Manual microbiologia completo

Manual de Microbiologia Clínica
para o Controle de Infecção
em Serviços de Saúde
Edição Comemorativa para o IX Congresso Brasileiro de
Controle de Infecção e Epidemiologia Hospitalar
Salvador, 30 de agosto a 3 de setembro de 2004
- Versão Preliminar -

Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária
SEPN 515, Edifício Omega. Bloco B, Brasília (DF), CEP 70770-502
Internet: www.anvisa.gov.br
Gerência-Geral de Tecnologia em Serviços e Saúde
Gerência de Investigação e Prevenção das Infecções e dos Eventos Adversos
É permitida a reprodução total desta obra, desde que citada a fonte.
1. ed. 2004. Tiragem: 200 exemplares em CD
Edição nova com modificações no conteúdo e no título, tendo como base o Manual de Procedimentos
Básicos em Microbiologia Clínica publicado em 2000.
1. Infecção Hospitalar – Controle. 2. Infecção em Serviços de Saúde. 3. Microbiologia
Clínica. 4. Vigilância Sanitária em Serviços de Saúde. 5. Resistência microbiana. I. Brasil.
ANVISA Ministério da Saúde.

Coordenação do Projeto
Adelia Aparecida Marçal dos Santos – Gerência de Investigação e Prevenção das Infecções e
dos Eventos / ANVISA / MS
Autor
Carlos Emílio Levy - Laboratório de Microbiologia - Centro Infantil Boldrini / Campinas SP
Colaboradores
Angela von Nowakonski - Serviço de Microbiologia Clínica do Hospital das Clinicas - UNICAMP / Campinas SP
Caio Marcio Figueiredo Mendes - Universidade de São Paulo, Laboratório Fleury / São Paulo SP
Carlos Emílio Levy - Laboratório de Microbiologia - Centro Infantil Boldrini / Campinas SP
Carmen Oplustil - Laboratorio Fleury / São Paulo SP
Cássia Maria Zoccoli - Farmacêutica Bioquímica
Cláudia Maria Leite Maffei - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP / Ribeirão Preto SP
Elza Masae Mamizuka - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP / São Paulo SP
Emerson Danguy Cavassin - Laboratório de Microbiologia, Hospital das Clínicas da UE / Londrina PR
Flávia Rossi - Médica Microbiologista Clínica
Igor Mimica - Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa / São Paulo SP
Helena Petridis – Consultora técnica da ANVISA
Lycia Mara Jenne Mimica - Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa / São Paulo SP
Marcia de Souza Carvalho Melhem - Instituto Adolfo Lutz / São Paulo SP
Maria Carmen Gonçalves Lopes - Laboratório de Microbiologia, Centro Infantil Boldrini / Campinas SP
Marines Dalla Valle Martino - Hospital Israelita Albert Einstein / São Paulo SP
Nilton Lincopan – Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP
Rosângela Aparecida Mendes Silva - Laboratório de Microbiologia, Centro Infantil Boldrini / Campinas SP
Revisores
Claude André Solari - Sociedade Brasileira de Microbiologia / São Paulo SP
Helena Petridis – Consultora técnica ANVISA
José Carlos Serufo - Sociedade Brasileira de Medicina Tropical / Faculdade de Medicina da UFMG
Lauro Santos Filho - Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPB / João Pessoa PB
Maria Rita Elmor – Laboratório de Microbiologia do Hospital Sírio Libanês / São Paulo SP
Pedro Bertollini - Professor aposentado da Faculdade de Odontologia de Piracicaba / USP
Sílvia Figueiredo Costa – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP

CONTEÚDO GERAL
Módulo I
Principais Síndromes Infecciosas
1. Infecções do Trato Urinário
2. Infecções de Ossos e Articulações
3. Infecções de Pele e Tecido Subcutâneo
4. Infecções Intestinais
5. Infecções Abdominais
6. Infecções do Sistema Nervoso Central
7. Infecções Sistêmicas
8. Infecções Genitais
9. Infecções do Trato Respiratório Superior
10. Infecções do Trato Respiratório Inferior
11. Referências Bibliográficas
Módulo II
Segurança e Controle de Qualidade no
Laboratório de Microbiologia Clínica
1. Regulamento técnico para laboratórios clínicos
2. Requisitos básicos para laboratório de
microbiologia
3. Classificação dos laboratórios segundo o nível
de biossegurança
4. Laboratórios NB-1, NB-2 e NB-3
5. Precauções quanto à contaminação
6. Controle de qualidade no laboratório
Módulo III
Procedimentos Laboratoriais: da
Requisição do Exame à Análise
Microbiológica
1. Requisição de exames microbiológicos
2. Coleta, transporte e conservação de amostra
3. Microscopia e coloração
4. Semeadura em meios de cultura
5. Identificação
6. Manutenção e Estoque de Cultura
Módulo IV
Descrição dos Meios de Cultura
Empregados nos Exames Microbiológicos
1. Introdução
2. Meios de cultura para transporte e conservação
3. Meios para crescimento e isolamento
4. Meios comerciais para provas de identificação
5. Fórmulas e produtos para provas de
identificação
6. Discos para identificação
7. Meios para teste de sensibilidade aos
antimicrobianos
Módulo V
Detecção e identificação das bactérias
de importância médica
1. Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e
outros Gram positivos
2. Neisserias
3. Enterobactérias
4. bastonetes não fermentadores
5. Bacilos curvos ou espiralados
6. Bacilos Gram positivos
7. Fastidiosos
8. Anaeróbios
9. Interpretação de resultados e laudos
Módulo VI
Detecção e identificação das
micobactérias de importância médica
1. Introdução
2. Coleta de amostras
3. Processamento de amostras
4. Cultura para Isolamento de micobactérias
5. Identificação das diferentes espécies de
micobactérias
6. Anexos
Módulo VII
Detecção e identificação dos fungos de
importância médica
1. Introdução
2. Coleta e transporte de amostras
3. Processamento de amostras
4. Identificação de fungos
5. Descrição das principais micoses

