecimientos nucleares de los casos. Cualquier anomalía en el estadio de metafase II (MII) fueron y citoplasmáticos que suceden en el número de PN que se produjese fuera microinyectados. preembrión fuera del rango tradicional de esta franja horaria de las 17-20h, de valoración de los mismos, sin quedaría pues sin ser evaluada. 260 ovocitos fueron fecundados comprometer su viabilidad ni alterar normalmente (74,7%) y 12 tuvieron una las condiciones de temperatura y El objetivo de este estudio, es determinar fecundación anómala (4,6%). concentración de CO2 del cultivo. la utilidad del incubador EmbryoScope, en la valoración de anomalías en la 9 preembriones, los cuales en el rango fecundación de los ovocitos fuera de ese horario de entre las 17 y 20 horas post- rango de las 17-20h. fecundación fueron valorados como
- 140. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 138 035: DEtErMINAcIÓN DE lOS tIEMPOS EXActOS DE lOS PrINcIPAlES EVENtOS DEl DESArrOllO EMBrIONArIO UtIlIZANDO cINEMAtOGrAFÍA TIME-LAPSE EN 1340 EMBrIONES HUMANOS J. Herrero1, M. Cruz2, A. Tejera1, I. Rubio1, J. L. Romero1, M. Meseguer1. 1 IVI Valencia, Laboratorio de FIV, Valencia, España. 2IVI Alicante, Laboratorio de FIV, Valencia, España. e-mail: javier.herrero@ivi.es INTRODUCCIÓN FertiliTech, Aarhus, Denmark). Cada peso normal (IMC 18-28 kg/m2) y no imagen es captada en 5 planos focales estuvieron sometidas a tratamiento La adquisición de imágenes mediante diferentes en tiempo real, analizándose endocrino (incluyendo gonadotropinas la tecnología time-lapse es un método hasta un máximo de 72 embriones y anticonceptivos orales) en los 3 meses que aplicado a los laboratorios simultáneamente, correspondientes a precedentes al estudio. de reproducción asistida permite 6 placas independientes. El tiempo de determinar con precisión parámetros cada evento se registró en horas tras la RESULTADOS cinéticos durante el desarrollo microinyección. Gracias a un programa embrionario. Hasta donde sabemos, de procesamiento de imágenes con un La tabla 1 presenta los valores mínimos, éste es el trabajo con el mayor número visor de alta resolución se registraron máximos y la media, con los intervalos de de embriones analizados mediante todos los eventos embrionarios para los confianza, para cada evento analizado: este procedimiento. Por primera vez análisis estadísticos posteriores. divisiones desde el estadio de cigoto a es posible establecer la morfocinética embrión de 8 células, compactación en embrionaria a través del registro Se monitorizó el desarrollo de 1340 la transición a mórula y formación del continuado de los tiempos exactos embriones obtenidos mediante ICSI blastocisto. de los principales sucesos desde el de 210 parejas incluidas en nuestro momento de la fecundación hasta el programa de donación ovocitaria desde CONCLUSIONES estadio de blastocisto. septiembre de 2009 hasta noviembre de 2010. El único criterio de exclusión para La captura de imágenes seriadas OBJETIVO estas parejas fue la presencia de factor mediante tecnología time-lapse aplicada masculino severo (con un recuento a la embriología, nos ha permitido por Determinar con exactitud los momentos espermático de menos de 5 millones de primera vez asentar con seguridad y en que ocurren los eventos que tienen espermatozoides móviles progresivos objetividad las bases de la cronología lugar durante el desarrollo embrionario totales en el eyaculado). Los criterios del desarrollo embrionario. El presente preimplantatorio. de inclusión para las donantes fueron estudio contiene el mayor tamaño tener entre 18 y 35 años, no estar ni muestral analizado hasta el momento MATERIAL Y MÉTODOS haber estado expuestas a ningún tipo de con este sistema, aportando información agente radiactivo o a sustancias químicas consistente y exacta sobre la distribución Las imágenes de los embriones se nocivas, no ser consumidoras de tóxicos de los eventos que tienen lugar desde tomaron de forma continua cada 15 y no presentar historiales familiares de la microinyección hasta el estadio de minutos utilizando un incubador tri-gas patologías cromosómicas hereditarias, blastocisto. En breve, estos avances con una cámara incorporada y diseñada teniendo cariotipos normales. Todas harán posible usar el timing embrionario para la adquisición automática de las donantes tenían ciclos menstruales como un nuevo criterio de selección con imágenes (EmbryoScopeTM, Unisense normales de 26 a 34 días de duración, objeto de mejorar los resultados clínicos. IC 95% Variable Media Mínimo Máximo Límite inferior Límite Superior 1a división (a 2 células) 26,10 25,47 26,73 20,40 35,56 2 división (a 3 células) ª 36,27 35,35 37,19 24,08 44,45 3a división (a 4 células) 38,02 37,05 38,99 24,74 48,23 4a división (a 5 células) 48,95 47,56 50,33 35,64 64,44 5a división (a 6 células) 52,05 50,78 53,32 39,55 66,41 6a división (a 7 células) 54,39 53,01 55,77 39,55 69,75 7a división (a 8 células) 58,41 56,82 60,01 39,55 73,08 Compactación mórula 85,61 84,80 86,42 70,22 99,65 Formación blastocisto 97,68 96,65 98,71 79,94 115,65 Tabla 1. Valores medios, mínimos, máximos e intervalos de confianza
- 141. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 139 036: rESUltADOS PrElIMINArES DE lA APlIcAcIÓN DE lOS ArrAYS DE cGH cOMO tÉcNIcA DE DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl F. Marina1, N. Pérez1, N. Fosas1, A. Carrasco1, M. Sandalinas2, E. García-Guixé2, A. Jiménez-Macedo2, C. Giménez2 y S. Marina1 1 Instituto de Reproducción CEFER. ANACER, 2Reprogenetics, España. e-mail: info@institutocefer.com INTRODUCCIÓN diferentes indicaciones (abortos de parciales, o trisomías) (35,29%) y 8 repetición, edad materna avanzada, fueron anormales complejos (23,53%). Numerosos estudios corroboran el fallos repetidos de implantación, Se han realizado 6 transferencias hecho de que muchos embriones concepciones previas con aneuploidías (75%) con una media de 2 embriones provenientes de ciclos de FIV presentan y/o factor masculino) fueron transferidos. La tasa de embarazo por anomalías cromosómicas. Actualmente biopsiados en día +3 de desarrollo in transferencia resultó en un 33,3%, con el método de Diagnóstico Genético vitro. Los blastómeros (1 blastómero una tasa de implantación del 25%. Si en Preimplantacional utilizado para por embrión) fueron dispensados en estos embriones se hubiese realizado detectar estos embriones y evitar su tubos de PCR donde fueron sometidos un DGP para 5 cromosomas, se hubieran transferencia al útero era el screening al proceso de amplificación total del detectado el 55% de los embriones de aneuploidías para 5, 9 o 12 genoma (WGA). Posteriormente se anormales. Si se hubiera realizado cromosomas mediante FISH. La técnica procedió al marcaje fluorescente e un DGP de 9 cromosomas se hubieran de hibridación genómica comparada hibridación sobre arrays de BAC. El detectado el 85% de los embriones con con arrays (aCGH) permite analizar análisis de los perfiles obtenidos se anomalías. todos los cromosomas y aumentar así realizó a través de un escáner InnoScan la probabilidad de transferir embriones 710AL (Innopsys). La transferencia de CONCLUSIONES cromosómicamente normales. los embriones normales se realizó en día +5. Según nuestros resultados, la técnica OBJETIVOS de aCGH permite diagnosticar casi la RESULTADOS totalidad de los embriones biopsiados. El objetivo es mostrar nuestros Los arrays de CGH permiten detectar resultados obtenidos en ciclos de ICSI Se han realizado 8 casos de ICSI con un mayor número de anomalías y en los que se ha realizado un ciclo de DGP mediante aCGH desde abril de descartar más embriones anormales DGP utilizando la técnica de aCGH. 2010. Se han biopsiado un total de 35 que con los métodos empleados hasta embriones, obteniéndose diagnóstico ahora. La técnica de aCGH muestra en MATERIAL Y MÉTODOS en 34 de ellos (97,14%). Catorce la actualidad ser una técnica de utilidad embriones fueron diagnosticados como clínica. Los embriones de parejas que acuden normales (41,18%), 12 presentaban al centro de reproducción asistida por aneuploidías (monosomías totales o 037: EFEctO DE lOS ENDOcANABINOIDES, 2-ArAQUIDONIlGlIcErOl (2-AG) Y 2-ArAQUIDONIlGlIcErOl ÉtEr (2-AGE), EN lAS FUNcIONES IN VItrO DE ESPErMAtOZOIDES HUMANOS M.M. Francou, E. García-Hernandez, J.L. Girela, M.J. Gómez-Torres, J. Ten, R. Bernabeu, J. De Juan Departamento de Biotecnología, Universidad de Alicante e-mail: manuelafrancou@gmail.com INTRODUCCIÓN tejidos del organismo llamados son el 2-araquidonilglicerol (2-AG), “endocanabinoides”. Estos son un 2-araquidonilglicerol éter (2-AGE) y Los canabinoides son los componentes grupo de ácidos poliinsaturados la anandamida (AEA). Estos juegan biológicos activos de la planta que median sus efectos uniéndose a un rol importante en la regulación de marihuana “cannabis sativa”. dos tipos de receptores: receptor de de las funciones reproductivas, tanto Naturalmente, existen canabinoides canabinoide tipo-1 (CB1) y tipo-2 (CB2). femeninas como masculinas. Así, en sintetizados por diferentes Los endocanabinoides más importantes espermatozoides humanos, la AEA
- 142. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 140 reduce la motilidad progresiva e induce o bien de 2-AGE: 10 nM, 100nM, 1 µM, Los espermatozoides que sufrieron la reacción acrosómica espontánea. 10 µM y 100 µM. También se realizó reacción acrosómica de forma Sin embargo, en otras especies como un control negativo, sustituyendo el espontánea aumentaron un 33% con peces y toros provoca una inhibición de endocanabinoide por PBS. Una vez el 2-AG (100 µM) y un 55 % con el la reacción acrosómica. Debido a que trascurrido el tiempo de incubación, 2-AGE (100 µM), respecto al control el efecto del 2-AG y 2-AGE no ha sido se evaluó la viabilidad, motilidad y (p< 0,05). Por otra parte, cuando los establecido en células espermáticas, su reacción acrosómica de cada alícuota. espermatozoides fueron expuestos estudio permitiría conocer la influencia La viabilidad se realizó mediante la al 2-AG no se observaron diferencias de estos endocanabinoides en las técnica eosina-negrosina. La motilidad significativas entre los MP, MNP y NM. No funciones in vitro de los espermatozoides se analizó en un microscopio de obstante, el 2-AGE (100µM) disminuyó humanos. contraste de fases, clasificando los los MP (68%) y aumentó los NM (50%) espermatozoides en motiles progresivos respecto al control. OBJETIVO (MP), motiles no progresivos (MNP) y no motiles (NM). La reacción acrosómica CONCLUSIONES El principal objetivo de este trabajo espontánea fue evaluada mediante la fue determinar los efectos que tiene técnica de FITC-PSA y analizada en un El 2-AG y 2-AGE influyen de manera la exposición del 2-AG y 2-AGE en microscopio de epifluorescencia LEICA diferente en las funciones in vitro la motilidad, viabilidad y reacción DMRB. de los espermatozoides humanos. acrosómica de espermatozoides Las altas concentraciones de 2-AGE humanos. RESULTADOS producen un efecto tóxico sobre los espermatozoides, causando una MATERIAL Y MÉTODOS Los efectos de ambos endocanabinoides disminución de los mótiles progresivos y fueron observados en la concentración un aumento de los no mótiles. Además, Para este estudio fueron analizadas más alta (100 µM). El 2-AGE (100µM) ambos endocanabinoides 2-AG y 2-AGE 10 muestras de donantes tiene un efecto tóxico sobre los aumentan la reacción acrosómica normozoospérmicos (25-35 años), espermatozoides, disminuyendo espontánea. Nuestros resultados según los criterios de la OMS significativamente (p< 0,05) su sugieren que los endocanabinoides (Organización Mundial de la Salud, viabilidad con respecto al control. Sin afectan a los principales patrones 2010). Alícuotas de cada muestra embargo, en todas las concentraciones seminales, pudiendo reducir la fueron incubadas independientemente estudiadas, el 2-AG no tuvo ningún capacidad fecundante de los con diferentes concentraciones de 2-AG efecto sobre la viabilidad espermática. espermatozoides. 038: DIFErENcIAS EN lA cINÉtIcA EMBrIONArIA ENtrE cIclOS DE FIV E IcSI M. Roldán, M. Martínez, B. Gadea, M. Cruz, M. Meseguer, M. Muñoz, I. Pérez-Cano IVI Alicante e-mail: mariaroldan82@hotmail.com INTRODUCCIÓN de forma no invasiva la cinética Los ovocitos procedentes de ICSI se embrionaria. metieron en el EmbryoScope® después Los embriones que evolucionan dentro de realizar la técnica (día 0), mientras de unos rangos de tiempo determinados OBJETIVOS que los ovocitos inseminados mediante presentan mayor tasa de desarrollo a FIV se introdujeron tras ser decumulados blastocisto y potencial implantatorio. Estudiar, utilizando el EmbryoScope®, (día 1). En ambos grupos se consideró el las diferencias en la cinética embrionaria tiempo 0 (T0) al momento en el que se El timing de división junto a la entre ciclos de FIV e ICSI; desde la hora realizó el FIV/ICSI. morfología embrionaria se consideran de realización de la técnica hasta la indicadores del potencial de desarrollo y llegada al estadio de blastocisto. Los parámetros analizados en el se aplican con éxito en los programas de timing de división embrionaria fueron: FIV-ICSI para la selección embrionaria. MATERIAL Y MÉTODOS desaparición de los pronúcleos (DPN), división a 2 células (T2), 3 células (T3), El uso del EmbryoScope®, que integra Se evaluaron 782 embriones 4 células (T4), 5 células (T5), 6 células la captura de imágenes mediante procedentes de 125 ciclos de donación (T6), 7 células (T7), 8 células (T8), tecnología de time-lapse y el cultivo de ovocitos, desde el 29/7/2009 hasta mórula (M), blastocisto (B) y blastocisto embrionario, permite examinar el 31/3/2011 en la clínica IVI Alicante. expandido (BE).
- 143. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 141 Posteriormente analizamos los incrementándose notablemente a partir condiciones fisiológicas de ambas tiempos en alcanzar dichos estadios de T4 en ambos grupos. técnicas, y que sufren los gametos estableciendo el T0 en el momento de la inseminados mediante FIV con respecto desaparición de los pronúcleos. Cuando se evaluaron los tiempos a los de ICSI. transcurridos entre cada división, Los resultados obtenidos fueron considerando T0 la desaparición de El análisis de los tiempos transcurridos analizados estadísticamente mediante los pronúcleos, no se observaron entre cada división, cuando se consideró un test ANOVA, p<0.05. diferencias significativas entre los T0 el momento de la desaparición grupos. de los pronúcleos, demostraría que RESULTADOS los embriones de ambos grupos se CONCLUSIONES comportan de manera similar en su Existen diferencias estadísticamente división. significativas entre las primeras El uso del EmbryoScope® permite divisiones embrionarias (Tabla 1), determinar, de forma continuada y Los resultados obtenidos muestran siendo el timing para DPN, T2 y T3 mayor no invasiva, los tiempos de división rangos de tiempo muy similares, para la en embriones de FIV (DPN= 25.22 ± embrionaria mediante la tecnología de desaparición de pronúcleos y divisiones 0.15, T2= 28.19 ± 0.17, T3= 40.11 ± 0.28) time-lapse. hasta T3, en los embriones procedentes que de ICSI (DPN= 23.82 ± 0.17, T2= 26.9 de ambos tratamientos. Sin embargo, ± 0.17, T3= 38.94 ± 0.35). Existen diferencias significativas en los en las divisiones posteriores a T3, la tres primeros estadios (DPN, T2 y T3) mayor dispersión de los datos evidencia La dispersión en los datos de los cuando T0 corresponde al momento del que el rango de tiempo en el que ocurre tiempos de división obtenidos resultó FIV/ICSI. Estas diferencias se atribuyen la división es mayor. menor en estos primeros estadios, al desfase de tiempo, por las propias Tiempos de División FIV (n=401) ICSI (n=381) p DPN 25,22±0,14* 23,81±0,16* 0,00 T2 28,19±0,17* 26,90±0,16* 0,00 T3 40,10±0,28* 38,94±0,35* 0,01 T4 41,74±0,26 41,18±0,44 0,27 T5 54,52±0,56 53,07±0,66 0,09 T6 58,26±0,64 56,86±0,71 0,14 T7 63,69±0,82 61,42±0,88 0,06 T8 70,26±1,00 69,88±1,13 0,80 M 91,55±0,61 91,82±0,57 0,76 B 103,49±0,64 103,93±0,61 0,62 BE 117,44±1,18 114,64±3,03 0,30 Tabla 1. * diferencias estadísticamente significativas, test Anova p<0,05 039: EXPErIENcIA AcUMUlADA EN El DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl EN lA ENFErMEDAD DE HUNtINGtON M. Martínez-Fresno, A. Goméz Duro, P. Eibes Peteiro, A. Sotillo, E. Fernández Geniality Diagnóstico Genético e-mail: mmfresno@geniality.es INTRODUCCIÓN IT15 (4p16.3). La prevalencia media en Debido a la sintomatología, la falta de la población general es de 6,2/100.000 tratamiento y el mal pronóstico de los La enfermedad de Huntington (EH) es siendo la edad de manifestación entre enfermos, individuos a riesgo de padecer un trastorno neurodegenerativo del la tercera y cuarta década de vida, la EH no desean conocer su condición sistema nervioso central con herencia dependiendo del nº de repeticiones de de portadores de la enfermedad, pero autosómica dominante y penetrancia la expansión, con una perspectiva de desean tener descendencia sin riesgo. completa, causada por la expansión del vida tras el diagnóstico de 15 a 20 años. Por ello, nuestro equipo realiza dos trinucleótido “CAG” repetido en el gen tipos de estudios, directos e indirectos.
- 144. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 142 En los estudios directos se analiza la familias. En todos los ciclos se emplearon α=0,05), la tasa de embarazo global es expansión del trinucleótido en el ADN entre 6 y 9 STRs para el estudio de 33,3%, siendo del 50% en el grupo de de las blastómeras así como una amplia informatividad, seleccionando aquellos estudios directos vs 20% en estudios batería de marcadores tipo short tandem informativos o semi-informativos, y indirectos (Tabla I), esta diferencia repeat (STRs) colindantes a la mutación entre 4 y 6 STRs para el DGP. Únicamente puede deberse a que la media de (ver Tablas II y III). En los estudios un ciclo fue cancelado antes de llegar embriones transferidos es 1,6 en el caso indirectos, uno de los miembros de la a biopsia. Los ciclos se han agrupado de estudios indirectos y 2,1 en directos, pareja tiene el 50% de riesgo de tener en estudios directos e indirectos. Se sin embargo el tamaño de la muestra no Huntington pero no desea conocer su analizaron 199 blastómeras de un permite un análisis estadístico robusto. condición, por lo que sólo se analizan los total de 119 embriones biopsiados STRs con el fin de seleccionar aquellos (Tabla I). A todas las blastómeras se CONCLUSIONES embriones que no hayan heredado el les realizó, después de la lisis celular, haplotipo de riesgo. la técnica de Multiple Displacement La amplia batería de STRs permite Amplification (MDA) con el fin de realizar DGP tanto directos como OBJETIVO amplificar todo el genoma completo indirectos, con una alta tasa de y poder posteriormente estudiar en embrión diagnosticado, 100% y Diseño de una metodología diagnóstica una sola reacción (PCR-multiplex) los 96% respectivamente, solventando usando una amplia batería de STRs marcadores seleccionados para cada problemas como el ADO inherentes a la que permita, biopsiando una única una de las familias y la mutación en los metodología empleada en DGP (MDA y célula embrionaria, mejorar las casos directos. PCR-multiplex en una única célula). Al tasas de embrión diagnosticado y 66% de los embriones de este estudio solventar incidencias que ocurren en la RESULTADOS se le analizaron dos células, práctica amplificación de una sola célula como habitual en el DGP de enfermedades son el allele Drop-out (ADO) y el fallo de De un total de 119 embriones se monogénicas. Sin embargo, la tasa amplificación total. analizaron 199 blastómeras biopsiadas de embrión diagnosticado, del 100%, (Tabla I), obteniendo diagnóstico en obtenida mediante esta metodología MATERIAL Y MÉTODOS 117 embriones (98,3%). Al comparar en aquellos embriones donde se biopsió ambos grupos vemos que aunque no una sola célula (44%), nos ha permitido Se realizó un estudio prospectivo en existen diferencias estadísticamente descartar la biopsia de una segunda un total de 21 ciclos de fecundación in significativas entre la tasa de célula. vitro para el DGP de Huntington en 12 embriones sin diagnóstico (p=0,2124 Tabla I Estudio Indirecto Estudio Directo Total Número de Ciclos 12 9 21 Número de Ciclos cancelados 1 (8,3%) 0 1 (4,76%) Número de Embriones Biopsiados 55 64 119 Número de Embriones con 1 célula biopsiada 18 22 40 Número de Embriones con 2 célula biopsiadas 36 42 78 Número de Embriones con 3 célula biopsiadas 1 0 1 Número de Células analizadas 92 107 199 Número de Embriones sin diagnóstico 2 (3,6%) 0 2 (1,7%) Número de Embriones sanos 18 (32,7%) 27 (42,2%) 45 (37,8%) Número de Embriones afectos - 37 (57,8%) 37 (31,1%) Número de Embriones con riesgo 35 (63,6%) - 35 (29,4%) Número de Embriones transferidos 16 17 30 (1,6) Número de Transferencias 10 8 18 Transferencia 1 Embrión 5 (50%) 1 (12,5%) 6 (33,3%) Transferencia 2 Embriones 4 (40%) 5 (62,5%) 9 (50%) Transferencia 3 Embriones 1 (10%) 2 (25%) 3 (16,7%) Tasa de embarazo por transferencia 20% 50% 33,30%
- 145. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 143 Tabla II Posición respecto al STR locus Distancia al locus Blastómeros analizados Tasa de ADO D4S449 Upstream 2,33 Mb 7 14,50% D4S2936 Upstream 2,32 Mb 17 42,03% D4S3038 Upstream 1,97 Mb 7 0% D4S127 Upstream 0,037 Mb 113 22% D4S126 Upstream 0,023 Mb 86 31% I1CAHD Downstream Intrón 1 72 31,30% D4S3034 Downstream 0,080 Mb 113 35,20% D4S412 Downstream 0,135 Mb 171 25,70% D4S2957 Downstream 0,587Mb 5 0% W1388 Downstream 1,43 Mb 17 16,60% D4S2375 Downstream 1,72 Mb 10 0% D4S394 Downstream 3,71 Mb 20 33,30% Tabla III Posición respecto al Expansión locus Distancia al locus Blastómeros analizadas Tasa de ADO HD2 Exón 1 - 83 34,07% HD4 Exón 1 - 53 53,32% 040: ANÁlISIS DE lA ESPEcIE-ESPEcIFIcIDAD DE lA rEAccIÓN AcrOSÓMIcA EN ESPErMAtOZOIDES MUrINOS MEDIANtE El USO DE PrOtEÍNAS QUIMÉrIcAS DE ZP3 HUMANO-rAtÓN M. T. Zomeño-Abellán1, M. A. Ramirez2, A. Gutiérrez-Adán2, J.C. Martínez3, J. Landeras3, J. Ballesta1, M. Avilés1. 1 Universidad de Murcia, Departamento de Biología Celular e Histología, Murcia, España.2INIA Madrid, Madrid, España.3IVI-Murcia, Murcia, España. e-mail: teresazome@um.es INTRODUCCIÓN están glicosiladas, esta glicosilación es y el resto de la secuencia de hZP3. La diferente. Con el fin de discernir si los segunda proteína quimérica (h-mZP3) La zona pelúcida (ZP) del ratón está dominios N- y C-terminales de mZP3 contenía la región C-terminal de mZP3 compuesta por tres glicoproteínas, están involucrados en la inducción de la (F269-Q424). Las construcciones hZP3, ZP1, ZP2 y ZP3. De las cuales ZP3 está RA en el ratón, se crearon dos proteínas m-hZP3 y h-mZP3 se transfectaron en descrita como receptor primario del quiméricas de ZP3 utilizando diferentes células CHO. Las muestras seminales espermatozoide capacitado e inductor regiones de la proteína humana y fueron aisladas de la cola epididimaria de la reacción acrosómica (RA). La RA es murina, y se evaluó su actividad de siete ratones CD1, capacitadas un proceso especie-específico, y aún no mediante ensayos de RA. mediante swim-up en HTF suplementado se conoce con exactitud el mecanismo con 4g/l de BSA durante 1h a 37ºC, molecular responsable de la inducción MATERIAL Y MÉTODOS 5% CO2 y 95% de humedad relativa. de la RA mediada por ZP. Aunque las Los ensayos de RA se llevaron a cabo glicoproteínas ZP3 humana (hZP3) y ZP3 El cDNA de hZP3 (amablemente donado a una concentración de 1-10 x 106 murina (mZP3) tienen una identidad por el Dr. Dean, NIH, USA) y el cDNA espermatozoides/ml, incubando aminoacídica del 67%, difieren en gran de mZP3 (Invitrogen) se subclonaron durante 1h con las tres glicoproteínas medida en su patrón de glicosilación. en un plásmido pEGFP-N1 (Clontech). recombinantes secretadas por las En la región N-terminal de mZP3 existe A partir de éstos se subclonaron las células CHO (100µg/ml), ZP solubilizada un cluster de O-glicosilación que no está dos nuevas glicoproteínas. La primera murina (20µg/ml) y progesterona presente en hZP3. Mientras que en la proteína quimérica (m-hZP3) contenía (10µM). La evaluación de la RA se región C-terminal ambas glicoproteínas la región N-terminal de mZP3 (M1-L47) realizó mediante el uso de la lectina
- 146. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 144 procedente de arachis hypogaea unida resultado es muy similar al porcentaje similar a la ZP solubilizada murina, y sin a isocianato de fluoresceína (PNA-FITC) de espermatozoides reaccionados embargo hZP3 no posee esta actividad (Sigma). mediante progesterona (59,2% ± 3,56) sobre los espermatozoides murinos. y ZP solubilizada de ratón (53,8% ± Estos resultados sugieren que al menos RESULTADOS 1,24), con los que no presentaban una de las dos regiones (N-terminal y diferencias significativas. Sin embargo, C-terminal) de mZP3 insertada en hZP3 Mediante western-blot se determinó sí presentaban diferencias significativas es suficiente para la inducción de la el peso molecular aproximado de las con el porcentaje de espermatozoides RA en espermatozoides murinos. Esto glicoproteínas recombinantes hZP3, reaccionados de manera espontánea implica que la especie-especificidad m-hZP3 y h-mZP3, y de la ZP solubilizada (29,6% ± 2,54) y con el grupo tratado se ha podido establecer a nivel de dos murina; siendo 55 kDa, 60 kDa, 64 kDa con hZP3 (35,6% ± 3,17). regiones de la proteína ZP3. y 83 kDa respectivamente. El medio de cultivo que contenía m-hZP3 y h-mZP3 CONCLUSIÓN Estudio financiado por la Fundación produjo la RA en espermatozoides Séneca de la Región de Murcia 0452/ murinos en un porcentaje de 57% ± 2,09 Las proteínas quiméricas m-hZP3 y GERM/2006 y IVI-Murcia. y 56,6% ± 2,33 respectivamente. Este h-mZP3, poseen una actividad biológica 041: HAtcHING ASIStIDO lOcAlIZADO EN trANSFErENcIA DE BlAStOcIStOS crIOPrESErVADOS D.Gumbao1, B. Amorocho1, D. López1, A.Sánchez1, J. Marcos1, J. Landeras2. 1 Laboratorio FIV, IVI Murcia, Murcia, Spain, 2Unidad de Ginecología, IVI Murcia, Murcia, Spain e-mail: david.gumbao@ivi.es INTRODUCCIÓN OBJETIVOS procedentes de ciclos de FIV-ICSI- TE incluidos en el programa de La implantación de los embriones en Valorar los resultados preliminares ovodonación, cuya transferencia se el endometrio uterino es un proceso obtenidos a partir de la transferencia realizó en día cinco de desarrollo fundamental para que tenga lugar la embrionaria de blastocistos embrionario siendo sometidos gestación. Pero para ello, el embrión criopreservados de ciclos incluidos previamente y de forma randomizada desarrollado hasta el estadio de en programa de ovodonación a los a HA por adelgazamiento (zona blastocisto, debe escapar a la zona que previamente a la transferencia se thinning) mediado por láser en la zona pellucida (ZP) mediante el denominado realizo HA, diferenciando cuando el HA correspondiente a la MCI o del TRF hatching o eclosión embrionaria. se realizó a nivel de la MCI o bien a nivel una vez que tuvo lugar la reexpansión Diferentes técnicas incorporada en de trofoectodermo (TRF) con el fin de de los mismos y siendo transferidos el los últimos años en las TRA tratan de evidenciar diferencia alguna. mismo día. Los resultados obtenidos simular este proceso in vitro, lo que se se analizaron estadísticamente (Test conoce como Hatching asistido (HA), MATERIAL Y MÉTODOS Fisher p<0.5) con el fin de evidenciar aunque no parece estar totalmente diferencias significativas entre ambos claro el resultado que esta técnica El estudio tuvo lugar en la clínica grupos. pueda tener en los resultados en ciclos IVI Murcia entre Noviembre 2009 y de FIV-ICSI-TE. Febrero 2011 a partir de 22 embriones RESULTADOS HA MCI HA TRF n 11 11 Edad 38.8 ± 5.9 38.7± 5.6 T. Gestación 90.9 54.6 0.149 T. Implantación 80.0* 37.5* 0.029 Tabla 1. Resultados obtenido.*diferencia estadísticamente significativa. Test Fisher p<0.05 CONCLUSIONES especialmente a la hora de incrementar con los resultados obtenidos por otros las tasas de implantación en pacientes grupos que defienden el papel de la MCI Los resultados obtenidos se muestran incluidas en programas de ovodonación, en el proceso de hatching embrionario. a favor de realizar el HA a nivel de MCI, lo que parece estar en consonancia
- 147. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 145 042: cOrrElAcIÓN ENtrE MOrFOlOGÍA EMBrIONArIA Y ANEUPlOIDÍAS EN D4 E IMPlANtAcIÓN EN D5, EN UN PrOGrAMA DE DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl (DGP) A. Delgado, L. Escrich, A. Mercader, P. Buendía, V. Peinado, M. Meseguer IVI Valencia e-mail: arantza.delgado@ivi.es INTRODUCCIÓN in situ fluorescente (FISH) para los 95% de intervalo de confianza. Las Odds cromosomas 13,15,16,17,18,21,22, X ratio fueron las siguientes: La evaluación de la morfología e Y. Los embriones fueron divididos D4: A=2.857 (1.943-4.202) B=4.207 embrionaria sigue siendo la herramienta en categorías según el estadio en (2.876-6.155) C=8.665 (5.006-14.997). de mayor peso en el laboratorio en cuanto D4-D5. D4: A (células); B (mórula); p=0,0001. El área bajo la curva fue de a selección de embriones para transferir C (blastocisto). D5: A (blastocisto 0.651 (0.548-0.575). se refiere, si bien, está ampliamente temprano); B (blastocisto cavitado); C D5: A=2.715(1.384-5.324) B=4.244 documentado que una buena morfología (blastocisto expandido); D (blastocisto (2.102-8.569) C=5.092 (2.120-12.233) no siempre corresponde con un embrión hatching); E (blastocisto hatched). D=5.991 (3.285-10.926) E=7.834 euploide, ni con un embrión que Mediante regresión logística se calculó (2.244-27.350) p=0,0001.El área bajo la implantará y dará lugar a una gestación. el efecto de la morfología embrionaria curva ROC fue de 0.658 (0.618-0.698). sobre las aneuploidías en D4 y sobre OBJETIVOS la implantación en D5. Después de CONCLUSIONES introducir las distintas categorías en El propósito de este estudio es analizar el modelo, se obtuvo una predicción Muchos embriones aneuploides presentan la morfología embrionaria en D4-D5 que fue comparada con el resultado una morfología óptima y podrían ser y su correlación con aneuploidías e real y evaluado con análisis de curvas seleccionados para la transferencia implantación respectivamente. ROC. El valor predictivo del modelo fue embrionaria. Mediante el análisis de definido con el área bajo la curva (IC95) regresión logística se observa una mayor MATERIAL Y MÉTODOS proporcionado por el análisis ROC. Para incidencia de anomalías cromosómicas en la estadística se utilizó el programa embriones de desarrollo subóptimo en D4, Estudio retrospectivo de 1.352 Statistical Package for the Social así como una mayor tasa de implantación embriones del programa de DGP. Las Sciences (SPSS) y Medcalc Software. en estadios más avanzados de desarrollo pacientes fueron tratadas para distintas en D5. A pesar de estos resultados, indicaciones: aborto de repetición, RESULTADOS los parámetros morfológicos no son edad materna avanzada, fallo de suficientes para evitar transferir embriones implantación, factor masculino severo Las comparaciones estadísticas fueron aneuploides, ni para aumentar de forma y causas mixtas. La biopsia embrionaria establecidas mediante regresión significativa las tasas de implantación. se realizó en D3 y los embriones fueron logística y la significancia del modelo De cualquier manera, la morfología es cocultivados individualmente sobre una se calculó con el ómnibus test (like hood un parámetro complementario útil para monocapa de células endometriales. El ratio). Las Odds ratio del efecto de cada mejorar la selección y los resultados de los análisis se realizó mediante hibridación estadio en D4-D5 se expresaron con un ciclos de DGP. 043: EStUDIO DE lA SEGrEGAcIÓN crOMOSÓMIcA EN UNA POrtADOrA DE UNA trANSlOcAcIÓN rEcÍPrOcA t(1;10) (P12;P11.2) G. Daina*1,2, M. Rius*1, L. Ramos1, J. del Rey1, J. Benet1,2, J. Navarro1,2, O. López3, A. Mata3, A. García3, L. Bassas3, JR. Bordás4, O. Martinez-Pasarell3 *Los dos primeros autores contribuyeron por igual en este trabajo 1 Unitat de Biologia Cel•lular i Genètica Mèdica, Facultat de Medicina, Departament de Biologia Cel•lular, Fisiologia i Immunologia, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193, Bellaterra. 2Càtedra de Recerca Eugin-UAB, Barcelona. 3Laboratori de Seminologia i Embriologia, Fundació Puigvert Barcelona. 4Programa de Reproducció Assistida, Fundació Puigvert-Hospital de Sant Pau, Barcelona e-mail: gemma.daina@uab.es INTRODUCCIÓN generar un 20-80% de gametos Diagnóstico Genético Preimplantacional desequilibrados dependiendo de los (DGP) está indicado para evitar Los individuos portadores de cromosomas implicados y el tamaño la transmisión a la descendencia translocaciones recíprocas pueden de los fragmentos intercambiados. El de reorganizaciones en forma
- 148. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 146 desequilibrada. Las tasas de embarazo posible estudiar el primer corpúsculo en 3 embriones (12%), involucrando por ciclo de DGP en portadoras de polar (1CP) de los ovocitos y dos ciclos los cromosomas 3, 4, 12 y X. translocaciones recíprocas no alcanzan de FIV con análisis de blastómeros. En el 15% (ESHRE PGD Consortium X). Es todos ellos, el estudio citogenético de CONCLUSIONES posible que los embriones transferidos todos los cromosomas se realizó tanto presenten aneuploidías en cromosomas en 1CP como en blastómero aplicando la La aplicación de la CGH ha permitido que no se analizan, pudiendo impedir su técnica de CGH rápida. estudiar la segregación cromosómica implantación en el útero materno. en una translocación recíproca t(1;10) RESULTADOS en 1CP y en blastómero, además de Por otro lado, en ciclos de FIV la detectar otras anomalías numéricas hiperestimulación ovárica con dosis Del ciclo de MIV se estudiaron 8 1CPs, 4 y estructurales. El porcentaje de elevadas de gonadotropinas podría de ellos fueron normales o equilibrados células observadas con segregación favorecer la presencia de aneuploidías en resultantes de una segregación desequilibrada entra en el rango los ovocitos obtenidos. Recientemente, alternante (50%), y los otros 4 fueron descrito anteriormente (20-80%). se ha aplicado la técnica de maduración desequilibrados: 3 originados a partir in vitro de ovocitos (MIV) para intentar de una segregación adyacente 1 (37,5%) Se observa presencia de anomalías obtener mejores resultados sobre y 1 de una segregación adyacente 2 no ligadas a la translocación en los todo en casos de mujeres con ovario (12.5%). No se observaron aneuploidías embriones procedentes de ciclos de FIV y poliquístico. de cromosomas no implicados en la no en ovocitos obtenidos de maduración translocación. in vitro. Hay que tener en cuenta que OBJETIVOS en el estudio de 1CP las anomalías De los ciclos de FIV se analizaron observadas son maternas, mientras que El objetivo de este trabajo fue el estudio 25 embriones. Se observaron 10 en el blastómero pueden tener origen de la segregación cromosómica en embriones equilibrados resultantes de ovocitario, espermático o embrionario. material descartado de una portadora una segregación alternante (40%), y Por otro lado, la estimulación hormonal de una translocación recíproca, con el 15 embriones desequilibrados (60%): aplicada en ciclos de FIV podría inducir fin de estudiar no solo los desequilibrios 4 de ellos que provenían de una la aparición de aneuploidías y otras derivados de la translocación, sino segregación adyacente 1 (16%), 5 de anomalías cromosómicas, aunque también todos los cromosomas del una segregación adyacente 2 (20%) y 6 sería necesario el estudio de un mayor complemento. Para ello se aplicó la de una segregación 3:1 (24%). número de casos para poder llegar a Hibridación Genómica Comparada conclusiones definitivas. (CGH). Adicionalmente, en 9 de los 25 embriones (36%) se observaron AGRADECIMIENTOS MATERIAL Y MÉTODOS aneuploidías de cromosomas no implicados en la translocación FIS-ISCIII (PI080012), Grup de Suport Paciente de 30 años de edad, cariotipo (cromosomas 4, 11, 12, 16, 17, 19, 22, a la Recerca, Generalitat de Catalunya 46,XX, t(1;10)(p12;p11.2) y respuesta X e Y). El análisis con CGH también ha (2009SGR1107), Càtedra de Recerca elevada a la estimulación ovárica. Se permitido la detección de pérdidas o Eugin-UAB, Beca Fundació Crèdit le practicó un ciclo de MIV en el que fue ganancias de fragmentos cromosómicos Andorrà. 044: ¿cÓMO AFEctA lA INcUBAcIÓN IN VItrO A lA FUNcIONAlIDAD DEl ESPErMAtOZOIDE HUMANO? E.M. García, S. Lozano, M.J. Gómez-Torres, LL. Medrano-López, J. De Juan Departamento de Biotecnología. Universidad de Alicante e-mail: em.garcia@ua.es INTRODUCCIÓN y la fragmentación del ADN. Por otra OBJETIVO parte, hay autores que muestran que Existen diversos estudios que los espermatozoides incubados in vitro Evaluar los efectos sobre la viabilidad, sugieren que la función espermática pueden sufrir reacción acrosómica motilidad, estado del acrosoma, se ve alterada en espermatozoides espontánea en bajas proporciones. Sin fragmentación del ADN y alteraciones capacitados tras periodos prolongados embargo, hasta el momento no se ha morfológicas tras 24, 48, 72 y 96 horas de incubación in vitro. El parámetro más concretado si estos cambios siguen el de incubación in vitro a 5% de CO2 y a afectado parece ser la motilidad, aunque mismo patrón en espermatozoides en 37ºC, antes y después de la capacitación. también se ve alterada la viabilidad fresco y tras capacitación.
- 149. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 147 MATERIAL Y MÉTODOS posibles daños a nivel de membrana, como en capacitado mediante MEB, las acrosoma, pieza intermedia y flagelo. imágenes obtenidas corroboran los Para este estudio fueron utilizadas daños descritos anteriormente. A partir muestras seminales procedentes de RESULTADOS de las 24 horas observamos en el 90% 10 varones sanos voluntarios. Las de las células analizadas, rotura de muestras fueron procesadas en el Tras 24 horas de incubación se observó membrana plasmática y acrosomales Departamento de Biotecnología de un descenso significativo tanto en y presencia de vesículas alrededor de la Universidad de Alicante y fueron la motilidad como en la viabilidad la cabeza, producto de la liberación clasificadas como normozoospérmicas en muestras en fresco y capacitadas. del contenido acrosomal. A nivel del según la OMS (2010). Cada muestra Por otro lado, el porcentaje de cuello se observaron fisuras y piezas fue dividida en dos alícuotas. Una de espermatozoides con ADN fragmentado intermedias desorganizadas. A lo largo ellas fue capacitada, mediante swim- se duplicó entre las 24 y las 48 horas de del flagelo observamos una posible up e incubada en medio HAM F-10 en incubación. Este aumento significativo desorganización de las fibras densas. los diferentes tiempos, mientras que se observó en muestras en fresco y en la otra alícuota fue incubada en fresco capacitado. CONCLUSIÓN bajo las mismas condiciones. En cada uno de los tiempos de incubación se Cuando se valoró la reacción A partir de las 24 horas todos los analizó el porcentaje de fragmentación acrosómica, se observó un aumento del biomarcadores espermáticos analizados del ADN mediante la técnica TUNEL, porcentaje de espermatozoides con el se ven afectados de la misma forma la integridad del acrosoma mediante acrosoma alterado entre las 24 y las 48 antes y después de la capacitación, la lectina FITC-PSA, así como la horas de incubación. No se obtuvieron por lo que el plasma seminal no evita motilidad y la viabilidad. Las muestras diferencias significativas entre las la pérdida de funcionalidad en el fueron, además, analizadas mediante muestras en fresco y capacitadas, en espermatozoide durante una incubación Microscopía Electrónica de Barrido ninguno de los tiempos de incubación. in vitro prolongada. (MEB) con el fin de comprobar los Al estudiar las muestras, tanto en fresco 045: ¿QUÉ APOrtA lA IMSI EN lOS cASOS DE FActOr MAScUlINO SEVErO? M. Sánchez de Burgos, M. Morales Morales, L. Andrés Criado, M. Cuadros, Mª Ángeles Manzanares, E. Ricciarelli, J. Cuadros Clínica de Medicina de la Reproducción y Ginecología FIVMadrid e-mail: jcuadros@fivmadrid.es INTRODUCCIÓN de Nomarski con un objetivo de 60x masculino severo, mujeres menores de con aceite de inmersión, que permite 40 años, 3 o más ovocitos en MII en la Desde que en 1992 se introdujo la alcanzar un aumento final de 6800x. punción. ICSI, ésta ha resultado ser el método de elección para tratar la infertilidad OBJETIVO El grupo control en el cual se realizó de origen masculino. La selección de ICSI incluye 23 pacientes con una media espermatozoides para la microinyección El objetivo de este estudio retrospectivo de edad de 34,4 años. El grupo estudio se lleva a cabo basándose en la motilidad es valorar si existe una mejora en en el que se realizó IMSI incluye 23 y en la morfología, teniendo en cuenta las tasas de fecundación, embarazo pacientes y una media de edad de 34,1 cola, cuello y cabeza. Esta selección e implantación con la inyección de años. Los parámetros a valorar fueron la se lleva a cabo a 400x (objetivo de espermatozoides morfológicamente tasa fecundación, la tasa de gestación 40x). Sin embargo, espermatozoides seleccionados (IMSI), basada en clínica, la tasa de implantación y los aparentemente normales a ese aumento MSOME, versus la ICSI tradicional en los abortos. El análisis estadístico se llevó a pueden tener anomalías estructurales casos de oligoastenoteratozoospermia cabo mediante el test de Chi-cuadrado. que sólo se pueden detectar si utilizamos severa. aumentos mayores que los de la ICSI. A RESULTADOS raíz de esto surge la MSOME (Selección MATERIAL Y MÉTODOS morfológica por las organelas de los No se observó diferencias espermatozoides móviles), técnica que Este estudio se ha llevado a cabo de estadísticamente significativas en permite seleccionar espermatozoides Enero a Diciembre de 2010. Los criterios ninguno de los parámetros evaluados. por la ausencia de vacuolas en el núcleo, de selección de los pacientes fueron en nuestro caso utilizando la óptica similares en ambos grupos: factor
- 150. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 148 DISCUSIÓN Tasa fecundación Emb.clínico Tasa implantación Aborto Este estudio demuestra que tanto la IMSI 67,7% 43,5% 22,4% 10% IMSI como la ICSI convencional dan lugar a unos resultados clínicos similares (95/141) (10/23) (11/49) (1/10) en los casos de factor masculino severo. Esto nos lleva a pensar, para estudios ICSI 67,6% 52,2% 30,4% 8,3% posteriores, que quizás podría existir otro grupo de pacientes a los que les (134/198) (12/23) (14/46) (1/12) beneficiase más esta técnica, como es el caso de pacientes con 2 o más fallos de ICSI o en abortadoras de repetición. 046: EStUDIO PrElIMINAr: EFEctO DE lOS trAtAMIENtOS DE cAPAcItAcIÓN ESPErMÁtIcA SOBrE El ÍNDIcE DE FrAGMENtAcIÓN DEl ADN ESPErMÁtIcO I. Panisello1, T. Planella2, C. Vives2, P. Feliu2, Ll. Arola3, I. Saumell2 1 Alumna en prácticas de la Universitat Rovira i Virgili. 2 Embriogyn, Centre de Reproducció Humana Assistida. 3 Profesor de la Facultad de Quími- ca de la Universitat Rovira i Virgili de Tarragona. e-mail: isaumell@embriogyn.com INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS minutos a 1500 rpm. Al pellet se añade 0,5 ml del mismo medio y se incuba La determinación del índice de Se realiza un estudio preliminar, hasta el momento de su utilización. fragmentación del ADN (IF) espermático prospectivo con 7 muestras de semen junto con el seminograma básico dentro del programa de Fecundación in Para analizar el IF aplicamos el puede aportar más especificidad para vitro de Embriogyn. Se valora el IF del paquete comercial de Halosperm® conocer el origen de la esterilidad de ADN a los 20 minutos de la obtención basado en la tecnología SCD, (Sperm un paciente y, así, indicar la técnica de de la muestra (IF basal) y después Chromatin Dispersion) el cual permite reproducción asistida más adecuada. de ser capacitado, justo antes de la descondensación diferencial su utilización en FIVconvencional o de la cromatina entre aquellos Es conocido que la transferencia del ICSI, (IF capacitado). Las técnicas de espermatozoides que presentan su ADN íntegro desde el espermatozoide al capacitación utilizadas son: ADN fragmentado respecto a aquellos óvulo puede ser esencial para conseguir que lo mantienen intacto. Efectuamos una gestación con éxito. Tanto es así que LavaDo SEMINaL las lecturas en microscopio óptico de desde el punto de vista del laboratorio de contraste de Hoffman visualizando un andrología, existen diferentes estudios Se utiliza toda la muestra, añadiendo mínimo de 500 espermatozoides. sobre la repercusión de la capacitación G-IVF+ Vitrolife® s.V (37ºC / 6%CO2) espermática en la integridad del en volumen 1:1 y se homogeneiza. Se Para estudiar si existen diferencias ADN espermático. Algunos estudios, centrifuga 10 minutos a 1400 rpm y se estadísticamente significativas entre apuntan a una disminución de la rechaza el sobrenadante. El pellet se los IF (basal y capacitado) se utiliza la fragmentación del ADN espermático resuspende con 0,2 ml del mismo medio prueba t de comparación de dos medias, después de la capacitación según la y se incuba hasta el momento de su corregida para muestras pequeñas. técnica de laboratorio utilizada. utilización. RESULTADOS OBJETIVOS GRaDIENTES DE DENSIDaD En todos los casos, el IF basal es El objetivo de este estudio es valorar el A las columnas de gradientes de inferior al 30% (no patológico). Los efecto de los diferentes tratamientos densidad (95% y 50%) SpermGrad resultados obtenidos muestran de de capacitación espermática sobre el /G-IVF+ Vitrolife® s.V se añade 1ml forma estadísticamente significativa índice de fragmentación del ADN en las de semen. Se centrifuga la columna (t= 3,26; p<0,05) que los tratamientos muestras de semen para FIV e FIV-ICSI durante 20 minutos a 1200 rpm. El de capacitación espermática permiten y, a la vez, relacionarlo con la tasa de pellet se transfiere a un tubo con 4 ml de obtener espermatozoides con un menor gestación. G-IVF+ (37ºC / 6%CO2) centrifugando 10 IF ( IFcapacitado = 2,56%) que antes
- 151. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 149 de ser capacitados ( IFbasal = 11,6%). sobre el efecto que tiene la manipulación espermática en el laboratorio de En relación a las gestaciones obtenidas, in vitro de los espermatozoides antes de andrología se consiguen seleccionar de los 7 ciclos de FIV estudiados se su utilización en TRHA. espermatozoides con mejor integridad obtiene gestación clínica en 5 de éstos de ADN. Es pronto para poder relacionar (71,42%). Aunque el número de muestras el IF con las tasas de gestación por lo estudiadas es muy reducido, sorprende que es evidente que será necesario CONCLUSIONES a la luz de los resultados obtenidos, que ampliar la muestra estudiada y así dar el IF capacitado es realmente muy bajo. veracidad a los resultados obtenidos. Este estudio pretende orientar hacia un Así pues, entendemos que gracias a los nuevo trabajo más profundo y extenso protocolos específicos de capacitación 047: lA IMPOrtANcIA DE lA BAJA cONcENtrAcIÓN DEl crIOPrOtEctOr EN lA cONGElAcIÓN cElUlAr. cONGElAcIÓN lENtA VS VItrIFIcAcIÓN VS UltrA-VItrIFIcAcIÓN DE ÓVUlOS E. Criado, C. González, H. R. Benito CERAM. Centro de reproducción de Marbella. e-mail: ecriados@yahoo.es INTRODUCCIÓN consigue un aumento en la velocidad que el nitrógeno líquido (-196ºC Vs de enfriamiento, llegando hasta -210ºC) y con la propiedad de evitar el Actualmente existen dos técnicas para 250.000ºC/min aproximadamente efecto Leiderfrost. la conservación celular: el enfriamiento evitando así la formación de cristales lento y la vitrificación. de hielo que dañen la célula. Para esto Para aumentar la transmisión de se utiliza un sistema de micro-capilares temperatura y minimizar el volumen El enfriamiento lento o slow freezing de cristal de cuarzo y nitrógeno se utiliza un microcapilar de cristal de está basado en el control de la tasa de líquido Slush. Como consecuencia cuarzo. Éste tiene un diámetro de 0.2- enfriamiento con el objetivo de crear un de estos nuevos componentes 0.3 mm permitiendo ultra-vitrificar equilibrio entre los distintos factores tenemos la posibilidad de disminuir la 0.1-0.2 µl con una pared de 0.01 mm de que causan daño celular, entre los que concentración de los crioprotectores grosor, mucho más fina que cualquier se encuentran la formación de hielo, a 2M (concentración poco tóxica para otro sistema (0.075 open Pulled Straw). fracturas y una excesiva deshidratación la célula) aumentando la tasa de Pero la característica más importante de la célula. Está caracterizada por la supervivencia, de fecundación y de es que la conductividad térmica del baja concentración de crioprotectores y desarrollo del embrión después de la cuarzo es mucho más elevada que la por la curva de enfriamiento. descongelación del óvulo. del plástico del que están hechos los otros sistemas de congelación. Esto La vitrificación es un proceso mediante OBJETIVOS lo convierte en uno de los materiales el cual un líquido se solidifica en una que mejor transmite la temperatura. fase vítrea con un descenso rápido Demostrar la eficacia de una nueva de la temperatura y un aumento de la técnica de Ultra-vitrificación La técnica de Ultra-vitrificación viscosidad, evitando así la formación celular que nos permite ultra- permite utilizar una concentración de cristales intracelulares que vitrificar óvulos humanos con “no tóxica” para la célula: 2M de pueden dañar el contenido celular. velocidades de enfriamiento ultra- PrOH+0.5 Sacarosa. Obteniendo Existen varias formas de conseguir la rápidas permitiéndonos usar bajas un 92% de supervivencia en óvulos vitrificación, pasando todas ellas por concentraciones de crioprotectores maduros humanos. el empleo de una alta concentración de típicas de Slow freezing. De esta manera agentes crioprotectores (etilenglicol, podemos disminuir la toxicidad de éstos RESULTADOS dimetilsulfóxido, 1,2-propanodiol, etc.) y mejorar las tasas de supervivencia, llegando incluso a concentraciones de fecundación y de desarrollo Hemos analizado y comparado la tasa hasta 6M en algunos protocolos. Dichas embrionario. de supervivencia, de fecundación y concentraciones de crioprotectores de blastulación con distintas técnicas resultan muy tóxicas para la célula. MATERIAL Y MÉTODOS de congelación en distintos artículos científicos publicados recientemente por La técnica de Ultra-Vitrificación, Como solución refrigerante se usa Cao YX et al., 2009 (1), Ho-Joon Lee et desarrollada en los últimos años, el nitrógeno Slush, mucho mas frío al., 2010 (2) y E Criado et al., 2011 (3).
- 152. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 150 Según estos estudios, utilizando la estudios realizados utilizando esta doble de tasa de blastulación con el técnica de Slow freezing se obtiene un nueva técnica con óvulos maduros consiguiente beneficio y eficacia a la 61% de tasa de supervivencia, un 61.3% humanos se ha obtenido un 92% de tasa hora de transferir esos embriones. No de tasa de fecundación y un 12% de tasa de supervivencia (3). obstante estos estudios se tienen que de blastulación (1). Con la técnica de realizar en óvulos humanos y ver si ese Vitrificación se obtiene un 91.8%, un CONCLUSIONES 92% de tasa de supervivencia es una 67.9% y un 33.1% respectivamente (1). “supervivencia morfológica” o una Utilizando esta nueva técnica de Ultra- Esta técnica es una nueva opción para “supervivencia funcional”. Esta nueva vitrificación con baja concentración preservar óvulos humanos obteniendo técnica puede ser uno de los primeros de crioprotector en óvulos maduros una elevada tasa de supervivencia. pasos para alcanzar la congelación de ratón se han obtenido un 92.5% de Todo indica, según los resultados celular sin sustancias crioprotectoras tasa de supervivencia, un 75% de tasa obtenidos en óvulos de ratón, que ultra- simplificando, mejorando y abaratando de fecundación y un 59.1% de tasa vitrificando con baja concentración las técnicas de criopreservación celular. de blastulación (2). En los últimos de crioprotector se obtiene casi el 048: ¿tIENEN FEcHA DE cADUcIDAD lOS PrEEMBrIONES crIOPrESErVADOS? B. Sánchez, J. Guardiola, M.D. Lozano, S. Borrego, G. Antiñolo Unidad de gestión Clínica de Genética, Reproducción y Medicina Fetal. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla e-mail: beasanchandujar@hotmail.com INTRODUCCIÓN OBJETIVO embriones transferidos fue similar en todos los periodos de almacenamiento. El número de preembriones Analizar si el tiempo de almacenamiento Los preembriones se congelaron criopreservados en los centros de de los preembriones criopreservados de siguiendo un protocolo de congelación reproducción humana asistida, así como un programa de FIV afecta negativamente lenta (propanodiol y sacarosa como el tiempo que permanecen almacenados, a la supervivencia embrionaria tras agentes crioprotectores) con un ha aumentando progresivamente como la descongelación, la capacidad de congelador programable por ordenador consecuencia del mayor número de implantación y la tasa de embarazo. (Minicool 40PC) y se descongelaron ciclos realizados, mejores resultados mediante descongelación rápida. obtenidos y la tendencia a disminuir el MATERIAL Y MÉTODOS Sólo se criopreservaron preembriones número de preembriones transferidos. considerados con calidad suficiente. Por ello, y desde que la nueva ley Análisis retrospectivo de 909 ciclos de Consideramos embarazo clínico de reproducción humana asistida descongelación embrionaria realizados la observación ecográfica de saco en España permite mantener los entre Enero de 2007 y Junio de 2010. gestacional con latido fetal 6-7 semanas preembriones criopreservados hasta Se han descongelado 2543 embriones post-transferencia. Para el análisis que finalice la edad reproductiva de la pertenecientes a pacientes del programa estadístico se utilizó el test χ2 o el test paciente, es interesante comprobar si de FIV-ICSI de nuestra Unidad que se exacto de Fischer cuando fue necesario. el tiempo de almacenamiento influye habían realizado el ciclo entre 1998 La significación estadística se estableció negativamente en su viabilidad y y 2010, analizando 5 periodos de en p< 0,05. capacidad de implantación. tiempo de almacenamiento. La media de edad de las pacientes y el número RESULTADOS Periodo de almacenamiento (Días) 20-100 101-365 366-730 731-1095 > 1095 p (1-2 años) (2-3 años) (> 3 años) Nº ciclos de descongelación 328 390 71 65 55 Edad paciente 34 34.5 35 34 34.5 Nº de embr descongelados 924 1071 211 164 173 Tasa de supervivencia 66.5 70.5 71 72.5 57.8 0.008 Nº de transferencias 290 341 63 59 47 Nº de embr transferidos 1.7 1.7 1.8 1.7 1.9 % Emb Clínico/ Transf 15,5 (n= 45) 17 (n= 58) 25,4 (n= 16) 18,6 (n= 11) 19,1 (n= 9) 0,445 % Aborto 20 (n= 9) 44,9 (n= 26) 56,2 (n= 9) 27.3 (n= 3) 22 (n= 2) % Implantación 9.7 11.5 14.2 11.9 13.3 0.608 % Nacidos vivos/Transf 12,4 (n= 36) 9,4 (n= 32) 11,1 (n= 7) 13.6 (n= 8) 14,9 (n= 7) 0,640
- 153. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 151 De las 16 transferencias con significativas entre los distintos que sobreviven mantienen la misma preembriones de más de 5 años, se períodos de almacenamiento capacidad para implantar, dar lugar a obtuvo embarazo clínico y nacido vivo analizados, en la tasa de embarazo un embarazo clínico y a un niño sano, sano en dos de ellas, en ambos casos los clínico, en la tasa de implantación, y en sin afectarles el tiempo que llevan preembriones llevaban criopreservados la tasa de nacido vivo. almacenados. Esto permite ampliar 7 años. Se observan diferencias el plazo para concluir el proyecto estadísticamente significativas en la CONCLUSIONES reproductivo de la pareja, que aumente tasa de supervivencia. Respecto a la el número de preembriones disponibles tasa de aborto, el análisis estadístico no Aunque el tiempo de almacenamiento para programas de embriodonación, y fue posible debido al reducido número de los preembriones criopreservados prolongar el tiempo de almacenamiento de casos en los dos últimos periodos. parece influir negativamente en la tasa permitido en países con normas muy No hay diferencias estadísticamente de supervivencia, los preembriones restrictivas. 049: EStUDIO DE ANEUPlOIDÍAS ESPErMÁtIcAS MEDIANtE HIBrIDAcIÓN IN SItU FlUOrEScENtE (FISH) EN PAcIENtES POrtADOrES DE UNA INVErSIÓN PErIcÉNtrIcA DEl crOMOSOMA 9 F. Marina, R. Alcolea, M. Rafael, M. Domínguez, L. Jiménez, A. Hernández y S. Marina. Instituto de Reproducción CEFER. ANACER e-mail: info@institutocefer.com INTRODUCCIÓN también se estudió el cromosoma 9 En este estudio, aunque con pocos casos, (Vysis® TelVysion 9p). Para ambos hemos conseguido una de las series más Las inversiones pericéntricas del estudios se utilizó como grupo control grandes publicadas en la bibliografía. cromosoma 9 son consideradas como semen de donante fértil. En 4 pacientes No podemos sacar grandes conclusiones una variante normal del cariotipo sin se realizó estudio meiótico en biopsia debido a la heterogeneidad de los ningún efecto. Algunos autores han testicular. resultados. El 61,5% de los pacientes sugerido que estas variantes pueden presentaron un recuento espermático causar alteraciones en el seminograma RESULTADOS normal. Sólo un paciente presentó e infertilidad. En el presente estudio alteraciones en el FISH (diploidías) pretendemos determinar si los pacientes La edad media de los pacientes fue: 36,5 cuando estudiamos los cromosomas portadores de inversión pericéntrica (27-45). El recuento medio por mL fue: 13, 18, 21, X e Y. Con los resultados del cromosoma 9 presentan una mayor 48,5 millones (0,29-200). La media obtenidos, no podemos establecer incidencia de aneuploidías en el semen. de espermatozoides con morfología ninguna relación entre las inversiones normal fue: 22,7% (2-58). El motivo pericéntricas del cromosoma 9 y las MATERIAL Y MÉTODOS de consulta fue la esterilidad primaria aneuploidías espermáticas estudiadas. (n=10), secundaria (n=1) e infertilidad Aunque sólo se han realizado 4 estudios Estudiamos 13 hombres que acudieron (n=2). El FISH para los 5 cromosomas meióticos, el 75% de ellos mostraron a la consulta con deseo reproductivo fue normal (n=12). Uno presentaba alteraciones. Este resultado apunta y que presentaban en el cariotipo una diploidías significativas (S). No se a un posible efecto de la inversión en inversión pericéntrica del cromosoma estudió el 9. El FISH para el cromosoma la meiosis. Es necesario ampliar los 9. El seminograma se realizó según la 9 presentó disomías (S) en 2. Uno fue estudios meióticos y de aneuploidías OMS. Para el estudio de FISH se fijaron normal. La meiosis (n=4) fue alterada espermáticas del cromosoma 9 para los espermatozoides con Carnoy y en 3: anomalías de apareamiento (n=2) aclarar si las inversiones pericéntricas posteriormente se descondensaron y bloqueo (n=1). Normal en un caso. del cromosoma 9 tienen algún efecto en las cabezas con DTT (dithiotreitol). la espermatogénesis y/o en la meiosis. Se utilizó como sonda el kit Vysis® CONCLUSIÓN Aneuvision compuesto por tres sondas centroméricas (para los cromosomas Es difícil encontrar en la bibliografía 18, X e Y) y dos específicas de loci (para series grandes de pacientes con los cromosomas 13 y 21). En 3 casos anomalías cromosómicas en el cariotipo.
- 154. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 152 050: rElAcIÓN DE lOS POlIMOrFISMOS GENÉtIcOS DEl FActOr DE crEcIMIENtO VAScUlO ENDOtElIAl (VEGF) Y lA INcIDENcIA DE PrEEclAMPSIA EN El EMBArAZO S. Rafael, S. Veganzones, M. Vidaurreta, V. de la Orden, M.A. Duarez, J.A. Vidart, M. Abad, N. Martell, M. Maestro. Hospital Clínico San Carlos, Madrid e-mail: sara.rafael.f@gmail.com INTRODUCCIÓN en la consulta de Alto Riesgo Obstétrico y en el polimorfismo -1154 G/A se y en la Unidad de Hipertensión del encontraron porcentajes muy similares La preeclampsia es una enfermedad Hospital Clínico San Carlos de Madrid. en ambos grupos (preeclámpticas: multisistémica, que afecta al 6-8% de los Como grupo control de este estudio se 38,5% y controles: 40%) (OR: 1,06; IC: embarazos y permanece como la primera reclutaron 35 mujeres con al menos dos 0.42-2,71)(p=0,89). causa de morbimortalidad materno embarazos a término y sin hipertensión perinatal en los países desarrollados. Se ni durante el embarazo ni en el CONCLUSIONES define por la aparición de hipertensión y puerperio. proteinuria. A pesar de que no se encontraron El análisis de los polimorfismos -2578C/ diferencias significativas en ninguno El factor de crecimiento vascular endotelial A, -1154G/A y +936C/T del gen vEGF fue de los polimorfismos, se ha observado (VEGF) está implicado en la vasculogénesis realizado mediante reacción en cadena una mayor frecuencia del alelo A del y la permeabilidad vascular. Se han de la polimerasa (PCR) a tiempo real polimorfismo –2578C/A en el grupo descrito varios polimorfismos frecuentes en Smart Cycler® en el laboratorio de control, sin embargo el alelo infrecuente en la población, que se asocian con una Genómica (Servicio de Análisis Clínicos) del polimorfismo +936C/T está en mayor disminución en los niveles de la proteína. del hospital Clínico San Carlos de proporción en el grupo de pacientes Algunos de estos polimorfismos se han Madrid. con preeclampsia. La mayor frecuencia asociado con el riesgo de preeclampsia y del alelo T del polimorfismo +936C/T la severidad de los síntomas. RESULTADOS ha sido previamente descrita. Los resultados no fueron estadísticamente OBJETIVOS En el polimorfismo -2578C/A, el significativos probablemente debido al porcentaje de pacientes con el tamaño muestral. El objetivo de este trabajo fue analizar alelo menos frecuente (genotipos la asociación entre tres polimorfismos -2578CA y –2578AA) fue menor en las Este trabajo presenta los resultados del gen vEGF (-2578C/A, -1154G/A y preeclámpticas (51%), respecto a los preliminares del estudio. Es necesario +936C/T) y determinar la influencia en controles (62%) (OR: 0,80 IC: 0,52- completar el muestreo y análisis en una el desarrollo de preeclampsia. 1,23) (p= 0,316); por el contrario en el población de mayor tamaño para poder polimorfismo +936 C/T se encontró un determinar el efecto de la presencia de MATERIAL Y METODOS mayor porcentaje de pacientes con el los polimorfismos del gen vEGF en el alelo T en las preeclámpticas (30,8%) riesgo de sufrir preeclampsia. Se reclutaron 39 gestantes con respecto a las gestantes sanas (25%) diagnóstico de preeclampsia, atendidas (OR: 0.78 IC: 0,28-2,15) (p=0.63); 051: “cAZANDO” GrANDES DElEcIONES cON SNP’S. APlIcAcIÓN Al DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl C. Giménez, C. Arjona, E. García-Guixé, A. Jiménez-Macedo, M. Sandalinas Reprogenetics, Barcelona e-mail: litus@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN poner en jaque el desarrollo de un es muy complicado y variable, por lo protocolo de DGP para enfermedades que no es recomendable utilizarlo en El DGP molecular para el análisis de monogénicas, bien por su tamaño, DGP. En esta situación lo recomendable embriones provenientes de parejas bien porque las técnicas habituales es realizar un estudio de ligamiento portadoras de patologías genéticas es de detección requieren de grandes siempre que exista estructura familiar una técnica ampliamente establecida. cantidades de DNA para su diagnóstico. y que esté dispuesta a colaborar, pero, Al margen de posibles temas legales, En ambos casos el análisis de tales ¿qué hacer cuando la anomalía es de algunas alteraciones génicas pueden anomalías a partir de una sola célula novo?
- 155. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 153 OBJETIVOS Se localizan microsatélites up y región delecionada. Tres de los 5 STR’s downstream de los genes implicados y cinco de los 26 SNP’s seleccionados Desarrollar un protocolo de DGP para así como SNP’s dentro de las regiones resultaron semi-informativos. la detección de grandes deleciones delecionadas. génicas de novo que cursan, en un caso, La eficiencia de amplificación general es con Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) y en RESULTADOS del 95% con una tasa de ADO alrededor un segundo caso con esclerosis tuberosa del 6%. (TS) tipo 2. En el caso de la NF1 se diseñaron y analizaron 7 marcadores polimórficos CONCLUSIONES MATERIAL Y MÉTODOS (STR’s) flanqueantes a la región de estudio y se seleccionaron 20 SNP’s La estrategia descrita nos ha permitido Persona portadora de una deleción en dentro de la región delecionada. ofrecer el DGP a la pareja en estudio, si heterozigosis de los exones 19b a 23.1 Cinco de los 7 STR’s resultaron semi- bien para poder ejecutarlo ha sido preciso del gen NF1. informativos, mientras que no se el diseño y análisis de numerosas parejas encontró informatividad en ninguno de de primers con el subsiguiente coste en Persona portadora de una deleción en los 20 SNP’s seleccionados. Tras informar tiempo, en esfuerzo y económico. heterozigosis de los exones 1 al 15 del a la pareja de la situación, ésta decidió gen TSC2. desistir de la continuación del estudio. El DGP para enfermedades monogénicas requiere de una elevada especialización Ambos casos son de novo, por lo que En el caso de la TS se diseñaron y y experiencia que permite poner a no es posible el diagnóstico mediante analizaron 5 marcadores polimórficos disposición de los pacientes protocolos estudio de ligamiento. flanqueantes a la región de estudio y diagnósticos con las más elevadas tasas se seleccionaron 26 SNP’s dentro de la de fiabilidad. 052: ANEUPlOIDÍAS Y FrAGMENtAcIÓN EN El DNA ESPErMÁtIcO ¿EXIStE cOrrElAcIÓN? E. Martínez, Mª. Gaytan, A. Liñán, D. Cernuda, M. Ariza, MªC, Nogales, F. Bronet. IVI-MADRID e-mail: EvaMaria.Martinez@ivi.es INTRODUCCIÓN 2011. Todos los varones tenían menos de RESULTADOS 45 años (media edad de 39) y tenían un Aunque el seminograma constituye un pilar seminograma previo con un resultado De los 38 casos, 3 mostraron esencial para la evaluación de la esterilidad, normal o levemente alterado (≥ 15 diferencias significativas con respecto en muchas ocasiones no permite detectar millones/ml, > 35% de espermatozoides al valor control para las disomías de los la presencia de alteraciones sutiles en móviles A+B). Se determinó el índice de cromosomas sexuales (0,37%) tanto el espermatozoide ya que muchos de fragmentación de ADN (DFI), mediante en fresco como en capacitado. No se ellos presentan parámetros normales la técnica de TUNEL, tanto en fresco como encontraron alteraciones para el resto en el eyaculado. Así pues, un estudio en capacitado de la muestra seminal el de cromosomas analizados. Treinta y exhaustivo requiere la determinación día de la microinyección y además se fijó tres muestras (86,4%) presentaron un de otros parámetros encaminados a la una alícuota en fresco de cada uno de los DFI inferior al 20%, considerándose profundización del estudio masculino a eyaculados para realizar la técnica de FISH. por tanto muestras normales. El 13,6 % nivel de la integridad estructural del ADN El estudio de FISH en el capacitado sólo se de las muestras (5 muestras) tuvieron espermático y a nivel cromosómico (FISH). realizó en aquellos casos en los cuales el niveles elevados de fragmentación. resultado del FISH en fresco fue anormal. El objetivo de este trabajo es estudiar si Para su análisis se empleó sondas locus El estudio de dispersión muestra que no existe relación entre la fragmentación específicas (LSI) para los cromosomas 13 hay correlación entre DFI y anomalías de ADN y FISH de espermatozoides en y 21 y sondas centroméricas (CEP) para cromosómicas en espermatozoides para alícuotas de muestras seminales empleadas los cromosomas 18, X e Y. La media de ninguno de los cromosomas estudiados. en los tratamientos de microinyección espermatozoides contados fue de 3350 intracitoplasmática de IVI- Madrid para los cromosomas X, Y y 18 y 3010 para CONCLUSIONES los cromosomas 13 y 21. MATERIAL Y MÉTODOS Los resultados obtenidos en este estudio Se llevó a cabo un estudio de dispersión no muestran ninguna correlación entre Se realizó un estudio prospectivo de 38 para ver si había correlación entre las la fragmentación del DNA espermático ciclos de pacientes con AR y FI de origen dos variables de estudio. Para el análisis y el estudio de aneuploidías. idiopático, dentro del programa de DGP, estadístico se empleo coeficiente de desde Abril de 2010 hasta Enero de correlación de Pearson.
- 156. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 154 053: lA FrAGMENtAcIÓN DEl ADN ESPErMÁtIcO 1 A. Mata, 1A. Garcia, 1R. Gustà, 1O. Lopez, 1O. Martinez-Passarell, 2M. J. Saiz, 1L. Bassas 1 Laboratorio de Seminología y Embriología Fundacio Puigvert 2 Servicio de Ginecología Hospital de la Santa Creu y Sant Pau Barcelona e-mail: amata@fundacio-puigvert.es INTRODUCCIÓN la fragmentación espermática con (p =0.037) y en el nº de oocitos MII muestras previamente congeladas (9.9±6 vs 7±4.2) (p = 0.033). No hubo El estudio de los parámetros el mismo día de la punción folicular, diferencias ni en la (TF) (66.9±18.9 seminales, concentración espermática, con medio crioprotector (Freezing vs 71.8±22.3 %) ni en el (IFE) (18.8 motilidad, vitalidad y morfología Medium) IrvineScientific®. La ±7.9 vs 18.8±9.8%) ni en los demás son insuficientes para predecir la prueba de fragmentación del ADN parámetros seminales. Se produjeron capacidad de fecundación en un se realizó mediante el método 8 abortos (27.6%) y únicamente la programa de FIV(1). La integridad del SCD (Sperm Cromatin Dispersion) concentración espermática mostró ADN espermático es necesaria para Halosperm®. El resultado se expresó diferencia significativa entre las una correcta transmisión del material en porcentaje, como índice de gestaciones que finalizaron en aborto genético. El genoma paterno es de fragmentación espermático (IFE) de y las gestaciones a término (27.7±20.5 gran importancia en la iniciación y los espermatozoides fragmentados vs 50.9±50.9) (p = 0.06). mantenimiento de la gestación tanto (halo pequeño, sin halo y degradados) natural como en TRA (2). El análisis del con respecto a los no fragmentados o CONCLUSIONES Índice de Fragmentación Espermático normales (halo grande y mediano). (IFE) podría ser útil junto con los Para el análisis estadístico se utilizó Cuando la tasa de fertilidad es baja, parámetros seminales para predecir el t-test para comparación entre existe una buena correlación inversa tanto la gestación espontánea como grupos que siguieron una normal y el entre el (IFE) y los parámetros la FIV coeficiente de correlación de Pearson seminales de motilidad y morfología. mediante el programa informático SPSS OBJETIVOS vs 12.0 siendo el nivel de significación No hemos observado ninguna estadística p < 0.05 correlación entre (IFE), tasa de El objetivo de este estudio fue fecundación y gestación. analizar los parámetros seminales RESULTADOS convencionales y clínicos junto con Creemos que el (IFE) no parece el IFE y su correlación con la tasa de De las 73 parejas estudiadas hubo una predictivo de fertilidad en un programa fecundación (TF), de gestación (TG) y tasa de fecundación media ± SD del de FIV. de abortos (TA) en nuestro programa (66.91±24.5 %) y una tasa de gestación/ de FIV. ciclo del 39.7 %. El (IFE) de las 73 Es posible que estudiando subgrupos muestras estudiadas se correlacionó de pacientes infértiles, éstos podrían MATERIAL Y MÉTODOS débilmente con la motilidad progresiva beneficiarse de la prueba de integridad (R = - 0.255 p = 0.029) y con las formas de ADN. Se analizaron un total de 73 muestras normales (R = - 0.212 p=0.075). Cuando de semen procedentes de parejas la (TF) fue < 65% mejoró la correlación Mehdi M et al. Andrologia 2009,41:386-6. que acudieron a nuestro centro para entre (IFE) y la motilidad progresiva Análisis de la fragmentación del ADN en técnicas de FIV /ICSI. Se realizó (R = - 0.401 p = 0.031) junto con las espermatozoides humanos: Correlación un seminograma a cada paciente formas normales (R = - 0.50 p = 0.006) con los parámetros seminales. el mismo día de la punción folicular Si comparamos gestación versus no según criterios OMS 2010. Se analizó gestación, observamos diferencias en la Sakkas D, Alvarez JG.Fertil. Steril.; (Epub la concentración, motilidad progresiva edad de la mujer (media ± DS) (35.5±3.8 ahead of print) Sperm DNA fragmentation: (a+b), prueba de vitalidad y formas vs 37.6±3.2) (p = 0.020) y en la edad mechanisms of origin, impact on normales. Se realizó el estudio de del hombre (37.7±4.5 vs 40.1±4.2) reproductive outcome, and analysis.
- 157. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 155 054: EStUDIO DEl tESt HBA rEAlIZADO EN SEMEN FrEScO Y SEMEN cAPAcItADO DE VArONES EN cIclO DE INSEMINAcIÓN ArtIFIcIAl I. Orozco, A. Gabriel, P. López, A. Guijarro, C. Muñoz, R. Núñez, P. Caballero Clínica Tambre, Madrid e-mail: iorozco@clinicatambre.com INTRODUCCIÓN acridina/bromuro de etidio) y movilidad 14,20, 6,80 y 9,08. CV: 192,67, 73,59 y total antes y después de la capacitación. 30,47). El Sperm-Hyaluronan Binding assay (HBA) Para obtener el valor de HBA, se analizó es una prueba que valora la maduración el porcentaje de espermatozoides De las tres variables dependientes espermática en semen fresco. Dicha unidos a AH (sin desplazamiento pero (HBA, vitalidad y movilidad), sólo prueba, se basa en la capacidad de los con movimiento flagelar), respecto el porcentaje de HBA mostró una espermatozoides maduros para unirse al número total de espermatozoides correlación significativa entre los al ácido hialurónico (AH). Esta molécula móviles + espermatozoides inmóviles valores en fresco y tras la capacitación. es el principal mucopolisacárido con batida flagelar. Aquellos Los cambios en movilidad y vitalidad de la matriz del cumulus oophorus espermatozoides absolutamente con la capacitación muestran una y componente del líquido folicular. inmóviles, no fueron valorados. correlación lineal entre sí, pero el Dicha unión con el espermatozoide se cambio en HBA no se relaciona de forma correlaciona con un correcto proceso Como variables independientes lineal con ninguno de ellos. espermiogénico en la remodelación en recogimos el volumen del eyaculado la membrana plasmática, extrusión de y la concentración espermática Encontramos un modelo multivariante la gota citoplasmática y reemplazo de antes y después del capacitado. capaz de predecir los cambios en HBA histonas por protaminas. Además, analizamos la adecuación con el capacitado a partir del total de a la normalidad mediante el test de espermatozoides en fresco (volumen x OBJETIVO Kolmogorov-Smirnov, las diferencias recuento), el HBA inicial y el cuadrado de medias pre y postcapacitado con la de la movilidad en fresco. Identificar y cuantificar los cambios en T de Student para muestras pareadas la capacidad espermática de unión al AH y las correlaciones entre variables con CONCLUSIONES tras el lavado seminal con gradientes de el test de Pearson. El modelo predictor densidad. multivariado fue realizado mediante Tras la capacitación con gradientes análisis de covarianzas para muestras la media de HBA de la muestra sufrió MATERIALES Y MÉTODO repetidas (ANCOVA-MR) y regresión un incremento de 7,37%, siendo muy lineal multivariante. El límite de alta la variabilidad de este cambio, Analizamos el semen de 41 pacientes significación se estableció en todos los con muchos casos en los que el HBA que acudieron para tratamiento de IAC casos en 0,05. disminuyó tras el capacitado. por EOD o factor masculino leve, siendo la edad de la mujer inferior a 38 años. RESULTADOS Parámetros habituales como el volumen, recuento espermático, movilidad y HBA Como variables dependientes Las diferencias en el porcentaje de en fresco permiten predecir un 68,1% registramos los valores de HBA, HBA, vitalidad y movilidad fueron de de la variación total en HBA que tendrá vitalidad (mediante el test de naranja de 7,37, 9,24 y 29,80 respectivamente (DE: la muestra tras la capacitación. 055: lAH ( lASEr ASSIStED HAtcHING) EN cIclOS DE FIV/IcSI EN 2 GrUPOS DE EDADES B. Amorocho, G. Calderón, D. Gumbao, L. Fernández, J. Landeras. IVI Murcia beatriz.amorocho@ivi.es INTRODUCCIÓN manipulación de la zona pelúcida en embriones que provienen de mujeres mujeres de edad avanzada. Sin embargo en edad reproductiva avanzada. La Durante la década pasada han sido existe una incertidumbre considerable revisión realizada por Das S et al., en ofrecidos diferentes métodos para la acerca de la efectividad de la técnica en 2010 sobre 28 estudios, revelan que hay
- 158. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 156 evidencias donde el assisted Hatching en 2 grupos: A 104 ciclos se les realizó CONCLUSIONES puede incrementar las tasas de éxito LAH (Grupo LAH) y a los 105 ciclos en mujeres con fallo de implantación y restantes no se les realizó LAH (Grupo Según estos resultados, no encontramos probablemente en edad avanzada, pero No LAH). Dentro de estos dos grupos se diferencias estadísticamente significativas se debe de estudiar más las tasas de subdividieron en edades: aunque sí hay una tendencia en favor del embarazo múltiple. LAH en tasas de gestación/ implantación LAH 38 y 39 años, No LAH 38 y 39 años, en grupo global de LAH/No LAH p=0,46/ OBJETIVOS LAH ≥ 40 años y No LAH ≥ 40 años. p=0,31. En los resultados según edad, encontramos diferencias significativas en El objetivo de este estudio es valorar A cada uno de los embriones a transferir tasas de gestación/ implantación en los el efecto del LAH en función de los en D3 de desarrollo se le realizó un grupos de 38 y 39 años con LAH y sin LAH. resultados en tasa de gestación, afinamiento de la zona pelúcida usando implantación y aborto en 2 grupos de el sistema octax laser shot cuando les Este estudio revela la efectividad de la edades en ciclos de FIV/ICSI. correspondía el assisted Hatching. técnica LAH en mujeres pertenecientes a grupos de edades entre 38 y 40 años con MATERIALES Y MÉTODOS Los grupos fueron homogéneos en buenos resultados en tasas de gestación e cuanto a IMC, edad, calidad embrionaria implantación. Estudio prospectivo y randomizado, y número de embriones transferidos/ realizado en el IVI-Murcia, entre el ciclo. A partir de 40 años, no encontramos 1 de Marzo de 2006 y el 31 de Dic de efecto beneficioso de LAH aislado (sin 2010. Se estudiaron 209 ciclos FIV/ICSI El análisis estadístico se realizó con el DGP) y puede ser debido a la presencia de realizados en mujeres ≥ 38 años, que test de Fisher con valor significativo anomalías cromosómicas en los embriones de forma aleatoria fueron distribuidos cuando p< 0,05. de este grupo de pacientes. Tasa de Gestación Tasa Implantación Tasa Aborto LAH ≥ 38 años 38% 24,4% 22% No LAH ≥ 38 años 29,2 % 19,6% 22% Resultados globales de LAH y No LAH en mujeres ≥ 38 años Tasa de Gestación Tasa Implantación Tasa Aborto LAH 38 y 39 años 45,0% a 35,0 % b 21,0% No LAH 38 y 39 años 27,6% a 20,0 % b 19,0% LAH ≥ 40 años 19,0% 12,5% 37,5% NO LAH ≥ 40 años 34,5% 22,2% 30,0% a p= 0,0486 b p= 0,0173 Resultados por grupos de pacientes según edad y LAH / No LAH 056: SElEccIÓN ESPErMÁtIcA MEDIANtE El USO DE lOS MEDIOS POlIVINIlPIrrOlIDONA (PVP) Y HIAlUrONAtO (SPErMSlOW). INFlUENcIA EN lA cAlIDAD EMBrIONArIA M. T. Cañete, S. García, L. Font, A. Sánchez-Oliver, E. Flores, R. García-Otero, C. Martínez. EMBRYOCENTER CIVTE Sevilla e-mail: mtcanete@civte.com INTRODUCCIÓN que lo rodea. Los expertos señalan OBJETIVO que los espermatozoides maduros que El ácido hialurónico se encuentra de han externalizado sus receptores son Por tanto nuestro objetivo sería forma natural en el ovocito, ya que capaces de unirse al ácido hialurónico. comparar el uso del acido hialurónico en está presente en la matriz extracelular relación al PVP (Polivinilpirrolidona) en
- 159. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 157 cuanto a tasa de fecundación y calidad RESULTADOS CONCLUSIONES embrionaria en día +3. Se microinyectaron 400 ovocitos: 200 La unión de los espermatozoides al MATERIAL Y METODOS con espermatozoides seleccionados en ácido hialurónico muestra una mejora SpermSlow y 200 seleccionados en PVP. en cuanto a la calidad de los embriones Se realizó un estudio prospectivo No encontramos diferencias significativas en día +3, por lo que su uso está comparativo entre los medios de en las tasas de fecundación. Sin embargo, recomendado al no ser una sustancia hialuronato (SpermSlow, Medicult) y según los criterios de calidad embrionaria que podría tener efecto dañino en los polivinilpirrolidona (PVP, SageMedia) de ASEBIR, observamos diferencias mismos y por ser componente de la en la selección espermática de pacientes estadísticamente significativas en los matriz extracelular del ovocito. sometidas a ICSI. embriones de calidad A en día +3 en los seleccionados con SpermSlow. 057: rESUltADOS PrOGrAMA DE DONAcIÓN DE EMBrIONES EN IVI MADrID S. Pareja; L. Herrero; MJ. Molina; M. Jiménez; J. Fernández; Y. Mínguez IVI Madrid e-mail: sandra.pareja@ivi.es INTRODUCCIÓN con los consentimientos a firmar. En fueron transferidas con embriones los casos de donación de embriones descongelados donados. La criopreservación embrionaria es a otros pacientes, las parejas gozan una técnica que se emplea de rutina en de tiempo suficiente que asegure una RESULTADOS los centros de Reproducción Asistida y correcta decisión, y además mantienen que permite a los pacientes conservar una entrevista con una enfermera De un total de 103 ciclos comenzados sus embriones sobrantes para futuros especializada, y en caso necesario de donación de embriones se realizaron intentos de embarazo. Existen parejas con su ginecólogo y/o psicólogo del 84 transferencias (81,4%). Se observó que por motivos muy diversos no centro. Los antecedentes genéticos se resultado positivo de β-hCG en 43 de estas llegan a utilizar nunca sus embriones valoran mediante test de enfermedades 84 transferencias (51,2%) y la tasa de congelados. La donación de esos hereditarias en la familia. embarazo clínico por embrión transferido embriones congelados a otras parejas fue de 44%. La tasa de implantación fue es una alternativa aceptada en muchos En los donantes de embriones se de 26% y el 8% terminó en aborto. países y que nuestra legislación también analiza el VIH, hepatitis B y C y no contempla (45/2003 y 14/2006), reciben compensación económica por CONCLUSIONES permitiendo así establecer un programa la donación. Se tiene en cuenta, salvo anónimo de donación de embriones que los pacientes no lo consideren La donación de embriones representa en beneficio de pacientes estériles. El imprescindible, la compatibilidad una herramienta muy útil para ayudar objetivo de este estudio retrospectivo sanguínea y fenotípica. A los receptores a algunas parejas estériles. Nuestros es relatar nuestra experiencia y los se les informa del grupo sanguíneo resultados son inferiores a los obtenidos resultados de nuestro programa de y de la edad de los donantes. Los con nuestro programa de donación de donación de embriones durante un embriones proceden de pacientes que ovocitos (61% de tasa de gestación y período de 5 años, desde el año 2005 en el momento de su tratamiento eran 40% de implantación). Sin embargo, hasta el año 2010. menores de 35 años. para la paciente el coste de este tipo de tratamiento es considerablemente MATERIAL Y MÉTODOS Entre 2005 y 2007, un total de 2223 inferior al del ciclo de donación de parejas fueran informadas sobre el ovocitos. Esa diferencia y la inmediatez En nuestro centro las pacientes firman posible destino de sus embriones. en el tratamiento se refleja en una mayor anualmente, y transcurridos dos Cuarenta y seis de estas parejas demanda en la donación de embriones años desde la criopreservación de los estuvieron de acuerdo en donar sus en los últimos tiempos. embriones, un consentimiento sobre embriones a otras pacientes estériles. el posible destino de sus embriones Los embriones donados habían sido El aumento de estos tratamientos congelados: 1-continuar almacenados congelados y descongelados por el nos permitirá en breve realizar un en el banco, 2-donación a investigación método de congelación lenta y el análisis más detallado del programa y o 3-donación a otras parejas infértiles. endometrio se preparó mediante confiamos que con la vitrificación de Las parejas son citadas en la clínica para protocolo estándar de TRA. Entre 2005 embriones, implantada en los últimos valoración de su situación concreta y 2009, se comenzaron 103 ciclos y años en nuestro laboratorio, aumentará y posible asesoramiento relacionado finalmente un total de 84 receptoras indudablemente la eficacia del programa.