INTRODUÇÃO
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA
O objetivo do laboratório de microbiologia não é apenas apontar o responsável por um determinado
estado infeccioso, mas sim, indicar, através do monitoramento de populações microbianas, qual o
perfil dos microrganismos que estão interagindo com o homem. Com essas informações, a equipe de
saúde é capaz de definir quais microrganismos podem ser responsáveis pelo quadro clínico do
paciente e assim, propor um tratamento mais adequado. No entanto, para alcançar esses objetivos,
os laboratórios de microbiologia devem possuir estrutura capaz de estabelecer informações sobre a
melhor amostra biológica, reconhecer a flora normal, reconhecer os contaminantes, identificar
microrganismos cujo tratamento beneficia o paciente, identificar microrganismos com propósitos
epidemiológicos, obter resultados rápidos em casos de emergência, racionalizar no uso de
antimicrobianos, realizar o transporte rápido das amostras e o relato dos resultados e manter uma
educação médica contínua em relação aos aspectos da infecção hospitalar.
A primeira edição do Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de
Infecção Hospitalar teve como proposta padronizar as técnicas microbiológicas consideradas
fundamentais na rotina e que pudessem dar respaldo às atividades das Comissões de Controle de
Infecção Hospitalar. Se, por um lado, sua virtude foi a simplicidade e objetividade no desenvolvimento
dos temas, as suas limitações e a rápida evolução do conhecimento nesta área logo reclamaram sua
atualização.
Estamos, agora, diante da oportunidade de resgatar algumas falhas daquela primeira edição,
procurando ampliar e aprofundar temas considerados essenciais, contando com um seleto e
conceituado corpo editorial e de colaboradores. Nossa expectativa é de que os laboratórios de
microbiologia, a partir das bases oferecidas por este Manual, possam assimilar e alcançar novos níveis
de complexidade laboratorial, atendendo às exigências e características próprias de cada unidade
hospitalar.
Não tivemos a pretensão de alcançar o conteúdo e a profundidade dos manuais-textos de
microbiologia tradicionalmente consultados e que também nos serviram de referência, mas sim, de
servir como manual de bancada de técnicas consagradas, procedimentos básicos padronizados e
informações atualizadas de utilidade no meio hospitalar.
Esta edição revisada e ampliada foi programada em 10 módulos, abrangendo os seguintes temas:
Módulo I Principais síndromes infecciosas
Módulo II Segurança e controle de qualidade no laboratório clínico
Módulo III Procedimentos laboratoriais: da requisição do exame à análise microbiológica
Módulo IV Descrição dos meios de cultura empregados nos exames microbiológicos
Módulo V Detecção e identificação bactérias de importância médica
Módulo VI Detecção e identificação micobactérias de importância médica

Módulo VII Detecção e identificação de fungos de importância médica
Módulo VIII Detecção e identificação de vírus de importância médica (em produção)
Módulo IX Principais métodos de detecção da resistência no Laboratório Clínico (em produção)
Módulo X Laboratório de Microbiologia e sua interação com a Comissão de Controle de Infecção
Hospitalar (em produção)
Esperamos assim atender à grande maioria de microbiologistas que, afastados dos grandes centros,
não têm acesso a informações atualizadas na área de Microbiologia e que, melhor capacitados,
possam estar à altura das expectativas das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar, oferecendo
um suporte técnico atualizado e mais eficiente.

INTRODUÇÃO A INFECÇÃO HOSPITALAR
Uma das maiores preocupações na área de saúde é a alta incidência de infecção hospitalar ou
nosocomial, isto é, infecção adquirida em ambientes hospitalares durante a internação ou após a alta
do paciente, quando este esteve hospitalizado ou passou por procedimentos médicos.
A infecção hospitalar atinge o mundo todo e representa uma das causas de morte em pacientes
hospitalizados. No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, a taxa média de infecção hospitalar é de
cerca 15%, ao passo que nos EUA e na Europa é de 10%. Cabe lembrar, no entanto, que o índice de
infecção hospitalar varia significativamente, pois está diretamente relacionada com o nível de
atendimento e complexidade de cada hospital.
Diferentes microrganismos como bactérias, fungos, e vírus causam infecções hospitalares. O grupo de
patógenos, no entanto, que se destaca é o das bactérias que constituem a flora humana e que
normalmente não trazem risco a indivíduos saudáveis devido sua baixa virulência, mas que podem
causar infecção em indivíduos com estado clínico comprometido – denominadas assim de bactérias
oportunistas.
O segundo grupo de importância médica nas infecções hospitalares são os fungos, sendo o Candida
albicans e o Aspergillus os patógenos mais freqüentes. Os fungos são responsáveis por
aproximadamente 8% das infecções hospitalares. Dentre as viroses, o vírus da hepatite B e C,
enteroviroses e viroses associadas com pneumonia hospitalar são comumente registrados. As viroses
representam por volta de 5% das infecções.
Geralmente os sítios de infecção hospitalar mais freqüentemente atingidos são o trato urinário, feridas
cirúrgicas e trato respiratório. Os patógenos que lideram no ranking das infecções hospitalares estão
descritos na tabela abaixo.
Agentes mais comuns de infecções nosocomiais
Patógeno Sítios comuns de isolamento do patógeno
Bactérias Gram negativas
Escherichia coli Trato urinário, feridas cirúrgicas, sangue
Pseudomonas sp Trato urinário, trato respiratório, queimaduras
Klebsiella sp Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas
Proteus sp Trato urinário, feridas cirúrgicas
Enterobacter sp Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas
Serratia sp Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas
Bactérias Gram positivas
Streptococcus sp Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas
Staphylococcus aureus Pele, feridas cirúrgicas, sangue
Staphylococcus epidermitis Pele, feridas cirúrgicas, sangue
Fungi
Candida albicans Trato urinário, sangue
outros Trato urinário, sangue, trato respiratório

O ambiente hospitalar é inevitavelmente um grande reservatório de patógenos virulentos e
oportunistas, de modo que as infecções hospitalares podem ser adquiridas não apenas por pacientes,
que apresentam maior susceptibilidade, mas também, embora menos freqüentemente, por visitantes
e funcionários do próprio hospital.
Os patógenos implicados nas infecções hospitalares são transmitidos ao indivíduo tanto via endógena,
ou seja, pela própria flora do paciente quanto pela via exógena. Esta última inclui veículos como
mãos, secreção salivar, fluidos corpóreos, ar e materiais contaminados, como por exemplo,
equipamentos e instrumentos utilizados em procedimentos médicos. Muitos destes procedimentos são
invasivos, isto é, penetram as barreiras de proteção do corpo humano, de modo a elevar o risco de
infecção (vide Tabela)
Os principais fatores que influenciam a aquisição de uma infecção são:
status imunológico
idade (recém-nascidos e idosos são mais vuneráveis)
uso abusivo de antibióticos
procedimentos médicos, em particular, os invasivos
immunosupressão
falhas nos procedimentos de controle de infecção
Exemplos de microrganismos da flora normal humana
Pele Olhos Cavidade oral
Staphylococcus
Micrococcus
Propionibacterium
Corynebacterium
Streptococcus
Malassezia
Pityrosporum
Staphylococcus
Streptococus
Neisseria
Lactobacillus
Neisseria
Streptococcus
Fusobacterium
Actinomyces
Treponema
Bacteroides
Trato respiratório Trato Digestivo Trato Urogenital
Staphylococcus
Corynebacterium
Streptococcus
Hemophilus
Neisseria
Branhamella
Ouvido
Staphylococcus
Corynebacterium
Bacteroides
Lactobacillus
Enterococcus
Escherichia coli
Proteus
Klebsiella
Enterobacter
Bifidobacterium
Citrobacter
Fusobacterium
spirochetes
Streptococcus
Bacteroides
Mycobacterium
Neisseria
Enterobacter
Clostridium
Lactobacillus
Candida
Trichomonas