- 160. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 158 058: lA FrAGMENtAcIÓN DE ADN EN SEMEN PUEDE DISMINUIrSE rEDUcIENDO lOS DIAS DE ABStINENcIA A UNO I. Pons, R. Cercas, C. Villas, C. Braña, S. Fernández-Shaw URH García del Real, Madrid e-mail: ipons@urh.es INTRODUCCIÓN varicococele, criptorquidia, y en el 77.8%(28/36) de los casos se oligoteratoastenozoospermia severa, consiguió disminuir la fragmentación Diferentes estudios sugieren que diabetes mellitus o quimioterapia. por debajo del 30%. En el primer intento disminuyendo el tiempo de abstinencia, lo consiguieron el 67.9%(19/28), en se puede mejorar la fragmentación de Desde enero 2009 a los pacientes el segundo el 25%(7/28) y en el tercer ADN de los espermatozoides. con una fragmentación >30% se les intento el 7.1%(2/28). recomienda obtener otra muestra tras Esta fragmentación se puede medir, un día de abstinencia. Se realizaron tres biopsias testiculares entre otras técnicas, mediante el SCD en pacientes a los que no se les consiguió (Sperm Chromatin Dispersion test) y se Las muestras que mejoran su disminuir la fragmentación en tres considera que una fragmentación igual fragmentación (<30%), se congelan intentos tras un día de abstinencia. En o superior al 30% puede ser perjudicial y mantienen congeladas hasta que se dos de ellos (66.6%), la fragmentación para conseguir un embarazo a término. utilizan para el ciclo de FIV/ICSI. resulto menor al 30%. OBJETIVO Si no se consigue disminuir la CONCLUSIONES fragmentación por debajo del umbral En este estudio prospectivo tratamos de normalidad después de tres La mayoría de los pacientes con la de comprobar que se puede disminuir intentos tras un día de abstinencia se fragmentación de ADN alterada pueden la fragmentación de ADN en semen le recomienda al varón realizar una conseguir disminuirla por debajo del reduciendo los días de abstinencia. biopsia testicular que se congelará y umbral del 30% reduciendo los días de mantendrá congelada para su posterior abstinencia a uno. MATERIALES Y MÉTODOS utilización en su ciclo de FIV/ICSI si no supera el límite del 30%. Las muestras con fragmentación normal Desde Mayo de 2008 en nuestra Unidad pueden congelarse para usarse en un se determina la fragmentación de ADN RESULTADOS ciclo de FIV/ICSI. en espermatozoides mediante el test SCD tras 3 a 7 días de abstinencia a De las 314 fragmentaciones diagnósticas Si no se consigue disminuir la todos los pacientes que cumplan una realizadas, 44 (14%) resultaron fragmentación por debajo del umbral de o más de estas características: BMI alteradas (≥30%). normalidad del 30%, se puede ofrecer la > 25, más de 45 años, consumo de realización de una biopsia testicular. tabaco >10 cigarrillos/día, consumo De éstas, 36 pacientes repitieron de alcohol > 6 unidades/semana, dos la fragmentación con una muestra o más abortos, fallo de implantación, obtenida tras un día de abstinencia 059: cAlIDAD EMBrIONArIA DE OOcItOS DONADOS DESVItrIFIcADOS VS FrEScOS E. Huguet, D. Agudo, M. Alonso, C. López, F. Bronet IVI-Madrid Aravaca e-mail: eva.huguet@ivi.es INTRODUCCIÓN embrionario similares en el caso de OBJETIVO oocitos desvitrificados y frescos. Para Desde la introducción de la técnica no introducir el factor de calidad El principal objetivo es mostrar de de vitrificación en los Laboratorios oocitaria, el estudio se ha realizado con manera fehaciente y estadística cómo de FIV como una técnica rutinaria se embriones del programa de donación es la calidad de aquellos embriones han realizado muchos estudios que de óvulos, no haciendo distinción en el procedentes de oocitos vitrificados han demostrado la preservación del diagnóstico masculino. (EPOV) y de los procedentes de oocitos potencial de fecundación y desarrollo frescos (EPOF), atendiendo a los
- 161. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 159 parámetros de morfología y cinética También se han analizado los resultados Calidad global embrionaria: hay más embrionaria utilizados en nuestro globales: Tasa de Gestación Clínica embriones de calidad buena y regular laboratorio. (TGC), Tasa de Aborto Clínico, Tasa en los EPOF tanto en D2 (54.3% y 65.8% de Implantación (TI), Tasa de RNV, y vs 18.8% y 13.9% respectivamente; MATERIAL Y MÉTODOS en particular los embriones que han p<0.0001) como en D3 (22.9% y 35.9% generado un RNV. vs 9.6% y 11.1% respectivamente; Es un estudio retrospectivo que abarca p<0.0001). en 43 meses 467 ciclos con 2940 Se ha utilizado el programa G-STAT 2.0 embriones provenientes de 5963 MetII para el análisis estadístico de los datos. Los EPOV tienen mejores tasas de RNV/ en el grupo EPOV y 2215 ciclos con ET (30.3% vs 25.1%; p<0.005) en 13960 embriones provenientes de RESULTADOS cualquier día de transferencia (2, 3, 5, 20195 MetII del grupo EPOF; todos ellos 6) y mayor T.I. cuando la transferencia es con transferencia. En la donación de D2: ambos grupos comparables en en D5/6 (52.5% vs 31.6%; p<0.05). Sin óvulos se realiza siempre ICSI. cuanto al nº de cél. y fragmentación. embargo, los embriones transferidos Los EPOF tienen más BMN (9.1% vs que generan RNVs son más compactados Los parámetros que se han medido son: 3.2%; p<0.0001) y mejor simetría (42% en los EPOV (72% vs 64%; p=0.0054) nº de células, % de fragmentación, vs 39.4%; p=0.0134). y con menor tasa de BMN en los EPOF presencia de blastómeras multinucleadas (98% vs 94%; p<0.0001). (BMN), simetría, compactación (D3) y D3: más embriones rápidos (>10 cél.) calidad global del embrión, valorada en EPOF (9.1% vs 6.3%; p<0.0001) y CONCLUSIONES esta última como Excelente (4 células más lentos (<7 cél.) en EPOV (35.9% para D2, 8 cél. para D3, sin fragmentos, vs 30.7%; p<0.0001). En D5 hay más Aunque hay diferencias observando simetría perfecta, sin BMN), Buena (4 blastocistos en EPOF. En cuanto a aisladamente los parámetros cél. para D2, 8 cél. para D3, ≤10% de la fragmentación los EPOV tienen el morfológicos, se puede concluir que los fragmentos, simetría casi perfecta, sin doble de tasa de fragmentación dentro EPOV son más lentos en su desarrollo y BMN), Regular (4 cél. para D2, 7-8 cél. del rango 21-40% (4.9% vs 2.9%; producen menos embriones de calidad para D3, <21% de fragmentos, simetría p<0.0001). La compactación es mayor Buena/Regular que los EPOF. con más 20% diferencia, sin BMN), Mala en los EPOV (38.5% vs 34.2%; p<0.0001) (4 cél. para D2, 7-8 cél. para D3, >20% y la simetría es comparable en ambos. de fragmentos, mala simetría, con o sin En cuanto a BMN la tasa es mayor en BMN). EPOV (13.3% vs 3.9%; p<0.0001). 060: INFlUENcIA DE lA tErAPIA HOrMONAl EN PAcIENtES cON OlIGOZOOSPErMIA IDIOPÁtIcA MODErADA D. Pabón , M. Martínez , N. Torres, L. Rodríguez, S. Pérez, I. Fernández, E. Muñoz, J. Remohí. IVI-VIGO e-mail: dina.pabon@ivi.es INTRODUCCIÓN prolongado en infertilidad idiopática. MATERIALES Y MÉTODOS En algunos casos se ha logrado activar Las hormonas FSH (hormona folículo la espermatogénesis en hombres que Estudio prospectivo aleatorio de estimulante) y HCG (hormona coriónica padecen infertilidad idiopática. Sin 30 pacientes diagnosticados con humana) juegan un papel crucial embrago, otros estudios que han oligozoospermia idiopática moderada, en la inducción y mantenimiento de usado estas drogas como tratamiento que con sus parejas se someterían a ICSI. la espermatogénesis, debido a este en infertilidad idiopática, no destacan La evaluación del varón incluye: examen papel fisiológico se han estudiado ninguna ventaja (Matorras et al., 1997; urológico, exploración testicular física y tratamientos hormonales que pudieran Kamischke et al., 1998). ecográfica normal, niveles séricos de FSH servir como terapia en pacientes con < 10 UI/mL, cariotipo normal, ausencia oligozoospermia idiopática. Algunos OBJETIVO de marcadores de infección seminal, sin grupos como (Baccetti et al 2004; leucospermia. 15 pacientes recibieron Foresta et al 2005 & 2007) que han usado Evaluar en pacientes oligozoospérmicos tratamiento hormonal durante 6 la FSH, y la HCG como tratamiento, con niveles normales o bajos de FSH, semanas, alternando diariamente 75 han reportado mejoras en la calidad el efecto de la terapia con FSH y HCG, UI/d SC de FSH (Gonal F® - Merck-Serono, seminal y/o en las tasas de gestación. en relación a calidad seminal, tasa España) 3 veces a la semana, con 2 dosis Dado estos efectos obtenidos, se ha de gestación y resultados de Recién de 2500 UI/d de hCG (hCG-Lepori®, sugerido el uso de FSH y HCG como Nacidos Vivos (RNV). Pharma-Lepori, España). Se incluyen 15 tratamiento sustitutivo, sostenido y pacientes controles que no recibieron
- 162. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 160 ningún tratamiento. Los criterios para que han recibido tratamiento, para los pacientes tratados también evaluar la respuesta al tratamiento son incrementaron significativamente la se ve incrementada en comparación calidad seminal, tasa de gestación y RNV. calidad seminal, en relación al total de con los pacientes no tratados. No se espermatozoides móviles progresivos. han encontrado diferencias en parto RESULTADOS La tasa de gestación para estos prematuro, ni periodo gestacional pacientes es del 60% mientras que la medio, ni entre las tallas y pesos de los En la evaluación de nuestros tasa de gestación para los pacientes no RNV, entre los grupos. resultados, el 100% de los pacientes tratados es del 26.6%. La tasa de RNV Valoración de calidad espermática Tasa de gestación 45 Total de espermatozoides 40 pre 35 100 móviles 1x106 post 30 Porcentaje 80 25 20 60 15 40 10 20 5 0 0 pacientes controles pacientes tratados controles pacientes Etiología controles Etiología pacientes Fallo Oculto 7% 13% Normal 6% 7% 7% 6% 13% 19% 31% Inmunológico 27% PCO Tubárico 27% 6% Endometriosis 25% 6% Edada CONCLUSIONES tratamientos suministrados de FSH donde se incluyan diferentes criterios + HCG, incrementan tanto la calidad de selección de los sujetos sería Nuestros resultados preliminares indican seminal como la tasa de gestación y de necesario para corroborar los hallazgos. cómo en pacientes diagnosticados RNV, en tratamientos de ICSI, pero un con oligozoospermia idiopática, los estudio con un número mayor de casos 061: VAlOr DIAGNÓStIcO DEl tESt HBA EN PAcIENtES QUE SE SOMEtEN A tÉcNIcAS DE rEPrODUccIÓN ASIStIDA G. López, R. Lafuente, I. Linares, A. Brassesco, M. Brassesco CIRH e-mail: glopez@cirh.es INTRODUCCIÓN principal mucopolisacárido de la matriz (cumulus oophorus y zona pelúcida), del cumulus oophorus y un componente para ello, el espermatozoide maduro El test HBA (Hyaluronan Binding assay) del líquido folicular humano. produce como mínimo dos proteínas es un ensayo cualitativo de la madurez específicas de unión al hialuronato, de los espermatozoides. Sólo los El proceso de fecundación requiere de las cuales una está implicada en la espermatozoides móviles y maduros son que el espermatozoide reconozca y penetración del espermatozoide en capaces de unirse al ácido hialurónico, el penetre las capas que rodean al ovocito la matriz del cúmulo. Además de la
- 163. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 161 madurez espermática, la integridad del Cada pareja entrega una muestra de con espermatozoides de grados I y II. material genético del espermatozoide semen obtenida mediante masturbación Dichos espermatozoides presentan un también parece estar relacionada con tras mantener de 2 a 5 días de máximo de 2 vacuolas pequeñas y son su capacidad de unión al hialuronato. abstinencia. Cada muestra fue evaluada los más indicados para la microinyección mediante seminograma completo, de los ovocitos. OBJETIVOS valorando concentración, movilidad y morfología. Se realizó también el Por último, se observa también una Se pretende determinar la eficacia test HBA y el Test de magnificación que correlación positiva entre el porcentaje del test HBA como herramienta permite clasificar a los espermatozoides de espermatozoides maduros y el para pronosticar el potencial de en cuatro categorías en función del porcentaje de fecundación ovocitaria. fertilidad masculina en pacientes que número y tamaño de vacuolas (Grado se someterán a un tratamiento de I: Forma normal sin vacuolas; Grado CONCLUSIONES reproducción asistida. II: Forma normal y un máximo de 2 vacuolas pequeñas; Grado III: Forma A pesar del reducido número de casos MATERIAL Y MÉTODOS normal y al menos una vacuola grande; y de tratarse de un estudio preliminar, Grado IV: Forma anormal y/o otras gracias a la tendencia observada entre En estudio prospectivo se seleccionan anormalidades). Tras la realización del las relaciones estudiadas, se observa parejas formadas por mujeres sanas ciclo de FIV se valora el porcentaje de una relación directa entre la madurez menores de 37 años y hombres sanos fecundación, la calidad embrionaria y el de los espermatozoides y los diferentes menores de 45 años con indicación de resultado del ciclo. parámetros del seminograma. Fecundación in vitro. El resultado del test HBA, obtenido Si tenemos en cuenta también la Se excluyen pacientes con patologías como el porcentaje de espermatozoides relación que se observa entre el asociadas que pueden interferir maduros, se compara con las diferentes grado de vacuolización del núcleo con el tratamiento de estimulación variables estudiadas. del espermatozoide y el porcentaje ovárica como: endometriosis, baja de fecundación con la madurez respuesta al tratamiento, ovario RESULTADOS espermática, podemos deducir que poliquístico, hombre con varicocele el test HBA para evaluar el potencial o cuyo seminograma muestra una Al comparar el resultado del test de fertilidad masculino puede ser una concentración espermática inferior a 10 HBA con los parámetros básicos buena herramienta diagnóstica. M/mL y/o que está tomando medicación del seminograma, se observa una que pueda afectar la producción o la correlación positiva entre ellos, de Seguimos ampliando este estudio calidad espermática. tendencia más marcada cuando se trata para obtener un grupo de pacientes de la movilidad. significativo que permita valorar En el periodo comprendido entre enero también, la calidad embrionaria y el y mayo del 2011 se incluyen un total de Lo mismo sucede con el grado de resultado de embarazo en los diferentes 25 parejas en el estudio preliminar. vacuolización espermática. Una mayor grupos de pacientes. madurez espermática se correlaciona 062: EStUDIO DE rEclUtAMIENtO NAtUrAl VS EStIMUlAcIÓN cONVENcIONAl EN INSEMINAcIONES INtrAUtErINAS (IIU) D. Pabón, A. Carballo, M. Martínez, N. Torres, L. Rodríguez, B. Martínez, JM. Gacias, I. Fernández, S. Portela, E. Muñoz, J. Remohí. IVI-VIGO e-mail: dina.pabon@ivi.es INTRODUCCIÓN asocian a una mayor tasa de implantación OBJETIVO y de gestación, comparándolos con la En los últimos años surge un concepto estimulación convencional (EC). Por Nuestro propósito es evaluar los de estimulación suave relacionado otra parte se reduce el posible daño en resultados de IIU realizadas con un con ciclos de inicio tardío en la la receptividad endometrial producto protocolo nuevo de RN con respecto a estimulación sobre el 4º-5º día del ciclo, de la estimulación con menores dosis de los resultados obtenidos usando EC. aprovechando el reclutamiento natural medicación, además de presentar una (RN). Los estudios de RN realizados, en evidente reducción de los costes del MATERIALES Y MÉTODOS tratamientos de FIV, han indicado que ciclo. Los estudios de RN se han llevado éstos no solo mejoran la calidad de los a cabo en tratamientos de FIV, pero no Estudio Aleatorio prospectivo en ovocitos recuperados, sino también se se encuentran en la literatura para IIU. el que se incluyen tratamientos de
- 164. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 162 IIU realizadas en IVI-VIGO desde ovulación. En el protocolo de EC la 17mm también fue similar para los 2 01/01/2009 hasta 01/03/2011. Se estimulación se inició el 2do-3er día del grupos, (1,2± 0,5 vs 1± 0.) (p:0,49) la incluyen en el estudio pacientes ciclo con75 UI/d de hMG, por 5 días y tasa de gestación para el protocolo de RN menores de 41 años, con ciclos regulares periódicamente se controla la respuesta fue del 10,3% y para el EC fue del 21,9%. espontáneos, cavidad uterina normal ovárica hasta alcanzar 1 o 2 folículos con evidencia tubárica bilateral, que no dominantes, momento en el que se Hasta el momento no se han encontraron hayan tenido más de 3 ciclos previos de desencadena la ovulación y 24h después diferencias entre la tasa de aborto, IIU y con un ciclo previo para garantizar se programa la IIU. embarazo ectópico, parto prematuro, ni el reposo ovárico. De las 43 pacientes, periodo gestacional medio. 23 recibieron aleatoriamente el RESULTADOS protocolo de RN y 20 el protocolo de EC. CONCLUSIÓN El protocolo de RN consistió en controlar Se incluyen 43 pacientes, 23 de las cuales el desarrollo folicular hasta encontrar un recibieron el protocolo de RN y 20 el Nuestros resultados muestran que no folículo dominante de diámetro medio protocolo de EC. Para los dos protocolos, hay perjuicios en usar el RN en las IIU. ≥11 mm, momento en el que se inició no se encontró diferencias en edad media Nuestro equipo ha descrito un nuevo la estimulación administrando 75 UI/d de las pacientes, ni en los niveles basales protocolo de estimulación suave usando de hMG/día ultrapurificada (Menopur de FSH, Estradiol y progesterona, ni en el como base el RN que permite un ahorro ® FERRING) hasta conseguir 1 o 2 número de espermatozoides depositados económico a los pacientes. Esperamos folículos ≥17mm Ø, momento en el que en la inseminación tras la capacitación conseguir un estudio con mayor número se determinan los niveles de estradiol espermática. El número promedio de de casos para confirmar los beneficios y progesterona y se desencadena la folículos de diámetro mayor o igual a del RN en IIU. 063: INFlUENcIA DE lA DOSIS ADMINIStrADA DE FSH EN lA EStIMUlAcIÓN DE DONANtES DE OVOcItOS, cOMBINADA cON lA EDAD DE lA DONANtE D. Agudo.; M. Alonso.; C. López.; E. Huguet. ; M. Testillano.; D. Becerra.; M. Patiño.; F. Bronet IVI MADRID e-mail: david.agudo@ivi.es INTRODUCCIÓN OBJETIVOS edad (140 donantes del grupo 1 y 130 donantes del grupo 2). Los criterios de selección de donantes Determinar si las dosis de FSH empleadas de ovocitos pueden ser muy variados, en la estimulación ovárica, influyen Los test, t de student y Chi2 fueron atendiendo al IMC, entrevista en los resultados de nuestro programa empleados para comparar porcentajes, psicológica, serologías, cariotipo, de donación de ovocitos, dilucidando considerándose estadísticamente embarazos previos, hábitos tóxicos, si la edad de las donantes, combinada significativos valores medios de p<0.05. características físicas. Una de las con las dosis empleadas, presentan un características más valoradas es la edad efecto sinérgico. RESULTADOS de la donante, por lo que en España, la edad límite para aceptar a una donante MATERIAL Y MÉTODOS La media de ovocitos obtenidos en el de ovocitos es de 35 años. Por otra grupo 1, fue de 19.5 ovocitos, frente a parte, las dosis de FSH empleadas para Estudio retrospectivo de 486 ciclos de 16.5 del grupo 2. la estimulación ovárica, en tratamientos donación de ovocitos procedentes de de reproducción asistida, está ligada 291 donantes con edades comprendidas Al comparar el porcentaje de ciclos de de manera directamente proporcional entre 18-21 años (grupo 1) y 195 donantes del grupo 1 que necesitan a la edad de la paciente o donante a donantes entre 30-34 años (grupo ≤150 FSH (51.9%) frente a las del grupo estimular y que se relaciona a su vez 2). Las donantes se estimularon con 2 (33.3%), observamos diferencias con la reserva folicular, por lo que un dosis de FSH variables en función del significativas (p= 0.01). ovario que necesite altas dosis de FSH, número de antrales, ≤150 UI con más puede indicar una peor respuesta, que de 14 folículos antrales (151 donantes No se observan diferencias significativas suele acompañarse de una peor calidad del grupo 1, y 65 donantes del grupo al comparar tasas de gestación ovocitaria y embrionaria, lo cual se 2), y >150 UI con 14 folículos antrales bioquímica (TGB), tasa de gestación reflejará en los resultados. o menos, independientemente de la clínica (TGC) y tasas de implantación
- 165. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 163 (TI) de las donantes del grupo 1 (60.3%, a las estimuladas con >150 FSH (TGB: No existen diferencias significativas en 54.2% y 37.2%), frente a las del grupo 2 55.5, TGC: 49.6% y TI: 33.9%) si se los resultados atendiendo sólo a la edad (60.9%, 54.7% y 35.7%). observan diferencias estadísticamente de las donantes. significativas en términos de TGB: Al comparar los resultados de las p=0.016, y TGC: p=0.045, y una Cuando desglosamos no solo por edad, donantes del grupo 1 estimuladas con tendencia hacia la significación en el sino por dosis de FSH administrada, ≤150 FSH (TGB: 64.3%, TGC: 56.6% y caso de la TI: p=0.089. observamos como las donantes TI: 39%), frente a las estimuladas con mayores de 29 años, se comportan de >150 FSH (TGB: 56.4%, TGC: 51.9% y CONCLUSIONES manera diferente en función de la dosis TI: 35.4%) no se observan diferencias de medicación, obteniéndose mejores significativas. La edad de las donantes se correlaciona resultados si no se tienen que emplear directamente con las dosis necesarias altas dosis de FSH para su estimulación Sin embargo cuando comparamos los de FSH para conseguir un número de ovárica. resultados de las donantes del grupo ovocitos similares en los grupos de edad 2 estimuladas con ≤150 FSH (TGB: estudiados. 74.1%, TGC: 65.5% y TI: 42.3%), frente 064: ANÁlISIS cOMPArAtIVO DEl ÉXItO EN rEPrODUccIÓN ASIStIDA DE MUEStrAS SEMINAlES cON ScD PAtOlÓGIcO Y NO PAtOlÓGIcO I. Moragues, B. Ramos, A. Montoya, N. Wegmann, J. Aizpúrua IVF Spain (Alicante) e-mail: i.moragues@ivf-spain.es INTRODUCCIÓN fecundación o implantación después MATERIAL Y MÉTODOS de FIV/ICSI, y pueden estar asociadas Diversos autores han correlacionado a mala calidad embrionaria, bloqueo Realizamos un análisis prospectivo de los valores de fragmentación del embrionario o aborto. Aunque en 200 ciclos de ovodonación con el fin de ADN espermático con los resultados estos procedimientos se seleccionan comparar los resultados en TRA de dos de los Tratamientos de Reproducción los espermatozoides de mejor grupos de varones. Varones con DFI Asistida (TRA) para establecer un motilidad y morfología, debido a la patológico ≥30% y un segundo grupo punto de corte a partir del cual limitación de la técnica usada, siempre con DFI no patológico ≤30%. Realizamos se pueda predecir el resultado hay un porcentaje de los mismos que la medida del DFI (DNa fragmentation de las mismas, con resultados contienen varios grados de daño en el index) en semen en fresco. Utilizamos aceptablemente congruentes. Se ADN y que pueden alcanzar el ovocito el Kit comercial de HalospermR ha demostrado que los varones con un mínimo o ningún esfuerzo (FIV y correlacionamos los índices de infértiles tienen una mayor fracción o ICSI). fragmentación con los parámetros de espermatozoides con roturas en seminales y con los resultados el ADN, y que este hecho puede tener OBJETIVOS obtenidos tras llevar a cabo la TRA: tasa un impacto negativo en los resultados de fecundación, calidad y desarrollo de las técnicas de reproducción El objetivo del estudio es concluir si embrionario, tasa de formación de asistida. Las muestras de semen que dicho parámetro de fragmentación blastocisto, tasa de embarazo clínico. muestran altos niveles de daño en el se puede utilizar de forma rutinaria Analizamos los datos obtenidos de ADN están con frecuencia asociadas como un valor predictivo de éxito en ambos grupos mediante la Chi-cuadrado a una disminución de las tasas de las TRA. con la corrección de Yates. RESULTADOS SCD (DFI) Tasa de fecundación Tasa de Blastocisto Número ET Embarazo No patológico 15,67% 84,11% 61,95% 1,38095238 80,00% Patológico 31,00% 68,20% 23,48% 2 50% p 0.0117 0.0130 0.0001 0.0001
- 166. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 164 200,00% No patológico Patológico 150,00% 100,00% 50,00% 0,00% SCD(DFI) Tasa de Tasa de Número ET Embarazo fecundación Blastocito CONCLUSIONES entre los dos grupos estudiados, con altamente significativas. Estos datos SCD patológico con el no patológico. nos llevan a pensar que el resultado Los resultados que hemos obtenido Las tasas de fecundación, de blastocisto del SCD podría considerarse como valor muestran diferencias significativas y de embarazo presentan diferencias predictivo del éxito de las TRA. 065: cONtrOl DE cAlIDAD EXtErNO MUltIcÉNtrIcO PArA lA cUANtIFIcAcIÓN DE VIH EN SEMEN lAVADO I. Molina, MC. Gonzalvo, A. Rosales, AP. Ortiz, B. González, B. Romero, L. Martinez. Unidad de reproducción, Hospital Universitario Virgen de las Nieves e-mail: imoglez@gmail.com INTRODUCCIÓN de Reproducción Asistida en VIH en se encontraran falsos positivos, pero se Europa), se analizaron dos grupos observaran 25 falsos negativos en total Las parejas serodiscordantes para el de muestras, 6 ejemplares de plasma (16 %) en ambos grupos de muestras VIH-1, en las que el hombre es positivo seminal y 5 ejemplares de células (20% en plasma seminal y 11% en recurren, en determinadas circunstancias, seminales. El rango de concentraciones células seminales). a las técnicas de reproducción asistida de VIH incluía 1000, 500, 500, 200, para conseguir descendencia evitando la 100 y 0 copias/ml en plasma seminal y En el análisis cuantitativo se comprobó transmisión horizontal a la mujer. Para para células seminales 1000, 500, 200, que la reproducibilidad entre- poder utilizar el semen de estos hombres, 100 y 0 copias/ 106 células. Se enviaron laboratorios es correcta con una en determinados casos, es necesario que muestras a 18 laboratorios, 14 de los desviación estándar (DE) por debajo sea procesado para eliminar la presencia cuales remitieron sus resultados. de 0.5 Log y la reproducibilidad intra- de VIH-1 y analizado posteriormente para laboratorio es correcta para la mayoría confirmar la ausencia de partículas virales. RESULTADOS de los laboratorios (DE por debajo de 0.5 Log). OBJETIVO En el análisis cualitativo de plasma seminal el 100%, 79%, 79%, 71%, 50% CONCLUSIÓN Valorar la calidad de diferentes y 100% de los laboratorios hicieron una laboratorios que realizan la detección correcta, respectivamente La existencia de falsos negativos tanto determinación de VIH en semen. para las concentraciones anteriormente en las muestras de plasma seminal mencionadas. Respecto a la muestra de como en las de células seminales, pone METODOLOGÍA células seminales el 93%, 86%, 71%, de manifiesto la necesidad de realizar 93% y 100% de los laboratorios hicieron un control de calidad externo en los En este control de calidad, organizado una detección correcta, respectivamente laboratorios que determinan cualitativa por CREAThE (Red de Centros de Técnicas para las concentraciones descritas. No y cuantitativamente VIH en semen.
- 167. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 165 066: rEDUccIÓN DE rIESGO DE trANSMISIÓN DE HEPAtItIS B, HEPAtItIS c Y/O VIH MEDIANtE lAS tÉcNIcAS DE rEPrODUccIÓN ASIStIDA I. Molina, MC. Gonzalvo, JA. Castilla, B. González, AP. Ortiz, J. Mozas, J. Fontes, MA. Calderón. Unidad de reproducción, Hospital Universitario Virgen de las Nieves e-mail: imoglez@gmail.com INTRODUCCIÓN 2005 y diciembre de 2009. El semen de embarazo múltiple fue del 21.4%. lavado fue testado para descartar la Las tasas no muestran diferencias Las técnicas de reproducción asistida presencia de partículas virales. Las significativas en fecundación y tasas de (TRA) con semen lavado pueden lograr mujeres serodiscordantes no infectadas embarazo en función de la infección. un embarazo con un riesgo mínimo de fueron evaluadas antes y después de Como resultado del tratamiento se transmisión vertical y horizontal del cada tratamiento para comprobar la obtuvieron 34 recién nacidos (22 de virus de inmunodeficiencia humana ausencia de anticuerpos contra VIH, embarazo único y 6 gemelos). De estos (VIH), hepatitis C (VHC) y la hepatitis VHC y/o VHB. recién nacidos 8 fueron prematuros B (VHB) en parejas serodiscordantes. (<37 semanas), uno prematuro extremo Además, las TRA pueden ofrecer RESULTADOS (<32 semanas), 6 bebés nacieron con también una reducción del riesgo de bajo peso (<2500 gramos) y uno con sobreinfección con nuevas cepas en Se realizaron un total de 173 ciclos en 93 muy bajo peso (<1500 gramos). En el parejas seroconcordantes. parejas. Fueron tratadas 33 parejas, en seguimiento no se detectó ninguna las que el hombre era seropositivo para seroconversión en los 34 recién nacidos OBJETIVOS VIH (23 de estos hombres eran también (analizados al nacimiento y a los 3 positivos para VHC, un hombre era meses de edad), ni en las 93 mujeres Evaluar la utilización de las TRA como positivo para VHB y otro positivo para tratadas. opción segura para lograr un embarazo. VHC y VHB), 23 parejas con hombres seropositivos para VHC (uno era CONCLUSIONES MATERIAL Y MÉTODOS también positivo para VHB) y 37 parejas con hombres seropositivos para VHB. El lavado de semen e ICSI ha demostrado Este estudio retrospectivo incluye a En total se obtuvieron 38 embarazos ser una opción segura y eficaz para la 93 hombres seropositivos para VIH, clínicos (22% por ciclo y un 40,9% reducción del riesgo de transmisión VHC o VHB que fueron sometidos a por pareja) en 173 ciclos iniciados, y en parejas serodiscordantes o de tratamientos de reproducción asistida se produjeron 28 partos (16,2% por superinfección en parejas concordantes en nuestro centro entre noviembre de ciclo y un 30,1% por pareja), la tasa que deseen tener un hijo. 067: ¿AFEctA El IMc DE lA DONANtE O DE lA rEcEPtOrA A lOS rESUltADOS FIV/IcSI EN UN PrOGrAMA DE DONAcIÓN DE OVOcItOS? A. Sánchez, D. Gumbao, J. Marcos, D. López, J. Landeras, B. Amorocho Laboratorio FIV. IVI Murcia. Murcia e-mail: leonana@hotmail.com INTRODUCCIÓN por Bellver et al., en 2007 revelan que el ICSI en un programa de donación de IMC interfiere en la receptividad uterina. ovocitos. Diferentes estudios han analizado el Sin embargo, no existe en la actualidad Índice de masa corporal (IMC) de las bibliografía de la influencia del IMC de METODOLOGÍA receptoras de óvulos en un programa las donantes en las tasas de gestación e de Ovodonación. Styne–Gross A et al., implantación de sus receptoras. Estudio retrospectivo realizado en el en 2005 refiere que no existe ningún IVI-Murcia, del 1 de Enero de 2007 al 31 efecto negativo del elevado IMC de OBJETIVOS de Diciembre de 2008. las receptoras en la receptividad endometrial y éxito reproductivo, Valorar si el IMC de la donante y El IMC fue calculado mediante la mientras que los estudios publicados receptora, afecta a los resultados FIV/ fórmula: peso (Kg)/altura (m2).
- 168. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 166 Los ciclos fueron divididos en grupos Los datos referentes a las receptoras de El análisis estadístico se realizó con el según su IMC: Menor de 20, entre 20- óvulos fueron los siguientes: test de Fisher con valor significativo 24,9, entre 25-29,9 y mayor o igual de Receptoras con IMC menor de 20 con cuando p< 0,05. 30. Se excluyeron ciclos de DGP y de 22 ciclos, 196 ciclos con IMC entre 20- mujeres mayores de 45 años. 24,9, 74 ciclos con IMC entre 25-29,9 y RESULTADOS 36 ciclos correspondientes al grupo de Se estudiaron 333 ciclos de donantes: 64 IMC ≥ 30. Un total de 3861 ovocitos fueron corresponden a aspiraciones foliculares inseminados. de donantes con IMC < 20.Otros 186 Se compararon tasas de gestación e ciclos correspondieron a donantes implantación entre los diferentes grupos. Los resultados son los que se recogen en con IMC entre 20-24,9. Otros 549 a las siguientes tablas. donantes con IMC entre 25-29,9. Las Los grupos fueron homogéneos en 24 restantes aspiraciones pertenecen cuanto a edad y calidad embrionaria de a IMC ≥ 30. las receptoras. Tabla I: Tasas de fecundación, gestación, implantación y aborto de las receptoras cuyos ovocitos provienen de donantes de los 4 grupos diferenciados de IMC, independientemente del IMC de la receptora. Tabla II: Tasas de fecundación, gestación, implantación y aborto de los 4 grupos diferenciados de receptoras independientemente del IMC de la donante de la que provienen sus ovocitos. CONCLUSIONES tendencia a una óptima receptividad pronóstico reproductivo en un programa uterina, al contrario que en el grupo de de donación de ovocitos. Refiriéndose a las donantes, tanto IMC≥30 donde se observa una tendencia en la tasa de gestación como en la de a una baja receptividad uterina. implantación no se observan diferencias estadísticamente significativas, Consideramos que debemos continuar excepto en el grupo de IMC<20 donde se con el estudio a través del aumento observa una menor tasa de gestación. del tamaño muestral para llegar a datos más concluyentes en cuanto a Respecto al grupo de las receptoras con la selección de las donantes de óvulos un IMC entre 20-24,9, observamos una y determinar que grupo es de mejor
- 169. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 167 068: PrOGrESIÓN DE lOS rESUltADOS DE crIOPrESErVAcIÓN EMBrIONArIA DESPUÉS DE lA INtrODUccIÓN DE lA VItrIFIcAcIÓN EN UN PrOGrAMA DE FIV A. García1, O. López1, O. Martínez-Pasarell1, A. Mata1, S. Peon2 L. Bassas1. 1 Laboratorio de Seminología y Embriología, Fundació Puigvert, 2Servicio de Ginecología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona e-mail: agarcia@fundacio-puigvert.es INTRODUCCIÓN se realizó con el Thaw-kit (Vitrolife, Cryotop utilizados para la vitrificación EMB), y la desvitrificación (187 ciclos, de embriones mediante las tasas de El éxito de las técnicas de reproducción 460 embriones) repartidos entre el gestación por transferencia (26% vs se ve facilitada por la criopreservación dispositivo de Cryoleaf (105 ciclos, 25%), tasas de implantación (19% vs de embriones. Durante los últimos n=253 embriones) y Cryotop (82 ciclos, 15%) y tasas de aborto (13% vs 28%). años, la vitrificación ha sido reconocida 207 embriones), se realizó con Medicult como una alternativa ventajosa a Vitrification Warming (Origio), el día CONCLUSIONES la tradicional congelación lenta en antes de la transferencia para evaluar embriología humana. Sin embargo, el potencial de crecimiento de los La progresión de los resultados clínicos hay pocos datos disponibles publicados embriones. de la vitrificación embrionaria puede sobre la eficacia comparativa de las documentarse mediante comparación variantes técnicas de vitrificación. continua con el método clásico de RESULTADOS congelación lenta. OBJETIVO La tasa de supervivencia fue del 85% Los dos sistemas de pajuelas utilizadas El objetivo del presente estudio es con CL y 87% con VT. El porcentaje de para la vitrificación son equivalentes evaluar nuestros resultados de la embriones en crecimiento fue del 59% en eficacia, aunque se observa mayor técnica de vitrificación (VT), como (CL) y 65 % (VT). Una media de 1,8 y número de abortos con Cryotop. alternativa a la congelación lenta (CL) 1,6 embriones fueron transferidos, para la criopreservación de embriones respectivamente, en el grupo de producidos en una clínica del programa CL y VT. Las tasas de embarazo por de FIV y comparar la eficacia de dos transferencia fueron del 19% (CL) diferentes recipientes utilizados para la en comparación con el 26% (VT). Las vitrificación de embriones. tasas de implantación fueron del 12% (CL) y 17 % (VT). Todos los parámetros MATERIAL Y MÉTODOS de eficacia clínica de VT mejoraron progresivamente para cada año natural, Se aplicó un diseño prospectivo mientras que se mantuvieron estables comparativo con asignación pseudo- con CL. Los embarazos múltiples en aleatoria de los ciclos de FIV a los el grupo de CL fueron 6,2 %, y 16,7 grupos de CL o VT. (día de la semana), % en el grupo VT. Cuatro embarazos desde 2008 hasta el final de 2010. (25%) de CL y 8 embarazos (19%) de Sólo los embriones con buena calidad VT terminaron en abortos. Con la CL morfológica (categorías A y B) fueron se observaron tasas de embarazo por criopreservados en la etapa de división ciclo en D2 del 25%, mayores que en (D2 o D3). Para CL (132 ciclos, 546 D3 (10%), mientras que con VT no embriones) se utilizó el sistema Freeze- hubo diferencias entre D2 (26%) y D3 kit (Vitrolife, EMB), pajuelas CBS, y (20%). Las tasas de gestación en ciclos un congelador programable (Planer en los que se descongelaron 1, 2 o ≥3 1.7, Telstar). La VT (338 ciclos, 1022 embriones previamente congelados con embriones) se realizó con Medicult CL fueron, respectivamente, 0%, 14%, Vitrification Cooling (Origio), utilizando y 22%, mientras que en ciclos de VT pajuelas Cryoleaf (McGill, Medicult) fueron 11%, 28% y 25% al descongelar hasta Mayo/2009, y posteriormente 1, 2 o ≥3 embriones. se pasó a usar pajuelas Cryotop (Kitazato, Durviz). La descongelación Se comparó la eficacia de los dos lenta (88 ciclos, n= 270 embriones) tipos de pajuelas abiertas Cryoleaf y
- 170. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 168 069: ANÁlISIS cOMPArAtIVO DE lAS tASAS DE IMPlANtAcIÓN DE EMBrIONES MONONUclEADOS Y EMBrIONES MUltINUclEADOS EN D+2 M .Cuadros, L. Andrés Criado, M. Sánchez de Burgos, M. Morales Morales, E. Ricciarelli, J.L. Gómez Palomares, J. Martínez, J. Cuadros Clínica de Medicina de la Reproducción y Ginecología FIVMadrid e-mail: jcuadros@fivmadrid.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS formación de un saco gestacional (tasa de implantación = 5,3 %). En el grupo La valoración morfológica de los Se analizaron retrospectivamente de embriones mononucleados, 26 de los embriones tiene dos variables comunes 245 embriones transferidos en ciclos 85 embriones de implantación conocida en todos los centros de reproducción de FIV-ICSI en D+2. De éstos, 74 dieron lugar a la formación de un saco asistida: el número de células y el grado embriones presentaban al menos una gestacional (tasa de implantación de fragmentación. Además de estas célula binucleada (grupo de embriones = 30,6%). La diferencia entre dos características principales, a lo multinucleados), 92 embriones ambos grupos fue estadísticamente largo de los años diversos estudios han presentaban un núcleo único en cada significativa. (p<0,001). demostrado que el número de núcleos una de sus células (grupo de embriones y la presencia de multinucleación mononucleados) y 79 presentaban CONCLUSIÓN tienen un importante valor predictivo algunas células con núcleo único. Para el de la viabilidad de los embriones. Sin análisis se incluyeron sólo los embriones Los resultados indican que embargo, debido a la baja frecuencia multinucleados o mononucleados los embriones que presentan de multinucleación en los embriones con implantación conocida (57 y 85 multinucleación tienen una tasa de seleccionados para las transferencias embriones, respectivamente). En el caso implantación significativamente embrionarias, la tasa de implantación de una transferencia con dos embriones menor que los embriones cuyas de dichos embriones resulta difícil de de la misma calidad que resultara en células poseen un núcleo único. Estos determinar. una implantación, se considera que uno datos ponen de manifiesto hasta de ellos es de implantación conocida. qué punto afecta la multinucleación OBJETIVO El análisis estadístico se realizó con el el potencial implantatorio de los programa informático SPSS STATISTICS embriones, y la ventaja que supone En este estudio se comparan las 17.0. la visualización de los núcleos para tasas de implantación de embriones una mejor determinación de la calidad multinucleados frente a la de RESULTADOS embrionaria y por lo tanto para una embriones mononucleados, para mejor selección de los embriones que determinar la diferencia en la tasa de En el grupo de embriones van a ser transferidos. implantación en presencia o ausencia multinucleados, 3 de los 57 embriones de de multinucleación. implantación conocida dieron lugar a la 070: SÍNDrOME DE AIcArDI-GOUtIÈrES. PrIMEr cASO cON ÉXItO C. Giménez1, C. Arjona1, A. Castellanos2, D. Pascual2, E. Garcia-Guixé1, A. Jiménez-Macedo1, M. Sandalinas1 1 Reprogenetics, Barcelona; 2Málaga FIV, Málaga e-mail: litus@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN leucodistrofia y linfocitosis del líquido la patología, correlacionándose las cefalorraquídeo que en la mayoría de alteraciones en TREX1, RNASEH2C y El síndrome de Aicardi-Goutières los casos debuta en los primeros días o RNASEH2A, con un fenotipo grave, (AGS) es una enfermedad rara que meses de vida, si bien se han descrito mientras que mutaciones en RNASEH2B se transmite, mayoritariamente, formas más moderadas que aparecen dan lugar a formas más moderadas. siguiendo un patrón de herencia después del año de edad. En el 80% autosómico recesivo. Se trata de una de los casos graves, los niños mueren OBJETIVOS encefalopatía subaguda hereditaria antes de los 10 años. Mutaciones en los caracterizada por la asociación de genes TREX1, RNASEH2A, RNASEH2B Describir el protocolo de diagnóstico calcificación de los ganglios basales, y RNASEH2C, son responsables de genético preimplantacional (DGP) para
- 171. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 169 la detección del síndrome de Aicardi- de una segunda ronda que amplifica se procesó una alícuota del medio de Goutières (AGS) en una familia con cada una de las regiones implicadas biopsia como blanco para cada uno de descendencia afecta. por separado. Para la detección los embriones. de la mutación se llevó a cabo una MATERIAL Y MÉTODOS minisecuenciación que permitió Se obtuvo resultado de todos los establecer la presencia/ausencia de la embriones resultando ser dos de ellos Familia portadora de la mutación mutación. afectos, dos no afectos y uno portador. c.341G>A (p.Arg114His) en el gen Se procedió a la transferencia de 2 TREX1. Todos los productos de amplificación embriones en día +5 de desarrollo, fueron analizados en un secuenciador resultando en un embarazo gemelar que Se desarrolló un protocolo de DGP automático. actualmente se encuentra en la semana específico para la familia en estudio que 7 de gestación. incluye: diseño y optimización de los RESULTADOS cebadores que permiten amplificar la CONCLUSIONES región donde se encuentra la mutación Se diseñaron y analizaron 5 marcadores así como marcadores polimórficos, polimórficos (STR’s) flanqueantes El DGP para enfermedades monogénicas confirmación de la mutación en DNA a la región de estudio. Dos de los 5 requiere de una elevada especialización genómico procedente de cada una marcadores resultaron ser totalmente y experiencia que permita el desarrollo de las muestras (progenitores e hija informativos y un tercero semi- de protocolos aptos para prácticamente afecta), identificación de los haplotipos informativo, por lo que los tres fueron cualquier anomalía génica causante de de riesgo y optimización de la PCR seleccionados para el DGP. una patología. multiplex en célula única. El desarrollo del protocolo ofreció La aplicación de las técnicas de DGP Una vez finalizado el trabajo en el una tasa de amplificación del 95% con molecular en parejas portadoras de laboratorio de genética se inició el ciclo una tasa de ADO del 7%, por lo que se enfermedades genéticas permite la de FIV-ICSI-DGP. procedió a dar luz verde al inicio del transferencia de embriones libres de la ciclo de FIV. enfermedad en estudio, evitando que la La biopsia se realizó en día +3 mediante pareja deba enfrentarse a la decisión de la práctica de un orificio en la zona Se obtuvieron 14 ovocitos, interrumpir o no un embarazo afecto. pelúcida con ácido Tyrodes y aspiración microinyectándose 10 MII que de blastómeros. resultaron en 8 zigotos. Cinco de los 8 En nuestro conocimiento este es el embriones fecundados evolucionaron primer caso de DGP con embarazo Se realizó un protocolo cuádruple de adecuadamente hasta día +3, evolutivo para el síndrome de Aicardi- PCR que incluye una primera ronda procediéndose a la biopsia de un único Goutières. multiplex de amplificación seguida blastómero de cada embrión. Además, 071: DIAGNÓStIcO GENÉtIcO EN ESPErMAtOZOIDES DE PAcIENtES cON cArIOtIPO NOrMAl. rESUltADOS EN 507 cASOS A. R. Jiménez-Macedo, E. García-Guixé, C. Giménez, M. Sandalinas Reprogenetics, Barcelona e-mail: pgdteam@reprogenetics.es INTRODUCCIÓN Hybridization) en espermatozoides es una en espermatozoides de pacientes con herramienta muy útil para el estudio de los cariotipo normal. Durante el proceso de gametogénesis gametos masculinos, ya que proporciona humana es frecuente que se produzcan una estimación del riesgo de anomalías errores meióticos. Estos errores pueden cromosómicas que podemos encontrar en provocar aneuploidías en los gametos los embriones derivados de la fecundación MATERIAL Y MÉTODOS y ser transmitidas a la descendencia con esta población espermática. provocando fallos de implantación Se procesaron mediante FISH 507 embrionaria, abortos, o descendencia muestras de espermatozoides de afecta. pacientes con cariotipo normal que OBJETIVOS acudían a TRA por problemas de El Diagnóstico Genético en fertilidad y/o esterilidad. Se aplicaron Espermatozoides (DGE) mediante la Estudio de los resultados obtenidos en sondas para los cromosomas X, Y, 13, técnica de FISH (Fluorescent In Situ el análisis de anomalías cromosómicas 14, 15, 18, 20, 21 y/o 22.
- 172. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 170 Las muestras analizadas se clasificaron (AT), el 29.03% de pacientes con CONCLUSIÓN en función de los parámetros seminales O l i g o A s t e n oTe r a t o z o o s p e r m i a siguiendo valores de referencia de la (OAT) y el 14.97% de los pacientes Según nuestro grupo de estudio, más OMS 2010. normozoospérmicos (N). del 20% de los pacientes con cariotipo normal que se realizan una FISH RESULTADOS De los casos con DGEALT, el 92.38% de espermatozoides por problemas de los casos hubieran sido detectados de fertilidad tienen un incremento De los casos estudiados, el 20.71% analizando únicamente los significativo de aneuploidías en sus resultaron en DGE alterado (DGEALT) y el cromosomas: X, Y y 21. De los 8 casos gametos. La totalidad de los casos 79.29% en DGE normal. De los pacientes con DGEALT (7.7%) restantes en los de FISH con un resultado alterado con Oligozoospermia(O) el 33.3% que no estaban implicados estos tres presentan alguno de los cromosomas: presentaban el DGEALT, el 14.06% de los cromosomas, 6 casos presentaban X, Y, 13, 18 y/o 21 alterado por lo que individuos con Astenozoospermia (A), el disomía para el cromosoma 18, y 2 casos en este estudio la aplicación de un DGE 18.35% del grupo de Teratozoospermia, para el cromosoma 13. Por lo que todos de estos 5 cromosomas sería suficiente el 30% de los pacientes los casos con DGEALT hubieran sido para detectar la totalidad de las Oligoastenospérmicos (OA), el 25% de detectados analizando únicamente los muestras cromosómicamente alteradas. los OligoTeratozoospérmicos (OT), el cromosomas X, Y, 13, 18 y 21. 25% de los AstenoTeratozoospérmicos 072: INFlUENcIA DE lOS DIAS DE ABStINENcIA EN lOS rESUltADOS DE UN cIclO DE FEcUNDAcION IN VItrO (FIV) I. Pons, R. Cercas, C. Villas, C. Braña, S. Fernández-Shaw URH García del Real, Madrid e-mail: ipons@urh.es INTRODUCCIÓN (N=77) ciclos en los que el varón obtuvo ninguna de estas diferencias fueron la muestra de semen para el ciclo de estadísticamente significativas. Diferentes estudios apuntan que una FIV tras un día de abstinencia. Grupo 2: fragmentación elevada en el ADN de (N=83) ciclos en los que el varón obtuvo CONCLUSIONES espermatozoides puede ser perjudicial la muestra para el ciclo de FIV tras la para la consecución de un embarazo a abstinencia sexual que recomienda la Los resultados de un ciclo de FIV/ICSI término. OMS (3-7 días). parecen tener una ligera mejoría si se usan muestras de semen tras un día de En este trabajo sugerimos que se El análisis estadístico empleado fue abstinencia. puede disminuir el porcentaje de Chi cuadrado, Test exacto de Fisher o T fragmentación de los espermatozoides de student según el caso. Se consideró Es necesario aumentar el número de disminuyendo los días de abstinencia y una diferencia estadísticamente casos para observar si se confirma que esta disminución puede mejorar las significativa cuando P<0.05. estadísticamente esta tendencia. tasas de embarazo a término. RESULTADOS OBJETIVO Ambos grupos fueron estadísticamente El objetivo de este estudio fue evaluar homogéneos para las variables prospectivamente la influencia de los analizadas. días de abstinencia en los resultados de un ciclo de FIV. La tasa de embarazo fue superior en el grupo 1 que en el grupo 2 (53.2% vs. MATERIALES Y MÉTODOS 50.6%, P>0.05), la tasa de aborto fue inferior en el grupo 1 que en el grupo En abril 2009 comenzamos un estudio 2 (7.3% vs. 14.3%, P>0.05), y por ello prospectivo randomizado en 160 la tasa de embarazo evolutivo fue primeros ciclos de FIV/ICSI que se superior en el grupo 1 que en el grupo dividieron en dos grupos. Grupo 1: 2 (49.4% vs. 42.2%, P>0.05), aunque
- 173. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 171 073: UNA DIStANcIA ANOGENItAl AcOrtADA PrEDIcE BAJA cAlIDAD SEMINAl EN VArONES JÓVENES J. Mendiola1,2, R.W. Stahlhut1, N. Jørgensen3, F. Liu1,4, S.H. Swan1,4 1 Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester, NY, USA. 2Grupo de Inves- tigación en Salud Pública y Epidemiología, Unidad de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia, Espinardo (Murcia). 3University Department of Growth and Reproduction, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark. 4Mt. Sinai School of Medicine, New York, NY, USA. e-mail: jaime.mendiola@um.es INTRODUCCIÓN seminal y cumplimentaron una encuesta 7.3 veces más riesgo (IC 95% 2,5, epidemiológica. Las muestras seminales 21,6) de tener una concentración En roedores macho, la distancia fueron evaluadas siguiendo los criterios espermática baja (<20 millones/ml). anogenital (AGD) es un marcador de la Organización Mundial de la Salud La concentración espermática media preciso de la exposición a andrógenos (OMS, 1999). Se utilizaron modelos (ajustada) para un varón en el cuartil en el ambiente intrauterino y predice de regresión multivariante para 25 de la distribución de la AGDAS fue de la capacidad y función reproductiva en examinar la concentración, movilidad 34,7 millones/ml, comparado con 51,6 la etapa adulta. Diversas sustancias y morfología espermática en relación millones/ml que presentó un varón en antiandrogénicas medioambientales con dos medidas de AGD, a saber: la el cuartil 75 de la distribución. Sólo pueden interferir en la síntesis in utero distancia desde la base posterior del se vieron asociaciones débiles y no de hormonas androgénicas y alterar escroto al ano (AGDAS), y la distancia significativas entre los parámetros el desarrollo del tracto reproductivo desde la inserción posterior del pene espermáticos y la AGDAP. masculino, incluyendo un acortamiento al ano (AGDAP). Las siguientes variables de la AGD. No se conoce todavía si la se incluyeron en los modelos finales CONCLUSIONES AGD está relacionada con la función para ajustar por posibles factores de reproductiva en varones humanos. confusión: edad, altura, tabaquismo, En nuestra población, la AGDAS grupo étnico, estación del año y tiempo presentó una fuerte asociación con OBJETIVOS de abstinencia sexual. Los análisis se todos los parámetros espermáticos realizaron con los programas de análisis y es un predictor de baja calidad Examinar las asociaciones entre la AGD estadístico SPSS v18.0 y SAS v9.0. seminal. En modelos animales, la y los parámetros seminales en varones AGD de machos al nacimiento refleja adultos. RESULTADOS los niveles androgénicos prenatales durante la ventana de programación MATERIAL Y MÉTODOS La AGDAS se asoció significativa y de masculinización (masculinization positivamente con todos los parámetros programming window) y predice la AGD Se estudiaron 126 alumnos universitarios espermáticos (concentración, y la función reproductiva adulta. Por que participaron en el Rochester young movilidad, morfología, número total tanto, nuestros resultados sugieren Men’s Study (RYMS), Rochester (NY, de espermatozoides y número total de que el ambiente androgénico durante EE.UU.), entre los años 2009 y 2010. A espermatozoides móviles) con p-valores el periodo fetal temprano ejerce una los varones que aceptaron participar en entre 0,002 y 0,048. Los varones con influencia fundamental sobre la AGD y el estudio se les realizó una exploración una AGDAS por debajo (comparado con la calidad seminal en humanos, como andrológica, obtuvieron una muestra por encima) de la mediana presentaron se ha demostrado en modelos animales. 074:INFlUENcIA DEl ÍNDIcE DE MASA cOrPOrAl (IMc) EN lA cAlIDAD SEMINAl A. Yoldi; A. Vaquero; JP. Ramírez y JA. Castilla. CEIFER. (Centro de Estudios e investigación de la Fertilidad). Granada e-mail: alberto.yoldi@ceifer.com INTRODUCCIÓN Categorías IMC Grado Intervalo Bajo peso 1 < 18.5 El índice de masa corporal (IMC) se Peso normal 2 18.5 a 24.9 define como: Peso (kg) /Altura2 (m), y Obesidad grado.1 3 25 a 29.9 según la OMS existen 5 categorías: Obesidad grado. 2 4 30.0 a 39.9 Obesidad mórbida. Grado. 3 5 40.0 ≤
- 174. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 172 Existen publicaciones en la literatura definidos por el Manual OMS, en sus Mediante el test de normalidad científica acerca de la influencia que diferentes ediciones. Se ha empleado Kolmogorov-Smirnov apreciamos que presenta el IMC en la reproducción un microscopio de contraste de ninguna de las variables estudiadas humana. Una gran cantidad de estos fases atemperado a 37ºC. El personal presenta una distribución normal; por estudios se basan en parejas sometidas investigador está inscrito desde el año lo tanto tendremos que utilizar métodos a TRA, enfocándose el estudio hacia el 1999 al Programa de Control de Calidad no paramétricos para estudiar la serie. factor femenino. Externo de Análisis de Semen del Grupo de Interés en Andrología de la ESHRE y Al aplicar el test de Kruskall- OBJETIVOS de ASEBIR. La edad media de la muestra Wallis, vemos que sólo el nº total es de 22.17 años (±4.18 SD). de espermatozoides por eyaculado relacionar las diferentes categorías presenta una disminución significativa del IMC con las variables de calidad Las características seminales analizadas conforme aumenta el IMC (sig.=0.002). seminal y conocer su influencia sobre han sido: concentración, volumen, nº las mismas. total de espermatozoides en eyaculado, CONCLUSIONES % espermatozoides progresivos (A+B) y MATERIAL Y MÉTODOS % de morfología normal. La calidad seminal en una muestra de 2444 jóvenes aspirantes a donante de De cada aspirante a donante de semen RESULTADOS banco de semen disminuye conforme que ha acudido a nuestro centro entre aumenta el índice de masa corporal los años 1993 a 2010, se ha estudiado Hemos excluido el grado 5, al tener un (IMC). Esta disminución presenta una muestra seminal obtenida por único individuo representativo. Tras significación estadística tan sólo en masturbación con un período de eliminar los outliers mediante el método una de las cinco variables seminales abstinencia de 3-5 días (n=2444). del recorrido intercuartílico, la muestra estudiadas (nº total de espermatozoides Para el análisis del semen se han presenta la siguiente estadística por eyaculado). seguido los procedimientos estándar descriptiva: IMC.1 IMC.2 IMC.3 IMC.4 n sd n sd n sd n sd x x x x Conc.(106/ml) 27 85.3 48.99 1854 77.7 48.28 439 72.4 43.99 41 70.4 49.26 Vol. (ml) 27 3.7 1.12 1852 3.7 1.49 424 3.6 1.36 40 3.1 1.22 Total (106) 27 297.3 158.01 1829 263.9 170.18 425 242.8 161.46 38 182.8 132.33 Prog (%) 26 45.9 13.49 1795 46.6 12.63 445 45.4 15.57 40 43.4 15.50 Norm (%) 4 14.5 11.59 368 16.5 6.69 84 17.4 6.29 4 16.0 1.41 075: USO DE lA MEtABOlÓMIcA PArA lA SElEccIÓN EMBrIONArIA EN D+2 Y D+3 M. Morales Morales, L. Andrés Criado, M. Sánchez de Burgos, M .Cuadros, E. Hernández, J.L. Gómez Palomares, J. Cuadros Clínica de Medicina de la Reproducción y Ginecología FIVMadrid e-mail: jcuadros@fivmadrid.es INTRODUCCIÓN en el laboratorio de embriología sí Viametrics-E utiliza un algoritmo es novedosa. Esta información sería matemático que genera un score Aunque el análisis del metabolismo del complementaria a la que obtenemos a de viabilidad en función de la embrión para determinar su viabilidad partir de la valoración de la morfología concentración de grupos funcionales no es reciente, su aplicación práctica de los embriones. (-CH, -OH, -NH) en el medio de cultivo
- 175. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 173 en el que se han desarrollado los En el grupo experimental, hemos 7 fueron pruebas de embarazo positivas, embriones, mediante espectroscopía analizado con Viametrics-E los todas ellas embarazos clínicos (53,8 del infrarrojo cercano. Teóricamente, embriones en D+2 o D+3 de 28 ciclos de %). Utilizando el test de Chi-cuadrado, el score de viabilidad predeciría cuáles mujeres de 38 años o menos, en los cuales no se encontraron diferencias de los embriones tendrían un mayor los embriones fueron preseleccionados estadísticamente significativas. potencial de implantación. por su morfología y se midió el score de viabilidad a los mejores embriones, CONCLUSIÓN OBJETIVO transfiriendo los de score más alto. Como grupo control, hemos analizado En este estudio preliminar, no En este estudio preliminar valoramos 13 ciclos de características similares a encontramos que el uso del score de si el uso de Viametrics-E aumenta la las del grupo experimental, donde se viabilidad de Viametrics-E aumente probabilidad de embarazo en nuestro transfirieron embriones en D+2 o D+3 las tasas de embarazo. Concluimos programa de FIV-ICSI. en mujeres de 38 años o menos, en los que la valoración morfológica sigue cuales los embriones se seleccionaron siendo la herramienta principal para MATERIAL Y MÉTODOS únicamente por su morfología. la determinación de la viabilidad embrionaria, y consideramos necesaria Comparamos ciclos en los que se ha RESULTADOS la revisión de los planteamientos para la transferido embriones seleccionados aplicación práctica de la metabolómica por su mayor score de viabilidad, En el grupo experimental, de las 28 en la clínica, para hacer de su uso una después de una selección morfológica, transferencias, 14 fueron pruebas realidad a corto plazo. versus ciclos en los que se ha transferido de embarazo positivas (50 %) y 11 embriones seleccionados sólo por su embarazos clínicos (39,3 %). En el grupo morfología. control, de 13 transferencias realizadas, 076: ANÁlISIS DEl GrOSOr DE lA ZONA PElÚcIDA SEGÚN lAH (lASEr ASSIStED HAtcHING) O NO EN cIclOS DE FIV/IcSI EN 2 GrUPOS DE EDADES B. Amorocho, G. Calderón, A. Sánchez, J. Marcos, P. Albero, L. Fernández, M. Nicolás, J. Landeras IVI Murcia e-mail: beatriz.amorocho@ivi.es INTRODUCCIÓN pero los grupos de edades estudiados MATERIALES Y MÉTODOS son menores de 38 años. El Hatching Asistido (AH) es una técnica Estudio prospectivo y randomizado, usada para facilitar el proceso de la En un estudio de Amorocho y cols. realizado en el IVI-Murcia, entre el 1 eclosión en embriones pertenecientes en 2011se obtienen la evidencia del de Marzo de 2006 y el 28 de Febrero de a pacientes de peor pronóstico beneficio del LAH en el grupo de 2011. Se estudiaron 213 ciclos FIV/ICSI reproductivo (Schoolcraft y cols.1994), pacientes de 38-40 años d edad. realizados en mujeres ≥ 38 años, que edad avanzada, fallo de implantación de forma aleatoria fueron distribuidos (Stein y cols), embriones congelados OBJETIVOS en 2 grupos: A 107 ciclos se les realizó (Gabrielsen y cols. 2004). Sin embargo, LAH (Grupo LAH) y a los 106 ciclos existen otros grupos que aportan El objetivo de este estudio es analizar restantes no se les realizó LAH (Grupo información en contra de la técnica como si el grosor de la zona pelúcida de los No LAH). Dentro de estos dos grupos se Lazendorf y cols. 2008 y el grupo de Kutlu embriones transferidos en día 3 de subdividió la población en dos grupos en 2010. Son muy pocos los estudios desarrollo tiene alguna influencia sobre de edades: 38 -39 años y > 40años. publicados enfocados a la medición de el beneficio del LAH en ciclos de FIV/ la zona pelúcida y el posterior análisis ICSI en 2 grupos de edades y valorar En todos los grupos se registró la media como Sun en 2005 y Hagemann en 2010, éxito reproductivo. de la zona pelúcida de los embriones a
- 176. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 174 transferir a en D3 de desarrollo, y de Los grupos fueron homogéneos en CONCLUSIONES acuerdo con la literatura subdividimos cuanto a IMC, edad, calidad embrionaria de nuevo la población en < 15 y > 15 y número de embriones transferidos/ A la vista de los resultados, sí µm. ciclo. encontramos beneficio del LAH en el grupo de edad comprendido entre 38- Para realizar el LAH se usó el sistema El análisis estadístico se realizó con el 39, cuando estratificamos la población Octax laser shot cuando les correspondía test de Fisher con valor significativo de estudio en función del grosor de la el assisted Hatching. cuando p< 0.05. zona pelúcida. Resultados por grupos de pacientes según edad y No LAH < 15 µm < 15 µm > 15 µm > 15 µm No LAH 38 y 39 años > 40 años 38 y 39 años > 40 años Casos 22 8 56 20 Tasa Gestación 18,5 % 0% 30,4% 45% Tasa Implantación 10% 0% 23,2% 28% Tasa Aborto 0% 0% 23,5% 33% Resultados por grupos de pacientes según edad LAH LAH < 15 µm < 15 µm > 15 µm > 15 µm 38 y 39 años > 40 años 38 y 39 años > 40 años Casos 21 6 44 36 Tasa Gestación 33,0 % 16,7% 50,0% 19,4% Tasa Implantación 24,0% 8,3% 20,0% 11,1% Tasa Aborto 14,2% 0% 27,0% 0% 077: El Nº DE EMBrIONES IMPlANtADOS AFEctA Al rESUltADO DE lA GEStAcIÓN E. Vidal, S. Cívico, M. Guimerà, V. Moreno, JM. Calafell, N. Brandi, J. Balasch Hospital Clínic de Barcelona e-mail: evidal@clinic.ub.es INTRODUCCIÓN tasa de gestación múltiple aumenta con et al., 2010). Además, diversos trabajos el número de embriones transferidos, (Torsky et al, 2005; Glujovskyet al, El objetivo principal en los tratamientos considerándose este hecho como 2007) sugieren que la transferencia de de fecundación in vitro (FIV) es la uno de los efectos adversos en los más de un embrión, podría favorecer consecución de un embarazo cuyo tratamientos de reproducción asistida. el proceso de implantación y la tasa de resultado sea el nacimiento de un niño La transferencia de un único embrión niños nacidos, que se explicaría por una sano. Con el fin de incrementar las evitaría el riesgo de embarazo múltiple, relación de sinergismo o cooperación probabilidades de embarazo, la práctica pero reduciría significativamente la entre los embriones. habitual en FIV es la transferencia de probabilidad de éxito en términos de más de un embrión. Por otra parte, la embarazo (Cochrane, 2009; McLernon
- 177. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 175 OBJETIVOS en función de la edad : Grupo 1: edad ≤ CONCLUSIONES 35 años (63,61%); Grupo 2: ≥ 36 años Analizar la evolución de los embarazos (36,39%). En ambos grupos, se registró La probabilidad de tener un nacido vivo obtenidos en nuestro programa de el número de implantaciones únicas en FIV aumenta cuando se produce una FIV en función del número de sacos y dobles diagnosticadas mediante implantación embrionaria doble. Este gestacionales observados en el primer ecografía (6-7 semanas de gestación), efecto destacaría especialmente en el control ecográfico la tasa de aborto clínico, de nacido vivo grupo de mujeres mayores de 35 años. y los resultados neonatales. MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS Estudio retrospectivo desde el año 1998 al 2009, que comprende un total de 2283 Los resultados obtenidos en los gestaciones clínicas de pacientes de dos grupos del estudio se detallan a FIV, divididas en dos grupos de estudio continuación: Grupo 1: Edad ≤ 35 años Gestaciones Total Gestaciones Abortos 1r trimestre Con algún nacido vivo 1438 (63%) 170 (11,8%) 1212 (84,3%) Gestaciones únicas 951 (67%) 148 (15,6%) 760 (80%) Gestaciones dobles 486 (29,3%) 22 (4,53%) 450 (92,6%) Grupo 2: Edad ≥ 36 años Gestaciones Total Gestaciones Abortos 1r trimestre Con algún nacido vivo 845 (37%) 209 (24,7%) 602 (71,2%) Gestaciones únicas 636 (75,3%) 190 (29,9%) 419 (65,9%) Gestaciones dobles 209 (24,7%) 19 (9,1%) 184 (88%) 078: EFEctO DE lA EXPANSIÓN EN El GEN FMr1 (X-FrÁGIl) SOBrE lA rESPUEStA OVÁrIcA Lledó B., Guerrero J., Ortiz JA, Morales R., Ten J., Giménez J., Llácer J., Bernabeu R. Instituto Bernabeu e-mail: blledo@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN Mülleriana mostró una relación directa este estudio incluimos los resultados de entre el número de repeticiones (35-55) X-frágil de 204 donantes (141 controles El síndrome de X-frágil es la causa más y la reserva ovárica. y 63 grupo estudio). La población de frecuente de retraso mental después del estudio se dividió en 3 subgrupos: S. de Down, encontrándose asociado El objetivo de este estudio es comprobar mujeres con 35-39 repeticiones (n=34), con fallo ovárico precoz (POF). Está si las repeticiones CGG en el gen 40-45 (n=12) y >45 (n=17). causado por una expansión dinámica FMR1 tienen valor predictivo de la CGG en el gen FMR1 localizado en el respuesta ovárica tras tratamientos con El protocolo de estimulación ovárica cromosoma X. Un número elevado gonadotropinas, en ciclos de ovodón. para las donantes combina rFSH (150 o de repeticiones CGG en el gen FMR1 225), antagonista (Cetrorelix) y análogo supone una mayor predisposición MATERIALES Y MÉTODOS (Triptorelina) para provocar el pico de LH. al POF. Se han evidenciado formas menos severas de POF con rangos En nuestro centro desde 2008 se realiza El test molecular se llevó a cabo siguiendo intermedios de repeticiones. Gleicher cribado de x-frágil de forma rutinaria en las recomendaciones del kit comercial et al considerando la hormona anti- todas nuestras donantes de ovocitos. En (Abbott Fragile X PCR Kit®). El alelo con
- 178. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 176 menor número de repeticiones se designó control requieren más gonadotropinas Nuestros datos muestran que la como el alelo-1. Todos los estudios (2212 IU) que el grupo de estudio (1850 estimulación ovárica no se ve afectada estadísticos se realizaron en base al IU) e independientemente del subgrupo por el número de repeticiones en el alelo-2 empleando el software SPSS y el (1846 para 35-39; 1959 para 40-45 y rango intermedio y normal. El número test chi-cuadrado asumiendo varianzas 1779 para >45). Los días de estimulación de ovocitos recuperados y los resultados iguales y una significación de 0.05. para las mujeres del grupo control del ciclo no se ven influenciados por fue de 11.40 vs 9.82 para el grupo de el número de repeticiones CGG. Por RESULTADOS estudio. Sólo los subgrupos 35-39 (9.6) el contrario a estudios previos, se y 40-45 (9.8) mostraron diferencias necesitan menos gonadotropinas y días No se observan diferencias significativas significativas. Estos resultados difieren de estimulación en mujeres con 35-45 en los resultados del ciclo (tasas de los trabajos publicados en pacientes repeticiones CGG en el gen FMR1. de beta-HCG, aborto, y embarazo infértiles. evolutivo) entre los grupos control y Considerando estos resultados, los estudio y los diferentes subgrupos. DISCUSIÓN alelos en el rango intermedio y normal La tasa de embarazo fue del 47% para de repeticiones CGG no se puede emplear el grupo control vs 54% para el grupo Por primera vez presentamos datos que como predictores de la estimulación de estudio. Respecto a la estimulación muestran la correlación entre los alelos ovárica. Sin embargo, considerando la ovárica no se observan diferencias en normales e intermedios en el gen FMR1 gravedad del síndrome de x-frágil y la la edad de la donante y el número de y la estimulación ovárica empleando frecuencia de portadoras, el cribado ovocitos recuperados entre la población un modelo que no introduzca variables en las candidatas de donación es control y la de estudio y los diferentes de confusión como el programa de necesario. subgrupos. Las donantes del grupo donación de ovocitos. 079: EStUDIO DE ANEUPlOIDÍAS ESPErMÁtIcAS MEDIANtE HIBrIDAcIÓN IN SItU FlUOrEScENtE (FISH) EN DONANtES DE SEMEN F. Marina, R. Alcolea, M. Rafael, M. Domínguez, L. Jiménez, A. Hernández y S. Marina Instituto de Reproducción CEFER. ANACER. e-mail: info@institutocefer.com INTRODUCCIÓN semen que realizamos en pacientes con centroméricas (para los cromosomas parámetros seminales por encima de los 18, X e Y) y dos específicas de loci (para Los bancos de semen cada vez necesitan límites inferiores de referencia según los cromosomas 13 y 21). Se estudiaron dar más garantías a las pacientes. el manual de la OMS (2010) muestran un mínimo de 1000 espermatozoides Además del screening obligatorio por que el 10,5% de ellos están alterados. para cada grupo de sondas. Para el ley, se han ido introduciendo nuevos Desde el año 2009 hemos incorporado grupo control se estudiaron 10 donantes test para aumentar la seguridad de las el estudio de aneuploidías espermáticas con fertilidad probada en los que se muestras de semen utilizadas por los en los donantes de semen para contaron 10.000 espermatozoides para pacientes que requieren donación de investigar la incidencia de alteraciones cada grupo de sondas. gametos. Se han introducido nuevos en este colectivo y para ofrecer una test infecciosos, como la detección de mayor seguridad a las usuarias del RESULTADOS clamidias o de citomegalovirus y test banco de semen. genéticos como la detección del gen En los 380 donantes estudiados, el de la fibrosis quística, la beta-talasemia MATERIAL Y MÉTODO volumen medio de eyaculado fue y el cariotipo. Es conocido que en 4,3 mL ± 1,5 (2,1-10,8); la media estudios prenatales de mujeres de Estudiamos un total de 380 donantes, de espermatozoides normales fue pacientes con recuentos espermáticos con edad entre 18 y 30 años y 29% ± 10 (16-73); el recuento de bajos, hay un aumento en las anomalías aceptados para todas las otras pruebas espermatozoides/mL medio fue 94,2 cromosómicas de novo (Bonduelle et de screening. Para el estudio de × 106 ± 47×106 (21-286); la media al., 2002 HR 17:2600). Los padres de FISH se fijaron los espermatozoides del porcentaje de espermatozoides niños con estas anomalías de novo con Carnoy y posteriormente se con movilidad traslativa fue 52,6% sabemos que muestran incrementos descondensaron las cabezas con DTT ± 9,1 (19-73). Cuatro donantes significativos de aneuploidías (dithiotreitol). Se utilizó el kit Vysis® presentaron incremento significativo de espermáticas. Los estudios de FISH en Aneuvision compuesto por tres sondas aneuploidías 1,0% (4/380).
- 179. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 177 CONCLUSIONES alterado, presentan un mayor riesgo de pacientes y se incrementaría el riesgo generar descendencia con anomalías de abortos o de cromosomopatías La incidencia de aneuploidías cromosómicas de novo. Las muestras en la descendencia. Consideramos espermáticas encontrada en los de donantes son utilizadas por muchas justificable la realización del estudio de donantes es inferior a la que pacientes hasta que se consiguen los 6 aneuploidías espermáticas en donantes encontramos en los pacientes estériles nacimientos marcados por la ley. Si no de semen para proporcionar una mayor con parámetros seminales por encima realizáramos este estudio, un donante seguridad a los pacientes, en especial de los valores mínimos de referencia aceptado que presente FISH espermático a aquellos que no consiguen gestación (1,0% vs 10,5%). La incidencia de alterado podría haber sido utilizado con semen del cónyuge y pasan a usar donantes con alteraciones es baja, pero en muchas pacientes. Se reducirían las semen de donante. sabemos que pacientes con el FISH posibilidades de gestación de estas 080: EXPrESIÓN DE lA AlDEHÍDO DESHIDrOGENASA 1A2 (AlDH1A2) EN cÉlUlAS DEl cÚMUlUS (cc) MEDIANtE ANÁlISIS DE EXPrESIÓN GÉNIcA DIFErENcIAl: POSIBlES IMPlIcAcIONES EN lA MADUrAcIÓN OVOcItArIA. V. García-Láez, D. Beltrán, C. Albert, J. Horcajadas, F.J. Esteban, J.A. Martínez-Conejero, M.J. De los Santos IVI Valencia - INCLIVA garcialaez@hotmail.com INTRODUCCIÓN (CN) y 4 sometidas a protocolos test Chi-cuadrado considerándose de hiperestimulación ovárica (CE) significativa una p<0.05. La aldehído deshidrogenasa (ALDH1A2) con agonistas de GnRH y con FSH es la enzima que cataliza la formación del recombinante. La media de edad entre RESULTADOS ácido retinoico (AR), forma metabólica los dos grupos fue similar (27,2 vs 26,0). activa de la vitamina A. El AR es importante Los resultados del microarray durante la formación de los folículos Después de la extracción del ARN mostraron que la estimulación ovárica primordiales en humanos, induciendo de las CC con Trizol, se realizó su induce la activación o desactivación de la entrada en meiosis de las oogonias. amplificación lineal mediante el determinados genes (7 sobre y 10 infra- Además, en otros modelos animales, podría WT-Ovation Pico RNA Amplification regulados), mostrando por primera tener cierta importancia en la maduración System (NuGEN Technologies). El vez la expresión del gen ALDH1A2 en citoplasmática del ovocito. De hecho, ADNc se hibridó con el Whole Human las CC siendo éste sobre-expresado también se ha encontrado la expresión de Genome Oligo Microarray (Agilent en los CN con un fold change de 4.62 receptores de AR en las CC, así como un Technologies). El análisis de imagen se y un p-valor corregido de 0.025, aumento de la concentración de AR en los realizó mediante el Software GenePix demostrando también su asociación líquidos foliculares de folículos dominantes Pro 6.0. Para las comparaciones se con un aumento intrafolicular de E2 comparados con los atrésicos, lo cual se utilizaron tests no paramétricos. Los (562.000 en CN vs 241.750 pg/ml en encuentra correlacionado positivamente genes fueron considerados como sobre CE). Sin embargo, no se encontraron con la concentración de estradiol (E2). o infra-expresados cuando la p<0.05 y diferencias significativas entre los CE el fold change>2. La validación de los y CN en la correcta posición y estado OBJETIVO microarrays fue realizada un total de del huso meiótico (66.7% vs 46.7%), 19 CC adicionales mediante qRT-PCR. birrefringencia (1.77nm vs 1.31nm) El objetivo de este estudio consistió en y datos de fecundación (66.6% vs evaluar las diferencias de expresión génica Además se evaluó la presencia y 59.4%), respectivamente. mediante microarrays entre donantes posición del huso meiótico mediante sometidas a ciclos naturales y estimulados el software de imagen Oosight, se CONCLUSIONES y su posible correlación con los niveles realizaron medidas de birrefringencia de estradiol intrafoliculares, calidad y se hizo un seguimiento de los datos La mayor expresión del gen ALDH1A2 ovocitaria y potencial de fecundación. de fecundación de cada ovocito. Por observada en los CN mostró una relación último, se realizaron mediciones con los niveles de E2 intrafolicular, sin MATERIAL Y MÉTODOS hormonales intrafoliculares de E2 embargo, esto no se correlacionó con mediante MEIA (análisis immunoensayo parámetros de maduración ovocitaria En este estudio se incluyeron 4 enzimático de micropartículas). Para como presencia de huso meiótico o donantes sometidas a ciclo natural los análisis estadísticos fue usado el potencial de fecundación.
- 180. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 178 081: cOMPArAcIÓN DEl DIAGNÓStIcO SEMINAl EMPlEANDO lOS VAlOrES DE rEFErENcIA DE lA OMS 1999 Y 2010: DIStrIBUcIÓN EN FUNcIÓN DE lA ActIVIDAD FÍSIcA E ÍNDIcE DE MASA cOrPOrAl Delgado E1, Guarnizo MC1, Morgado S2, Sánchez-Correa B2, Roncero RG2, Gordillo JJ2 Mijares J3, De Julián J1, Tarazona R2, Casado JG2,3 1 Norba, Ginecología y Reproducción S.L., Cáceres, España. 2Universidad de Extremadura, Departamento de Fisiología, Área de Inmunología, Cáceres, España. 3Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón, Terapia Celular, Cáceres, España. e-mail: elenadelnie@clinicanorba.com INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS de normozoospérmicos en el grupo de varones con hábitos de vida deportiva El aumento de la infertilidad masculina Las muestras se obtuvieron de fue significativamente superior al resto en los últimos años a hecho necesario pacientes que acudieron con sus parejas de los grupos siendo esta diferencia revisar los valores de referencia que a Norba, Ginecología y Reproducción más acusada que cuando se usaron los utilizamos para diagnosticar un semen S.L. para someterse a un tratamiento valores de la OMS 99. Del mismo modo, como normal. Dichos valores publicados de fertilidad. Tras 20-40 minutos de observamos que el porcentaje de varones por la Organización Mundial de la licuefacción se analizó el volumen, con alguna anomalía espermática está Salud (OMS) se obtienen de los datos número, movilidad, morfología y el incrementado en los preobesos y en los recopilados de un elevado número de recuento espermático tras capacitación. obesos de grado I siendo esta diferencia muestras de sémenes de individuos A continuación, las muestras se mayor si empleamos los valores de la cuyas parejas se embarazaron en un agruparon según la actividad física que OMS 99. Igualmente, llama la atención plazo máximo de 12 meses. Estos valores desarrollaban los pacientes (deportistas que con los nuevos valores de referencia se han revisado en 2010 en el quinto habituales, ocasionales o sedentarios) desaparecen las teratozoospermias manual de la OMS y principalmente el y según su IMC (obesos, pre-obesos y en todos los subgrupos estudiados, número, la movilidad, la morfología peso normal). Los resultados obtenidos mientras que disminuyen los pacientes y la recuperación espermática han se compararon según diagnóstico con con oligoastenozoospermia y aumentan disminuido de manera considerable. los valores de la OMS 99 y OMS 2010. los pacientes con oligozoospermia. Los cambios socioeconómicos y la adquisición de nuevos hábitos de vida RESULTADOS CONCLUSIONES podrían ser las causas que expliquen este descenso. La dieta y el ejercicio Al analizar los diferentes parámetros Los resultados de este trabajo físico son parámetros importantes en de fertilidad observamos que los demuestran que la actividad física el individuo que afectan directamente varones con hábitos de práctica y el IMC son factores directamente a la fisiología del testículo. De hecho, deportiva presentaban un incremento relacionados con la calidad espermática una de las consecuencias de la mala en el volumen de eyaculado, en la de los varones. Estos resultados se alimentación es el aumento de la concentración de espermatozoides y mantienen aunque de forma menos obesidad en los últimos años que podría en la movilidad espermática respecto significativa con los nuevos parámetros considerarse como un factor asociado a a los que tienen una actividad física de la OMS 2010. la infertilidad masculina. ocasional o unos hábitos de vida sedentarios. Además, al agrupar los Aplicando los valores de referencia OBJETIVO varones en función del IMC se comprobó publicados por la OMS 2010 aumenta que el recuento de espermatozoides el número de pacientes sin anomalías El objetivo de este trabajo fue analizar móviles estaba disminuido en varones espermáticas y disminuyen de la influencia del deporte y del índice de preobesos u obesos en grado I. Por otro manera significativa el número de masa corporal (IMC) sobre la calidad lado, al agrupar las muestras según pacientes con teratozoospermia y con espermática y comparar los resultados diagnóstico utilizando los valores oligoastenozoospermia. obtenidos según los valores publicados publicados por la OMS en 1999 y en el por la OMS en 1999 y en 2010. 2010 observamos que el porcentaje
- 181. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 179 082: EFEctO DE lA ADMINIStrAcIÓN DE lA HOrMONA lUtEINIZANtE (lH) SOBrE lOS cIclOS DE FIV. rESUltADOS SEGÚN lA EDAD C. Álvarez LLeó, M. Sánchez Toledo, C. García Garrido, S. Navarro Velasco, M. Resta Serra, G. González de Merlo. Hospital General Universitario de Albacete e-mail: cristina10lleo@gmail.com INTRODUCCIÓN La HOC se llevó a cabo utilizando los significativamente más frecuentes en protocolos de la Unidad de Reproducción los del grupo sin LH y los EEPV (p=0,003) La LH es la hormona que interviene en del Hospital de Albacete. El control de en los del grupo con LH. la foliculogénesis, esteroidogénesis, la respuesta ovárica se realizó mediante maduración ovocitaria, ovulación control ecográfico y estradiol en sangre. Estudio 2. Se realizaron dos grupos y mantenimiento del cuerpo lúteo. uno con FSH (n=24) y otro con FSH+LH Sin embargo, se ha cuestionado De los ovocitos MII recuperados se (n=13). En las pacientes con LH fue mucho su papel en los protocolos de evaluó su calidad morfológica según significativamente mayor: la FSH hiperestimulación ovárica controlada criterios de ASEBIR valorando: basal (8,7±4,3 vs. 5,0±1,6 mUI/ml). (HOC). Si bien la suplementación con Sin embargo, el nº folículos≥17mm LH no proporciona beneficios para las • Granulosidad citoplasmática (GC). (5,1±2,4 vs. 8,5±2,3), nº ovocitos pacientes jóvenes normogonadotropas, • Corpúsculo polar (CP): (6,8±4,4 vs.13,0±4,7), nº MII (5,3±3,0 sí existen indicios de una influencia – Fragmentado vs.10,5±5,0) y nº fecundados (3,5±2,5 positiva en pacientes de mayor edad y – No Fragmentado vs.6,7±4,3) fueron significativamente bajas respondedoras, aunque no está • Exudados en el espacio perivitelino menores. La tasa de embarazo e claro su impacto en mujeres menores (EEPV). implantación fueron similares. En de 35 años o con riesgo de síndrome de cuanto a la calidad de los ovocitos, hiperestimulación ovárica. Los MII se microinyectaron. Los la GC (p=0,004) y CP fragmentado embriones obtenidos se clasificaron en (p=0,000) fueron significativamente OBJETIVOS D+2/D+3 en tipo A, B, C y D (ASEBIR). más frecuentes en los del grupo sin LH La fase lútea se suplementó con Analizar el efecto de la administración progesterona. Cuando la bhCG fue CONCLUSIONES de LH en los tratamientos de HOC sobre positiva se confirmó la gestación dos la calidad ovocitaria y los resultados del semanas después por presencia de saco 1.La LH siempre se administró a las ciclo de FIV en un grupo de pacientes intrauterino. pacientes con mayor edad y FSH seleccionadas al azar y en un grupo de basal. pacientes con >36 años. RESULTADOS • El nº total de ovocitos, MII y MATERIAL Y MÉTODOS Estudio 1. Se realizaron dos grupos uno fecundados fue menor en el grupo en el que se administró FSH (n=51) y con LH. Se evaluaron prospectivamente 100 otro FSH+LH (n=49). Se observaron pacientes sometidas a FIV con diversos diferencias significativas en edad • Los ovocitos del grupo con LH fueron problemas de esterilidad. (32,6±4,2 vs.35,3±3,3 años), FSH de mejor calidad. basal (5,7±1,4 vs. 7,9±3,3mUI/ml), 1. Estudio1: 100 pacientes con edad dosis FSH administrada (1415,0±543,7 • La tasa de implantación y embarazo media: 34,0±4,1 (21-40 años). vs. 2797,7±714,3 UI) siendo mayores fue similar entre los grupos. en el grupo con LH. Por lo que 2. Estudio 2: 37 pacientes con edad respecta al resultados del ciclo, el nº • La LH mejora la calidad de los ovocitos >36 años, media 38,9±1,5 (36-40 folículos≥17mm (8,0±2,4 vs. 5,7±2,8), y los resultados del ciclo en pacientes años) nº ovocitos recuperados (12,1±4,6 vs. mayores. 8,2±5,0), nº MII (9,6±4,4 vs. 6,3±3,9) En cada trabajo dividimos las pacientes y nº fecundados (5,8±3,5 vs. 3,7±2,5) en dos grupos según las gonadotropinas fueron significativamente menores. administradas para la HOC: FSH sola Sin embargo, las tasas de embarazo e o combinada con LH. Se compararon implantación fueron similares entre edad y FSH basal, tratamiento de los grupos. Al analizar la calidad estimulación, calidad ovocitaria y de los ovocitos, la GC (p=0,002) y resultados del ciclo. CP fragmentado (p=0.000) fueron
- 182. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 180 083: cOMPArAcIÓN DE lOS rESUltADOS DE trANSFErENcIAS EN DÍA 4 VS DÍA 5 EN UN PrOGrAMA DE DONAcIÓN DE OVOcItOS J. Guerrero, J. Ten, M. Pérez, J. Llácer, R. Bernabeu Instituto Bernabeu Alicante e-mail: jguerrero@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS día 5). El número medio de embriones que se lleva a cultivo (7,1 ± 2,6 vs. 8,4 En la mayoría de laboratorios la Se analizaron retrospectivamente ± 2,8) y el número de embriones de transferencia embrionaria se realiza 265 transferencias de embriones en buena calidad en día 3 (3,3 ± 2,1 vs. de manera rutinaria coincidiendo con fresco en pacientes receptoras de 3,6 ± 2,1) fue significativamente mayor el día 2-3 de cultivo, o en estadio de ovocitos, de las que 112 se realizaron en las pacientes transferidos en día 5. blastocisto en día 5, mientras que la en día 4 y 153 en día 5. El día de la Considerando únicamente aquellos transferencia en día 4 es una opción transferencia se estableció en función ciclos con seis o más embriones que prácticamente no se ha tenido en del día de la recogida ovocitaria y de evolutivos en día 3 (51 ciclos en el cuenta. Esto se debe en gran medida a la disponibilidad de los pacientes. grupo de día 4 y 93 en el grupo de día la falta de sistematización de criterios Los parámetros clínicos analizados 5) observamos que estas diferencias morfológicos que sí están claramente más relevantes fueron la tasa de desaparecen, obteniendo una tasa de definidos para otros estadios. Hay β-hCG positiva, y tasas de embarazo β-hCG positiva del 66,7% vs. 79,3%; estudios que sugieren la superioridad de e implantación. Los resultados se embarazo clínico del 54,5% vs. 66,7% la transferencia de blastocistos respecto analizaron mediante el test de t-student y tasa de implantación del 38,2% vs. a la de embriones en estadio de células y el test chi-cuadrado. Se consideró 48,4% en pacientes transferidos en día debido a una mejor sincronización estadísticamente significativo una P 4 y día 5 respectivamente. embrión-endometrio y una selección valor <.05. embrionaria más objetiva una vez se CONCLUSIONES ha producido la activación del genoma RESULTADOS embrionario. Sin embargo, no siempre La transferencia de embriones en día 4 es posible programar la transferencia en Al evaluar los datos globalmente, se ofrece resultados clínicos comparables día 5, bien por cuestiones relacionadas observó un aumento significativo en a los de día 5 cuando el número y con el laboratorio o por objeciones cuanto a test de embarazo positivo calidad de la cohorte embrionaria en de los pacientes. El objetivo de este (60,7% vs. 75,2%), embarazo día 3 es similar. Por tanto, esta opción estudio es evaluar los resultados de la clínico (47,3% vs. 64,1%) y tasa de permite una mayor flexibilidad a la transferencia embrionaria en día 4 en implantación (34,1% vs. 47,1%) en día 5 hora de programar la transferencia estas situaciones y compararlos con los comparado con el grupo de día 4. La tasa embrionaria evitando inconvenientes a obtenidos en día 5. de aborto clínico fue similar en ambos los pacientes. grupos (11,3% en día 4 vs. 13,4% en 084: EStUDIO DE lA INtEGrIDAD DEl ADN ESPErMÁtIcO EN rElAcIÓN cON lA cAlIDAD SEMINAl Y lOS rESUltADOS DEl cIclO DE FIV M. Sánchez Toledo, C. Álvarez Lleó, C. García Garrido, M. Resta Serra, S. Navarro Velasco, G. González de Merlo. Hospital General Universitario de Albacete e-mail: mariasancheztoledo@hotmail.com INTRODUCCIÓN integridad del ADN espermático, básico OBJETIVOS en la transmisión del genoma paterno La calidad seminal es un factor al ovocito y factor determinante de – Analizar la relación entre la determinante del éxito reproductivo. El la calidad seminal y fertilidad. Este fragmentación del ADN medida seminograma es la única herramienta parámetro se está empezando a valorar mediante SCSA (Sperm Chromatin disponible para valorarla pero es en la práctica clínica, sin embargo Structure assay) y la calidad subjetivo y limitado a la hora de predecir no existe consenso al respecto de su seminal según los parámetros del el resultado de un ciclo de FIV. Además, utilidad como predictor del resultado seminograma. no proporciona información sobre la del ciclo.