Procedimentos médicos comuns associados com infecções nosocomiais
Procedimento Doença Patógeno
Cateterização urinária Cistite Bacilos gram negativos, enterococos
Cirurgia Feridas, septicemia Staphylococcus, bacilo gram negativos,
bacteróides
Terapia intravenosa Infecção no local de injeção,
septicemia
Staphylococcus, klebsiella, Serratia,
Enterobacter, Candida
Intubação respiratória pneumonia Pseudomonas, klebsiella, Serratia
Diálise renal Sepse, reação pirogênica Vírus da hepatite B, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas

Principais Síndromes
Infecciosas
Módulo I

ÍNDICE
1. Infecções do trato urinário ..............................................................................................1
Introdução ........................................................................................................................1
Patogênese........................................................................................................................2
Epidemiologia e fatores de risco............................................................................................3
Sinais e sintomas clínicos.....................................................................................................3
Diagnóstico laboratorial .......................................................................................................5
2. Infecções de ossos e articulações....................................................................................9
Introdução ........................................................................................................................9
Microrganismos mais freqüentes ...........................................................................................9
Coleta e transporte do material .......................................................................................... 10
Processamento de amostra ................................................................................................ 10
3. Infecções da pele e tecido subcutâneo ..........................................................................12
Introdução ...................................................................................................................... 12
Lesões eritematosas e superficiais: aspectos clínicos e diagnóstico........................................... 12
Ulcerações e nódulos: aspectos clínicos e diagnóstico ............................................................ 14
Fístulas e queimados: aspectos clínicos e diagnóstico............................................................. 15
Feridas cirúrgicas: aspectos clínicos e diagnóstico ................................................................. 17
Infecções complicadas e lesões causadas por mordedura: aspectos clínicos e diagnóstico............ 18
4. Infecções intestinais......................................................................................................21
Introdução ...................................................................................................................... 21
Principais causas infecciosas de desinteria............................................................................ 22
Associações entre os aspectos clíncios e os agentes etiológicos ............................................... 24
Diagnóstico laboratorial ..................................................................................................... 27
Relatório de resultados...................................................................................................... 28
5. Infecções abdominais ....................................................................................................30
Agentes microbianos mais frequentes.................................................................................. 30
Coleta e transporte do material .......................................................................................... 30
Processamento das amostras ............................................................................................. 30
6. Infecções do sistema nervoso central............................................................................32
Introdução ...................................................................................................................... 32
Dados epidemiológicos e etiologia de processos infecciosos do snc........................................... 33
Diagnóstico laboratorial ..................................................................................................... 35
7. Infecções sistêmicas......................................................................................................38
Introdução ...................................................................................................................... 38
Fatores de risco para bacteremia e fungemia ........................................................................ 38
Diagnóstico em hemoculturas............................................................................................. 39
Infecção relacionada a cateter vascular................................................................................ 41
8. Infecções genitais .........................................................................................................43
Introdução ...................................................................................................................... 43
Candidíase vulvo-vaginal ................................................................................................... 43
Tricomoníase ................................................................................................................... 44
Vaginose bacteriana.......................................................................................................... 45
Infecção gonocócica.......................................................................................................... 46
Infecções por chlamydia trachomatis................................................................................... 48
Infecções por mycoplasma spp. .......................................................................................... 49
Outras infecções genitais e seus patógenos .......................................................................... 50
9. Infecções do trato respiratório superior ........................................................................51
Introdução ...................................................................................................................... 51
Quadro clínico, agentes etiológicos e diagnóstico laboratorial .................................................. 51
10. Infecções do trato respiratório inferior..........................................................................53
Pneumonia da comunidade ................................................................................................ 53
Pneumonia hospitalar........................................................................................................ 54
Diagnóstico laboratorial das pneumonias.............................................................................. 56
Pacientes neutropênicos e imunossuprimidos........................................................................ 60
11. Referências bibliográficas..............................................................................................62

Mod - 1
1. INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
INTRODUÇÃO
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as doenças infecciosas mais comuns na prática clínica,
particularmente em crianças, adultos jovens e mulheres sexualmente ativas, sendo apenas menos
freqüente que as do trato respiratório. No meio hospitalar são as mais freqüentes entre as infecções
nosocomiais em todo o mundo. Do ponto de vista prático, por convenção, define-se como ITU tanto as
infecções do trato urinário baixo (cistites) e como as do trato urinário alto (pielonefrites).
Quanto à topografia, as ITUs são divididas em:
Altas - que envolvem o parênquima renal (pielonefrite) ou ureteres (ureterites)
Baixas - que envolvem a bexiga (cistite) a uretra (uretrite), e nos homens, a próstata
(prostatite) e o epidídimo (epididimite).
Significado de bacteriúria: A investigação microbiológica de suspeita da infecção urinária pela
urocultura, permitiu identificar dois grupos de pacientes com bacteriúria ≥ 100.000 bactérias por ml
de urina:
Sintomáticos, e portanto com infecção urinária
Assintomáticos, definidos como portadores de bacteriúria assintomática
A importância em diferenciar estes dois grupos é importante tanto do ponto de vista de conduta como
prognóstico. Para o primeiro grupo há a necessidade de tratamento imediato, para o segundo grupo
de pacientes, comumente constituído de meninas em idade escolar (1 a 2%) e de mulheres jovens
com vida sexual ativa (5%), existe um risco maior de desenvolver ITU no futuro. Não implicando
necessariamente em tratamento, pois cerca de 25% delas passam espontâneamente a ter uroculturas
negativas no prazo de um ano. Um grupo importante identificado com bacteriúria assintomática que
merece seguimento pelo elevado risco de ITU são as gestantes, idosos e pacientes cateterizados.
Quanto à evolução as ITUs podem limitar-se a episódio único ou isolado, a recidiva, a
reinfecção e a infecção urinária crônica:
Episódio único ou isolado: ocorre uma única vez e resolve habitualmente pelo uso de
antibioticoterapia. Um segundo episódio isolado, pode ocorrer sem relação temporal com o
anterior. Entre 10 a 20% das mulheres irão apresentar no decorrer da vida pelo menos um
episódio de infecção urinária.
Recidiva ou recaída de ITU – em conseqüência a falha no tratamento o mesmo microrganismo
isolado previamente persiste no trato urinário, causando infecção ou bacteriúria assintomática. A
persistência do mesmo microrganismo por meses ou anos, leva a infecção urinária crônica.
Reinfecção - é a ocorrência de um novo episódio de ITU, sem relação com o evento anterior,
causado por outro microrganismo, exceto que pela origem e freqüência do agente etiológico que
coloniza a região perineal, pode ser atribuída à mesma espécie bacteriana (ex: E.coli). Episódios
repetidos de reinfeção não devem ser confundidos com infecção urinária crônica.
ITU crônica representa a persistência do mesmo microrganismo por meses ou anos com recidivas
após tratamento, no caso de pielonefrite crônica, há associação com comprometimento da pelve e
parênquima renal.
ITU recorrente: ocasionalmente a recorrência é pela persistência do mesmo agente (recidiva), mas
em cerca de 90% dos episódios ocorre por reinfecção, com meses de intervalo entre eles. Cerca
de 20% das jovens após o episódio inicial de cistite tem infecções recorrentes, que caracterizam
bem este grupo. Dois ou mais episódios no período de 6 meses ou tês ou mais no período de um
ano definem as infecções recorrentes na mulher. Nos homens, a ITU recorrente é definida quando
ocorrem dois ou mais episódios de ITU em um período de até 3 anos, lembrando a freqüente
associação com prostatite bacteriana crônica, nos pacientes sem fatores predisponentes.
Quanto á presença de fatores predisponentes ou agravantes as ITUs são classificadas em
dois grupos:

Mod - 2
ITU não complicada: ocorre primariamente em mulheres jovens sexualmente ativas sem
anormalidade anatômica ou funcional do aparelho genitourinário.
ITU complicada: ocorre em indivíduos que já possuem alguma anormalidade estrutural ou
funcional do processo de diurese, presença de cálculos renais ou prostáticos, doenças subjacentes
em que haja predisposição a infecção renal (diabetes melittus, anemia falciforme, doença
policística renal, transplante renal) ou na vigência de cateterismo vesical, instrumentação ou
procedimentos cirúrgicos do trato urinário. Pelo maior risco, as ITUs em crianças, gestantes,
homens e infecções do trato urinário alto são consideradas infecções complicadas.
PATOGÊNESE
As três possibilidades de um microrganismo alcançar o trato urinário e causar infecção são:
Via ascendente: o microrganismo poderá atingir através da uretra, a bexiga, ureter e o rim. Esta via
é a mais freqüente, principalmente em mulheres (pela menor extensão da uretra) e em pacientes
submetidos à instrumentação do trato urinário.
Via hematogênica: ocorre devido a intensa vascularização do rim podendo o mesmo ser
comprometido em qualquer infecção sistêmica; é a via de eleição para ITU(s) por alguns
microrganismos como Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Histoplasma spp., sendo
também a principal via das ITU(s) em neonatos.
Via linfática: é rara embora haja a possibilidade de microrganismos alcançarem o rim pelas conexões
linfáticas entre o intestino e o rim e/ou entre o trato urinário inferior e superior.
Após o microrganismo atingir o trato urinário poderá ocorrer ou não infecção na dependência dos
seguintes fatores:
Adequação dos mecanismos de defesa do hospedeiro
Propriedades antibacterianas da urina (elevada osmolalidade e baixo ph) e da mucosa do trato
urinário (citocinas, mecanismos antiaderência).
Efeito mecânico da micção.
Resposta imune e inflamatória.
Integridade anatômica e funcional das vias urinárias.
Tamanho do inóculo (quanto maior o inóculo que alcança o rim, maior a chance de infecção). A
medula renal é altamente susceptível a infecção por baixas contagens bacterianas, ocorrendo o
inverso no córtex renal.
Virulência do microrganismo
Aderência às células uroepiteliais e vaginais
Resistência à atividade bactericida do soro
Produção de hemolisina e fator citotóxico necrotizante tipo i.
Nos pacientes com cateterismo vesical, os microrganismos atingem a bexiga através de três
caminhos:
- no momento da inserção do cateter
- através da luz do cateter
- através da interface mucosa-cateter
Por outro lado, os fatores envolvidos na fisiopatogênese das infecções urinárias associadas ao uso de
cateteres vesicais são:
- fenômenos inflamatórios locais (corpo estranho).
- eliminação dos mecanismos habituais de defesa (esvaziamento incompleto da bexiga,
alterações da imunidade local, via aberta de passagem até a bexiga).
- obstrução mecânica das glândulas periuretrais (facilitando quadros de uretrites e
epididimites). Nos pacientes com prostatite ou epididimite, os microrganismos atuam,
principalmente, através do refluxo da urina infectada nos ductos prostáticos e ejaculatórios.

Mod - 3
EPIDEMIOLOGIA E FATORES DE RISCO
As ITUs podem atingir todas as faixas etárias. A bacteriúria pode variar de 0.1 a 1,9% dos neonatos a
termo, alcançando 10% nos prematuros, sendo a incidência maior nos meninos até os três meses de
idade e freqüentemente acompanhada de bacteremia. A circuncisão de meninos e a amamentação
com leite materno parecem ser fatores ligados ao menor risco de infecção.
A partir dos três meses, as meninas passam a ser mais acometidas e as infecções principalmente nos
pré-escolares estão associadas a anormalidades congênitas. Nesta faixa etária, o risco para a menina
é de cerca de 4,5% e para o menino de 0,5%. Estas infecções são freqüentemente sintomáticas e
acredita-se que os danos renais resultantes das ITUs ocorram durante este período da vida.
Nos escolares a prevalência de bacteriúria é de 1,2% nas meninas e de 0,03% nos menino
s, sendo em geral assintomática. As pacientes do sexo feminino com bacteriúria assintomática
apresentam um risco de até 50% desenvolverem infecção sintomática quando iniciam a atividade
sexual ou durante a gravidez. Portanto a presença de bacteriúria na infância define a população de
risco em relação ao desenvolvimento de ITU na fase adulta.
Na fase adulta até os 65 anos, a ITU em homens é extremamente baixa (menos de 0,1%),
freqüentemente associada com anormalidades anatômicas ou doença da próstata como também à
instrumentação das vias urinárias. A prevalência de ITU é um pouco maior (1,5%) em homens jovens
atendidos em serviços de doenças sexualmente transmissíveis.
Idosos (acima de 65 anos) apresentam prevalência de ITUs com menores diferenças entre os sexos.
Nas infecções comunitárias a prevalência atinge 20% nas mulheres e 10% nos homens, enquanto nas
infecções hospitalares esta prevalência é de aproximadamente 30%. Os fatores responsáveis pela
incidência elevada de ITU nos idosos incluem:
- doença de base associada
- doenças ou condições que dificultam o esvaziamento normal da bexiga (ex: cistocele e
hipertrofia prostática)
- instrumentação das vias urinárias
- manejo da incontinência urinária com cateter vesical
- diminuição da atividade bactericida da secreção prostática
- diminuição do glicogênio vaginal e aumento do pH vaginal
Em mulher pós-menopausa as infecções recorrentes, com três ou mais culturas positivas e
sintomáticas em um ano, ou 2 dois episódios de ITU em seis meses, tem como fator predisponente a
cistocele, incontinência e aumento do volume de urina residual.
Pacientes internados desenvolvem ITUs mais freqüentemente que pacientes comunitários, tendo em
vista as condições gerais dos pacientes hospitalizados e a alta probabilidade de instrumentação do
trato urinário, que são os maiores contribuintes para esta diferença.
A ocorrência de bacteriúria em pacientes hospitalizados sem cateterismo é estimada em 1%, e o risco
de infecção varia de acordo com o sistema de drenagem utilizado, e a duração do cateterismo. No
sistema aberto, atualmente em desuso, cerca de 100% dos pacientes apresentarão bacteriúria em 2 a
4 dias a partir da cateterização, no sistema fechado 5 a 10% dos pacientes apresentarão bacteriúria
por cada dia de cateterização. A importância da ITU hospitalar está na sua elevada freqüência e
principalmente por ser considerada a principal causa de bacteremia por Gram negativos.
SINAIS E SINTOMAS CLÍNICOS
Neonatos e crianças até dois anos de idade com ITU(s) podem ser totalmente assintomáticos ou
apresentarem sintomas inespecíficos como: irritabilidade; diminuição da amamentação; menor
desenvolvimento pondero-estatural; diarréia e vômitos; febre e apatia, etc. Cerca de 7% dos casos
podem estar acompanhados de icterícia e de hepato-esplenomegalia.
Crianças maiores já podem relatar sintomas como: disúria, freqüência e dor abdominal.
No diagnóstico de ITU em crianças menores de dois anos, pode ser feita apenas uma triagem com a
urina obtida por coletor, se negativa tem valor diagnóstico de exclusão, mas se positiva, com ou sem
leucocitúria, o diagnóstico final depende de coleta por punção supra-púbica ou de urina obtida por

Mod - 4
sondagem vesical. Em crianças maiores de dois anos com controle esfincteriano, pode-se utilizar a
urina de jato médio.
Adultos com ITU baixa, limitada a uretra e bexiga, geralmente apresentam disúria freqüente, urgência
miccional e ocasionalmente dor na região particularmente pielonefrite, são freqüentemente
acompanhadas pelos mesmos sintomas das infecções baixas, além supra-púbica. As ITUs altas,
particularmente pielonefrite, são freqüentemente acompanhadas pelos mesmos sintomas das
infecções baixas, além de dor nos flancos e febre. Bacteremia quando presente poderá confirmar um
diagnóstico de pielonefrite ou prostatite.
AGENTES ETIOLÓGICOS DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
A flora normal da região periuretral é definida de acordo com a faixa etária e condições do paciente e,
raramente, causam ITUs apresentando em geral contagem de colônias menor que 1000 UFC/ml,
sendo constituída de: Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. (difteróides), Staphylococcus spp.
(exceto Staphylococcus aureus e S. saprophyticus), Lactobacillus spp.
Manifestações clínicas e microrganismos freqüentemente associados com os vários tipos de
ITUs.
Tipo de
Infecção
Manifestação
clínica
Microrganismo isolado Diagnóstico e contagem de
colônias (UFC/ml)
TratoUrinário
Alto
Pielonefrite
Aguda: febre,
náusea, calafrios,
vômito, dor no flanco
Crônica:
assintomática
Enterobactérias: E. coli e
outros grams negativos,
Enterococcus e
Staphylococcus aureus
≥ 105
Cistite
Disúria e frequência Escherischia coli e outros
grams negativos, S.
saprophyticus, Enterococcus
≥ 105
Uretrite
Disúria, frequência,
corrimento uretral
Chlamydia Trachomatis (a)
Mycoplasma hominis (b)
Ureaplasma urealyticum (c)
Neisseria gonorrhoeae (d)
Trichomonas vaginalis (e)
Candida albicans e spp. (f)
Urocultura negativa
a) Diagnóstico por IFD
b) e c) secreção uretral
semeada em meios de cultura
específicos. Alguns kits
permitem contagem de colônias
- ≥ 104
ucf/ml
d) cresce em ACH e TM
e) exame direto de jato inicial
de urina centrifugada
f) podem crescer em ágar
sangue ou CLED
TratoUrinárioBaixo
Prostatite
Aguda: febre,
calafrios, dor lombar
Crônica:
assintomática ou
semelhante aos
sintomas da aguda
N. gonorrhoeae, E. coli,
Proteus spp. e outras
enterobactérias
Menos frequente:
Enterococcus spp. P.
aeruginosa e Chlamydia
trachomatis*
Questionável: micoplasmas
Urocultura ou cultura da
secreção prostática
≥ 103
ucf/ml
*diagnóstico por IFD
Infecção
Hospitalardo
TratoUrinário
Cistite
Pielonefrite
Disúria e frequência
urinária na presença
de SVD pode ser
assintomático
Escherischia coli e outras
enterobactérias
P. aeruginosa
Acinetobacter spp.,
Enterococos
Candida albicans, C.
glabrata e Candida spp.
Staphylococcus coag. Neg
≥ 105

Mod - 5
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
A maioria das ITUs é diagnosticada através de dados clínicos e laboratoriais como piúria e ou
bacteriúria e também pela urocultura com contagem de colônias.
Pesquisa da Piúria - reflete a possibilidade de resposta inflamatória do trato urinário. A causa mais
comum é a infecção bacteriana que poderá ser confirmada pela urocultura; porém a piúria poderá ser
evidenciada nas situações clínicas apresentadas abaixo, cuja urocultura resulta negativa.
a) Não infecciosa:
- doença túbulo-intersticial (nefropatia por analgésicos e beta-lactâmicos)
- cálculos e corpos estranhos
- terapia com ciclofosfamida
- rejeição de transplante renal
- trauma genitourinário
- neoplasias
- glomerulonefrite
b) Infecciosa (microrganismos de difícil cultivo):
- Tuberculose e infecções causadas por micobactérias atípicas
- Haemophilus influenzae
- Chlamydia spp. e Ureaplasma urealyticum
- Gonococos
- Anaeróbios
- Fungos
- vírus (herpes, adenovírus, varicela-zoster)
- Leptospiras
c) Outras causas infecciosas:
- durante ou até uma semana após o tratamento adequado da ITU
- Infecção “mascarada” pela antibioticoterapia
- infecções adjacentes ao trato urinário (apendicite, diverticulite e prostatite)
A pesquisa de piúria poderá ser realizada por diferentes métodos manuais e automatizados:
Métodos Princípios Limites de Detecção
Microscópico:
- Gram Reconhecimento das bactérias por
características morfo-tintoriais.
Gram de uma gota de urina não
ccentrifugada
≥ 1 bactéria em campo de imersão
≥ 105
UFC/ml
Pesquisa de Leucócitos (urina não
centrifugada):
- lâmina e lamínula
- câmara de contagem
- excreção urinária de leucócitos
- sedimento urinário
Pequeno aumento 10x
Aumento 40x
Grande aumento 100x
Contagem na câmera de
hemocitômetro
Determinação da excreção
Determinação no sedimento
30 leucócitos/campo
5 leucócitos/campo
1-2 leucócitos/campo
≥ 10 plócitos/ml (valor clínico)
≥ 400.000 leucócitos/hora
≥ 10 plócitos/ml (valor clínico)
Testes Químicos:
- fitas nitrato redutase – teste de
Griess
- esterase leucocitária
Bactérias gram negativas reduzem
Nitrato a Nitrito
Detecta a presença dessa enzima
nos leucócitos
≥ 104
UFC/ml
falso neg em cocos gram + e
Pseudomonas
Equivale a 5 leucócitos/campo 40x