- 183. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 181 RESULTADOS Por otra parte dividimos los pacientes en dos grupos según el %DFI (≤10% y –Valorar la capacidad predictiva de Al correlacionar los parámetros del >10%) Los pacientes con fragmentación la fragmentación del ADN sobre el seminograma con el %DFI observamos superior al 10% presentaban mayor resultado de FIV, así como la relación una correlación negativa entre el %DFI, edad media (37,95 vs. 34,71 años) entre la edad del varón y el grado de la movilidad progresiva en fresco (r=- (p=0,043) y menor porcentaje de fragmentación. 0,563, p=0,000); y en capacitado (r=- la movilidad progresiva en fresco 0,321, p=0,041) y la concentración en (24,57% vs. 44,19%) (p=0,002) y de MATERIAL Y MÉTODOS capacitado (r=-0,378, p=0,015) No se espermatozoides normales (1,92% vs. observó relación entre fragmentación 3,81%) (p=0,016) Se valoraron 43 muestras seminales y tasa de fecundación, calidad procedentes de pacientes sometidos a embrionaria y tasa de embarazo. Por último realizamos dos grupos tratamientos de FIV. La edad media de de pacientes: normozoospérmicos los varones fue 35,62±4,87 años y la de Para estimar como afectaba la edad y con alguna patología seminal. Los las mujeres 33,88±3,95 años. Se valoró: de ambos miembros de la pareja sobre normozoospérmicos tenían menor edad volumen, concentración, movilidad la tasa de gestación se realizó una media (32,33 vs. 36,49 años) (p=0,042) progresiva y morfología espermática regresión logística, no encontrando y menor %DFI seminal (4,70% vs. según criterios de la OMS (2010) El diferencias. Aunque se observó una 11,34%) (p=0,007) resultado del ciclo se evaluó por su tasa tendencia con la edad a disminuir la de fecundación, calidad embrionaria el tasa de embarazo y a aumentar la de CONCLUSIONES día de la transferencia, bhCG positiva y aborto, sin embargo esta última no la tasa de gestación clínica (presencia de pudimos comparar estadísticamente •La movilidad progresiva en fresco saco gestacional) debido al pequeño tamaño muestral. desciende con el %DFI. La fragmentación del ADN se valoró Del mismo modo, estudiamos la posible •La fragmentación del ADN espermático utilizando la técnica SCSA. Ésta se basa asociación entre el %DFI y la edad de los no predice los resultados del ciclo de en el principio de que la cromatina varones. Dividimos los pacientes en dos FIV. anormal presenta mayor susceptibilidad grupos de edad (≤36 y >36 años) Los in situ a desnaturalizarse parcialmente. varones <36 años presentaban mayor •El incremento de la edad de los Al teñir las células desnaturalizadas en movilidad progresiva en fresco (41,42% varones disminuye la calidad seminal. medio ácido con naranja de acridina, vs. 30,47%) (p=0,034) y menor %DFI podemos valorar la fluorescencia que los de mayor edad (7,01% vs. 13,2%) •La determinación del %DFI emitida mediante citometría de flujo y (p=0,040) No se observaron diferencias al espermático podría ser de utilidad en obtener así el porcentaje del índice de comparar con los resultados del ciclo de FIV. casos de esterilidad idiopática. fragmentación del ADN (%DFI). 085: INcIDENcIA Y rEPErcUSIÓN DE lA APArIcIÓN ESPONtÁNEA DE BUrBUJAS EN lAS MIcrOGOtAS DE MEDIO DE cUltIVO trAS INcUBArlAS EN cONDIcIONES DE HIPOXIA Y SIN HUMEDAD M. Vila, P. Muñoz, E. Ferrer, M. Ferrer, M. Ruiz Jorro CREA, Centro Médico de Reproducción Asistida, Valencia e-mail: maria.vila@creavalencia.com INTRODUCCIÓN existe alguna repercusión en la calidad se midió utilizando el software Cronus 3 embrionaria. (Research Instruments). Hemos observado la aparición espontánea de burbujas en las MATERIAL Y MÉTODOS Asimismo, se comparó la calidad microgotas de medio de cultivo (IVF, G-1 embrionaria según la existencia o y G-2 – Vitrolife Serie V Plus), utilizando Se analizó, de forma prospectiva, la no de burbuja en la gota: Grupo incubadores bench-top (K-Systems burbuja aparecida en 223 de 1132 gotas A, embriones cultivados en gotas sin G-185) en condiciones de hipoxia (5% de 30 µl de IVF, en 222 de 1820 gotas de burbuja (n=52), Grupo B, embriones Oxígeno) y en un ambiente sin humedad. 50 µl de G-1 y en 165 de 567 gotas de cultivados con burbuja (n=38) y Grupo 50 µl de G-2. Las gotas fueron incubadas C, embriones en gotas de las que se OBJETIVOS entre 16-20 h antes de su uso, en eliminó previamente la burbuja (n=23). incubadores K-Systems G-185 con baja Para analizar posibles cambios en la Intentar saber cuándo y porqué aparecen presión de oxígeno (5% O2 y 6% CO2) y composición del medio, se midió la estas burbujas, su composición y si sin humedad. El tamaño de la burbuja osmolaridad de la microgota con un
- 184. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 182 Micro-Osmómetro (Modelo 3300 de medios (2,86 +0,96 mm). Este tamaño CONCLUSIONES Advanced Instruments) y su porcentaje no aumenta ya más con el tiempo. de oxígeno con un microsensor de Las burbujas que aparecen de forma fibra óptica de 50 micras y un lector Tampoco se encontraron diferencias en espontánea en las microgotas de cultivo Microx TX3 (PreSens). Finalmente, la osmolaridad de los medios cuando se embrionario son burbujas de aire que para determinar la composición de la había formado burbuja (262+0,06mOs) no afectan a la osmolaridad del medio, burbuja, se introdujo el microsensor en o no en su interior (265+0,05mOs). al porcentaje de Oxígeno en la gota ni a su interior y se analizó el contenido de la calidad de los embriones. oxigeno con el equipo Microx TX3. En cuanto a la calidad embrionaria, el porcentaje de embriones A o B (ASEBIR) - Su incidencia es diferente según el RESULTADOS presente en cada grupo, no presentó medio de cultivo, siendo más frecuente diferencias significativas (A: 40,4% ; B: su aparición en G-2. El tamaño de la La formación de burbujas ocurrió en el 34,2% ; C:52,2%). burbuja, sin embargo, es similar en los 19,7% de las gotas de IVF, en un 12,2% 3 medios comparados. de las gotas de G-1 y en un 29,1% de las El porcentaje medio de oxigeno en gotas de G-2, encontrándose diferencias las gotas de medio de cultivo con o - La formación de estas burbujas de aire significativas entre todos los medios. sin burbuja fue similar (5,3+0,20% vs se podría deber a la acumulación de El tamaño medio de las burbujas fue 4,9+0,23%), mientras que el porcentaje microgotas de oxígeno provenientes similar en todos los medios (IVF: 1,41 medio de oxígeno en la burbuja, de los medios de cultivo, al ser +0,37mm; G-1: 1,49 +0,47mm; G-2: medido introduciendo en su interior estos envasados en condiciones 1,30 +0,44mm). el microsensor de fibra óptica, fue de atmosféricas (20% de O2), y a la 21,1+0,26%). incapacidad de contener la presión de Cuando las burbujas no son eliminadas, vapor de agua en el medio líquido por alcanzan un tamaño medio, tras 20h un aumento brusco de la temperatura más de incubación, similar en todos los al preparar las placas. 086: DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl EN PAcIENtES POrtADOrES DE ANOMAlÍAS NUMÉrIcAS DE lOS crOMOSOMAS SEXUAlES M. Gaytán, A. Liñán, E. Martínez, M. Ariza, MªC. Nogales, D. Cernuda, F. Bronet. IVI Madrid e-mail: maria.gaytan@ivi.es INTRODUCCIÓN Aunque se espera que estos pacientes y si estas aneuploidías se limitan a generen un mayor número de embriones los cromosomas sexuales o también El Diagnóstico Genético con aneuploidías para los cromosomas afectan a los autosomas. Preimplantacional (DGP) mediante sexuales y para los autosomas, este hibridación in situ fluorescente (FISH) posible efecto intercromosómico no ha MATERIAL Y MÉTODOS es una técnica dirigida a parejas sido demostrado de forma concluyente. con un mayor riesgo de transmitir El estudio cromosómico básico en DGP Se analizaron 47 embriones mediante a su descendencia alteraciones incluye seis autosomas (cromosomas FISH procedentes de 12 ciclos de DPI. Al cromosómicas o genéticas. Este grupo 13, 15, 16, 18, 21 y 22) además de los menos uno de los miembros de la pareja incluye a los pacientes portadores sexuales (X e Y), y se ha planteado si en era portador de una anomalía numérica de anomalías numéricas de los este tipo de pacientes sería suficiente de los cromosomas sexuales. La media cromosomas sexuales: mosaicismos con analizar sólo los cromosomas de edad materna era de 36,7 años. del síndrome de Turner, polisomías del sexuales. cromosoma X, síndrome de Klinefelter, Para el análisis cromosómico se etc. Las anomalías de los cromosomas OBJETIVOS utilizaron sondas de ADN fluorescentes sexuales tienen una menor repercusión específicas para la detección de los fenotípica que las de los autosomas, Evaluar si los portadores de anomalías cromosomas 13, 15, 16, 18, 21, 22, X e Y. siendo los problemas de infertilidad una numéricas de los cromosomas de sus consecuencias. sexuales presentan un mayor riesgo Los resultados obtenidos fueron de producir embriones aneuploides, comparados con valores control. El
- 185. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 183 análisis estadístico se realizó mediante afectado en un 25,5% de los embriones anomalías numéricas de los cromosomas Chi-cuadrado. Las diferencias se (control=6%, n=200, p<0,0001), el sexuales es significativamente superior consideraron significativas para p<0,05. cromosoma 15 en un 25,5% de los a la tasa de aneuploidías en la población embriones (control=7%, n=200, control (70,2% frente a 33%, n=200, RESULTADOS p=0,0002), el cromosoma 16 en un p<0,0001). 29,8% de los embriones (control 9%, Se han evaluado 47 embriones de los n= 200, p=0,0001), el cromosoma 18 en Estas aneuploidías no solo afectan a cuales 14 eran euploides (29,8%) y un 27,7% de los embriones (control 8%, los cromosomas sexuales, sino que 33 aneuploides (70,2%). De estos 33 n=200, p=0,0002), el cromosoma 21 incluso con mayor frecuencia se ven embriones en un solo caso (3%) las en un 29,8% de los embriones (control implicados los autosomas. Esto sugiere anomalías se limitaban a los cromosomas 10%, n= 200, p=0,0004), el cromosoma fuertemente la existencia de un efecto sexuales, el 36,4% presentaban 22 en un 29,8% de los embriones intercromosómico que justifica y anomalías tanto de los cromosomas (control 7%, n=200, p<0,0001) y los hace imprescindible el análisis de los sexuales como de los autosomas y el cromosoma sexuales en un 27,7% de autosomas en los embriones de este 60,6% presentaban alteraciones de los los embriones (control 9%, n=200, grupo de pacientes. Son necesarios autosomas exclusivamente. p=0,0005). estudios con un mayor número de embriones para confirmar esta Todos los cromosomas analizados CONCLUSIONES hipótesis. presentaban una tasa significativamente mayor de aneuploidías que el grupo La tasa de aneuploidías en embriones control. El cromosoma 13 estaba que proceden de pacientes portadores de 087: EStUDIO DEScrIPtIVO DE MIcrODElEcIONES DEl crOMOSOMA Y EN El HOSPItAl VIrGEN DE lAS NIEVES DUrANtE El PErIODO 2005-2011 B. Pérez, A. Rosales, M. Martínez, I. Delgado, J. Gil, C. Amezcua, S. Pedrinaci. Servicio Análisis Clínicos. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. e-mail: ana.clavero.sspa@juntadeandalucia.es INTRODUCCIÓN 14% de casos. Con el reciente auge espermatozoides/mL. En general este de la reproducción asistida mediante estudio está indicado a pacientes Se ha identificado en el cromosoma ICSI (microinyección espermática), que presentan anormalidades Y la región susceptible de sufrir el estudio de microdeleciones del cromosómicas, azoospermia deleciones denominadas AZF (factor cromosoma Y ha cobrado especial obstructiva, hipogonadismo de azoospermia), que a su vez se importancia debido, por un lado hipogonadotrófico y patologías como dividen en tres regiones: AZFa, AZFb, a la posibilidad de transmitir esta varicocele, criptorquidia, infecciones. AZFc, en la que se encuentran genes alteración genética a la descendencia relacionados con la espermatogénesis. masculina y por otro lado a la relación MATERIALES Y MÉTODOS Las microdeleciones del cromosoma genotipo/fenotipo, ya que parece ser Y, tras el síndrome de Klinefelter, que deleciones que afectan a la región Se estudiaron un total de 460 muestras constituyen la segunda causa más AZFc son compatibles con la existencia desde marzo de 2005 hasta marzo frecuente de infertilidad masculina, de espermatogénesis residual que de 2011. A partir de ADN de sangre estando presente entre un 2-10% de podría permitir la recuperación periférica se realizó una amplificación hombres estériles. Esta incidencia de espermatozoides a partir de mediante 2 PCRs multiplex, usando puede aumentar si utilizamos unos biopsia testicular para ser utilizados siete marcadores microsatélites criterios más estrictos de selección: posteriormente en ICSI. Por todo ello, para analizar las 3 regiones AZF del oligozoospermia severa y azoospermia será necesario dar consejo genético a cromosoma Y: sY86 (región AZFa), no obstructiva. Las microdeleciones estas parejas. sY127, sY134 (región AZFb), sY254, más frecuentes son aquellas que afectan sY255 (región AZFc, gen DAZ). Como a la región AZFc (60%), seguidas AZFb El estudio de las microdeleciones control interno se incluyeron los genes (16%), y raramente afecta a la AZFa del cromosoma Y debe ofrecerse a SRY y ZFY, analizándose los productos de (5%). Microdeleciones que afectan a pacientes que presenten azoospermia PCR mediante electroforesis capilar. 2 o 3 regiones se diagnostican en un o concentraciones menores 1x106
- 186. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 184 RESULTADOS fue la AZFb , y 1 caso (7,7%) presentó del cromosoma Y es muy importante, microdeleción de las regiones AZFa + tanto por su capacidad de predecir la Desde marzo de 2005 hasta marzo del AZFb + AZFc. posible existencia de espermatogénesis presente año, se han analizado un residual, como por la necesidad de total de 468 muestras procedentes de CONCLUSIONES dar consejo genético ante la posible varones con problemas de esterilidad. transmisión de la deleción a la Del total analizado, en 455 casos El estudio de las microdeleciones del descendencia masculina. (96,3%) se descartó la existencia de cromosoma Y es una técnica simple, microdeleciones en Y; y en 13 casos económica y no invasiva, que nos La incidencia de microdeleciones en (3,7%) se diagnosticó la presencia de permite el diagnóstico genético varones con problemas de esterilidad microdeleciones en el cromosoma Y. De de algunos casos de la esterilidad en nuestro medio es de un 3,5% los pacientes afectos, 9 casos (69,2%) masculina. concordando con la encontrada en la presentaron deleción de la región AZFc literatura. completa, 2 casos (15,4%) presentaron Debido al reciente auge de la deleciones en las regiones AZFb + AZFc, reproducción asistida mediante ICSI, 1 caso (7,7%) la deleción afectada el diagnóstico de las microdeleciones 088: POSIcIÓN DEl ESPErMAtOZOIDE EN lA MIcrOINYEccIÓN Y SU INFlUENcIA EN lA FEcUNDAcIÓN A. Sáez, C. Muñoz, C. Olmedo, J. L. Soriano, I. Cuevas Hospital General Universitario de Valencia e-mail: alsaecue@etsia.upv.es INTRODUCCIÓN sometidas a tratamientos de y el 6,3% en la zona 4. Se analizó la tasa fecundación in vitro (ICSI) en la Unidad de fecundación de los diferentes lugares Desde el nacimiento en 1992 del de Reproducción Humana Asistida del de deposición del espermatozoide por primer niño mediante microinyección Hospital General Universitario, desde separado, siendo del 2,2% en zona 1, intracitoplásmica de espermatozoides el período comprendido entre abril de 69,8% en zona 2, 24,5% en zona 3 y 3,6% (ICSI), esta técnica se ha convertido 2009 y febrero de 2010. en zona 4, obteniéndose diferencias en una de las más relevantes dentro estadísticamente significativas. La chi- de la medicina reproductiva. El Durante el procedimiento de cuadrado obtenida fue de 0.037. proceso de microinyección es un paso microinyección se fue anotando la extremadamente importante para la posición en la que se depositaba el CONCLUSIONES correcta fecundación. Sin embargo, espermatozoide y posteriormente se técnicamente resulta complicado observó qué ovocitos habían fecundado. Las mayores tasas de fecundación se inyectar el espermatozoide en la Para poder establecer una relación se obtienen cuando los espermatozoides posición deseada debido a que este dividió el citoplasma ovocitario en 4 se depositan en la zona 2 y las peores procedimiento se ve influenciado por la zonas equivalentes: siendo la zona 1 la tasas en las zonas 1 y 4. La zona 3 tiene calibración del microinyector así como más cercana a la pipeta de Holding y la una tasa de fecundación intermedia, por las condiciones del citoplasma 4 la más alejada. quizá debido al posterior arrastre ovocitario, entre otros. del espermatozoide por la membrana Los datos obtenidos se analizaron ovocitaria a la zona descrita como 4. El OBJETIVO mediante el test chi-cuadrado usando el estudio sugiere que la composición del programa estadístico SPSS 11.0. Dado citoplasma ovocitario a nivel periférico El objetivo de este estudio es establecer que los datos analizados se obtuvieron y a nivel central es tan diferente que la posible relación entre el lugar de de forma consecutiva, se realizó puede estar afectando a la fecundación. la deposición del espermatozoide en aleatorización para evitar sesgos en los el citoplasma ovocitario durante la 495 ovocitos. microinyección y la tasa de fecundación observada. RESULTADOS MATERIAL Y MÉTODOS La muestra obtenida en la aleatorización fue de 244 ovocitos. El 4,2% de los Se recopilaron los datos de un total espermatozoides microinyectados de 495 ovocitos microinyectados quedaron depositados en la zona 1. El consecutivamente de 72 pacientes 67,6% en la zona 2, el 21,8% en la zona 3
- 187. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 185 089: APlIcAcIÓN DE lA SElEccIÓN ESPErMÁtIcA MEDIANtE IMSI EN PArEJAS cON tErAtOZOOSPErMIA. rESUltADOS PrElIMINArES C. Puche1, JC. Capdevila1, S. Rovira1, C. Castelló1, J. Massó1, M. Solans1, M. López-Teijón1,2, E. Velilla1 Institut Marquès1, Barcelona; Fundación Leonardo Marquès2, Barcelona e-mail: silvia.fernandez@institutomarques.com INTRODUCCIÓN clínico de este grupo de pacientes. A GII. Se analiza la tasa de fecundación, pesar de esto, no existe un consenso de embriones evolutivos, de embarazo La microinyección intracitoplasmática claro en cuanto a las indicaciones y de embarazo evolutivo. La media de de espermatozoides seleccionados clínicas donde la aplicación de esta embriones transferidos fue de 2,2. El morfológicamente mediante alta técnica presenta un beneficio. análisis estadístico se realiza mediante magnificación (IMSI) nos permite two-tailed test Chi-cuadrado (95% IC). visualizar los espermatozoides OBJETIVOS morfológicamente normales según RESULTADOS criterios de la OMS con ausencia o El objetivo de este estudio es valorar la presencia de una mínima cantidad de aplicación de la tecnología IMSI como No se detectan diferencias vacuolas. Diferentes publicaciones tratamiento en parejas con alteraciones estadísticamente significativas en han demostrado, tras la observación en la morfología espermática. ninguno de los parámetros analizados: a alta magnificación, una correlación tasa de fecundación (71.7%-GI vs entre una morfología normal de la MATERIALES Y MÉTODOS 71.4%-GII), de embriones evolutivos cabeza del espermatozoide y mayores (58.7 % -GI vs 44.5% -GII), de tasas de embarazo, así como menores Se incluyen un total de 70 ciclos de embarazo/transfer (34.3%-GI vs tasas de aborto, tanto en pacientes esterilidad de larga evolución que 44.5%-GII) y de embarazo evolutivo/ con fallos repetidos de implantación presentan <4% de formas normales en transfer (22.8%-GI vs 37.1%-GII). (Bartoov et al., 2002, 2003; Junca et la muestra seminal (Kruger et al. 1988). al., 2004; Berkovitz et al., 2005; 2006) GI: ICSI (n=35) y GII: IMSI-ICSI (n=35). CONCLUSIONES como en pacientes con altos niveles de Se descartan del estudio aquellos fragmentación del DNA (Hazout et al., ciclos con meiosis, fragmentación del Los resultados muestran una mayor 2006). La utilización de dicha técnica DNA y FISH alterados. Se seleccionan tasa de embarazo evolutivo utilizando para seleccionar en mayor medida los mediante IMSI únicamente los la técnica de IMSI en pacientes que espermatozoides morfológicamente espermatozoides normales sin vacuolas presentan teratozoospermia, aún así normales de una muestra seminal con o bien aquellos que presentan como los resultados no son estadísticamente elevado porcentaje de formas alteradas máximo dos vacuolas pequeñas que significativos. Consideramos que es (teratozoospermia) diagnosticada ocupan menos del 4% de la cabeza. Se necesario aumentar el número de casos mediante microscopía de baja microinyectan un total de 576 ovocitos, para confirmar estos resultados. resolución, podría mejorar el pronóstico 283 correspondientes al GI y 293 al 090: ¿EN QUÉ EStADIO EMBrIONArIO ES MEJOr trANSFErIr Y cONGElAr? EVAlUAcIÓN GENErAl DE lOS cIclOS DE FIV M. A. Carracedo, J. Ten, J. Guerrero, J. Llácer, R. Bernabeu Instituto Bernabeu e-mail: jten@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN en fresco serán elegidos los embriones no haya dado lugar a una gestación que morfológica y cinéticamente evolutiva. Con las nuevas técnicas de En la actualidad, en los tratamientos presenten mejor desarrollo y ‘los criopreservación que tenemos hoy día de fecundación in Vitro (FIV) no es restantes’ de buena calidad podrán ser (vitrificación) las tasas de gestación son extraordinario encontrarnos el día criopreservados para que la pareja los casi comparables a las obtenidas con de la transferencia embrionaria con utilice en un futuro, bien para tener embriones en fresco por lo que a la hora un elevado número de embriones de un nuevo hijo o bien en el caso de que de evaluar los resultados de los ciclos buena calidad. Para la transferencia la transferencia de embriones frescos de FIV debemos considerar tanto las
- 188. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 186 transferencias de embriones en fresco MATERIAL Y MÉTODOS (38.89 vs. 39.29) y tasa de embarazo como con embriones criopreservados. clínico acumulada (88.90 vs. 71.40) no Pero ¿en qué estadio embrionario es Análisis prospectivo randomizado de existen diferencias estadísticamente mejor transferir y congelar? 55 ciclos de FIV/ICSI con transferencia significativas (p>0,05). Para las de dos embriones, realizados desde variables % de ciclos con embriones Teóricamente, con la transferencia junio de 2009 hasta la actualidad en criopreservados (96.30 vs. 71.40) y % de blastocistos se obtendrían nuestro centro. Se establecen dos de embriones criopreservados (57.41 mejores tasas de implantación, mejor grupos de estudio: grupo A (n=27): vs. 30.95) sí que existen diferencias selección embrionaria, el número de ciclos transferidos en día 3 con al estadísticamente significativas embriones a transferir se reduciría menos 1 embrión categoría A y 2 (p<0,05) a favor del día 3. y habría una mejor sincronización embriones categoría B (criterios entre el embrión y el endometrio. Sin ASEBIR) en el día de la transferencia, CONCLUSIONES embargo, el riesgo de cancelación del y grupo B (n=28): ciclos transferidos ciclo por no transferencia es mayor en día 5 con al menos 1 embrión Según el diseño de nuestro estudio y las tasas de gestación acumuladas categoría A y 2 embriones categoría B se observa una tendencia a obtener por ciclo (transferencia en fresco más en día 3. Las variables analizadas son: mejores resultados con la transferencia transferencia de criopreservados) edad materna, tasas de fecundación, y congelación embrionaria en día 3. Hay pueden verse disminuidas, bien por embarazo clínico e implantación, % de más pacientes que congelan embriones, no tener la posibilidad de congelar ciclos con embriones criopreservados y el número de embriones para embriones, bien porque los embriones % de embriones criopreservados y tasa congelar es mayor y cuando se evalúa en estadio de blastocisto no sobreviven de embarazo clínico acumulada (ciclo globalmente el ciclo (tasas acumuladas) a la congelación-descongelación. en fresco más ciclo criopreservado). los resultados son mejores. Seguimos incluyendo pacientes en el estudio para OBJETIVO RESULTADOS ampliar el número de casos y reevaluar estos resultados. Determinar qué día es el más apropiado Para las variables edad materna (33.07 para la transferencia y congelación vs. 33.43), tasa de fecundación (73.01 embrionaria: estadio de células (día 3) vs. 75.51), tasa de embarazo clínico o estadio de blastocisto (día 5). (51.90 vs. 53.60), tasa de implantación 091: VAlIDEZ DE lA MAGNIFIcAcIÓN DE ESPErMAtOZOIDES cOMO PrUEBA DIAGNÓStIcA PrEVIA A IMSI R. Lafuente, G. López, J. Canals, D. Rey, E. Carballo y M. Brassesco CIRH-Clínica Corachan. Barcelona e-mail: rlafuente@cirh.es INTRODUCCIÓN ciclo de fecundación in vitro (FIV). Está movilidad o la fragmentación del ADN demostrado por otros autores el efecto espermático. Para poder realizar un buen diagnóstico negativo que tiene la vacuolización clínico en el varón es necesario disponer espermática y la fragmentación del MATERIAL Y MÉTODOS de técnicas que nos permitan valorar ADN sobre la calidad embrionaria y la la viabilidad de los espermatozoides tasa de embriones no evolutivos. Sin Se incluyeron 270 parejas estériles de desde distintos puntos de vista. embargo, se necesitan más estudios forma aleatoria, que acuden a realizarse Recientemente, han aparecido distintas que correlacionen estas técnicas y su un tratamiento de FIV a nuestro centro metodologías en este sentido como el importancia en tratamientos de IMSI. desde finales de 2009. estudio de la fragmentación del ADN, el estudio de la madurez espermática OBJETIVOS A todos los pacientes se les realiza mediante la unión al ácido hialurónico, un estudio seminológico completo, y también la alta magnificación de Se trata de valorar la utilidad del estudio siguiendo las recomendaciones de la espermatozoides. Todas estas técnicas de la magnificación espermática a 8000x OMS, y una determinación morfológica valoran cosas diferentes y resulta en pacientes que se van a someter a de alta magnificación con un de máximo interés poder evaluar su un tratamiento de FIV, como método microscopio invertido LeicaAM6000, utilidad y compararlas entre sí. diagnóstico y como prueba de viabilidad clasificando a los espermatozoides previa a una posible IMSI. Nos interesa en cuatro grados según la presencia La alta magnificación de además, correlacionar la información vacuolar. El análisis de la fragmentación espermatozoides o la fragmentación obtenida con otros parámetros como del ADN se realizó mediante la técnica del ADN son predictores del fracaso del la concentración espermática, la SCD (Halosperm, Halotech DNA, SL),
- 189. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 187 según protocolo del fabricante. Se De la misma manera, al considerar la diagnóstica en la que es necesario considera una fragmentación alterada movilidad, la tendencia es positiva, es mayor consenso a la hora de establecer a partir del 30% (Fernández JL, et al., decir, los pacientes con espermatozoides criterios de clasificación según grado de 2003). menos vacuolados presentan mejor vacuolización y el límite de normalidad movilidad. estándar, pero que ofrece información Se analiza la tendencia que muestran los valiosa de cara a poder orientar el tipo resultados al comparar la magnificación En cuanto a la fragmentación, también de tratamiento reproductivo aconsejado con la concentración, la movilidad y la resulta interesante observar que a a los pacientes. fragmentación del ADN. medida que aumentan los valores de fragmentación, también aumenta el Da una información precisa de las RESULTADOS índice de vacuolización. posibilidades de realizar una IMSI, al poder evaluar previamente el grado de Se observa una tendencia CONCLUSIONES vacuolización, y resulta evidente cómo positiva cuando se comparan los la magnificación se correlaciona con los espermatozoides menos vacuolados La magnificación espermática se parámetros básicos del seminograma y con la concentración espermática. puede definir como una nueva prueba con la fragmentación del ADN. 092: INFlUENcIA DEl trAtAMIENtO DEl SEMEN cON QUIMIOtrIPSINA EN cIclOS FIV/IcSI A. Ortiz, F. Monllor, G. Lozano, B. Vicente, A. Pérez, M. Jiménez Centro Extremeño de Reproducción Humana Asistida. Hospital Materno e Infantil de Badajoz e-mail: fabianmonllor@hotmail.comte@cirh.es INTRODUCCIÓN responsable de la movilidad y adhesión En cada par de muestras se analizaron del espermatozoide a la zona pelúcida. los siguientes parámetros: REM, %2PN, Tras la eyaculación, se activan en el %A+B y test de gestación. semen mecanismos dependientes de OBJETIVO factores que se originan en la glándula La relación entre el uso de QT y el test de de Cowper y en la próstata, que Nos planteamos analizar la repercusión gestación se analizó mediante tabla de favorecen la licuefacción del mismo. del tratamiento del semen con QT sobre el contingencia. Los otros tres parámetros REM (recuperación de espermatozoides se analizaron mediante el estadístico t Inmediatamente después de la móviles), el % de fecundación correcta de Student para muestras relacionadas. eyaculación en el vaso de recolección, (%2PN), el % de embriones de categoría En todas las comparaciones se calculó el semen es típicamente una masa A+B según la clasificación ASEBIR y el P valor, considerando una diferencia coagulada semisólida. Normalmente la la gestación en dos ciclos FIV/ICSI significativa cuando P<0,05. En la tabla muestra licua completamente con 15 distintos de una misma pareja en los de contingencia se calculó también el min a temperatura ambiente, siendo que, en uno de ellos fue necesario el Coeficiente de contingencia (C) que raro que tarde 60 min o más. tratamiento con QT y en el otro no. puede oscilar entre 0 (correlación nula) y 0,81 (correlación máxima). Para el En ocasiones las muestras pueden MATERIALES Y MÉTODOS análisis estadístico de los datos se no licuar, dificultando la evaluación utilizó el programa SPSS Statistics 17.0. del semen. En estos casos puede ser Se analizaron 110 muestras de semen necesario un tratamiento adicional obtenidas de 55 pacientes sometidos a RESULTADOS como la digestión enzimática utilizando ciclos FIV/ICSI en dos ocasiones cada enzimas proteolíticas como la uno, siendo necesario el uso de QT en De cada pareja de parámetros se quimiotripsina (QT). uno solo de los ciclos. obtuvieron los siguientes valores de P: Este tratamiento es utilizado en Las muestras de semen no licuadas 1ª.- REM sin QT-REM con QT: P=0.327 muestras de semen en las que pasados tras la recolección se sometieron a un 2ª.- %2PN sin QT-%2PN con QT: P= 0.447 30-60 min a 37oC no han licuado tratamiento de 3 min con QT utilizando 3ª.- %A+B sin QT-%A+B con QT: P=0.986 completamente. Sin embargo, podría un vaso Marq-10. Las muestras se afectar bioquímicamente al plasma capacitaron mediante técnica de swim- No se encontraron por lo tanto seminal y a la motilidad y viabilidad up y se utilizaron posteriormente diferencias significativas en ninguno de de los espermatozoides debido a que para fecundar los ovocitos mediante los tres pares analizados. podría alterar la actividad de la enzima inyección intracitoplasmática (ICSI) y/o α-glucoxidasa, presente en el semen y fecundación in vitro (FIV) convencional.
- 190. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 188 De la comparación entre el resultado CONCLUSIONES concluimos que el empleo de QT para del test de gestación y el uso de QT se conseguir la completa licuefacción de obtuvo un valor de P=1 y un Coeficiente Dado que no observamos diferencias las muestras de semen empleadas en de contingencia de C=0. Por lo tanto la significativas ni correlación entre el los ciclos FIV/ICSI es una herramienta diferencia en absoluto es significativa uso o no de QT con respecto al REM, el útil para agilizar el tratamiento de la y la correlación entre ambas variables %2PN, el %A+B y el resultado del test muestras previo a la técnica. es nula. de gestación en los casos analizados, 093: VArIABlES MOrFOlÓGIcAS Y MOrFOMÉtrIcAS PrEDIctOrAS DE GEStAcIÓN EN UN PrOGrAMA DE FIV-IcSI E. Lázaro, I. Molina, J. Pertusa, A. Debón, P.J. Fernández, A. Pellicer. Unidad de Reproducción Humana Asistida. Hospital Universitario La Fe, Valencia e-mail: ellzaib@etsia.upv.es INTRODUCCIÓN de 2009 y Marzo de 2010 que dieron lugar día 2 de desarrollo, con un porcentaje a gestación, y de 56 ciclos seleccionados de fragmentación menor del 35%, Uno de los problemas más importantes al azar durante el mismo periodo de sin alteraciones estructurales en la de las Técnicas de Reproducción tiempo que no dieron lugar a gestación. zona pelúcida, con una media para el Asistida son las gestaciones múltiples perímetro del embrión de 211 micras, que suponen un riesgo importante Se evaluaron variables clínicas de con todas las blastómeras con apariencia para la salud materno-fetal. Estos la pareja (edad de la mujer, factor esférica (factor de circularidad 0,91), con riesgos solo los podemos eliminar varón severo, transferencia selectiva una media para el área del blastómero disminuyendo el número de embriones y número de embriones transferidos y de 3270 micras2, con una media para el a transferir. Para disminuir el número congelados); variables embrionarias radio del blastómero de 32 micras y con de embriones transferidos sin disminuir morfológicas (número de células, un espesor de la zona pelúcida de 14 las tasas de gestación y de implantación simetría y fragmentación de las micras aproximadamente. es imprescindible mejorar las técnicas blastómeras y anomalías estructurales actuales de selección embrionaria de la zona pelúcida) y las variables CONCLUSIONES desarrollando nuevas herramientas que embrionarias morfométricas (área y permitan seleccionar a los embriones perímetro, radio del círculo equivalente Las variables morfométricas permiten con un mayor potencial de implantación. y factor de circularidad del embrión y de disminuir la subjetividad de los sistemas cada una de sus blastómeras y espesor de de clasificación embrionarios actúales, OBJETIVOS la zona pelúcida). presentando una mayor capacidad discriminante y predictora de gestación. En el presente trabajo, se pretende Se compararon las variables clínicas de validar la capacidad predictiva de la pareja y las variables embrionarias La variable factor de circularidad de diversos parámetros morfológicos y (morfológicas y morfométricas) en las blastómeras podría sustituir a las morfométricos a partir del análisis de función de la gestación. variables simetría e igualdad de las imágenes de embriones que ya han blastómeras. La dimensión del embrión sido transferidos y de los cuales se RESULTADOS y de sus células, descrito con las conoce su destino. La incorporación variables: radio del círculo equivalente de estas variables morfométricas a los No se observaron diferencias y sus parámetros derivados, es un sistemas de clasificación embrionaria significativas para las variables clínicas factor objetivo a tener en cuenta en la actuales permitirá mejorar y facilitar de la pareja en función de la gestación. predicción de la gestación. considerablemente la selección Ambos grupos son homogéneos y las embrionaria previa a la transferencia. diferencias que se puedan encontrar Proponemos un nuevo sistema de parecen debidas a las características clasificación basado en las variables MATERIAL Y MÉTODOS propias de los distintos embriones y morfológicas: número de células no a efectos derivados de los ciclos y porcentaje de fragmentación y Se analizaron fotografías de 217 de FIV-ICSI de los que proceden. La en las variables morfométricas: embriones procedentes de 112 ciclos capacidad discriminante de las variables factor de circularidad y radio del de FIV-ICSI realizadas inmediatamente morfométricas fue muy superior a la de círculo equivalente del embrión y las antes de su transferencia. Se las variables morfológicas. Todo ello blastómeras, y espesor de la zona transfirieron 1, 2 ó 3 embriones en día 2 permite plantear el siguiente perfil para pelúcida. Este nuevo sistema mejoraría y de desarrollo. Los embriones procedían los embriones con mayor capacidad facilitaría la selección de los embriones de 56 ciclos realizados entre Diciembre para gestar: embriones de 4 células en previa a la transferencia.
- 191. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 189 094: cONtrOl DE lAS cONDIcIONES MIcrOAMBIENtAlES EN INcUBADOrES K-SYStEMS G-185 SIN HUMEDAD Y cOMPArAcIÓN cON INcUBADOrES cONVENcIONAlES M. Vila, E. Ferrer, P. Muñoz, M. Ferrer, M. Ruiz Jorro CREA, Centro Médico de Reproducción Asistida, Valencia e-mail: maria.vila@creavalencia.com INTRODUCCIÓN placas de cuatro pocillos con 500µl normales de cultivo del G-185 respecto de medio G-1 (Vitrolife) a las 24h, al Heracell1-150 (286, 389 y 541 mOs a La introducción de incubadores 48h y 72h de equilibrado con Micro- las 24h, 48h y 72h, frente a 271, 266 y bench-top en los laboratorios de Osmómetro (modelo 3300 de Advanced 273 mOs en el Heracell1-150). embriología, obliga a una readaptación Instruments). en determinados procedimientos. Cuando acoplamos un sistema externo En nuestro caso, tras la adquisición Las condiciones generales del de humidificación a la cámara grande de incubadores K-Systems G-185 laboratorio (temperatura, humedad, del G-185 y medimos la osmolaridad de funcionando en condiciones de cultivo presión positiva, renovaciones, etc.) 1ml, 1,5 ml y 2ml de medio equilibrado con hipoxia controlada y sin humedad, estuvieron siempre controladas. en un tubo Falcon 2003 obtenemos unos nos planteamos realizar un estudio valores de 291, 271 y 259 mOs. comparativo de las condiciones RESULTADOS microambientales, respecto a un CONCLUSIONES incubador convencional. La cámara de cultivo del G-185 está más fría que la del Heracell-150 (34,88+ 0,14 • Las condiciones de temperatura y OBJETIVOS ºC y 34,99 + 0,12 ºC vs 37,25 + 0,05 ºC y osmolaridad en un incubador G-185 36,95 + 0,06 ºC) pero la temperatura son muy estables. Análisis de Temperatura y Osmolaridad de la microgota, medida por duplicado, en la cámara y en la gota de medio de permanece igual de estable (36,71 + 0,09 • La temperatura en las microgotas cultivo de un incubador K-Systems ºC y 36,82 + 0,06 ºC vs 37,26 + 0,05 ºC y de cultivo no se ve afectada por la G-185 y comparación con un incubador 36,38 + 0,08 ºC) en ambos incubadores, entrada, en la cámara de cultivo, del convencional (Heracell-150). debido a la estabilidad de la temperatura gas, a menor temperatura. de la base calefactada del G-185 (37,83 + Valoración de la posibilidad de utilizar 0,05 ºC y 37,64 + 0,03 ºC). • Trabajando bajo aceite mineral, la la cámara grande del G-185 con una osmolaridad de las gotas de cultivo entrada de gas y un sistema externo de La humedad en el Heracell-150 fue de es la misma con una atmósfera humidificación. 96,4+ 0,06% mientras que en la cámara humidificada o sin humidificar. grande adaptada del G-185 fue de solo MATERIAL Y MÉTODOS un 75,3+ 0,09%. • No es posible trabajar con placas de cuatro pocillos sin aceite mineral en Monitorización durante 72h de La osmolaridad de las microgotas de el G-185. temperatura y humedad en el interior medio de cultivo G-1 cubiertas con de los incubadores (Heracell-150 y aceite y preequilibradas durante 24h, • La humedad máxima alcanzada K-Systems G-185) así como temperatura 48 y 72h fue de 261,263 y 266 mOs en en la cámara grande del G-185 de las microgotas de medio de cultivo, el Heracell-150 y de 263, 269, 266 mOs acoplando una entrada externa de mediante sondas termopar de tipo en el G-185. gas prehumidificado y atemperado, K 0,1 mm con calibración ENAC. es insuficiente para trabajar con Monitorización de temperatura de Se observa un importante aumento volúmenes inferiores a 2 ml de medio la base calefactada del G-185 con de la osmolaridad al incubar 500uL de cultivo sin aceite. idéntica metodología. Medición de de medio IVF sin cubrir de aceite en osmolaridad sobre gotas de 40µl y placa de cuatro pocillos en las cámaras
- 192. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 190 095: cOMPArAtIVA DE rESUltADOS DE DEScONGElAcIÓN lENtA VS DESVItrIFIcAcIÓN L. Andrés Criado, M. Sánchez de Burgos, M. Morales Morales, M .Cuadros, J.L. Gómez Palomares, E. Hernández, J. Cuadros Clínica de Medicina de la Reproducción y Ginecología FIVMadrid e-mail: jcuadros@fivmadrid.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS CONCLUSIÓN La vitrificación de embriones es una Se realizó un estudio prospectivo y El análisis estadístico mediante el test técnica relativamente nueva que se va randomizado desde Enero de 2010 de Chi-cuadrado no mostró diferencias incorporando como técnica de rutina hasta Febrero de 2011. La técnica de significativas en los resultados en los centros de reproducción asistida. congelación en cada paciente se decidió obtenidos con ambas técnicas, si bien Desde mediados del año 2008 hemos mediante el programa estadístico la tasa de aborto es considerablemente ido implantando progresivamente dicha Research Randomizer Form v4.0. más alta en los ciclos de desvitrificación técnica en nuestro centro. de embriones. Se llevaron a cabo un total de 133 OBJETIVO descongelaciones lentas vs 105 desvitrificaciones. Considerando que hemos completado la curva de aprendizaje, nos interesa RESULTADOS comparar los resultados obtenidos con desvitrificación versus los que tenemos Los resultados obtenidos los con la descongelación lenta tradicional, presentamos en la siguiente tabla: tanto en tasas de embarazo como en tasas de aborto. Nº de ciclos hCG + Gest. clínica Aborto Emb. evolutivo Descongelación lenta 133 33,1% (44/133) 27,1% (36/133) 16,6% (6/36) 22,5% (30/133) Desvitrificación 105 37,1% (39/105) 33,3% (35/105) 34,3% (12/35) 21,9% (23/105) 096: BENEFIcIO DE lA tÉcNIcA DE EclOSIÓN ASIStIDA EN GrUPOS SElEccIONADOS DE PAcIENtES INFÉrtIlES P. Torres, C. Ribes, I. Peinado, M. De la Orden, P. J. Fernández, V. Montañana, JM. Rubio y A. Pellicer Servicio Ginecología (Reproducción Asistida), Hospital Universitario La Fe, Valencia. e-mail: patriblanc81@hotmail.com INTRODUCCIÓN (mínimo 2 transferencias con embriones repartieron aleatoriamente en grupo en fresco sin gestación) y edad materna de estudio (realizándose EA=52) y El fallo de implantación podría deberse avanzada (mayor de 36 años, sin control (NoEA=129). Los parámetros a la imposibilidad del blastocisto de gestaciones previas). estudiados fueron: características escapar de su zona pelúcida (ZP). físicas de la pareja, parámetros básicos La edad avanzada materna conlleva MATERIAL Y MÉTODOS de estimulación, calidad embrionaria cambios en la arquitectura de la ZP los y resultados de los ciclos (tasa de cuales también dificultarían la eclosión. Estudio prospectivo que incluyó 181 gestación (TG), tasa de implantación ciclos consecutivos de pacientes cuyos (TI), tasa de aborto (TA) y tasa de OBJETIVO criterios de inclusión fueron: función niño en casa (TNC)). Los parámetros reproductora normal, más de 36 años morfométricos se analizaron mediante Evaluar la eficacia de la técnica de y/o tercer ciclo FIV/ICSI en el Hospital el programa de análisis de imagen Eclosión Asistida (EA) en pacientes Universitario La Fe de Valencia en los CRONUS®. El análisis estadístico de los con fallo de implantación recurrente años 2009 y 2010. Las pacientes se datos se realizó con el programa SPSS
- 193. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 191 18.0. Los parámetros cuantitativos TNC (16,3% EA (8/49) vs NoEA 19,4% NoEA 16.7% (1/6) ,p-valor=0.190) y fueron comparados usando el test –T o (24/124); p-valor = 0,644). TNC (EA 4,5% (1/22) vs NoEA 11,6% U de Mann Whitney; para los parámetros (5/43) ; p-valor = 0,655). cuantitativos X2 o Fisher, utilizándose 1.- Fallo implantación: EA (n=36) un nivel de a igual a 0,05. y NoEA (n=95). La realización de la CONCLUSIÓN técnica de Eclosión tampoco mostró RESULTADOS diferencias significativas: la TG (EA Nuestros datos muestran TG similares 30.6% (11/36) vs NoEA 28.4% (27/95) , tanto en la población estudiada como El estudio estadístico de los datos p-valor=0,810); TI (EA 14,7% (11/75) vs tras seleccionar pacientes con fallos mostró homogeneidad de los grupos NoEA 15,8% (32/203); p-valor=0,705); de implantación previos, demostrando con respecto a todos los parámetros TA (EA 44,4% (4/9) vs NoEA 28,6% que el fallo repetido de implantación evaluados en la población estudiada y (7/26) , p-valor=0,416) y TNC (EA 14,7% no es una indicación para la realización tras seleccionar los pacientes por: fallo (5/34) vs NoEA 19,1% (18/94) ; p-valor de la técnica de Eclosión Asistida. de implantación o edad avanzada. = 0,563). No obstante, la tasa de gestación e implantación tras EA parece ser más En la población estudiada no se observó 2.- Edad avanzada: EA (n=30) y NoEA alta, sin llegar a ser significativa, en diferencias significativas entre los (n=60). La realización de la técnica pacientes con edad avanzada. Futuras grupos evaluados en relación a: TG de Eclosión o no en esta selección de investigaciones podrían ayudar a (EA 30,8% (16/52) vs NoEA 29,5% pacientes, tampoco mostró diferencias evaluar la eficacia de la EA en este (38/129); p-valor = 0,861); TI (EA significativas: la TG (EA 28.0% (7/25) vs grupo de mujeres con mayor riesgo de 16,8% (18/107) vs NoEA 18% (49/272); NoEA 17,8% (8/45) , p-valor=0,318); TI endurecimiento en la ZP. p-valor = 0,460); TA (EA 33,3% (3/9) vs (EA 15,1% (8/53) vs NoEA 10,5% (10/95) NoEA 25,9% (7/27); p-valor = 0,667) y ; p-valor=0,523); TA (EA 75% (3/4) vs 097: PrOtOcOlO cOrtO DE ANÁlISIS DE MUtAcIONES PUNtUAlES EN El DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl DEl SÍNDrOME DE DEPlEcIÓN DEl ADN MItOcONDrIAl DE tIPO POlG1 Á. Gómez Duro1, M. Martínez-Fresno1, P. Eibes Peteiro1, A. Sotillo, J. Muñoz2, C. Zonza2, E. Fernández1 1 Geniality Diagnóstico Genético, Madrid, 2Instituto Madrileño de Fertilidad, Madrid e-mail: agomez@geniality.es INTRODUCCIÓN Este tipo de estudios de informatividad célula, en este caso, aplicado al estudio se realizan analizando marcadores tipo de mutaciones en el gen POLG1 en Las enfermedades mitocondriales short tandem repeat (STRs), colindantes Diagnóstico Genético Preimplantacional son un grupo heterogéneo de a la mutación para establecer la (DGP). trastornos, secundarios a un defecto segregación, identificando los en el metabolismo energético debido cromosomas portadores de los padres y MATERIAL Y MÉTODOS a una disfunción del sistema de el estudio mediante minisecuenciación fosforilación oxidativa. La mayoría de las mutaciones implicadas. Se estudiaron las muestras de ADN de las enfermedades que se inician Para mejorar el rendimiento de la provenientes de la pareja, la niña en la edad pediátrica se deben a minisecuenciación en una sola célula, fallecida, así como los padres de ella y la mutaciones en genes nucleares y son se realizan de forma rutinaria dos madre de él, con el fin de establecer la de herencia recesiva. Presentamos rondas de amplificación (nested-PCR) segregación del cromosoma 15 y poder el caso de una pareja que consulta (Figura 1). Para completar este proceso detectar posibles recombinaciones que porque han tenido una niña, fallecida se requiere un total de 7 horas. pudieran haber ocurrido en la niña. antes del año de edad por enfermedad neurodegenerativa de evolución OBJETIVO Se realiza el estudio de informatividad, rápida, diagnosticada de un síndrome mediante PCR multiplex, para identificar de depleción del ADN mitocondrial de Desarrollar un protocolo de los marcadores STR informativos y semi- tipo autosómico recesivo y cuyo estudio minisecuenciación mediante gradiente informativos para el DGP (D15S1046, genético revelaba la presencia de dos de concentración de primers en una sola D15S979, D15S202, D15S116, D15S127). mutaciones puntuales en heterocigosis ronda de amplificación, que permita Se diseñaron primers para el estudio en el gen POLG1 (15q25). acortar el protocolo de estudio de por minisecuenciación (SNaPshot®, mutaciones puntuales en una sola Applied Biosystems) de las mutaciones
- 194. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 192 en POLG1: C752T (p.T251I) en el EXON En cuanto al estudio en embriones la CONCLUSIÓN 3 y G2584A (p.A862T) en el EXON 16 y paciente se encuentra actualmente en un protocolo para el estudio de estas protocolo de estimulación ovárica. El tiempo de análisis y la cantidad de mutaciones en un solo paso y posterior ADN disponible en la célula biopsiada minisecuenciación, consistente en RESULTADOS son limitaciones en DGP. La metodología emplear de forma simultánea 3 primers descrita mejora la amplificación de con diferentes concentraciones, El estudio de informatividad permitió mutaciones puntuales en una sola célula prescindiendo de la segunda ronda de determinar los STRs informativos y permite acortar en 2 horas los tiempos amplificación (Figura 1). (D15S979, D15S202 y D15S127) y semi- de reacción en minisecuenciación, informativos (D15S1046, D15S116) en así como reducir la manipulación, Tras la puesta a punto del método la la pareja. minimizando contaminaciones y errores (temperaturas de amplificación, mezclas diagnósticos. Tras la biopsia, el proceso y tiempos de reacción) se confirmó el Las dos mutaciones se amplificaron de que incluye la lisis alcalina, whole protocolo en linfocitos aislados de sangre forma eficaz y según el método descrito, genome amplification y genotipado de periférica. Se analizaron 20 linfocitos tanto en ADN de sangre periférica como las blastómeras requerirá un total de 8 de cada uno de los padres (genotipos: en los linfocitos aislados. La eficacia de horas, permitiendo la transferencia en C752T/ wt y G2584A /wt) previa lisis amplificación global fue del 97 %. No se día +4. alcalina y amplificación tipo Whole detectó contaminación en ninguna de Genome Amplification (GenomiPhi V2). las células analizadas y la tasa de allele drop-out fue del 3%. Figura 1. Esquema de los protocolos análisis de mutaciones en DGP. Protocolo tradicional y desarrollado 098: INFlUENcIA DE lA MOrFOlOGÍA ESPErMÁtIcA EN lOS rESUltADOS clÍNIcOS Y PErINAtAlES DE cIclOS DE FIV cONVENcIONAl D. Pabón, M. Molla, M. Ojeda, M. Martínez, N. Torres, L. Rodríguez, S. Portela, E. Muñoz. J. Remohí. IVI-VIGO e-mail: dina.pabon@ivi.esniality.es INTRODUCCIÓN del varón. La Organización Mundial de criterios de la OMS de 2010 se ha la Salud (OMS) consideró inicialmente descendido al 4%. La mejor manera La subjetividad en la apreciación de la normalidad cuando la proporción de de estimar el efecto de la morfología morfología hace discrepar a muchos espermatozoides normales era de un de los espermatozoides es evaluando autores sobre el valor de la morfología 50%, posteriormente bajó al 30%, su impacto en los tratamientos de FIV estricta con la funcionalidad después con el criterio estricto de convencional espermática y con el potencial fértil Kruger cayó al 14% y con los nuevos
- 195. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 193 OBJETIVO RESULTADOS CONCLUSIÓN Nuestro objetivo es evaluar la influencia Se incluyen 313 ciclos de FIV en los Según nuestros resultados en ciclos de de la morfología espermática en los que no encontramos diferencias FIV convencional, existe una tendencia resultados clínicos y perinatales significativas entre el número de a mejorar los resultados de fecundación de nuestros tratamientos de FIV embriones transferidos por ciclo, y gestación con el porcentaje de convencional. la edad de las pacientes, ni el espermatozoides normales. Hemos número de espermatozoides usados encontrado diferencias significativas MATERIALES Y MÉTODOS en la fecundación de los ovocitos entre la tasa de fecundación y gestación obtenidos. Se encontraron diferencias entre el grupo A de morfología menor de Análisis retrospectivo en los que se estadísticamente significativas en 4% y el resto de grupos. La morfología incluyen exclusivamente tratamientos las tasas de fecundación y gestación, de espermatozoides levemente de FIV convencional realizados en cuando comparamos los resultados anormal o normal no tiene influencia IVI-VIGO desde 01/06/2006 hasta de semen con teratozoospermia de evidente en la tasa de gestación ni en el 30/06/2010. La base para valorar morfología normal ≤ 4% (grupo A) con los nacimientos. La morfología normal la morfología fue el criterio estricto aquellos que tenían mayor porcentaje jugó en nuestro estudio un papel de Kruger en el que la normalidad es normal de espermatozoides. La tasa de limitado en predecir los resultados y el considerada cuando hay más del 14% la fecundación, gestación y RNV para estado de los recién nacidos vivos en de espermatozoides morfológicamente los grupos fueron respectivamente A: ciclos de FIV convencional. La exactitud normales. Para el estudio se dividieron 4 57.67%, 14.9% y 11,76%; B: 72.52%, de la clasificación morfológica puede grupos según el porcentaje morfológico 53.86% y 52.87%; C: 72.65%, 54.04% y ser eficaz a la hora de aconsejar a seminal normal (N): A: .≤4%N, B: 53.84%; D: 74.26%, 61.35%. y 72,72%. los pacientes su tratamiento y sus 5–9%N, C: 10-13%N y D: ≥14%N. Se Ninguno de los RNV hasta ahora, expectativas, pero un estudio diseñado relacionó la morfología con la tasa ha mostrado defectos congénitos. para este propósito con un número de fecundación, la tasa de gestación No se han encontraron diferencias mayor de casos sería necesario para de cada ciclo de FIV y también con los estadísticamente significativas entre corroborar estos hallazgos. resultados de embarazo clínico y estado la tasa de aborto, embarazo ectópico, de los Recién Nacidos Vivos (RNV) de los parto prematuro, ni periodo gestacional diferentes grupos. Los protocolos de medio. En los RNV no se han encontrado estimulación de las pacientes fueron los diferencias entre las tallas y pesos de rutinarios. los RNV en los cuatro grupos. 099: EStUDIO cOMPArAtIVO DE lOS SEMINOGrAMAS DIAGNOStIcADOS SEGÚN lOS crItErIOS DE lA OMS 1999 VS OMS 2010 L. Julià; M. Hugas; M. Fernández Reig; J. Sarquella Ventura Unitat de Reproducció Humana i Diagnòstic Genètic. Clínica Girona. e-mail: labfiv@girofiv.co INTRODUCCIÓN Parece, por tanto que, con estos nuevos según si se utilizan los valores de parámetros se aumentará el conjunto referencia que establece la OMS de 1999 o Los últimos años se ha planteando la de seminogramas con resultado de los valores que establece la OMS de 2010. necesidad de revisar los valores de normozoospermia. referencia de los parámetros seminales MATERIAL Y MÉTODOS que se analizan en el seminograma. Esta circunstancia podría tener su importancia a la hora de establecer Estudio retrospectivo de 739 La Organización Mundial de la Salud las indicaciones masculinas de los seminogramas de pacientes que (OMS), en el año 2010, ha presentado tratamientos en los programas de acudieron a nuestro centro para realizar los nuevos criterios en los que se reproducción asistida. un estudio de infertilidad entre los años observa una tendencia a reducir los 2005 y 2010. valores límite que permiten considerar OBJETIVO un semen como normal. Las muestras de semen de los pacientes El objetivo de este estudio es analizar el fueron recogidas por masturbación y grado de variación y su significancia en siguiendo las directrices que marca la los diagnósticos de los seminogramas OMS.
- 196. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 194 Se valoraron los siguientes parámetros Las muestras se agruparon únicamente 11.5. Considerando estadísticamente seminales: volumen, concentración, según si el diagnóstico era: significativos los valores de p<0.05. movilidad total, movilidad grado a, b y normozoospermia, oligozoospermia, c y morfología. astenozoospermia y teratozoospermia. RESULTADOS No se tuvieron en cuenta, por tanto, la De cada una de las muestras, después de combinación de más de un parámetro. Resultados y porcentajes obtenidos efectuar el seminograma, se realizaron para cada uno de los diagnósticos según dos diagnósticos: uno con los criterios Los resultados obtenidos se analizaron los criterios de la OMS utilizados: de la OMS de 1999 y el otro con los estadísticamente mediante la prueba- criterios de la OMS de 2010. chi del paquete estadístico SPSS Normozoospermia Oligozoospermia Astenozoospermia Teratozoospermia OMS 1999 244 (33%) 216 (57%) 392 (70%) 269 (92%) OMS 2010 488 (67%) 163 (43%) 167 (30%) 24 (8%) p<0.0001 p=0,9393 p<0.0001 p<0.0001 Después de analizar los resultados diagnósticos con astenozoospermia y observándose una reducción de las se puede ver que en los diagnósticos teratozoospermia respectivamente. indicaciones masculinas. normozoospermia, astenozoospermia y teratozoospermia existen diferencias Este hecho se puede atribuir a la Con la experiencia actual, también se significativas según si se utilizan disminución de los valores de referencia constata que los anteriores valores los criterios de la OMS 99 o los de OMS 10 vs OMS 99, en los parámetros de referencia eran quizás demasiado 2010. Sin embargo no hay diferencias que se tienen en cuenta para realizar estrictos. significativas en el diagnóstico de la estos diagnósticos. oligozoospermia. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: En el caso de las oligozoospermias CONCLUSIONES puede ser lógico que no observemos - Manual de laboratorio de la OMS diferencias porque ambas clasificaciones para el examen del semen humano Los resultados obtenidos en este trabajo de la OMS tienen valores de referencia y de la interacción entre el semen y nos demuestran que aplicando los muy parecidos para el parámetro que el moco cervical. Cuarta Edición. Ed. criterios de referencia de la OMS 2010 valora este diagnóstico (nº spz totales). Panamericana 2001. aumenta significativamente el número de seminogramas diagnosticados con Según la nueva valoración se establecerá -WHO laboratory manual for the normozoospermia y sin embargo se una reestructuración de las indicaciones Examination and processing of human reducen de forma significativa los de los tratamientos de reproducción, semen. Fifth edition. 100: crIOPrESErVAcIÓN DE ZIGOtOS ANtE El rIESGO DE HIPErEStIMUlAcIÓN OVÁrIcA N. Gimbernat, J. Puig, J. Reinal, I. Vila, A. Cuartiella, A. Prat, M. Font. Centre de Genética Girona e-mail: info@centredegeneticagirona.com INTRODUCCIÓN OBJETIVO MATERIAL Y MÉTODOS Cuando hay un alto riesgo de Analizar los resultados de la Realizamos un estudio retrospectivo hiperestimulación ovárica, una congelación electiva de zigotos en de 29 ciclos de fecundación in vitro de las estrategias para evitarla es nuestro centro y valorar su continuidad con riesgo de hiperestimulación congelar todos los zigotos y realizar la como estrategia válida frente al riesgo ovárica entre mayo 2004 y enero 2010. transferencia en un ciclo posterior, una de hiperestimulación ovárica. Se trata de 27 pacientes de edades vez recuperados los niveles hormonales. comprendidas entre 28 y 41 (33,4 de
- 197. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 195 media) y con un nivel de estradiol el día embrión, 33 casos 2 embriones y en consiguieron 2 embarazos evolutivos de la punción folicular de 3.702,93 pg/ 13 casos 3 embriones (promedio 2,2 a partir de una única estimulación ml de promedio (mín 2.192, máx 5.600). embriones/criotransfer). No se canceló hormonal y punción ovárica, aunque Media de folículos puncionados 25, ningún ciclo. De las 27 pacientes, en dos transferencias consecutivas: en promedio 19 oocitos/punción. 6 desarrollaron hiperestimulación el primer caso con resultado de 1 niño ovárica (22,2 %), 3 leves y 3 moderadas en casa /transferencia (1+1) y en el En todos los ciclos se congelaron todos con evolución favorable. segundo 3 niños en casa (1+2). los zigotos (promedio 11 zigotos/ciclo) con un total de 321 zigotos congelados RESULTADOS CONCLUSIONES según el protocolo lento de Lasalle et al. 1985. En los 29 ciclos se obtuvieron 18 Según los datos analizados la gestaciones clínicas (36,7 % / criopreservación de zigotos presenta La descongelación se realizó el tercer día transferencia, 62 %/ciclo, 66,6 %/ unos resultados excelentes: permite de tratamiento hormonal sustitutivo. paciente), 4 abortos de primer minimizar el riesgo de hiperestimulación Se realizaron 49 transferencias (1,8 trimestre, y las 14 restantes finalizaron y realizar varias transferencias a partir trans/paciente). En 40 de los casos los con éxito. Por lo tanto la tasa de de una única estimulación hormonal y pronúcleos se dejaron en cultivo hasta gestación evolutiva y niño en casa punción ovárica. La tasa de gestación el día siguiente (+2) y se transfirieron en por criotransfer fue de 28,5 %, 48,2 evolutiva (48,2 % por ciclo y 51,58 fase de 4 células. En 4 casos se alargó el % por ciclo y 51,58 % por paciente. % por paciente) respalda totalmente cultivo a día +3 y en 5 hasta blastocisto, Tasa de implantación del 18,5 % (20 la opción como muy rentable. Estos transfiriéndose en día +5/+6. embriones implantados de los 108 datos pueden mejorar aún a medida transferidos). De los 14 embarazos, 2 que las nuevas técnicas de congelación De los 244 zigotos descongelados se fueron gemelares (14,2 %): en ambos (vitrificación) nos permitan una más seleccionaron 108 para transferir: casos las pacientes eran menores de alta recuperación embrionaria post- en 3 casos transferencia de un único 35 años (30 y 32). En dos ciclos se descongelación. 101: EFEctO DE lA ADIcIÓN DE HYAlUrONAN EN El MEDIO DE cUltIVO SOBrE El DESArrOllO EMBrIONArIO Y crIOtOlErANcIA DE EMBrIONES BOVINOS PrODUcIDOS IN VItrO Roser Morató1, Dolors Izquierdo2, Maria Teresa Paramio2, Teresa Mogas1 1 Departament de Medicina i Cirurgia Animals. 2Departament de Ciència Animal i dels Aliments. Facultat de Veterinària. Universitat Autònoma de Barcelona. e-mail: rmoratomolet@gmail.com Las posibilidades de aplicación de esta diferencia se puede mejorar bien bovinos obtenidos tras un procesos de las tecnologías reproductivas in vitro modificando las condiciones de cultivo MIV/FIV, se asignaron aleatoriamente a son múltiples y presentan un elevado o bien modificando los protocolos uno de los cuatro medios de cultivo: (1) interés en el caso del ganado bovino. “estándares” de crioconservación SFB; (2) BSA; (3) SFB+HA; (4) BSA+HA. La producción de embriones in vitro de los embriones. Diferentes autores A las 48h post-inseminación (pi), se (PIV) a partir de ovocitos obtenidos han descrito el potencial del ácido valoró la división embrionaria mientras de vacas de elevado valor genético es hialurónico (hyaluronan; HA), un que el desarrollo hasta el estadio de una herramienta que ofrece nuevas glicosaminoglicano presente en los blastocisto se evaluó a los días 7 y 8 perspectivas para la aceleración del fluidos oviductales y uterinos bovinos, pi. A día 7 pi, se vitrificaron aquellos progreso genético. Si a la producción para mejorar el desarrollo embrionario blastocistos expandidos y eclosionados. in vitro de embriones, le añadimos hasta el estadio de blastocisto y Después de su calentamiento, los los procesos de crioconservación, la aumentar su supervivencia tras blastocistos se transfirieron de nuevo conservación de embriones animales y su crioconservación (Block et al., a las gotas de cultivo correspondiente y su almacenaje permite la conservación Theriogenology 71: 1063-71. 2009). se valoró su supervivencia a las 3 y 24h del material genético del macho posteriores. Paralelamente, a día 7 pi, y la hembra y tiene un potencial El objetivo de este estudio fue evaluar se fijaron algunos de los blastocistos enorme en la protección y manejo el efecto de la adición de hyaluronan para la tinción diferencial ICM/TE. de especies y en el mantenimiento durante el período de cultivo de su heterocigocidad genética. embrionario in vitro en el desarrollo La adición de 1 mg/mL de hyaluronan al La criotolerancia de los embriones embrionario y su criotolerancia tras ser cultivo embrionario no tuvo efecto en obtenidos in vitro es mucho menor a la sometidos a un proceso de vitrificación/ los porcentajes de división embrionaria de los embriones in vivo. Se cree que calentamiento. Para ello, zigotos (72.9%; 67.1%; 71.8% y 70.5%
- 198. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 196 para los grupos SFB, BSA, SFB+HA y La adición de hyaluronan al cultivo al cultivo de embriones bovinos no BSA+HA, respectivamente) ni tampoco no mostró diferencias significativas tuvo efectos en los porcentajes de en el desarrollo hasta el estadio de en el número total de células de división, blastocistos o supervivencia blastocisto a día 7 (13.7%; 12.9%; los blastocistos con respecto a sus tras un proceso de vitrificación/ 15.0% y 15.1% para los grupos SFB, BSA, controles. Sin embargo, se observó un calentamiento. No obstante, la calidad SFB+HA y BSA+HA, respectivamente). incremento significativo de la ratio ICM/ de los blastocistos medida como la ratio A nivel de supervivencia después de la TE en los blastocistos procedentes del ICM/TE aumentó significativamente vitrificación/calentamiento, la adición cultivo embrionario BSA suplementado para aquellos blastocistos obtenidos de hyaluronan proporcionó porcentajes con HA comparado con su control del medio de cultivo suplementado con similares de blastocistos re-expandidos (0.44±0.12 y 0.31±0.05; BSA+HA y BSA BSA y hyaluronan. y eclosionados a las 3 (~76%) y a las respectivamente). Estos resultados 24h post-calentamiento (~64%). sugieren que la adición de hyaluronan 102: ElONVA: PrIMErOS cIclOS EN El INStItUtO BErNABEU M. A. Carracedo, J. Ten, J. Guerrero, R. Bernabeu, J. Llácer CENTRO: Instituto Bernabeu e-mail: jten@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN a la cadena β de la FSH humana. Por su durante el mes de marzo de 2011. Las capacidad para iniciar y mantener el estimulaciones se iniciaron con una Hasta ahora, las pacientes que crecimiento folicular múltiple durante inyección de Elonva 150 en protocolo precisan recibir gonadotropinas para la una semana entera, una única inyección con antagonistas en pauta fija y se estimulación ovárica se veían obligadas subcutánea de la dosis recomendada de completó con la administración de FSHr a administrarse inyecciones diarias Elonva puede sustituir las siete primeras (Gonal F o Puregon) o HMG (Menopur) debido a la vida media de las mismas. inyecciones de cualquier preparación de a partir del 8º día de estimulación. Se Un posible error en la dosificación de la FSH diaria en un ciclo de estimulación desencadenó la maduración folicular medicación, la angustia relacionada con ovárica. con una dosis de hCG (Ovitrelle) y 36 el número de inyecciones o la rigidez en horas después se realizó la punción los horarios generan una gran carga OBJETIVO ovárica y se inseminaron los ovocitos psicológica, lo que puede repercutir en mediante FIV convencional o ICSI las tasas de éxito e incluso provocar el Presentación de los resultados de los dependiendo de los antecedentes abandono del tratamiento. primeros ciclos estimulados con Elonva de la pareja. 18-20 horas post- en el Instituto Bernabeu. inseminación se valoró la fecundación. La Corifolitropina alfa (Elonva) se La transferencia embrionaria se realizó ha diseñado como un estimulante MATERIAL Y MÉTODO en día 3, día 4 o día 5. Se valoró la β-hCG folicular sostenido con el mismo perfil en sangre 13 días después de la punción farmacodinámico que la FSH pero con Analizamos los resultados clínicos y ovárica considerándose positiva cuando una duración prolongada de la actividad. de laboratorio de nuestra experiencia el valor fue >6 mUI/ml. Se consiguió añadiendo el 7 péptido inicial postcomercialización. Se trató carboxi-terminal de la subunidad β de la de 6 ciclos de estimulación ovárica para RESULTADOS gonadotropina coriónica humana (hCG) FIV realizados en el Instituto Bernabeu Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 Ciclo 6 Nº Ovoc. Recup. 10 12 14 9 22 17 TRA ICSI ICSI ICSI ICSI FIV ICSI Nº MII 10 5 9 7 - 13 Nº Ovoc. Fecund. 6 4 7 5 11* 13 Nº Embr. Transf. 2 2 2 2 2 1 Día Transferencia 3 2 5 3 5 4 Clasificación ASEBIR A/A A/A A/B A/A A/A A Nº Embr. Cong. - - 2 - 4 9 b-hCG Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Evolución - 2 sacos 2 sacos - 1 saco - *5 ovocitos inmaduros el día de la fecundación
- 199. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 197 CONCLUSIONES Los datos preliminares en su uso En pacientes con normorespuesta, post-comercialización reafirman Elonva puede ser a corto-medio La experiencia inicial con el uso la disminución en la carga física y plazo el fármaco de elección para la de Corifolitropina α en nuestro psicológica durante la estimulación estimulación ovárica. laboratorio fue satisfactoria mostrando ovárica sin perjuicios en la eficacia. características similares a otros protocolos de estimulación. 103: lOS VAlOrES DE cA-125 EVAlUADOS EN cONDIcIONES BASAlES NO SON PrEDIctIVOS DEl rESUltADO DE lA INSEMINAcIÓN ArtIFIcIAl JC. Martínez, M. Nicolás, L. Fernández, P. Albero, J. Landeras. IVI Murcia e-mail: juancarlos.martinez@ivi.es INTRODUCCIÓN todas las mujeres incluidas en el estudio RESULTADOS se les realizó una histerosalpingografía La utilidad clínica fundamental del CA- con objeto de comprobar su integridad 27 de las mujeres incluidas en el 125 es su uso como marcador tumoral tubárica. Las inseminaciones se estudio lograron un embarazo tras en el cáncer de ovario. El Ca- 125 es una realizaron tras estimulación ovárica la inseminación. Ambos grupos glicoproteína producida por el epitelio con FSH-r y las pacientes fueron presentaban características homogéneas de las trompas de Falopio, cérvix, por monitorizadas mediante ecografía tanto en edad como en número de células mesoteliales peritoneales, así transvaginal y evaluación de los niveles espermatozoides inseminados como por el endometrio de mujeres de estradiol. Las dosis de gonadotropinas ovulatorias, y presenta la particularidad fueron individualizadas atendiendo a No se observaron diferencias significativas de que es fácilmente medible en edad, valores hormonales y respuesta a en los valores de CA-125 entre grupo de circulación sanguínea. Por ello ha sido la estimulación. A y B (15,2±1,9 vs 22,3±2,7, p=0,13), usado como indicador de receptividad El análisis mediante curvas ROC no endometrial y diversos estudios se han Cuando al menos un folículo presentaba encuentra valor predictivo de los valores llevado a cabo evaluando su utilidad un diámetro igual o superior a de CA-125 con los índices de embarazo como factor pronóstico de embarazo 17mm se administraron 6500 UI de (área bajo la curva 0,542, p> 0,05) tras fecundación in vitro con resultados gonadotropina coriónica humana contradictorios. y se realizaron dos inseminaciones CONCLUSIONES a las 12 y 36 horas posteriores a su OBJETIVO administración. Aunque los valores de CA-125 son ligeramente inferiores en el grupo de El objetivo del presente estudio es Las muestras sanguíneas para pacientes que quedaron embarazadas evaluar la utilidad de los niveles basales determinar los valores de Ca-125 se frente a las que no se quedaron, de CA-125 como factor pronóstico tomaron entre el 3 y 5 día del ciclo no se observa una diferencia del éxito de los tratamientos de menstrual y el test de embarazo estadísticamente significativa. De inseminación intrauterina. se realizó tras 14 días de la última ahí que este marcador, medido en inseminación. condiciones basales, no presenta MATERIAL Y MÉTODOS ningún valor predictivo en los ciclos Los pacientes fueron divididos en 2 grupos de inseminación artificial. Estos 100 mujeres de edades comprendidas atendiendo al éxito del tratamiento. datos concuerdan con publicaciones entre 18 y 37 que acudieron a la clínica IVI Grupo A (grupo de embarazadas) y grupo previas sobre su valor predictivo en los Murcia para la realización de su primer B (grupo de no embarazadas). Se realizó tratamientos de fecundación in vitro ciclo de inseminación intrauterina un análisis estadístico mediante ANOVA y (Bradenberg et al., 1998; Fish et al., 2004) fueron incluidas en el presente estudio. A Curvas ROC. y en ICSI (Sohrabvand et al., 2004). Grupo A Grupo B p Edad 31,8±0,6 32,2±0,4 0,57 Nº de espermatozoides inseminados 9.4±1,5 x 10 6 11,1±0,9 x 106 0,33
- 200. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 198 104: VAlOrAcIÓN DE lA DIVISIÓN tEMPrANA EMBrIONArIA EN NUEStrO cENtrO M F. Fernández, E M. Martín, E. Cogollos, A. Gallego, E. Pérez de la Blanca, F. Martínez. Hospital Quirón Málaga e-mail: mafernandez.mlg@quiron.es INTRODUCCIÓN para la transferencia en un ciclo de CONCLUSIÓN reproducción asistida habían tenido o Según la bibliografía, la división no división temprana previa. Los resultados obtenidos nos indican temprana de zigotos es un parámetro que la división temprana parece estar indicador del potencial de desarrollo de MATERIAL Y MÉTODO asociada al desarrollo de embriones de embriones de buena calidad. mejor calidad en día +3 de cada ciclo Se trata de un estudio retrospectivo de reproducción asistida, ya que son La transferencia de embriones que se basado en los ciclos FIV-ICSI realizados en la mayoría de los casos los elegidos dividen tempranamente se asocia con entre 2009 y 2010 en nuestro centro. para ser transferidos. Sin embargo, este mayores tasas de implantación, aunque Se seleccionaron aquellos en los que se parámetro no parece estar relacionado aún existe cierta controversia en si comprobó la aparición o no de división con una mayor tasa de embarazo clínico. realmente es un parámetro esencial o temprana entre las 24-26 horas tras bien un parámetro secundario. inseminación. Quizás se requeriría un estudio mayor para poder obtener resultados En nuestro centro es un parámetro que En total fueron 110 ciclos en los que se definitivos. anotamos desde hace tiempo para tener había anotado la división temprana. más información de cada embrión, El 76% de los embriones elegidos para En cambio la división temprana sí que aunque no lo teníamos en cuenta a ser transferidos (por poseer la mayor nos va a servir como herramienta a la hora de elegir los embriones a transferir. calidad morfológica del pool del que hora de elegir los embriones de mayor proceden) habían tenido división potencial cuando tengamos que hacer Así el objetivo de este estudio fue embrionaria temprana. transferencia en día +2. valorar si los embriones elegidos Transferencia de embriones Transferencia de embriones con DT sin DT n 78 32 Edad media* 34.9 35.1 Media embriones transferidos* 2.1 2.2 % embriones transferidos que tenían división temprana 76 0 % embarazo clínico* 46.8 43.6 *No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. (Programa SSPS 15.0)
- 201. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 199 105: ArrAY-cGH DE OlIGOS EN DIAGNÓStIcO GENÉtIcO PrEIMPlANtAcIONAl DE ScrEENING DE ANEUPlOIDÍAS M. Martínez-Fresno1, A. Gómez Duro1, J. Muñoz2, P. Eibes Peteiro1, M. Calvente3, J. Suela3, E. Fernández1 1 Geniality Diagnóstico Genético, 2Instituto Madrileño de Fertilidad, 3NIMGenetics e-mail: efgarcia@geniality.es INTRODUCCIÓN • 2º ciclo: Biopsia de testículo, ICSI- Embrión Resultado DGP-SA mediante FISH: 25 ovocitos, 1 Aneuploide: -13; + 14 La hibridación in situ fluorescente (FISH) 15 MII, 6 embrionesà4 biopsiadosà 2 Aneuploide: +12 ha sido tradicionalmente la técnica 3 aneuploides, 1 normal que no empleada en el diagnóstico genético evoluciona 3 Aneuploide: +18 preimplantacional para el screening de 4 Aneuploide: -12, +15, -21 aneuploidías (DGP-SA), sin embargo, es • 3º ciclo: Biopsia de testículo en de todos conocido las limitaciones que fresco. ICSI-DGP-SA mediante array- 5 Diploide esta técnica presenta. En los últimos CGH (medios de cultivo Global). 20 meses, el array-CGH está sustituyendo ovocitos, 17 MII, 7 fecundadosà5 a la FISH ya que esta técnica de biopsiadosà4 aneuploides, 1 normal CONCLUSIONES diagnóstico genético permite analizar (blastocisto hatching) Transferidoà el genoma completo del embrión al Embarazo evolutivo Habitualmente el enfoque técnico de mismo tiempo, en busca de alteraciones este tipo de diagnóstico se ha llevado de ganancia o pérdida de material Las células biopsiadas se sometieron a a cabo mediante FISH de al menos 9 genético. Presentamos el primer lisis alcalina y amplificación genómica cromosomas (13, 15, 16, 17, 18, 21, embarazo obtenido por DGP-SA, con una previa mediante GenomePlex Whole 22, X e Y) en blastómeras fijadas tras plataforma de array-CGH basada en la Genome Amplification (WGA) Kit (Sigma- biopsia en día +3. Esto suponía dejar plataforma de oligos (embryoarray®). Aldrich). El análisis mediante array-CGH de analizar el 48% del genoma del se llevó a cabo mediante la plataforma embrión, en el mejor de los casos. En OBJETIVO embryoarray®, array de oligos de el caso que aquí se describe, 3 de los 60.000 sondas (Agilent Technologies) 4 embriones diagnosticados como Aplicación clínica del array-CGH de con adaptaciones al análisis de una sola aneuploides presentaban anomalías oligos (embryoarray®) al DGP de célula. El paquete informático que se numéricas detectadas mediante array- screening de aneuploidías cromosómicas empleó para llevar a cabo el análisis de CGH en cromosomas no incluidos en en una sola célula. datos está formado por dos sistemas: el análisis rutinario mediante FISH. El Feature extraction 10.1 y DNA Analytic embrión 2, presentaba una ganancia MATERIAL Y MÉTODOS 4.1 (se usaron como estadísticos ADM- del cromosoma 12 que no hubiera sido 2 con un nivel de significancia de 4 y detectada mediante FISH-9 cromosomas, Pareja que consulta para un DGP de ventana de 10Mb). pudiendo concluir en la transferencia screening de aneuploidías tras 2 ciclos de de este embrión. El array-CGH mejora la fecundación in vitro + DGP-SA mediante RESULTADOS selección y transferencia de embriones FISH, sin transferencia, realizados en diploides permitiendo el análisis de los otro centro. La mujer tiene 40 años de De los 5 embriones biopsiados, 3 de 23 pares de cromosomas incrementando edad y el marido presenta azoospermia ellos presentaron aneuploidías, uno así, en casos con indicación como el que obstructiva (ABVD). era diploide normal y otro no pudo se presenta, la tasa de implantación y de ser diagnosticado (embrión 4), este embarazo. • 1 ciclo: Biopsia de testículo, ICSI-DGP- embrión se volvió a biopsiar en día +5 SA mediante FISH: 18 ovocitos, 10 y se vitrificó a la espera de resultados. MII, 5 fecundadosà3 biopsiadosà 3 Posteriormente se diagnóstico como aneuploides aneuploide.