Mod - 6
Os testes utilizando fitas reagentes têm bom valor preditivo para afastar infecção urinária, no entanto
apresentam baixo desempenho para sugerir ITU. Altas doses de vitamina C podem dar falso teste
negativo para nitrito na fita, e a presença de Trichomonas pode dar teste positivo para esterase
leucocitária.
Valores de Sensibilidade, especificidade e valor preditivo (VP) dos testes nitrito e esterase
leucocitária, para predizer 105
UFC/ml
TESTE Sensibilidade
%
Especificidade
%
VP (%) do teste
positivo
VP (%) do teste
negativo
Nitrito 69 90 57 94
Esterase leucocitária 71 85 47 94
Bacterioscopia de urina:
Com a urina não centrifugada, e apenas homogeneizada, pegar uma alça com 10 µl de urina e
depositar sobre uma lâmina de vidro;
Deixar secar, fixar na chama e corar pelo gram.
Com objetiva de imersão (1000x) fazer contagem.
Se encontrar 1 ou mais bactérias por campo, sugere ≥ 105
UFC.
A presença de células epiteliais e vários tipos morfológicos de bactérias sugere contaminação.
Bacteriúria - a pesquisa de bacteriúria poderá ser realizada através da bacterioscópia da urina,
testes bioquímicos e cultura de urina.
QUANTIFICAÇÃO DA BACTERIÚRIA - CONTAGEM DE COLÔNIAS
A identidade da bactéria infectante isolada na cultura de urina é um dos fatores indicativos de
infecção, porém não podemos esquecer que existem microrganismos que colonizam freqüentemente a
uretra distal de pacientes, e que raramente causam ITUs. Cerca de 10 a 20% das pacientes
apresentam colonização da mucosa vaginal e da região periuretral por enterobactérias por esta razão,
além da identificação de bactérias uropatógenas, a avaliação do número de unidades formadoras de
colônias UFC por ml tornou-se um critério importante na interpretação da urocultura, já que os
microrganismos colonizantes geralmente apresentam-se em contagens baixas.
O critério de diagnóstico tradicional de Kass (1956), determina a contagem ≥ 105
UFC/ml como limite
indicativo de infecção urinária. Contudo, no caso de pacientes do sexo feminino apresentando infecção
urinária sintomática não complicada, este limite corresponde a uma alta especificidade e uma baixa
sensibilidade. De fato, cerca da terça parte das mulheres com síndrome clínica de disúria, freqüência,
urgência e piúria e que melhoram com o uso de antimicrobianos, apresentam contagens entre 102
a
104
UFC/ml, segundo critério de Stamm (1982). Portanto, atualmente torna-se necessário que os
laboratórios utilizem os critérios propostos por Stamm e comecem a detectar microrganismos a partir
de 102
UFC/ml, principalmente nesta população de mulheres.
Comparação de Contagem de Colônias para ITU Baixa por coliformes.
Valor PreditivoPesquisador Urina Sensibilidade Especificidade
Positivo Negativo
Stamm
(1982)
≥ 102
coliformes/ml
0.95 0.85 0.88 0.94
Kass (1956) ≥ 105
coliformes/ml
0.51 0.99 0.98 0.65
O resultado da urocultura deverá ser avaliado juntamente com os outros dados laboratoriais
(pesquisa de bacteriúria e/ou piúria) e clínicos (presença ou ausência de sintomas, fatores
predisponentes, população de risco, etc.). Considerando-se que as amostras de urina submetidas a
cultura são provenientes de pacientes com sintomas de ITU e de pacientes assintomáticos com alto
risco de Infecção.
Apresentamos na tabela seguinte os diversos métodos utilizados para a quantificação da urina e
posterior identificação e antibiograma.

Mod - 7
Parâmetros para interpretação das uroculturas
Parâmetro Método e Interpretação Comentário
Semi-Quantitativa Lamino cultivo e Dispstick ou Dip-slide Técnica semi-quantitativa
Pour-plate
1 microrganismo = 1000 UFC/ml
Método clássico padronizado raramente
utilizado, pois é muito trabalhoso.
Quantitativa
Alça calibrada = 0,01 ml
1 colônia = 100 UFC/ml
Alça calibrada = 0,001 ml
1 colônia = 1000 UFC/ml
Mais utilizada e de fácil execução
Lamino-cultivo
O lamino-cultivo consiste de um recipiente plástico cilíndrico, onde pode também ser coletado a urina,
com uma tampa ligada a um suporte plástico com duas faces contendo meios de cultura como CLED e
Mac Conkey ou outras combinações. Esta técnica tem sido muito utilizada tanto por laboratórios com
pequena rotina, como aqueles de grande movimento pelos seguintes motivos:
Facilita a semeadura, pois não necessita de alça calibrada ou outra medida de volume.
Facilita o transporte da urina semeada utilizando o próprio recipiente do lamino-cultivo.
Fácil conservação do produto em temperatura ambiente por cerca de seis meses.
Identificação sumária dos principais patógenos encontrados, dependendo do produto adquirido.
Estes meios permitem identificar através de algumas provas bioquímicas rápidas alguns dos principais
gêneros de bactérias ou pelo menos sugerir ou afastar a presença de E. coli. A coleta deve seguir os
padrões normais de assepsia e orientação, e a semeadura é feita sobre o próprio lamino-cultivo, de
forma que as faces do produto sejam colocadas uniformemente em contato com a urina.
- despejando-se a urina durante a coleta ou após coletada em frasco estéril
- semeada com um swab embebido na urina homogeneizada.
As principais desvantagens do método são:
- o método é semi-quantitativo
- superfície menor de leitura e observação de crescimento
Método Pour plate
Preparar previamente a diluição da urina para obtenção de um fator a ser utilizado na interpretação.
- 9,9 ml de salina + 0,1 ml da urina (10-2)
- 9,9 ml de salina + 0,1 ml da 1ª diluição (10-4)
- Adicionar 1 ml da última diluição em placa de Petri (150 mm)
- Acrescentar o Ágar Müller Hinton (fundido), homogeneizando e incubando à 35-37ºC em aerobiose
durante 24 h.
- A leitura é feita multiplicando o número de colônias obtido, pelo fator de diluição.
Semeadura com Alça Calibrada
Alguns trabalhos recomendam a semeadura das urinas somente com a alça calibrada 0,01µl (10 µL),
procurando detectar-se contagem de colônias a partir de 100 UFC/ml, outros trabalhos porém
recomendam a semeadura de acordo com a origem da amostra como o proposto abaixo.
Recomendação da Inoculação por Alça Calibrada segundo a origem da amostra clínica de urina
Amostra 0,001 ml ou 1 µl 1
0,010 ml ou 10 µl 2
Jato médio feminino X