- 202. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 200 106: INFlUENcIA DEl FActOr EStAtUrA EN lA cAlIDAD SEMINAl A. Yoldi; A. Vaquero; JP. Ramírez, JA. Castilla. CEIFER. (Centro de Estudios e investigación de la Fertilidad). Granada e-mail: alberto.yoldi@ceifer.com INTRODUCCIÓN principales parámetros de calidad investigador se encuentra inscrito seminal. desde el año 1999 al Programa de La significación de la estatura en los Control de Calidad Externo de Análisis marcadores de calidad seminal no ha MATERIAL Y MÉTODOS de Semen del Grupo de Interés en sido estudiada hasta el momento ya que Andrología de la ESHRE y de ASEBIR. es una característica que no parece que Se han estudiado 2444 muestras La edad media de la serie es de 22.17 influya sobre los parámetros seminales. seminales procedentes de aspirantes años (±4.18 SD). La mayoría de los estudios de calidad a donante de semen que han acudido seminal relacionados con esta variable a nuestro centro desde el año 1993 Los parámetros seminales analizados se centran en el índice de masa hasta el 2010. Se ha analizado una han sido: concentración, volumen, nº corporal, al representar este índice más muestra por individuo, empleando total de espermatozoides eyaculados y objetivamente las características del los parámetros definidos por el % espermatozoides progresivos (A+B). individuo ya que relaciona las variables Manual OMS en sus diferentes estatura y peso en un solo parámetro. ediciones. El semen se ha obtenido RESULTADOS por masturbación en nuestro centro, OBJETIVOS con un período de abstinencia de 3-5 Tras eliminar los outliers mediante el días. Se ha utilizado un microscopio recorrido intercuartílico, obtenemos la Estudiar si la estatura presenta de contraste de fases con placa siguiente estadística descriptiva: influencias significativas sobre los termocalefactada a 37ºC. El personal Concentración Volumen % Progresivos Nº total/eyac. Estatura n s.d. n s.d. n s.d. n s.d. x x x x < 1.70 m 1 301 79.8 49.20 294 3.8 1.42 306 45.3 13.09 303 267.6 176.56 1.71 a 1.75 m 2 545 81.2 49.50 539 3.7 1.37 549 45.7 13.58 549 273.9 180.80 1.76 a 1.80 m 3 729 82.1 49.81 704 3.7 1.42 721 46.3 13.37 733 275.1 185.39 1.81 a 1.85 m 4 447 79.1 47.47 442 3.8 1.42 451 45.1 13.75 454 276.3 185.91 1.86 a 1.90 m 5 229 79.3 46.55 222 4.1 1.46 232 46.1 13.93 225 279.5 179.58 > 1.91 m 6 76 78.9 51.17 78 4.0 1.50 77 46.7 14.76 78 287.1 184.88 Total 2327 80.6 48.91 2279 3.8 1.42 2336 45.8 13.60 2342 274.9 182.58 Tras emplear el test de normalidad aumento del volumen seminal, hemos El resto de las variables seminales Kolmogorov-Smirnov, ninguna de las apreciado también un incremento de la estudiadas no han presentado variables estudiadas presenta una cantidad total de espermatozoides por diferencias significativas relacionadas distribución normal. Por esta razón eyaculado; aunque, en este caso, no con la estatura. vamos a desarrollar las comparativas presenta significación estadística. de los parámetros seminales mediante métodos no paramétricos. CONCLUSIONES Mediante el test de Kruskall-Wallis, En nuestra población de 2444 jóvenes vemos que, de las cuatro variables aspirantes a donante de semen, hemos estudiadas, tan sólo el volumen seminal apreciado un incremento significativo muestra un aumento significativo del volumen seminal, proporcional al proporcional al aumento de la estatura aumento de la estatura. (sig.=0.033). Relacionado con este
- 203. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 201 107: INFlUENcIA DE lA VAcUOlIZAcIÓN Y/O AcUMUlAcIÓN DE rEtÍcUlO ENDOPlASMÁtIcO lISO EN OVOcItOS DE cIclOS FIV/ IcSI B. González, A. Clavero, A. Rosales, I. Molina, J.A. Castilla, E. Palacios, S. Carrillo, J. Mozas Unidad de Reproducción Hospital Universitario Virgen de las Nieves de Granada e-mail: beukasoto@gmail.com INTRODUCCIÓN la Unidad de Reproducción del H.U. Si analizamos los datos clínicos Virgen de las Nieves de Granada del no encontramos diferencias En ciclos FIV/ICSI podemos año 2010 (532 pacientes, 608 ciclos). estadísticamente significativas entre encontrarnos ovocitos con diferentes Se identificaron 3 grupos de estudio: los distintos grupos. Tampoco se fenotipos dismórficos como grupo con al menos un ovocito con observaron diferencias significativas en acumulación de retículo endoplasmático acúmulo de REL (14 pacientes), grupo los diferentes parámetros de laboratorio liso (REL) o presencia de vacuolas con al menos un ovocito vacuolado (20 evaluados entre los 3 grupos a estudiar. rodeadas de membrana y llenas de pacientes) y grupo control, sin ovocitos fluido. La vacuolización citoplasmática con los disformismos anteriores, Aunque se encontró una elevada tasa se considera un proceso de atresia correspondiente a un mes del año 2010 de abortos (50-66.6%) en ambos ovocitaria. La acumulación de REL se cogido al azar (67 pacientes). grupos de anomalías ovocitarias, ésta observa como vacuolas translúcidas no fue estadísticamente significativa al de tamaño pronuclear, y es claramente En todos ellos se valoraron los datos compararla con la observada en el grupo distinguible morfológicamente de clínicos (causa de esterilidad, protocolo control. Se observó una tendencia a una las vacuolas llenas de fluido bajo de estimulación, días de estimulación, menor tasa de gestación evolutiva por microscopio invertido. Los mecanismos unidades de FSH, edad media de la transferencia en las pacientes en las responsables de la aparición de REL aún paciente) y de laboratorio (número que algún ovocito presentó acúmulo de se desconocen. de ovocitos obtenidos, ovocitos en REL (7.1%), frente al grupo con vacuolas metafase II (MII), fecundados, calidad (30%) y el grupo control (26.1%). Algunos artículos afirman que la embrionaria, embriones transferidos, morfología de los ovocitos podría no embriones congelados, tasa de Teniendo en cuenta las diferencias afectar a los resultados de ciclos FIV/ gestación y tasa de aborto). obtenidas en el porcentaje de gestación ICSI, sin embargo otros demostraron evolutiva por transferencia, se estimó que las tasas de fecundación y división Para la comparación de estas variables que para un error α= 0.05 y una β= 0.10 se redujeron cuando se transfirieron entre grupos se utilizó el test X2 y un se necesitaría al menos unos 77 ciclos embriones que procedían de ovocitos análisis de la varianza. Se realizó un en cada grupo. dismórficos. estudio de potencia y tamaño muestral. CONCLUSIONES OBJETIVO RESULTADOS La presencia de acúmulo de REL y En este estudio retrospectivo, hemos De los 608 ciclos realizados durante vacuolas en ovocitos tras estimulación analizado la influencia de la presencia de el 2010, 14 (2.3%) presentaron algún ovárica es un hecho infrecuente, al menos un ovocito con vacuolización o ovocito con acumulación de REL y 20 además de ser ciclo-dependiente más con acúmulo de REL en los resultados de (3.2%) mostraron al menos un ovocito que mujer-dependiente, dado que no ciclos FIV/ICSI así como su frecuencia con vacuolización. Ninguna paciente suele repetirse en la misma mujer. Es de aparición. que presentara acumulación de REL necesario aumentar el tamaño muestral u ovocitos vacuolados había tenido para confirmar que la presencia de MATERIAL Y MÉTODOS ciclos previos con ovocitos de estas acúmulo de REL en al menos un ovocito características ni volvió a presentarlos es un marcador de mal pronóstico en Los pacientes incluídos en el estudio en el siguiente ciclo. ciclos FIV/ICSI. pertenecían al programa FIV/ICSI de
- 204. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 202 108: PrESENcIA DE UN SOlO NUclÉOlO EN PrONÚclEOS DÍA 1 (PN rAtÓN) EN EMBrIONES trANSFErIDOS Y SUS EFEctOS EN cIclOS DE Art EN IVI BArcElONA (2004 - 2010) Jiménez JP.1, Teruel J.1, Florensa M.1, Martín M.1, Pellicer A.2, Ballesteros A.1, Calderón G.1 1 IVI Barcelona; 2IVI Valencia e-mail: juanpitazo@gmail.com INTRODUCCIÓN i Ciclos en los que todos los embriones transferidos supone una reducción de transferidos presentaron PN ratón. la TGC, TI y aumento del aborto, estos La presencia de un único precursor resultados fueron más acentuados en el pronucleolar en pronúcleos de día 1 ii Ciclos en los que al menos 1 embrión grupo de ovocitos autólogos frente al (PN ratón) en embriones humanos es transferido presentó PN ratón. grupo de ovocitos donados, los cuales considerada como una anomalía grave, presentaron mejores tasas. evitándose, en la medida de lo posible, iii Ciclos en los que ningún embrión la transferencia de los embriones que transferido presentó PN ratón pero CONCLUSIONES presentan esta morfología. en la cohorte sí que se presentó el valor morfológico PN ratón en al La presencia de un solo nucléolo en OBJETIVOS menos 1 embrión. pronúcleo de dia 1 en embriones transferidos compromete en gran El objetivo de este estudio es evaluar el Los resultados se compararon con medida el potencial reproductivo de efecto en el rendimiento reproductivo el resto de ciclos del mismo periodo los mismos, especialmente en ciclos de la presencia del valor PN ratón en según su origen ovocitario (donación autólogos, en los que se observa una embriones transferidos. o autólogo). Las tasas de gestación peor tasa de implantación, menor clínica (TGC), implantación (TI), gestación clínica así como con una MATERIALES Y MÉTODOS embarazo gemelar (Tgem) y aborto mayor tasa de aborto, estos resultados clínico (AbClin) fueron comparadas podrían deberse a una mayor calidad de Análisis retrospectivo de 319 ciclos con al estadísticamente usando la prueba de los ovocitos donados frente a una peor menos 1 embrión de la cohorte en los que χ2 (TGC,Tgem y Ab Cinic) y test de mann- calidad de los autólogos, se evidencia se observó un solo nucléolo en pronucleo whitney (edad y TI) que en los ciclos de ovocitos donados de día 1. Los 319 ciclos se dividieron en la presencia de un solo nucléolo en ciclos de donación y ciclos autólogos RESULTADOS pronúcleo de dia 1 tiene efectos más que a su vez fueron divididos en otros 3 moderados. grupos en función de las características En ambos grupos la presencia del de los embriones transferidos. marcador PN ratón en los embriones Donación Control iii ii ii2 i Casos 3255 151 24 14 2* Edad % 41,16 41,61 41,59 41,57 40,05 TGC % 59.6 60,93 66,67 42,86 100 TI % 42,79 46,13 45,83 42,86 50 Tgem % 38,75 46,73 37,5 100 0 AbClin % 17,7 22,83 25 33,3 0 Autólogos Control iii ii ii2 i Casos 2358 88 36 21 15 Edad % 36,27 35,75 36,12 36,18 36,93 TGC % 48,85 46,59 50 9,52 6,67 TI % 34,6 34,12 25 8,33 5,88 Tgem % 31,6 41,46 16,67 100 0 AbClin % 15,28 19,51 27,78 0 100 Tabla resumen resultados. Grupo ii2: Ciclos en los que al menos 1 embrión transferido presentó PN ratón y se produjeron tasas de implantación del 0 o 100 %, este grupo no fue sometido a análisis estadístico, * Grupo estadísticamente no significativo.
- 205. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 203 109: IDENtIFIcAcIÓN DE lA EXPrESIÓN GÉNIcA DE MYH11 Y PF4V1 EN lAS cÉlUlAS DEl cÚMUlUS trAS EStIMUlAcIÓN OVÁrIcA MEDIANtE ANÁlISIS DE EXPrESIÓN GÉNIcA DIFErENcIAl: IMPlIcAcIONES SOBrE SU POSIBlE FUNcIÓN EN lA MADUrAcIÓN OVOcItArIA V. García-Láez, D. Beltrán, J.M. De los Santos, F.J. Esteban, J. Horcajadas, J.A. Martínez-Conejero, M.J. de los Santos IVI Valencia - INCLIVA e-mail: garcialaez@hotmail.com INTRODUCCIÓN sometidas a ciclo natural modificado y respuesta inmune, activación celular, otro formado por 4 donantes sometidas diferenciación celular y desarrollo MYH11, cadena pesada de miosina y a protocolos de hiperestimulación de órganos. De entre los 14 genes PF4V1, receptor G-protein-coupled ovárica con agonistas de GnRH y con FSH diferencialmente expresados, diez de PAF, son genes que codifican moléculas recombinante. Las CC fueron aisladas ellos (MYH11, ABCA8, ZNF33B, GIMAP1, relacionadas con la regulación de mecánicamente del ovocito, entre dos y ALDH1A2, CTSL2, WDR63, BLM, SOX4, la angiotensina II y angiogénesis, cuatro horas después de la obtención del ARHGAP28) estaban infra expresados el primero induciendo la síntesis ovocito e inmediatamente guardadas en en ciclos estimulados. De entre el panel de angiotensina II y el segundo Trizol y almacenadas a – 80ºC. Después de genes, especialmente dos, MYH11 inhibiéndola. Puesto que la mayoría de de la extracción del ARN de las CC se y PF4V1, fueron interesantes por su los protocolos utilizados en FIV requieren realizó la amplificación lineal mediante posible asociación con la regulación la utilización de gonadotropinas y una el WT-Ovation Pico RNA Amplification de la angiotensina II. Mientras que dosis final de hCG con el fin de obtener System (NuGEN Technologies). El ADNc MYH11 fue infra expresado en los un crecimiento multifolicular y madurez de las 8 muestras se hibridó con el ciclos estimulados, PF4V1 se encontró ovocitaria, es lógico pensar que dicha Whole Human Genome Oligo Microarray significativamente sobre expresado. situación, podría influir en los procesos (Agilent Technologies). El análisis de relacionados con la ovulación y la imagen se realizó mediante el Software CONCLUSIÓN maduración ovocitaria. GenePix Pro 6.0. Para las comparaciones se utilizaron tests no paramétricos. Los La estimulación ovárica afecta al OBJETIVOS genes fueron considerados como sobre perfil de expresión génica de las CC. o infra-expresados cuando el p<0.05 y Estudios en diferentes especies de El objetivo de este estudio fue analizar el fold change fue mayor de 2. mamíferos, sugieren la presencia el efecto de la estimulación ovárica un sistema funcional endotelina- sobre el transcriptoma de las células La validación de los microarrays fue angiotensina-péptido natriurético del cúmulus (CC), células en contacto realizada en un total de 19 CC adicionales a nivel ovárico involucrado tanto en íntimo con el ovocito, utilizando (9 procedentes de ciclos naturales y 10 la maduración ovocitaria como en la donantes de ovocitos sometidas a ciclos de estimulados) mediante qRT-PCR. ovulación, principalmente a través de naturales modificados y comparándolas su efecto sobre células de la granulosa. con ciclos estimulados. RESULTADOS La transcripción diferencial de los genes MYH11 y PF4V1 en las CC podría MATERIALES Y MÉTODOS Cuando comparamos ciclos relacionarse con la regulación de la estimulados frente a ciclos naturales, angiotensina II en las propias CC y En este estudio se incluyeron un el transcriptoma de las CC mostró podría tener un posible papel en los total de 8 donantes divididas en dos diferencias significativas en la mecanismos desencadenantes de la grupos: uno formado por 4 donantes expresión de genes involucrados en la maduración ovocitaria en humanos.
- 206. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 204 110: ÉXItO EN lA IAc: lA SUPErVIVENcIA ESPErMÁtIcA ES MEJOr INDIcADOr QUE El rEM M. Iglesias1, I. Galán1, P. Rollán2, L. Melado1, A. García-Enguídanos1, A. Gosálvez1,3. 1 Hospital Universitario Quirón Madrid. 2Universidad Autónoma de Madrid. 3Universidad Europea de Madrid. e-mail: miriamen1@yahoo.es; miglesias.mad@quiron.es INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO La supervivencia se calculó dividiendo RESULTADOS los espermatozoides con movilidad A + La supervivencia espermática de las B a las 24h de la inseminación entre los En la Tabla 1, la tasa de gestación fue muestras seminales empleadas para espermatozoides con movilidad A + B menor a partir de una cierta edad, y inseminación artificial, es un parámetro el día de la inseminación. Para ello, los encontramos un claro descenso de la no bien estudiado. El objetivo de espermatozoides que permanecen en el tasa de gestación a partir de los 36 años este estudio fue verificar el valor de residuo del tubo tras la inseminación (80 de 383 (21%) en pacientes de hasta la supervivencia espermática en la se diluyeron con medio IVF® (Vitrolife, 36a y 9 de 95 (9%) en mayores de 36a, predicción de éxito de la inseminación Göteborg, Suecia) para evitar su p<0.01). artificial, en relación a los parámetros deshidratación y se cultivaron a 37ºC clásicos de edad de la mujer y REM. con 6% de CO2. En la Tabla 2 se observa un aumento de la tasa de embarazo conforme MATERIAL Y MÉTODOS Para determinar si los valores son aumenta la supervivencia espermática. estadísticamente significativos se Al comparar la tasa de gestación cuando Desde enero de 2008 a diciembre de realizó la prueba de Χ2. la supervivencia es menor del 50% (8 2010 realizamos 478 inseminaciones de 83, 10%) con la obtenida cuando en el Hospital Universitario Quirón Registramos también la edad de la la supervivencia es mayor del 50% (32 Madrid (89 gestaciones, 19% tasa de mujer el día de la inseminación y el de 148, 22%) se observan diferencias embarazo) y valoramos la supervivencia REM inseminado (número total de claramente significativas (p<0.02). espermática en 231 casos. espermatozoides inseminados). Tabla 1: Edad de la mujer y tasa de embarazo. TOTAL <30a 31-32a 33-34a 35-36a 37-38a 39-40a 89 de 478 13 de 63 18 de 79 25 de 108 24 de 133 6 de 68 3 de 27 19% 21% 23% 23% 18% 9% 11% Tabla 2: Significación a los 36 años: *(p<0,01). Edad Hasta 36 años Más de 36 años % Gest 80 de 383 (21%)* 9 de 95 (9%)* Tabla 3: REM y tasa de embarazo. REM >20M 15-19M 10-14M 8-9M 6-7M 4-5M 2-3M <2M %Gest 10 de 47 14 de 63 24 de 104 12 de 63 11 de 57 10 de 60 4 de 46 4 de 24 (21%) (18%) (23%) (19%) (19%) (17%) (9%) (17%) Tabla 4: Significación del REM de 4 millones (p=0,09 no significativo). REM REM mayor o igual a 4M REM hasta 3M %Gest 81 de 408 (20 %)* 8 de 70 (11 %)*
- 207. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 205 Tabla 5: Supervivencia espermática y gestación. Supervivencia a las 24h 0-30% 31-50% 51-75% 76-100% 5 de 43 3 de 40 18 de 86 14 de 62 12% (8%) (21%) (23%) Tabla 6: Supervivencia espermática > 50% y su significación *(p<0,02). Supervivencia a las 24h 0-50% 51-100% 8 de 83 32 de 148 (10%)* (22%)* En la Tabla 3, el descenso en el REM con mejor significación que el REM. que la supervivencia espermática baja parece relacionarse relativamente con Sugerimos por ello que sea realizada de sea suficiente para desaconsejar la una menor tasa de embarazo. Cuando rutina en las Unidades de Reproducción inseminación aún en presencia de un el REM del día de la inseminación Asistida. REM aceptable. Iniciamos por ello un es superior o igual a 4M, quedaron estudio para intentar dilucidarlo. gestantes el 20% (81 de 408) frente La edad femenina por encima de los a 8 de 70 (11%) con REM menor de 4M 36 años establece un pronóstico (p=0.15, no significativo). negativo independiente de los factores seminales. CONCLUSIONES Queda por definir el valor predictivo de La supervivencia espermática se asocia la combinación de dichos factores. En con claridad al éxito en la inseminación, mujeres mayores de 36 años, es posible 111: EFEctO DE lA EclOSIÓN ASIStIDA SOBrE lA tASA DE EMBArAZO EN PAcIENtES cON trANSFErENcIA DE EMBrIONES cONGElADOS A. Gayo, V. Castañón, I. Arnott, M. Torrents, A. Tamargo, J. Álvarez, D. Díaz, E. Fernández, L. Sánchez Hospital Universitario Central de Asturias e-mail: abel_gayo@yahoo.com INTRODUCCIÓN frente a las pacientes que no fueron considerará como variable principal la sometidas a dicha técnica. tasa de embarazo bioquímico (beta-hCG) Se ha descrito que el assited hatching, o eclosión asistida, facilita la implantación MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS en aquellos embriones sometidos a procesos de descongelación debido a Se analizan retrospectivamente 60 Los pacientes sometidos a eclosión la rotura selectiva de la zona pelúcida pacientes que se criopreservaron sus asistida tuvieron una beta-hCG positiva que se ve endurecida en el proceso de embriones en D+2 o D+3 tras congelación en el 21 % de los casos, comparada con congelación. En aquellos pacientes lenta. Después de la descongelación, una tasa de 17 % en los pacientes que con gran número de embriones de en un grupo de pacientes (N=20) los no se sometieron a dicha técnica. buena calidad, una vez realizada la embriones son sometidos a tres pulsos transferencia en fresco, el resto son de 350 nm de laser (Zylos Laser) y se CONCLUSIONES congelados para ser transferidos en dejan tres horas hasta su transferencia ciclos posteriores. en incubador a 37 º C y 6 % CO2. La tasa Observamos una mayor tasa de de embarazo es comparada con otro embarazo en las pacientes que fueron OBJETIVO grupo de pacientes (N=40) que no fueron sometidas a tratamiento de eclosión sometidas a eclosión asistida. En ambos asistida. Se precisa mayor número de Comparar la tasa de embarazo de grupos de pacientes no hay diferencias criotransferencias con eclosión asistida aquellas pacientes a las que se realizó en cuanto a la edad, al tratamiento para unificar el tamaño muestral criotransferencia de embriones de estimulación y a la preparación y comprobar si las diferencias son sometidos a eclosión asistida con laser endometrial (progesterona vaginal). Se estadísticamente significativas.
- 208. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 206 112: PrESENcIA DE UN SOlO NUclÉOlO EN PrONÚclEOS DÍA 1 (PN rAtÓN) EN lA cOHOrtE EMBrIONArIA Y SUS EFEctOS EN cIclOS DE Art EN IVI BArcElONA (2004 - 2010) Jiménez JP.1, Teruel J.1, Florensa M.1, Martín M.1, Pellicer A.2, Ballesteros A.1, Calderón G.1 1 IVI Barcelona, 2IVI Valencia e-mail: juanpitazo@gmail.com INTRODUCCIÓN presencia de PN Ratón en los embriones marcador PN ratón en los embriones de de la cohorte. (0% sin presencia PN la cohorte supone una reducción de la La presencia de un único precursor ratón en ningún embrión de la cohorte TGC, TI y aumento del aborto en el grupo pronucleolar en pronúcleos de día 1 y 100% todos los embriones del ciclo de autólogos mientras que en el grupo (PN ratón) en embriones humanos es presentaban PN ratón) siendo. de donación no se evidencian estos considerada como una anomalía grave, efectos negativos. evitándose, en la medida de lo posible, i <10% cohorte PN ratón la transferencia de los embriones que CONCLUSIONES presentan esta morfología. ii ≥10 > 40% cohorte PN ratón La presencia del marcador PN ratón en OBJETIVO iii ≥40 cohorte PN ratón embriones de la cohorte compromete en gran medida el potencial reproductivo El objetivo de este estudio es evaluar el Los resultados se compararon con de los mismos, especialmente en ciclos efecto en el rendimiento reproductivo el resto de ciclos del mismo periodo autólogos. de la presencia y grado del valor PN según su origen ovocitario (donación ratón en la cohorte embrionaria. o autólogo). Las tasas de gestación El análisis del grado de afección del clínica (TGC), implantación (TI), marcador PN ratón en la cohorte (Ciclos MATERIALES Y MÉTODOS embarazo gemelar (Tgem) y aborto autólogos) se relaciona con una mayor clínico (AbClin) fueron comparadas edad de las pacientes, peor tasa de Análisis retrospectivo de 319 ciclos estadísticamente usando la prueba de implantación, menor gestación clínica, con al menos 1 embrión de la cohorte χ2 (TGC,Tgem y Ab Cinic) y test de mann- así como con una mayor tasa de aborto, en los que se observó un solo nucléolo whitney (edad y TI) sin embargo el mismo parámetro no en pronúcleo de día 1. Los 319 ciclos parece relacionarse de forma negativa se dividieron en ciclos de donación y RESULTADOS en ciclos de donación de ovocitos. ciclos autólogos que a su vez fueron divididos en otros 3 grupos en función Se observan diferencias entre los grupos del grado de afección en porcentaje de de donación autólogos, la presencia del Donación Control 0 ~100% i ii iii Casos 3255 180 49 122 8 Edad % 41,16 41,42 41,33 41,74 42,25 % Ratón Cohorte 16,06 8,31 16,58 52,55 TGC % 59.6 62,22 55,1 63,11 62,5 TI % 42,79 45,66 43,75 46,53 35,71 Tgem % 38,75 44,64 44,44 46,75 0 AbClin % 17,7 22,32 33,33 20,78 20 Autólogos Control 0 ~100% i ii iii Casos 2358 139 31 89 20 Edad % 36,27 35,9 34,74 35,85 37,9 % Ratón 23,01 8,25 19,19 62,69 TGC % 48,85 42,45 45,16 46,07 20 TI % 34,6 29,89 30,16 32,2 16,13 Tgem % 31,6 37,29 35,71 39,02 25 AbClin % 15,28 16,95 7,14 17,07 50 Tabla resumen resultados. Grupo 0 ~100%: Grupo global que incluye todos los ciclos en los que se encontró al menos un PN ratón en día 1
- 209. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 207 113: APlIcAcIÓN DE lAS ESPEcIFIcAcIONES DE cAlIDAD ANAlÍtIcAS Al cÁlcUlO DE lOS lÍMItES ADMISIBlES DE ErrOr EN PrOGrAMAS DE EVAlUAcIÓN EXtErNA DE lA cAlIDAD PArA cONcENtrAcIÓN ESPErMÁtIcA E. Palacios, M.C. Gonzalvo, A. Clavero, A. P. Ortiz, S. Carrillo, A. Rosales, B. Romero Unidad de Reproducción. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada e-mail: ana.clavero.sspa@juntadeandalucia.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS se obtienen límites muy estrictos. Sin embargo, con la estrategia 4 obtenemos Una actividad esencial de los Los datos que se analizarán en este estudio valores de intervalos de aceptación laboratorios de andrología es el control son los valores de la media y desviación intermedios en comparación con las de la calidad externo. Para la evaluación típica (DS) obtenidos sobre muestras demás estrategias. No se observan de la eficacia de los laboratorios control independientes, provenientes diferencias en los límites admisibles de participantes en los Programa de de dos Programas de Supervisión error en las estrategias 3 y 4 al variar el Supervisión Externa de la Calidad Externa de la Calidad. Se fijaron cuatro modelo empleado para el cálculo de las (PSEC) se utilizan límites admisibles estrategias diferentes de cálculo de los especificaciones de calidad analítica. de error, de manera que el resultado límites admisibles de error según la ISO de un laboratorio será considerado 13528:2005 (1) basada en los resultados DISCUSIÓN aceptable si se encuentra dentro de de los laboratorios participantes; dichos límites. En este momento los (2) basada en los resultados de los Los PSEC de concentración espermática, límites admisibles de error dependen, laboratorios expertos; (3) utilizando las deberían utilizar una estrategia ajustada en gran medida, de los criterios de los especificaciones de calidad basadas en la para la incertidumbre del valor asignado organizadores del PSEC. variabilidad biológica, estado del arte y para establecer los límites admisibles opinión de los clínicos; y (4) utilizando las de error, ya que con ella se obtienen OBJETIVO especificaciones de calidad y ajustando intervalos de aceptación clínicamente por la incertidumbre del valor asignado. útiles, de manera que los valores Nuestro objetivo es comparar los incluidos en ellos nos llevan a decisiones diferentes criterios descritos en la RESULTADOS clínicamente similares. El definir ISO 13528:2005 para el cálculo de adecuadamente a los laboratorios los comentados límites admisibles de Con la estrategia 1 y 2 se obtienen expertos es más importante que el error en los PSEC para la concentración límites admisibles de error muy amplios. modelo escogido para estimar las espermática. Al contrario, con la estrategia 3, basada especificaciones de calidad analítica en solo en las especificaciones de calidad, un PSEC de concentración espermática. 114: cAlIDAD EMBrIONArIA: AGONIStAS VErSUS ANtAGONIStAS DE lA GNrH EN UNA POBlAcIÓN DE BUEN PrONÓStIcO M. A. Vilches-Ferrón(*), M. M. Salas Martinez, J. J. Khouri Choufani, M. A. Torres Rodríguez, M. Pérez-Piaya Moreno, J. Morales Sánchez, G. Fiol Ruiz Complejo Hospitalario Torrecardenas, Almería e-mail: mangel.vilches.sspa@juntadeandalucia.es INTRODUCCIÓN así como en el desarrollo del embrión OBJETIVOS todavía no se conocen en detalle. El Desde 2000, la comparación de objetivo del estudio fue verificar el El objetivo principal es comparar agonista de la GnRH versus los impacto del protocolo con antagonistas los resultados clínicos y de calidad protocolos de antagonistas de GnRH de la GnRH, en comparación con el folicular, obtenidos en ciclos ICSI han sido analizados en distintos protocolo largo de los agonistas de mediante estimulación ovárica con el estudios clínicos, la mayoría de ellos se GnRH en el ovocito, en la calidad del tratamiento de antagonista de la GnRH centró en la evolución clínica de los dos embrión y en el desarrollo del embrión versus el habitual de agonistas de la protocolos, sin embargo, los efectos en los ciclos de FIV / ICSI. GnRH mediante protocolo largo. de los análogos de GnRH en el ovocito
- 210. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 208 MATERIALES Y MÉTODOS recibieron protocolo con agonistas CONCLUSIONES y con antagonistas. Existe un mayor Un estudio clínico randomizado, porcentaje de fallo de fecundación total 1. Los antagonistas de la GnRH realizado en la U Reproducción H en el grupo que recibió protocolo con son eficaces para prevenir picos de Torrecárdenas, con pacientes sometidas antagonistas. Sin embargo, la calidad LH y mantienen tasas adecuadas a inyección intracitoplasmática de y el grado de división embrionaria no de gestación. 2. Su tolerancia y espermatozoides (ICSI) durante el presentan diferencias entre ambos aceptabilidad es buena, con menos período entre Abril 2009 y Abril 2010. grupos, y consecuentemente el número días de estimulación. El periodo total Criterios inclusión: 1. Se incluirá en de pacientes con transferencia. Al de estimulación es más corto que el de la muestra de estudio mujer entre 18- analizar el porcentaje de embarazo entre agonistas de la GnRH, lo que hace que el 40 años, con esterilidad primaria, los dos grupos estudiados observamos procedimiento sea más fácil de aceptar con FSH sérica el día 3º <15 mUI/mL que cuando el cálculo se realiza sobre los por las pacientes. 3. Los embriones y que vaya a realizar su primer ciclo ciclos con punción o con transferencia obtenidos en ambos grupos de similar de reproducción asistida (ICSI). 2. embrionaria, la tasa de embarazo calidad, tanto en su desarrollo “in vitro” Aceptar la participación en el estudio. del protocolo con antagonistas sigue cómo en su capacidad de gestación. 4. Criterios exclusión: no cumplimiento siendo inferior a la de las pacientes que El ambiente hormonal de los folículos de alguno de los anteriores criterios de recibieron protocolo con agonistas, obtenidos tras DFM mediante protocolo inclusión. Al final del estudio se habían aunque asciende progresivamente. de antagonistas de la GnRH es similar incluido 159 pacientes, distinguiendo En ningún caso estas diferencias al existente tras protocolo largo de dos cohortes: 1. 75 pacientes que alcanzaron la significación estadística. agonistas de la GnRH, no alterándose recibieron protocolo largo de Agonistas Tampoco puede apreciarse diferencias la calidad ovocitaria y por tanto, la de GnRH. 2. 84 pacientes que recibieron significativas respecto a la tasa de calidad embrionaria. 5. Creemos que protocolo de Antagonistas de GnRH. implantación embrionaria entre ambos es necesario plantear estudios de grupos de pacientes. La tasa de múltiple receptividad endometrial que aclaren RESULTADOS y el porcentaje de los embarazos si la tendencia a una menor tasa de finalizados en aborto es mayor entre las embarazo en las pacientes que reciben No encontramos diferencias en el pacientes que recibieron protocolo con protocolo de antagonistas se debe a número de ovocitos por punción, ni antagonistas sin alcanzar significación una posible influencia negativa del en metafase II, ni en el porcentaje estadística. antagonista sobre el endometrio. de fecundados entre pacientes que 115: cUltIVO EMBrIONArIO lArGO Y trANSFErENcIA EN DÍA+5. ¿A VEcES O SIEMPrE? L. Uroz,1,2 A. Fusté,1,2 C. Aulesa,2 C. Márquez1,2 1 Gravida fertilitat avançada, Centre Internacional de Reproducció Humana Assistida de Barcelona. 2Unitat d’esterilitat, Hospital Materno-Infantil Vall d’Hebron e-mail: afuste@gravidabcn.com INTRODUCCIÓN en casos de diagnóstico genético realizar la transferencia. En el presente preimplantacional, mantener los trabajo, hemos prolongado el cultivo La transferencia de embriones embriones en cultivo hasta la hasta blastocisto en aquellos ciclos de en estadio de blastocisto (día+5) obtención de los resultados del análisis. FIV/FIV-ICSI que, en día+3, tenían más presenta ventajas respecto la Actualmente, las mejoras en los medios de tres embriones de buena calidad. transferencia en día+3, ya que de cultivo y los avances tecnológicos permite: (1) conseguir mejores tasas en los laboratorios de fecundación in OBJETIVOS de embarazo e implantación, (2) elegir vitro (FIV) han aumentado la eficiencia los embriones con mayor viabilidad del cultivo largo hasta blastocisto. No Estudiar si la evaluación embrionaria para la transferencia, (3) reducir el obstante, la aplicación de esta técnica en día+3 y el número de embriones número de embriones transferidos, en todos los ciclos de FIV conlleva de buena calidad en día+3 pueden (4) una mejor sincronización entre el riesgo de que los embriones no determinar el mejor día para la el embrión y el endometrio en el alcancen el estadio de blastocisto en el transferencia embrionaria: día+5 vs. momento de la transferencia y (5), laboratorio, y por lo tanto no se pueda día+3.