Mod - 8
Jato médio masculino X
Cateter X
Punção Supra-púbica X
Cistoscopia X
1
- uma colônia com alça de 1 µL = 1000 UFC/ml
2
- uma colônia com alça de 10 µL = 100 UFC/ml
Utilizado para amostras onde a contagem de colônias baixa tem significado clínico
Esse método consiste em utilizar a urina não diluída, e fazer a semeadura utilizando-se uma alça de
platina ou de plástico (disponível comercialmente), de diâmetro calibrado capaz de carrear uma
quantidade fixa de urina (0,001 ou 0,01ml), padronizando desse modo o fator de diluição.
Técnica: Em sua execução a alça bacteriológica é introduzida em uma amostra de urina bem
homogeneizada, fazendo-se movimentos para baixo e para cima no sentido vertical. A alça carregada
é então utilizada para inocular cada meio de cultura, fazendo-se, inicialmente, uma linha reta no
centro da placa e completando-se o espalhamento com uma série de passagens em um ângulo de
90º, através da linha original. Importante item de controle de qualidade é utilizar alças calibradas
periodicamente aferidas ou, quando possível, alças descartáveis.
Meios de cultura: As placas com meio seletivo (Mac Conkey ou EMB) e outro meio não seletivo (Ágar
Sangue de Carneiro a 5%) deverão ser incubadas 24 horas à 35-37ºC, devendo este período ser
prolongado quando as condições clínicas justificarem ou quando houver suspeita de infecção por Gram
positivos (Enterococos e Streptococcus agalactiae ou leveduras). Atualmente utiliza-se muito o meio
CLED, que permite crescimento das enterobacterias, impedindo o espalhamento dos Proteus, a
maioria dos gram positivos e leveduras. É prudente a leitura em 48-72 horas quando a contagem de
leucócitos ou a bacterioscopia sugerirem infecção urinária e não for verificado crescimento bacteriano
em 24 horas.
Nos casos de suspeita clínica de ITU por anaeróbios, o material clínico adequado para cultura é a urina
obtida por punção supra-púbica e semeada de acordo com as orientações deste manual para cultura
de anaeróbios. Quando houver suspeita de ITU fúngica, recomenda-se semear de acordo com as
orientações deste manual referentes às infecções fúngicas.
Outros dados laboratoriais que podem contribuir para o diagnóstico:
Hematúria: quando detectada isoladamente sugere tuberculose renal, litíase renal, doença
policística renal, cistite viral e trauma após cateterização.
Proteinúria: resposta fisiológica à exercícios físicos prolongados ou postura ereta (proteinúria
ortotástica)
Hemocultura positiva: indica a presença de microrganismo na corrente sangüínea proveniente de
um sítio conhecido (pulmão, osso, dente etc.) ou de um sítio desconhecido. Em pacientes com
pielonefrite aguda a hemocultura é positiva em 25%. A bacteremia é também bastante freqüente
nos neonatos com infecção do trato urinário.
Prostatite - Cerca de 50% dos homens em algum momento da vida irão apresentar sintomas
sugestivos de prostatite, embora apenas 5-10% serão caracterizados como casos agudos ou crônicos.
Os demais apresentarão quadros inflamatórios não infecciosos. O diagnóstico de prostatite bacteriana
aguda é, muitas vezes, confundido nos homens abaixo de 50 anos com infecção urinária. A prostatite
pode ser detectada com base em uroculturas positivas, ou cultura de secreção prostática com
presença de neutrófilos na secreção. Os sintomas, geralmente, são intensos na infecção aguda,
enquanto que na prostatite crônica eles são insidiosos, manifestando-se por infecções urinárias
repetidas, ou sintomas genitourinários irritativos ou obstrutivos.
Na fase aguda é contra-indicada a coleta de secreção prostática pela dor, embora o toque retal
cuidadoso já possa sugerir este diagnóstico, documentado por urocultura. Os principais agentes são a
E. coli, Proteus spp.,e outras enterobacterias, sendo menos freqüente o enterococo. É controvertido o
papel de estafilococos, Gardnerella, Haemophilus, Chlamydia, Mycoplasma, Trichomonas e vírus.

Mod - 9
2. INFECÇÕES DE OSSOS E ARTICULAÇÕES
INTRODUÇÃO
O tecido ósseo normal apresenta resistência natural às infecções, que, no entanto, podem ocorrer
quando este tecido é traumatizado, sua nutrição comprometida, pela presença de inóculo microbiano
significativo e/ou presença de corpo estranho. Um processo infeccioso agudo do tecido ósseo
caracteriza a osteomielite aguda, que na ausência de tratamento ou tratada de forma inadequada
evolui a partir de 10 dias para osteomielite crônica, com necrose tecidual, processo inflamatório,
presença de pus, seqüestro ósseo, podendo comprometer partes moles e podendo drenar através de
fístula, com evolução lenta por semanas meses ou anos.
O inóculo bacteriano comumente é introduzido pelo trauma, contigüidade (úlceras), via hematogênica
(bacteremia ou êmbolo), introdução de corpo estranho (próteses) e quebra de barreiras
(procedimentos cirúrgicos), etc.
A correta identificação do agente etiológico e seu teste de sensibilidade aos antimicrobianos é de
fundamental importância para as perspectivas de sucesso terapêutico. Não se recomenda fazer
avaliação microbiológica com base em material obtido com swab do orifício de drenagem de fístula, de
ferida, úlcera, etc.
A amostra clínica para o isolamento do agente deve ser obtida por procedimento cirúrgico ou por
punção biópsia aspirativa com técnica asséptica e material suficiente para:
Bacterioscopia pelo Gram, equando indicado coloração de Ziehl Neelsen
Exame histopatológico (recomendável)
Cultura para bactérias aeróbias e facultativas
Caso indicado cultura para fungos, micobactérias e anaeróbios.
MICRORGANISMOS MAIS FREQÜENTES
OSTEOMIELITE
Hematogênica – Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., S. agalactiae (recém-nascido),
Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Candida spp. (cateter).
Associação com quadros clínicos
Pós-trauma Streptococcus spp., Propionibacterium spp., Pseudomonas spp., Enterobactérias,
Staphylococcus spp., bactérias anaeróbias.
Pós-operatório Fixação de fratura: Coliformes, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus
Esternotomia: Staphylococcus aureus e S. epidermidis
Colocação de próteses: S. epidermidis, S. aureus, Enterobactérias e Pseudomonas
spp..
Pós-mordida de
animal
Pasteurella multocida, Eikenella corrodens.
Insuficiência
vascular
Enterobactérias, anaeróbios.
Anemia falciforme Salmonella spp. e Streptococcus pneumoniae.
Pé diabético e úlcera
de decúbito
Streptococcus spp., Anaeróbios, Gram negativos.
Infecção por HIV Bartonella henselae