- 211. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 209 MATERIAL Y MÉTODOS en día+3 y 109 en día+5. Todas las número significativamente menor de variables estudiadas mostraron embriones. La tasa de embarazo clínico Estudio retrospectivo de los ciclos de diferencias significativas. Las pacientes en día+5 fue de un 56,9%. No obstante, FIV realizados en el centro Gravida, a las que se les realizó la transferencia la transferencia en día+3 supuso una fertilitat avançada y Hospital Materno- embrionaria en día+5 eran más jóvenes buena opción para aquellas pacientes Infantil de la vall d’Hebron desde el que a las que se les hizo la transferencia con baja reserva ovárica, añosas o con 2009 hasta la actualidad. Los ciclos en día +3 (34,4 vs 36,4), produjeron ciclos no estimulados (ciclos naturales han sido divididos según el día de la un mayor número de ovocitos (9,5 vs asistidos). En estos casos la tasa de transferencia embrionaria: día+3 y 5,9), se les transfirió un menor número embarazo clínico fue de 37,5%. En día+5. Las variables analizadas han de embriones (1,84 vs 1,99), y dieron conclusión, el criterio de selección sido: la edad de la paciente, el número unas mejores tasas de embarazo clínico entre transferencia a día+5 y día+3 de ovocitos obtenidos, el número de (56,9% vs 37,5%) y de implantación utilizado en este estudio es adecuado. embriones transferidos, la tasa de (45,1% vs 25,1%). Futuros estudios pueden ayudar a embarazo clínico (presencia de saco concretar la calidad mínima del embrión gestacional) por ciclo con transferencia DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES para asegurar su viabilidad hasta día+5. y la tasa de implantación. Coincidiendo con otros estudios, la RESULTADOS transferencia embrionaria en día+5 mejoró significativamente las tasas Se realizaron 333 ciclos de FIV o FIV- de éxito de los tratamientos de ICSI, de los que 224 se trasfirieron FIV/FIV-ICSI aún transfiriendo un 116: EVAlUAcIÓN DE lA cINÉtIcA Y MOrFOlOGÍA EMBrIONArIA EN PAcIENtES cON FAllO DE IMPlANtAcIÓN rEcUrrENtE J. Ten, J. Guerrero, J. Llácer, R. Bernabeu Instituto Bernabeu, Alicante e-mail: jten@institutobernabeu.com INTRODUCCIÓN pacientes que habían realizado al menos no hubieron diferencias significativas 2 ciclos previos con transferencia total entre el grupo I y II respecto al número Encontrar la causa de los fallos repetidos de 4 embriones de buena calidad (tipos medio de embriones con calidad A, B, de la implantación (FRI) embrionaria A y B) sin éxito (grupo de estudio, I), C y D, respectivamente, en el día de la tras ciclos FIV es quizás uno de los n=94. El grupo control (II) fueron 742 transferencia: A ( 1.3 vs 1.7, p=0.1), B desafíos más retadores que tenemos pacientes que realizaron un primer (1.1 vs 1.2, p=0.4), C (0.9 vs 1.2, p=0.5) ante nosotros. Son numerosos los o segundo ciclo con transferencia de y D (1.9 vs 1.8, p=0.6). factores implicados e indudablemente embriones de buena calidad. Todas las la calidad embrionaria es esencial. mujeres de los dos grupos tuvieron <38 CONCLUSIONES años para evitar el sesgo de la edad OBJETIVO ligado a alteraciones cromosómicas y La cinética y morfología embrionaria no se descartó un factor uterino mediante se ven afectadas en aquellas pacientes El objetivo de este trabajo es valorar ecografía. Se valoró el número medio de con FRI. Los criterios morfológicos si existen diferencias en cuanto a la células de toda la cohorte embrionaria actuales son por tanto incapaces de cinética y morfología de toda la cohorte en el segundo día de cultivo, así como la discriminar aquellos embriones con embrionaria en pacientes con FRI calidad embrionaria según los criterios potencial para implantar en este tipo respecto a pacientes sin FRI. ASEBIR en el día de la transferencia. de pacientes. Otros biomarcadores de receptividad endometrial, MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS metabolómicos e incluso del líquido folicular van a ser claves para valorar la Se trata de un estudio retrospectivo en El número medio de células en el segundo competencia embrionaria, así como su el que se analizan 836 ciclos de FIV/ día de cultivo embrionario fue similar correspondiente diálogo endometrial. ICSI-TE realizados entre los años 2008 en los dos grupos (3.6 en el grupo I y y 2010. Consideramos FRI a aquellas 3.7 en el II, p=0.4). De la misma forma,
- 212. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 210 117: crYOPEttE: UNA NUEVA HErrAMIENtA PArA lA VItrIFIcAcIÓN EN SIStEMA cErrADO C. Roméu, M. Lierta, J. Sánchez Rubio, A. Chueca, A. Urries Reproducción Asistida Quirón Zaragoza, Grupo Hospitalario Quirón. e-mail: cromeu.zar@quiron.es INTRODUCCIÓN OBJETIVOS sistema utilizado para la vitrificación. Ambos son mecanismos de almacenaje La criopreservación de gametos y El objetivo del presente estudio fue cerrados. embriones se ha convertido en una comparar la eficacia de la vitrificación tarea rutinaria en los centros de de embriones multicelulares utilizando La descongelación se llevó a cabo el reproducción asistida. Actualmente Cryopette como soporte de almacenaje, mismo día de la transferencia o el día existen dos técnicas de congelación: con la de un sistema previamente previo a ésta. Se consideró que los la congelación lenta y la vitrificación, establecido como es la congelación embriones que habían sobrevivido al con sistemas de almacenaje abiertos lenta en pajuelas CBS. proceso eran aquellos que presentaban o cerrados. En la comunidad científica ≥ 50% de blastómeras intactas o parece haber discrepancias a la hora MATERIAL Y MÉTODOS bien tenían tres células viables en el de decidir el método de congelación momento de la descongelación, y al más adecuado para cada caso, Se congelaron un total de 272 menos una de ellas había dividido en pero con respecto al sistema de embriones en estadio de Día+3 post- las 18h posteriores de incubación. Los almacenaje consideramos que el punción pertenecientes a 62 ciclos de ciclos en los que no hubo supervivencia más seguro es el sistema cerrado FIV que aleatoriamente se distribuyeron embrionaria fueron cancelados. El ya que elimina cualquier riesgo de en 2 grupos según la técnica de embarazo se determinó analizando cross-contaminación entre muestras congelación empleada: congelación en sangre los niveles de beta-hCG durante su permanencia en el tanque lenta (Sydney IVF Cryopreservation 14 días después de la transferencia de congelación. Últimamente se ha kit ; Cook, Irlanda) versus vitrificación embrionaria. desarrollado una nueva herramienta (Medicult Vitrification Cooling kit ; para vitrificación en sistema cerrado, Medicult, Dinamarca). Para el método RESULTADOS Cryopette (Origio, Dinamarca), que de congelación lenta los embriones pretende mejorar los resultados se almacenaron en pajuelas de alta Los datos obtenidos se presentan en la logrados hasta el momento. seguridad biológica (CryoBioSystem, siguiente tabla. Francia) mientras que Cryopette fue el Congelación Lenta+CBS Vitrificación+Cryopette Edad materna 31,4 ± 5,9 33,1 ± 5 Nº Ciclos 41 21 Nº Ciclos Cancelados (%) 9 / 41 (22) 7 / 21 (33,3) Nº embs criopreservados (media) 205 (5) 67 (3,2) Nº embs descongelados (media) 196 (4,8) 63 (3) Supervivencia (%) 99 / 196 (50,5) 40 / 63 (63,5) Nº embs con 100% blastómeras intactas 44 / 99 (44,4) 18 / 40 (45) Nº embs transferidos (media) 81 (2) 31 (1,5) Embarazo por ciclo (%) 13 / 41 (31,7) 8 / 21 (38,1) Embarazo por transferencia (%) 13 / 32 (40,6) 8 / 14 (57,1)
- 213. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 211 CONCLUSIONES de la técnica de vitrificación con Vitrificación+Cryopette se establece Cryopette, como sistema de almacenaje como una herramienta de almacenaje Según los resultados alcanzados cerrado, a pesar incluso de haberse embrionario adecuada y segura ya que en este estudio se puede concluir criopreservado un menor número al ser un sistema cerrado eliminamos que mejoramos las tasas tanto de de embriones en los casos en los todo riesgo de contaminación cruzada. supervivencia embrionaria como de que se ha realizado vitrificación embarazo mediante la combinación respecto a los de congelación lenta. 118: lA EclOSIÓN ASIStIDA NO INcrEMENtA lOS rESUltADOS EN EMBrIONES DESVItrIFIcADOS NI trAS lA VItrIFIcAcION DE OVOcItOS M. Iglesias, I. Galán, P. Rollán, L. Melado, A. García, A. Gosálvez 1 Hospital Universitario Quirón Madrid. 2Universidad Autónoma de Madrid. 3Universidad Europea de Madrid. e-mail: miriamen1@yahoo.es; miglesias.mad@quiron.es INTRODUCCIÓN como de embriones, tanto en la tasa la tasa de implantación y la tasa de de implantación como en la tasa de embarazo evolutivo por transferencia. La eclosión asistida o assisted hatching embarazo evolutivo por transferencia. tiene una indicación ya bien establecida Todos los casos fueron realizados por la en embriones transferidos en día 3 tras MATERIAL Y MÉTODOS misma embrióloga (M.I.) y la técnica fue la congelación lenta. Sin embargo, su homogénea (eclosión asistida de forma utilidad tras la vitrificación es todavía Se analizaron todos los casos mecánica con micropipeta PZD). debatida. de desvitrificación del Hospital Universitario Quirón Madrid desde Enero Hemos analizado las 95 OBJETIVO de 2010 hasta Febrero de 2011 en los desvitrificaciones con transferencia de tres posibles casos de desvitrificación: nuestro centro mediante la prueba de Determinar la utilidad de la eclosión ovocitos de donante, ovocitos propios y chi cuadrado: asistida en embriones procedentes embriones. En cada grupo, se analizó la de la vitrificación tanto de ovocitos influencia de la eclosión asistida sobre TABLA 1: Desvitrificación de ovocitos de donante Tipo Pac. Ov. Desv. Ov. Sup. ET Gestantes Vesículas Mujeres fetos en curso Hatching 11 110 96 22 4 5 2 NO Hatch 18 242 199 35 7 8 7 TABLA 2: Desvitrificación de ovocitos propios Tipo Pac. Ov. Desv. Ov. Sup. ET Gestantes Vesículas Mujeres fetos en curso Hatching 15 132 120 33 5 7 5 NO Hatch 12 96 67 23 4 3 2 TABLA 3: Desvitrificación de embriones Tipo Pac. Ov. Desv. Ov. Sup. ET Gestantes Vesículas Mujeres fetos en curso Hatching 24 62 54 54 11 10 5 NO Hatch 15 40 35 35 5 4 3
- 214. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 212 RESULTADOS En el grupo de embriones desvitrificados parece incrementar la probabilidad tampoco encontramos diferencias de embarazo cuando se realiza en En los grupos de desvitrificación significativas a favor de la eclosión embriones procedentes de ovocitos de ovocitos, la eclosión asistida no asistida (11/24 46% frente a 5/15 desvitrificados, tanto si son ovocitos mejoró la tasa de embarazo (4/11 33% en la tasa de embarazo, 10/54 de donante como propios, ni cuando 36% frente a 7/18 39% en ovocitos 19% frente a 4/35 11% en la tasa de empleamos la técnica en embriones de donante y 5/15 33% frente a 4/12 implantación y 5/24 21% frente a 3/15 desvitrificados. 33% en ovocitos propios), ni la tasa de 20% en la tasa de gestación evolutiva implantación (5/22 23% frente a 8/35 por transferencia). Por ello, consideramos que es necesario 23% en ovocitos de donante y 7/33 21% recopilar más datos para llegar a una frente a 3/23 13% en ovocitos propios). CONCLUSIONES conclusión más determinante. Las tasas de gestación evolutiva fueron también similares (2/11 18% frente a Aunque el tamaño de la muestra no 7/18 39% y 5/15 34% frente a 2/12 17% permite establecer conclusiones respectivamente). definitivas, la eclosión asistida no 119: lA MUSIcOtErAPIA rEDUcE El EStADO DE ANSIEDAD EN UN PrOGrAMA DE FEcUNDAcIÓN IN VItrO (FIV) O. López1, A. García1, O. Martínez-Pasarell1, A. Mata1, I. Martínez2, K. Díaz2, F. Mas2, N. Camps3, E. Clot 4, P. Parés5, J. Goyanes2, L. Bassas1. 1 Laboratorio de Embriología y Seminología, 2Servicio de Enfermería, 3Servicio de Psicología Clínica, Fundació Puigvert, Barcelona. 4Laboratori Clínic IDI- BELL, Hospital Universitari de Bellvitge, Barcelona. 5Equipo de Ginecología; Programa de Reproducción Asistida, Fundació Puigvert-HSCSP, Barcelona. e-mail: olopez@fundacio-puigvert.es INTRODUCCIÓN Durante el periodo comprendido entre nº y calidad de los embriones (obtenidos diciembre 2010 hasta abril de 2011 se y transferidos). El test estadístico t de Las técnicas de reproducción asistida reclutaron 216 pacientes (n=112 grupo Student se empleó para variables que ocasionan en las pacientes malestar físico C y n=104 grupo M), todas ellas con seguían distribución de Laplace-Gauss y la y psíquico. La transferencia embrionaria transferencia embrionaria (TE) en día prueba u de Mann-Whitney para variables es la última intervención del proceso, 2 como criterio principal de inclusión. que no seguían dicha distribución. donde toda la ansiedad acumulada se Los efectos psicológicos de la música se manifiesta de nuevo. La musicoterapia es evaluaron mediante el test STAI (estado- RESULTADOS una técnica aplicada en diversos campos rasgo) y los efectos fisiológicos mediante de la medicina para disminuir la ansiedad la medición de la frecuencia cardiaca No se encontraron diferencias en los pacientes, y que facilita la relajación y tensión arterial. El día de la punción significativas en la tasa de gestación psicofísica de un modo sencillo. folicular (PF), las pacientes incluidas en entre ambos grupos (45,5% y 45,2% , el grupo M, recibieron un CD (vol II Music C y M respectivamente). El valor para el OBJETIVO for Rest & Relaxation, Mozart) junto con test STAI (estado) fue significativamente instrucciones para su audición periódica en más bajo en el grupo M vs grupo C El objetivo principal ha sido determinar condiciones de reposo físico hasta el día de (10,3 vs 13,9; p<0.001). El decremento el efecto de la música en las tasas de la TE, momento en el cual, cumplimentaron medio de la TA diastólica a los 90 min gestación de un programa de fecundación un cuestionario de satisfacción personal en el grupo de pacientes que recibieron in vitro (FIV). Como objetivos secundarios, sobre la experiencia. Durante la TE, musicoterapia respecto al grupo control se ha procedido a evaluar los efectos se continuó la audición musical en el fue significativamente mayor 13,9 vs psicológicos y fisiológicos de la música, quirófano y se mantuvo durante las dos 10,5 mmHg ( p<0.05). En el resto de así como la satisfacción personal de las horas de reposo posteriores. En ambos parámetros no se encontraron diferencias pacientes. grupos se determinó la frecuencia cardiaca entre los dos grupos. El cuestionario de y la tensión arterial (TA) a los 0, 30 y 90 satisfacción personal reflejó que un 84,6 MATERIAL Y MÉTODOS minutos post transferencia y se realizó el % de las pacientes, manifestaban haberse test de STAI. sentido bastante o muy relajadas durante Se trata de un ensayo clínico prospectivo, los dos días previos a la TE. Un 91,3% de abierto, controlado y aleatorizado en Se comprobó la homogeneidad de los las pacientes “repetirían la experiencia” y dos grupos de estudio, control (C) y grupos de estudio mediante los parámetros un 86,5% manifestaron su aprobación con musicoterapia (M). Todas las pacientes edad, intentos previos de fecundación, nº respecto a la música seleccionada. firmaron consentimiento informado. oocitos, nº de oocitos en metafase II y
- 215. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 213 CONCLUSIONES psicológico y fisiológico en las pacientes ayuda para afrontar el estado de ansiedad que recibieron dicha terapia. Las pacientes inherente a los procesos de reproducción Aunque las tasas de gestación fueron expuestas a la música apreciaron asistida. Sería interesante ampliar el similares entre los dos grupos, la una mejora en la calidad asistencial y estudio aumentando la duración del musicoterapia produjo una reducción humana percibida. Ello sugiere que la tratamiento. apreciable en indicadores de estrés musicoterapia puede ser utilizada como 120: AccESIBIlIDAD A lAS tÉcNIcAS DE rEPrODUccIÓN ASIStIDA EN PAcIENtES cON INFEccIONES VIrAlES crÓNIcAS I. Molina, A. Clavero, B. González, ER. Palacios, S. Carrillo, L. Martínez, MA. Calderón. Unidad de reproducción, Hospital Universitario Virgen de las Nieves e-mail: imoglez@gmail.com INTRODUCCIÓN Hospital público de referencia, una a los ciclos estimados a partir de la partir de la población general y otra a población general y aproximadamente Hasta la fecha son muchos los trabajos partir de la población subfértil. la quinta parte de lo estimado para que han descrito la seguridad de parejas subfértiles. El porcentaje de la técnica de lavado de semen-ICSI Se tuvieron en cuenta el número de varones inmigrantes con EIT atendidos para parejas serodiscordantes para parejas en edad reproductiva, el en nuestra unidad es similar a la VIH, VHC y VHB. Diferentes autores número de parejas subfértiles, la prevalencia de estas enfermedades han puesto también en evidencia la prevalencia de estas infecciones, los en la población inmigrante. No se escasa oferta de centros que ponen deseos reproductivos de estas parejas, encontraron diferencias significativas las ART a disposición de los pacientes así como el número máximo de dos en el número de ciclos realizados a con enfermedades infecciosas ciclos que se realiza a una pareja en el pacientes que residían a gran distancia transmisibles (EIT), sin embargo sistema sanitario público de Andalucía. de nuestro centro (> 200 km), respecto ningún estudio ha analizado la a los pacientes que residían cerca, tanto accesibilidad de las parejas a este tipo RESULTADOS para HIV como para hepatitis. de técnicas. Como era de esperar la demanda teórica CONCLUSIONES OBJETIVOS estimada de ciclos de ART por año en varones con EIT fue mucho mayor a No creemos que exista un problema Analizar la accesibilidad a las partir de datos de población general específico de accesibilidad a estas TRA en Andalucía para parejas que de parejas subfértiles, pues en la técnicas en estas parejas, aunque el serodiscordantes con varón positivo primera situación se incluye además de número de ciclos realizados sea menor a para EIT, así como los posibles a las parejas subfértiles, a las parejas la demanda esperada tanto al estimarla factores que influyen en ella, como la fértiles con esterilidad voluntaria. Al a partir de la población general como inmigración o la distancia del lugar de comparar estos valores con el número de la población subfértil. La ratio es la residencia al centro de reproducción. de ciclos realizados, observamos misma que la observada para pacientes que en el caso de HIV, se realizó sin EIT entre centros públicos (20%) y MATERIAL Y MÉTODOS aproximadamente una quinta parte de privados (80%) en España. La demanda la estimada para la población general no atendida en el sistema público de Se llevaron a cabo estimaciones de la y la mitad de lo estimado para parejas salud, suponemos que es atendida en el demanda teórica de ciclos de ART que infértiles. Sin embargo, los ciclos sistema privado, al igual que ocurre en deberían haberse realizado en parejas realizados en parejas con hepatitis las parejas sin EIT. con varón infectado con EIT en nuestro representan una pequeña parte de
- 216. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 214 121: lA INFlUENcIA DEl cUltIVO A BAJAS cONcENtrAcIONES DE OXÍGENO MEJOrA El DESArrOllO E IMPlANtAcIÓN DE lOS BlAStOcIStOS Y. Franco, M.J. Lázaro, P. Rodríguez, E. Ortiz, M. García Centro Sanitario Virgen del Pilar e-mail: josufranco@hotmail.es INTRODUCCIÓN Los estudios realizados en modelos para ello el soporte Cryotop y los medios animales muestran que las condiciones Irvine Scientific. El cultivo hasta el estadio de blastocisto fisiológicas encontradas en los oviductos nos permite realizar una mejor tienen un rango del 5-8,7% de O2, RESULTADOS evaluación de la calidad embrionaria y mientras que en el útero se encuentran una mejor selección de embriones para en torno al 2%. Por este motivo se Hastaelmomentosehanrealizado23casos transferir. Esto permite la realización ha observado un efecto favorable de desvitrificación, descongelándose de transferencias de embrión único, del cultivo con baja concentración un total de 35 blastocistos, con una logrando así una disminución en la tasa de O2 especialmente en el estadio de tasa de supervivencia del 74%. De estas de embarazo múltiple. blastocisto. 23 desvitrificaciones se realizaron 17 criotransferencias obteniéndose una El uso de los nuevos sistemas de cultivo OBJETIVOS tasa de implantación de un 46% con una embrionario como son los medios tasa de embarazo por transferencia de un secuenciales y los incubadores con baja Evaluar la eficiencia y beneficios del 53%. concentración de oxígeno muestran un cultivo de blastocistos en condiciones incremento significativo en la tasa de de baja concentración de O2. CONCLUSIONES implantación transfiriendo embriones en D+5 vs D+3. Estudios prospectivos han MÉTODOS El cultivo de blastocistos a baja demostrado que la tasa de implantación concentración de O2 permite obtener por blastocisto es de un 50,5% mientras En nuestro laboratorio de embriología una mejor tasa de desarrollo de que la tasa de implantación por embrión hemos implementado desde febrero blastocisto y una mejor calidad, lo de día 3 es de un 30,1% de 2010 el cultivo de blastocistos a que se traduce en un mayor número baja concentración de oxígeno (5% O2) de blastocistos vitrificados. Nuestros Las condiciones de cultivo embrionario utilizando para ello el mini-incubador resultados hasta el momento avalan tradicionales son de un 5% de CO2, 20% K-MINC 1000 (Cook). los estudios publicados por otros de O2 y el resto N2. Este porcentaje de autores obteniendo en nuestro centro oxígeno puede promover la generación De los ciclos realizados durante este una mayor tasa de implantación y de de especies reactivas de oxígeno, que periodo hemos obtenido en 55 ciclos embarazo por ciclo de desvitrificación puede provocar una disminución en una calidad óptima de blastocistos de blastocistos. el número de embriones que llegan al en D+5 y D+6, en los cuales fueron estadio de blastocisto. vitrificados 96 blastocistos utilizando 122: rElAcIÓN ENtrE El tIPO DE rOtUrA SIN SAltO Y lA tASA DE OVOcItOS DEGENErADOS C. Muñoz, A. Sáez, C. Olmedo, J. L. Soriano, I. Cuevas Hospital General Universitario de Valencia e-mail: konxi21@hotmail.com INTRODUCCIÓN hemos observado que la tasa de ovocitos del citoplasma ovocitario durante la degenerados tras la microinyección microinyección y la tasa de ovocitos Las técnicas de fecundación asistida oscila entre un 8 y un 10%. degenerados. se han convertido en un tratamiento de uso común para los diferentes tipos OBJETIVO MATERIAL Y MÉTODOS de infertilidad, tanto la de origen desconocido como la de factor masculino El objetivo de este estudio es establecer Se recopilaron los datos de un total de y femenino. En la bibliografía consultada la posible relación entre el tipo de rotura 495 ovocitos microinyectados de forma
- 217. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 215 consecutiva de 72 pacientes sometidas a exacta de Fisher’s usando el programa CONCLUSIONES tratamientos de fecundación in vitro (ICSI) estadístico SPSS 11.0. Para evitar sesgos en la Unidad de Reproducción Humana debidos a la obtención consecutiva de los Tras realizar este estudio observamos Asistida del Hospital General Universitario datos se aleatorizó la muestra. que cuando la rotura de la membrana durante el período comprendido entre se produce sin salto durante la abril de 2009 y febrero de 2010. RESULTADOS microinyección la probabilidad de que el ovocito degenere es 6 veces mayor. En Durante el procedimiento de microinyección La muestra obtenida en la aleatorización nuestro laboratorio hemos observado se fueron registrando los distintos tipos fue de 244 ovocitos. Se obtuvieron que los ovocitos obtenidos de folículos de rotura de la membrana ovocitaria diferencias estadísticamente ecográficamente post-maduros (>22 clasificando de la siguiente forma: con significativas en cuanto a la tasa mm.) presentan una mayor frecuencia salto y sin salto. Posteriormente se evaluó de degeneración de ovocitos que de rotura de membrana sin salto, por lo la fecundación, anotando los ovocitos que presentaban salto (8,3%) y la de los que la programación de las punciones habían degenerado y los que no. que no lo presentaban (35,7%). La chi- en el momento adecuado es importante cuadrado obtenida fue de 0.001 y la O.R. para los resultados del laboratorio. Los datos obtenidos se analizaron mediante fue de 6,1 con un intervalo de confianza el test chi-cuadrado con la corrección al 95% [1,6 – 20,0]. 123: PArÁMEtrOS SEMINAlES EN VArONES cON VIH SEGÚN El MANUAl DE lA OMS I. Molina, MC. Gonzalvo, JA. Castilla, B. González, ER. Palacios, AP. Ortiz, S. Carrillo Unidad de reproducción, Hospital Universitario Virgen de las Nieves e-mail: imoglez@gmail.com INTRODUCCIÓN consultan con su respectiva pareja en Número total de espermatozoides: la Unidad de Reproducción de nuestro 170.714.516 espermatozoides El estudio del semen permite conocer hospital, por deseos reproductivos. el estado funcional de la secreción En todos los casos la carga viral para Movilidad total: 46.5% exocrina de las glándulas sexuales VIH-1 de los pacientes fue inferior masculinas y nos orienta sobre a 40 copias/ml. Además, 23 de los Movilidad (a + b): 30.8% patologías del sistema genital. pacientes, presentaron coinfección por En pacientes con VIH el análisis virus de la hepatitis C, siendo en todos CONCLUSIONES de semen suele solicitarse dentro los casos la carga viral para el VHC de la práctica clínica derivada del menor de 15 UI/ml. A todos ellos, se Todos los pacientes con VIH que empleo de las diferentes técnicas de les realizó un análisis básico del semen, acuden a nuestro centro con deseos reproducción asistida, encaminadas determinando, entre otros parámetros, reproductivos, presentan un volumen, fundamentalmente a evitar la la concentración, volumen, número concentración espermática y número de transmisión horizontal y vertical. de espermatozoides y movilidad de espermatozoides superior a los valores los mismos. Los seminogramas fueron de referencia del manual de la OMS- OBJETIVOS realizados en el periodo comprendido 99 de análisis de semen. Sin embargo, entre 2005-2009. la movilidad espermática (tipo a+b) El objetivo de este estudio fue comparar presentó un valor medio (30.8%) los parámetros básicos del semen de RESULTADOS inferior al valor de referencia publicado individuos infectados por VIH con los en el manual OMS-99 de análisis de valores de referencia del eyaculado El análisis estadístico de los parámetros semen (≥50% de los espermatozoides según manual OMS-99 de análisis de seminales, anteriormente citados, con motilidad tipo a + tipo b). semen. muestran los siguientes valores medios: MATERIAL Y MÉTODOS Volumen: 3.2 ml Estudio retrospectivo observacional de Concentración: 33 pacientes infectados por VIH, que 58.453.125 espermatozoides/ml
- 218. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 216 124: El pH DEl MEDIO DE cUltIVO DEtErMINA El cO2 ADEcUADO DEl INcUBADOr C. Bou, D. Agudo, J. Alonso, A. Martínez, F. Bronet IVI Madrid e-mail: carmen.bou@ivi.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS necesita un mínimo de 4 horas para equilibrarse. En el incubador con 5,8% Uno de los factores que afecta a los Utilizamos el pHmetro on line MTG que el pH es 7,31 y el tiempo de equilibrio es resultados gestacionales es el medio de permite monitorizar de forma continua de 2 horas. Según estos resultados, el cultivo embrionario que se utiliza en el los valores de pH en intervalos de tiempo pH óptimo del medio que empleamos en laboratorio de Reproducción Asistida. establecidos. El sensor de pH está nuestro laboratorio se alcanza cuando Las características físico-químicas del integrado en una placa que contiene el incubador tiene un 6,5% de CO2. medio, pH, temperatura, osmolaridad 200 microlitros de medio de cultivo así como la concentración de O2 y CO2 Global (LifeGlobal) suplementado con CONCLUSIONES influyen en la viabilidad y desarrollo de HSA y cubierto de aceite mineral. El pH los embriones. recomendado por el fabricante es 7.20+/- Muchos procesos metabólicos, síntesis 0.1. Registramos los pH cada 10 minutos de proteínas, función mitocondrial OBJETIVOS durante 24 horas en incubadores con y regulación del citoesqueleto, son diferentes concentraciones de CO2: 7%, sensibles a variaciones de pH. Este Optimizar las condiciones de cultivo 6.5% y 5.8% factor también puede influir en la embrionario ajustando el porcentaje calidad embrionaria y depende de de CO2 del interior de los incubadores RESULTADOS la formulación del medio de cultivo. según el valor recomendado de pH Con el objetivo de minimizar el estrés del medio de cultivo, y determinando Cuando el incubador tiene un 7% de intracelular del embrión consideramos el tiempo óptimo de equilibrio de las CO2, el promedio de pH del medio es 7,17 importante controlar el pH del medio de placas de cultivo. alcanzándose el equilibrio a las 4 horas cultivo embrionario para ajustar el CO2 30 minutos aproximadamente. Cuando de los incubadores, y utilizar el medio tiene un 6,5% de CO2, el pH es 7,20 y una vez alcanzado el equilibrio. 125: cOrrElAcIÓN ENtrE MOrFOlOGÍA EMBrIONArIA Y GENÉtIcA B. Hurtado de Mendoza, J. Arbúes, T. Muñoz, I .García, C. Romero Instituto Ginecológico “La Cigüeña”. Madrid e-mail: cromero@laciguenia.com INTRODUCCIÓN potencial de implantación y así lograr MATERIAL Y MÉTODOS una gestación evolutiva que diera lugar Los centros de Reproducción Humana a un recién nacido sano. Documentamos un caso estudiado han ido incorporando de forma de una mujer de 38 años a la que se progresiva el Diagnóstico Genético Presentamos un caso clínico de estudio le practica un ciclo de FIV-ICSI con Preimplantacional (DGP) en casos de DGP donde una adecuada morfología DGP por abortadora habitual. Se de edad avanzada, fallo repetido de embrionaria coincide con embriones realizó estimulación ovárica folicular implantación y abortadoras habituales. cromosómicamente alterados. controlada con FSHr a una dosis diaria Se han publicado estudios haciendo de 225 UI durante 11días. Punción referencia a la escasa o nula utilidad OBJETIVO folicular a las 36 horas de aplicar hCGr de esta técnica por no aumentar 250mcg/ml (Ovitrelle). Se obtuvieron 21 la tasa de gestación. Sin embargo, Demostrar que una apropiada ovocitos, 18 de los cuales se encontraban consideramos que la evaluación de morfología del embrión para su en Metafase II. Se microinyectaron con distintas características morfológicas selección y posterior transferencia no semen conyugal fresco y se observaron de los embriones durante su cultivo in corresponde siempre con los resultados signos de fecundación en 14 zigotos, a vitro son insuficientes para seleccionar genéticos. las 18 h. post ICSI. Se realizó FISH para aquellos embriones con mayor los cromosomas 13, 15, 16, 17, 18, 21,
- 219. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 217 22, X e Y. Durante el cultivo in vitro, reveló información para 13 embriones, 2. El DGP demuestra que una adecuada los embriones fueron fotografiados uno no fue informativo. De los 13 morfología y evolución embrionaria cada 24 horas mediante cámara digital embriones solo 1 presentó normalidad no siempre se corresponde con un acoplada al microscopio invertido, cromosómica para todas las sondas embrión cromosómicamente normal. desde el estadio de zigoto hasta el de estudiadas, y los otros 12 presentaron blastocisto. cromosomopatías para los cromosomas 3. Profundizar en nuevos estudios y testados. (Tabla 1) añadir a los criterios de selección RESULTADOS embrionaria parámetros bioquímicos CONCLUSIONES relacionados con el metabolismo del De los 14 embriones analizados 2 de ellos embrión es un reto y aportaría datos se detuvieron post biopsia embrionaria 1. La información que aporta la objetivos para transferir aquellos y los 12 restantes se desarrollaron hasta morfología de los embriones embriones con mayor probabilidad el estadio de blastocito y eclosionaron es insuficiente para su correcta de conseguir un recién nacido sano espontáneamente. El estudio FISH selección. en casa. Tabla 1. Análisis de los resultados de FISH. (N.I. Hibridación no informativa) Evolución de embrión a blastocito presentando cromosomopatías múltiples
- 220. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 218 126: IDENtIFIcAcIÓN DE FActOrES BIOlÓGIcOS, SOcIAlES Y GEOGrÁFIcOS DE POSIBlE INFlUENcIA SOBrE lA cAlIDAD SEMINAl J. Valero, P.J. Fernández, I. Molina, A. Pellicer. Unidad De Reproducción Humana Asistida. Hospital Universitario La Fe, Valencia e-mail: jefreevalero@gmail.com INTRODUCCIÓN (consumo de café, tabaco y alcohol) y varones españoles es significativamente origen geográfico. superior (p<0,05) al de los varones del Numerosos estudios han analizado la norte de África (42 millones/ml vs. 27 posible influencia de los hábitos de En el estudio retrospectivo fueron millones/ml; p<0,01); mientras que vida y factores sociales, demográficos incluidos 2460 varones a los que se dicho recuento es significativamente o geográficos sobre la calidad seminal; realizó un espermiograma en la misma inferior al de varones procedentes siendo los resultados casi siempre Unidad, entre 1990 y 2010. de otros países de Europa Occidental controvertidos. Otros autores han (Italia, Francia, Reino Unido, Holanda, sugerido que en los últimos 50 años se Para los seminogramas se utilizaron etc.) (42 millones/ml vs. 51 millones/ ha producido un deterioro evidente de los valores de referencia establecidos ml; p<0,01) y de América (42 millones/ la calidad seminal. por la OMS en sus manuales de 1999 y ml vs. 49 millones/ml; p<0,01). 2010. Los datos fueron analizados con OBJETIVOS el programa estadístico SPSS mediante El estudio retrospectivo sólo muestra pruebas de análisis multivariante y un descenso significativo (p<0,01) en la En este contexto se plantea: curvas de regresión lineal. motilidad tipo "a" (14% vs. 28%) y en la progresión espermática (20 mm vs. 16 mm). Determinar la posible relación entre RESULTADOS la calidad seminal, hábitos de vida y CONCLUSIONES factor geográfico mediante un estudio Los resultados muestran que el prospectivo. consumo de café, alcohol y tabaco no El consumo de café, tabaco y alcohol, afecta significativamente a la calidad independientemente de las cantidades Evaluar, retrospectivamente, los seminal de los varones estudiados. Sin consumidas, no parece afectar a la calidad cambios en la calidad seminal durante embargo, intervenciones quirúrgicas seminal de los varones. los últimos 20 años. previas (o traumatismos recientes) sí que afectaron de forma significativa Tan sólo se observa deterioro en la calidad MATERIAL Y MÉTODOS (p<0,01) al recuento en fresco (36 seminal en varones que han sufrido algún millones/ml vs. 42 millones/ml). traumatismo previo o intervención en En el estudio prospectivo fueron los seis meses previos al espermiograma. incluidos 464 varones que acudieron Por otro lado, los varones con pareja También, se observa que los varones a la Unidad de Reproducción Humana estable presentaron un recuento con pareja estable presentan una mejor Asistida del Hospital Universitario La en fresco significativamente mayor calidad seminal que los que no la tienen. Fe de Valencia para ser diagnosticados (p<0,05) que varones sin pareja estable El factor geográfico revela que la calidad y tratados. A cada varón se le realizó (40 millones/ml vs. 27 millones/ml; seminal de los españoles es superior a la un espermiograma básico (recuento p<0,01). De igual modo, la población de los africanos, pero peor que la de otros y motilidad en fresco y tras swim-up, activa mostró un mejor recuento en países europeos así como de varones del viabilidad, estudio inmunológico y fresco (48 millones/ml vs. 37 millones/ continente americano. Finalmente, el progresión) y rellenó un cuestionario ml; p<0,01) que los varones en paro estudio retrospectivo revela, en los últimos que recogía su situación personal (con (p<0,05). 20 años y en la población estudiada, un o sin pareja estable), salud (procesos descenso en la motilidad progresiva tipo febriles, consumo de fármacos e Al estudiar el factor geográfico se observa "a" y progresión espermática. intervenciones previas), hábitos de vida que el recuento espermático en fresco de
- 221. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 219 127: trANSFErENcIA EMBrIONArIA ElEctIVA: SEGUrIDAD Y cAlIDAD EN rAH M. A. Vilches-Ferrón (*), M.C. Velázquez de Castro del Pino., E. Sánchez Fornieles, A. Montilla Gómez, J. J. Khouri Choufani., C. Arqueros Gutiér- rez, M. M. Nicolás Martínez Complejo Hospitalario Torrecárdenas, Almería e-mail: mangel.vilches.sspa@juntadeandalucia.es INTRODUCCIÓN óptimo el día de la transferencia, y 47 hacen eSET o DET. En los demás factores si transferencias de 36 a 38 años en su existe diferencias significativas (p < 0.05). Establecer en el H Torrecárdenas una primer ciclo FIV/ICSI, de las que 41 Las tasas de embarazo de eSET (30,6%) y política de transferencias electivas de tenían al menos un embrión óptimo. En DET (34,7%) sin diferencias (p>0.05). 1/2 preembriones (eSET) que permitiera el grupo de mujeres < 36 años en 1º o Las tasas de aborto tras eSET (18,2%) y reducir los embarazos gemelares sin 2º ciclo, 61 TE de 1 embrión y 128 de 2 DET (19,2%) sin diferencias significativas disminuir la probabilidad de embarazo. embriones. En el grupo de 36 a 38 años en (p>0.05).Tampoco hay diferencias entre Para determinar el grupo de pacientes a 1º ciclo, 16 transferencias de 1 embrión y las tasas de embarazo conseguidas los que se ofrecería eSET, nos basamos 8 de 2 embriones. Se analizaron en cada con eSET+CT (30,6%) y DET (34,7%) en el estudio previo de nuestros datos tipo de transferencia la tasa de embarazo (p>0.05), o entre eSET+CT (30,6%) y con el que establecimos las condiciones (TE), tasa de implantación (TI), tasa de DET+CT (37,3%) (p>0.05). En cuanto a la para la transferencia de 2 embriones en embarazos gemelares (T Gem), tasa respuesta a la estimulación ovárica (Nº cuanto a edad y calidad embrionaria. de aborto (TA), y tasa de embarazo de MII) y al resultado en el laboratorio conseguida en FIV más la conseguida (Nº MII inseminados, Nº embriones, OBJETIVOS con los embriones congelados del mismo Nº embriones óptimos) las pacientes ciclo (eSET+CT o DET+CT). Para calcular en cualquier grupo de edad, que optan Analizar los resultados de la esta última variable se han tenido en por eSET o DET, presentan diferencias transferencia de < 3 embriones y su cuenta sólo el primer embarazo por cada estadísticamente significativas. impacto en la tasa de embarazo y la ciclo de FIV. Los estadísticos se hicieron tasa de multigestación, para adoptar aplicando los test X2 y prueba t para CONCLUSIONES nuevas políticas en cuanto al número medias de dos muestras. de embriones transferidos y contribuir En mujeres de 36 o menos años, cuando a la solución de una importante RESULTADOS hay un embrión de calidad óptima, la complicación de las técnicas de tasa de embarazo de eSET es inferior Reproducción Asistida: el embarazo En el grupo de mujeres 36 a 38 años los a la tasa de DET. En este grupo casi el múltiple. factores de esterilidad se distribuyen de 10% (7,7%) de los embarazos obtenidos manera semejante entre las pacientes por DET son gemelares. Sin embargo MATERIALES Y MÉTODOS que optan por eSET (transferencia este valor es incluso algo mejor al 10% embrionaria de 1 solo preembrión) recomendado por la ESHRE. No obstante Los datos analizados en este trabajo o DET (transferencia embrionaria puede mejorarse estos resultados si se se han obtenido de ciclos FIV/ICSI de 2 preembriones), sin diferencias complementa el eSET con posteriores realizados en nuestro centro (marzo estadísticamente significativas. En el criotransferencias derivadas del mismo 2009 a marzo 2010). En este periodo se grupo de mujeres de menor o igual a 36 ciclo de FIV. Por tanto, para establecer realizan 220 transferencias a mujeres años, en el caso del factor masculino se el eSET es necesario tener un buen con edad <36 años en 1º o 2º ciclo, de puede asegurar que no hay diferencias programa de crioconservación. las que 180 tenían al menos un embrión significativas entre las pacientes que
- 222. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 220 128: NIVElES SÉrIcOS ElEVADOS DE PrOGEStErONA DUrANtE lA EStIMUlAcIÓN EN cASOS DE OVODONAcIÓN NO AFEctAN A lAS tASAS DE GEStAcIÓN, ABOrtO E IMPlANtAcIÓN M. Ojeda, J. Aguilar, M. Mollá, E. Táboas, E. Muñoz IVI Vigo e-mail: maria.ojeda@ivi.es INTRODUCCIÓN progresiva. CONCLUSIONES En la bibliografía existe controversia en RESULTADOS En el grupo de pacientes estudiado no cómo pueden afectar los niveles elevados existen diferencias estadísticamente de progesterona sérica en las tasas de La tasa de cancelación de transferencias significativas en cuanto a las TG, TA y gestación, aborto e implantación y en fue 21,7% (10/46), la TG por transferencia TI respecto a las obtenidas en nuestro la calidad embrionaria. En los casos embrionaria 55,55% (20/36), la TA por centro en el programa de ovodonación, de ovocitos propios puede afectar a la transferencia 15% (3/20) y la TI 40% aunque la tasa de cancelación de implantación del embrión debido a una (26/65), mientras que las obtenidas transferencias es más elevada por lo luteinización prematura. en nuestro centro en receptoras del que podemos considerar que son ciclos programa de donación de ovocitos son de peor pronóstico. El objetivo del presente trabajo es una tasa de cancelación de 9,08%, una evaluar el efecto de niveles elevados TG de 62,29%, una TA de 16,29% y una Elevados niveles séricos de progesterona de progesterona en la estimulación TI de 43,68%. durante la estimulación podrían afectar ovárica de donantes de ovocitos sobre a la calidad embrionaria en casos las tasas de gestación (TG), aborto (TA) Según se haya realizado la transferencia de ovodonación aunque deberíamos e implantación (TI) en las receptoras del en día 3 de vida embrionaria o en día considerar el efecto negativo que programa de ovodonación. 5-6, la TG fue de 25% (4/16) frente pueden ejercer las muestras seminales 75% (15/20), la TA de 25% (1/4) frente de baja calidad. En aquellos casos MATERIALES Y MÉTODOS 13,33% (2/15) y la TI de 17,85% (5/28) de cohortes embrionarias de calidad frente 56,75% (21/37), respectivamente. subóptima, el cultivo prolongado de los Estudio retrospectivo de 46 ciclos de En 8 de los 20 casos en los que se realizó embriones a día 5-6 parece una buena ovodonación en los que las donantes la transferencia en día 5-6 de vida, los estrategia para optimizar los resultados presentan niveles de progesterona embriones presentaban elevada tasa de clínicos. sérica entre 2,5 y 4 ng/ml en algún fragmentación en día 2 y 3. momento de la estimulación (2005- Estudios prospectivos y con mayor 2010). La estimulación ovárica de las En 7 casos las muestras seminales tamaño de muestras serían necesarios donantes se realizó con antagonistas, eran de baja calidad y resultaron en para confirmar estos datos. dosis diaria. Las receptoras fueron 1 aborto clínico, 2 no gestaciones, 2 preparadas según describe nuestro casos sin transferencia embrionaria y protocolo con un depósito de agonista 2 gestaciones clínicas evolutivas con GnRH y valerianato de estradiol en dosis recién nacido vivo sano. 129: rElAcIÓN DEl IMc cON lA cAlIDAD SEMINAl E. Garijo; F. Guijarro; Y. Garijo; A. Silván; L. García; J. García; M. Brandt Unidad de Reproducción Asistida, Hospital “La Moraleja” (Sanitas). Madrid e-mail: frguijarro@yahoo.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS estudio un total de 169 pacientes que se distribuyen en los distintos grupos Buscamos conocer si existe una Se realiza un análisis retrospectivo de IMC atendiendo a su peso y altura. correlación real entre el Índice de sobre los pacientes que llegan a Masa Corporal (IMC) con la calidad nuestro laboratorio para realizarse Se atiende a los parámetros principales espermática. un seminograma. Se incluyen en el del seminograma: volumen,
- 223. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 221 IMC Clasificación N 18,5-24,9 Normopeso 69 25-26,9 Sobrepeso grado I 50 27-29,9 Sobrepeso grado II (preobesidad) 33 30-34,9 Obesidad tipo I 17 Calidad seminal vs IMC 6 80 4 60 2 40 0 20 Volumen Concentración Morfología Normopeso Sobrepeso I Sobrepeso II Obesidad I concentración espermática, movilidad parámetros analizados a excepción a medida que se va aumentando el progresiva (a+b) y formas normales. del volumen eyaculado que disminuye sobrepeso. Se realiza un estudio estadístico ligeramente conforme aumenta el IMC. comparativo mediante t-student. CONCLUSIONES RESULTADOS La calidad espermática no depende del No se encuentran diferencias Índice de Masa Corporal aunque sí va estadísticamente significativas en los disminuyendo el volumen eyaculado 130: PrIMEr NAcIMIENtO EN lA clÍNIcA MENcÍA EN UN cASO DE HIPErPlASIA GlANDUlAr AtÍPIcA DE ENDOMEtrIO. NUEStrA EXPErIENcIA A. Fernández, B. de la Torriente Benito Clínica Mencía e-mail: biologa@clinicamencia.es INTRODUCCIÓN glándulas de tamaño y forma irregular atípica parece ser el único precursor con un incremento de la relación real ya que se encuentra en úteros con La mayoría de los cánceres de glándula-estromal en comparación cáncer de endometrio, presenta una endometrio aparecen en una situación con el endometrio proliferativo. Se gran similitud morfológica con este de hiperestronismo, siendo la lesión subdividen en dos grandes grupos, las tipo de neoplasia y se localizan en su precursora la hiperplasia endometrial que no presentan atipia celular y las proximidad. que se define como una proliferación de que sí presentan atipia. La hiperplasia
- 224. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 222 OBJETIVOS de Fostipur durante 8 días y además A los trece días de la trasferencia se administró Decapeptyl 0,1 como embrionaria evaluamos la β-hCG en El Objetivo de este trabajo es presentar agonista, la ovulación fue inducida sangre, logrando embarazo (1.500 mU/ la experiencia clínica de un ciclo de con una inyección de Ovitrelle 250 ml). Díez días después de la prueba de ovodón en una paciente con hiperplasia microgramos. embarazo se confirma por ecografía, glandular atípica. resultando dos sacos gestacionales. La receptora tuvo transferencia con Nacen dos niños sanos a las 34 semanas. La paciente de 44 años, viene a ciclo natural objetivándose el día 9º consulta para control gestacional de ciclo un endometrio de 9 mm, triple CONCLUSIONES en el 2009, el embarazo termina en línea y un folículo de 18 mm en el ovario aborto espontáneo en el 1º trimestre, derecho. Se desencadenó la ovulación La decisión de realizar la transferencia además ya había sufrido otro aborto con 1 ampolla precargada de Ovitrelle. El con ciclo natural en la paciente a los 6 meses, en 2007. Tras un año de día de la punción folicular se asociaron receptora, parece una buena elección esterilidad, y objetivarse baja reserva dos óvulos de Progeffik 200mg. en pacientes con Hiperplasia Glandular ovárica, se somete a un ciclo de ovodón. Atípica. RESULTADOS MATERIAL Y MÉTODOS Tras la punción ovárica de la donante, La estimulación ovárica de la donante se realiza la transferencia embrionaria de ovocitos fue con 150 unidades en Día+3. 131: UBIcAcIÓN DEl cOrPÚScUlO POlAr EN IcSI F, Guijarro; E, Garijo; A, Silván; Y, Garijo; L, García; J, García; M, Brandt Unidad de Reproducción Asistida, Hospital “La Moraleja” (Sanitas). Madrid e-mail: frguijarro@yahoo.es INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS también el bloqueo embrionario y la aparición de multinucleación. Se utiliza Para realizar microinyección Se realiza microinyección a un total de para el análisis estadístico el test del Chi espermática, el corpúsculo polar del 297 ovocitos situando el corpúsculo polar cuadrado. ovocito debe situarse a las 12 (arriba) arriba (12) en 181 de ellos y abajo (6) en o las 6 (abajo) para evitar interferir 116. Se analiza la tasa de fecundación RESULTADOS en la placa metafásica pero, ¿alguna en cada uno de los dos grupos, así de las dos posiciones puede favorecer como las calidades embrionarias tanto En cuanto a tasas de fecundación no se la fecundación o mejorar la calidad en D+2 como en D+3 basándonos en la observan diferencias estadísticamente embrionaria? clasificación según ASEBIR. Se analiza significativas dependiendo de dónde Calidades embrionarias respecto a la Tasas de fecundación respecto a la ubicación del CP durante la ICSI ubicación del CP durante la ICSI 45 40 80 35 70 30 60 25 20 50 15 40 10 30 5 0 20 A B C D Bloq Mnc 10 0 D+2 Cp A D+2 CpB D+3 CpA D+3 CpB CP Arriba CP Abajo
- 225. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r Rev Asoc Est Biol Rep Diciembre 2011 Vol. 16 Nº 2 223 se sitúe el corpúsculo polar durante la embriones se dejan para transferir en el corpúsculo polar (arriba o abajo) microinyección. D+3. Tampoco se observan diferencias siempre y cuando no se incida significativas en cuanto al bloqueo directamente sobre la placa metafásica. Respecto a las calidades embrionarias, embrionario o la multinucleación. si bien es cierto que parece haber un mayor porcentaje de embriones de CONCLUSIONES tipo A en D+2 cuando el ovocito ha sido microinyectado con el CP arriba, Durante la microinyección espermática estos porcentajes se igualan cuando los no tiene relevancia dónde se sitúe 132: INFlUENcIA DE lA cONcENtrAcIÓN SÉrIcA DE EStrADIOl SOBrE lA tASA DE rEcIÉN NAcIDO VIVO EN rEPrODUccIÓN ASIStIDA R. Requeijo, E. Fernández, P. Esteban, D. Rodríguez, P. Casado, C. Pousa, M.A. Andrade Hospital Xeral-Cíes de Vigo e-mail: Raquel.Requeijo.Pascual@sergas.es INTRODUCCIÓN ciclos cancelados; y en los que no hubo estimulación ovárica y en los controles transferencia. ecográficos que se realizaron hasta la La estimulación ovárica controlada es un administración de la hCG. paso imprescindible en las técnicas de Se realizó un protocolo largo con reproducción asistida para la obtención agonistas de la GnRh (Decapeptyl®, Para el análisis estadístico se empleó el de una cohorte folicular madura. Esto Ipsen Pharma y Synarel®, Pfizer) y paquete SPSS-15.0. Clasificamos mediante se asocia a niveles suprafisiológicos de administración de FSH recombinante análisis de percentiles a las pacientes en estradiol, hasta diez veces mayores que (Gonal-f®, Merck-Serono o Puregón®, tres grupos según el nivel de estradiol en un ciclo natural. Y aunque es bien Schering-Plough) y hMG (Menopur®, alcanzado el día de la administración de conocido el papel del estradiol para una Ferring). La ovulación se provocó hCG (Grupo 1 <1476, Grupo 2 =1476-3100, adecuada implantación embrionaria, con 6500 UI de hCG recombinante Grupo 3 >3100 pg/ml). sus niveles elevados durante los ciclos (Ovitrelle®, Merck-Serono) al de reproducción asistida han sido determinarse ecográficamente la RESULTADOS objeto de debate durante años. presencia de dos o más folículos ≥18mm. Para estudiar el efecto del estradiol OBJETIVOS La punción ovárica ecoguiada se hizo sobre la tasa de RNV en función de la 34-36 h después. Se inseminaron edad, se dividió a las pacientes en dos Evaluar el efecto de los niveles séricos los ovocitos a las 4-6 h mediante FIV grupos: <38 años y ≥38 años. En el grupo de estradiol en la tasa de recién (49.5%), ICSI (33.2%), o de forma de <38 años la tasa de RNV se incrementa nacido vivo (tasa de RNV) el día de la mixta (20.9%). La transferencia de progresivamente junto con los niveles administración de hCG en los ciclos de 1, 2 o 3 embriones se hizo al 2º-3º día de estradiol, aunque a partir de 1476pg/ reproducción asistida con estimulación de desarrollo embrionario. El soporte ml la diferencia de edad deja de ser ovárica controlada bajo protocolo largo de la fase lútea se hizo mediante estadísticamente significativa. En las ≥38 con análogos agonistas de la GnRh. la administración intravaginal años, a pesar de no ser estadísticamente de progesterona micronizada significativo, también encontramos una MATERIAL Y MÉTODOS (Utrogestán®, SEID o Progeffik®, Effik) mayor tasa de RNV a mayores niveles de desde el día siguiente a la captación estradiol el día de la hCG. Se revisaron 573 ciclos de reproducción ovocitaria hasta la semana 11 de asistida entre 1/1/08 y 31/12/09 gestación. Tasa total de RNV =30.2% (173/573). (pacientes de edad media 35años). Tasa de RNV según el nivel de estradiol: Se excluyeron ciclos de donación de Los niveles séricos de estradiol Grupo 1 =19.7%, grupo 2 =30.7%, ovocitos y DPI; pacientes ≤18 y ≥41 se determinaron mediante y grupo 3 =39.2%. Se observa una años; segundos y sucesivos ciclos; inmunoelectroluminiscencia (Cobas mayor tasa de RNV a mayor nivel de protocolos de estimulación distintos; 6000, Roche) el primer día de la estradiol, aunque es en este grupo
- 226. c O M U N I c A c I O N E S P Ó S t E r 224 donde encontramos una menor edad - El efecto del nivel de estradiol el día progesterona o una disminución media de las pacientes. Los datos sólo de la administración de hCG está en la receptividad endometrial, son estadísticamente significativos relacionado con la edad. Sin embargo, nuestros resultados muestran que comparando los grupos 1 y 2. encontramos beneficio tanto en el incremento del nivel de estradiol mayores como en menores de 38 años. resulta beneficioso. CONCLUSIONES - Aunque los niveles suprafisiológicos - Mayores niveles de estradiol predicen de estradiol podrían ocasionar una una mayor tasa de RNV. alteración en el ratio estradiol/ 133: INSEMINAcIÓN INtrAUtErINA EN cIclOS FIV/IcSI cON FAllO DE PUNcIÓN M.V. Aparicio, R. Mendoza, B. Corcóstegui, R. Matorras, Tx. Martínez-Astorkiza Hospital de Cruces- Barakaldo, Vizcaya e-mail: m.victoria.aparicioprieto@osakidetza.net INTRODUCCIÓN Las estimulaciones se realizaron con No se han encontrado diferencias FSH, o FSH más HMG, bajo frenación significativas, en ninguno de los El objeto de este estudio ha sido hipofisaria. parámetros estudiados, edad media determinar si tiene alguna utilidad de las pacientes, edad media de los realizar inseminaciones intrauterinas en Se realizaron controles de estradiol y varones, pauta de estimulación, horas aquellas pacientes que encontrándose controles ecográficos del desarrollo post hCG, parámetros seminales, en un ciclo FIV/ICSI, el día de la punción folicular, encontrándose en un desarrollo folicular. folicular no se obtiene ningún ovocito. 85,11% que el estradiol en el día de la administración de hCG fue mayor de RESULTADOS MATERIAL Y MÉTODOS 800 pg/ml y en el 91,5% el recuento folicular fue mayor o igual a 3 folículos No se ha producido ningún embarazo Se ha realizado un estudio retrospectivo mayores de 15 mm. tras realizar la inseminación artificial de 6.178 ciclos realizados en la Unidad intrauterina en dichas pacientes. de Reproducción Humana del Hospital En 78,26% el REM era mayor de 3 de Cruces – Baracaldo (Vizcaya) entre millones. CONCLUSIONES los años 1994 y 2010, de los cuales en 47 casos no se obtuvieron ovocitos. De En 12,76% existía un factor tubárico La IAC de rescate tras fracaso de estos 47 casos en 23 (48,9%) se realizó relativo y en un 14,89% mixta obtención de ovocitos tiene una Inseminación Artificial Conyugal post (tubárico relativo y factor masculino o probabilidad de éxito menor del 4,3% punción y en 24 (51,1%) casos no se endometriosis). (1/23). Su utilidad clínica por lo tanto realizó la inseminación. Ni en la edad parece controvertida. media de las pacientes, ni en la de los Las punciones foliculares se realizaron varones se han encontrado diferencias ecográficamente. significativas.
- 227. ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN asebir@asebir.com | www.asebir.com