Mod - 10
Imunossuprimidos Aspergillus spp., Complexo M. avium, Candida spp.
Usuários de droga
endovenosa e
pacientes que fazem
hemodiálise crônica
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
Locais onde as
doenças tem alta
prevalência
M. tuberculosis, Brucella spp.,
Infecção hospitalar Enterobactérias e Pseudomonas aeruginosa
ARTRITE SÉPTICA
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
Enterococcus spp.
Enterobactérias
Crônica e
monoarticular
Brucella spp., Nocardia spp., Mycobacterium spp., Fungo
Por faixa etária Até 3 meses: S. aureus, Enterobacterias, S. agalactiae (grupo B) e
Neisseria gonorrhoeae.
3 meses a 14 anos: S. aureus (27%), S. pyogenes (14%), S. pneumoniae
(14%), Haemophilus influenzae (3%), bacilos Gram negativos (6%),
Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis (14%) e desconhecida (36%).
Adultos: N. gonorrhoeae, S. aureus, Streptococcus spp., raramente bacilos
gram negativos.
PRÓTESES ARTICULARES
S. aureus
Staphylococcus spp (coagulase negativos)
Artrite reacional ou Sindrome de Reiter
Pode ocorrer após semanas infecção por: Chlamydia trachomatis, Yersinia enterocolitica,
Campylobacter jejuni, Shigella, Salmonella.
Poliartrite assimétrica que pode acompanhar de uretrite, conjuntivite, uveite e rash cutâneo. É
importante lembrar como diagnóstico diferencial de artrite migratória causada pela febre reumática,
pós-infecção, por Streptococcus pyogenes.
COLETA E TRANSPORTE DO MATERIAL
Estas amostras deverão ser colhidas através de procedimentos invasivos: punções ou durante o ato
cirúrgico. Observando-se os cuidados de assepsia para que a amostra coletada não seja contaminada.
A secreção ou líquidos serão aspirados com o auxílio de agulha e seringa estéreis e colocados em
frasco estéril ou em meio de transporte para anaeróbios facultativos e estritos (caldo de tioglicolato) -
eventualmente mantidos na própria seringa, nunca usando a agulha para obstruir a seringa, pelo risco
de acidentes. Eentão encaminhados rapidamente ao laboratório de microbiologia.
PROCESSAMENTO DE AMOSTRA
No laboratório de microbiologia, estas amostras serão processadas nas seguintes etapas:

Mod - 11
Avaliação da qualidade do material encaminhado:
Identificação adequada, frasco/meio de transporte correto, volume da amostra suficiente para os
testes requeridos, data/horário da coleta.
Coloração de Gram:
Serão observados forma, coloração e agrupamento dos microrganismos, além da presença de células
(leucócitos íntegros ou degenerados, inclusões bacterianas, etc). Se houver suspeita de
microrganismos álcool-ácido resistentes, preparar também lâminas para coloração de Ziehl Neelsen, e
na suspeita de fungos, preparação de azul de lactofenol ou de algodão.
Semeadura em meios adequados:
Meios de cultura para
bactérias aeróbias
Ágar sangue
Incubar a 35ºC durante 18 a 24 h
Verificar crescimento bacteriano:
- se negativo, incubar mais 24 h
- se positivo, identificar o microrganismo
Ágar chocolate suplementado
Incubar a 35ºC em jarra com 5% CO2 durante 18 a 24 h
Verificar o crescimento bacteriano:
- se negativo, reincubar
- se positivo, proceder à identificação do microrganismo
Meios de cultura para
bactérias anaeróbias
Brucella ágar acrescido de vitamina K (menadiona) e hemina
Incubar a 35ºC em jarra de anaerobiose durante 48 h
Verificar crescimento
- se negativo, repicar a amostra do tioglicolato a cada 48 h até completar
7 dias
- se positivo, proceder à identificação da bactéria
Culturas especiais Se houver suspeita clínica de micobactérias, semear em meios especiais
(Lowenstein Jensen ou Middlebrook); aguardar 60 dias para concluir a cultura
como negativa.
Se houver suspeita clínica de fungos, semear em Ágar Sabouraud-glicose;
incubar à temperatura ambiente durante 4 semanas.
Em caso de suspeita clínica, outras culturas especiais podem ser
disponibilizadas com meios específicos: culturas para Legionela, Micoplasma,
Clamídia e outros agentes fastidiosos.
As culturas para vírus demandam estrutura laboratorial especializada em
cultura célular. Quando realizadas devem ser finalizadas com a tipagem
monoclonal de cada vírus suspeito.

Mod - 12
3. INFECÇÕES DA PELE E TECIDO SUBCUTÂNEO
INTRODUÇÃO
A pele é o órgão mais acessível do corpo, um dos mais facilmente traumatizável e sujeito à infecção,
sendo composta de duas camadas. Uma superficial denominada epiderme e a outra mais profunda
denominada derme. Os folículos pilosos, as glândulas sebáceas e as glândulas sudoríparas abrem-se
para a superfície cutânea. Abaixo da derme está a camada subcutânea adiposa, sob a qual localiza-se
a fina membrana fascial que recobre os músculos, ligamentos e outros tecidos conjuntivos. O plano
fascial cria espaço em várias partes do corpo, incluindo a cabeça, o pescoço, dedos, mãos e pés. A
fascia é uma barreira que determina a extensão por onde a infecção pode se disseminar, mas pode
também criar desafios terapêuticos devido à sua impermeabilidade, tendo de ser tratada
cirurgicamente.
As infecções cutâneas envolvem uma grande diversidade de agentes etiológicos e mecanismos
patogenéticos múltiplos. Estas infecções são classificadas em primárias ou secundárias, (dependendo
da existência ou não de uma porta de entrada anterior à infecção), agudas ou crônicas (de acordo
com a duração da infecção), podendo ainda ser mono ou polimicrobianas. As infecções que têm o foco
primário em estruturas profundas podem manifestar-se como erupções cutâneas. As infecções
primárias ocorrem em pacientes sem porta de entrada evidente (Ex: erisipelas). As infecções
secundárias ocorrem, como complicações de lesões de pele (abrasões), traumas cirúrgicos ou feridas
penetrantes. Tais infecções podem ser tanto monomicrobianas, tais como feridas infectadas por
estafilococos, ou polimicrocrobianas, como em algumas condições gangrenosas causadas por
estreptococos microaerófilos e anaeróbios. As infecções secundárias podem ser localizadas ou
disseminadas, dependendo da extensão das doenças de base, ou precipitadas por algum trauma.
Como exemplo de infecções agudas ou crônicas podemos citar um furúnculo estafilocócico que acaba
em poucos dias, enquanto que algumas infecções fúngicas crônicas podem durar meses ou anos.
LESÕES ERITEMATOSAS E SUPERFICIAIS: ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO
IMPETIGO
É uma infecção cutânea intra-epidérmica superficial que produz lesões eritematosas, podendo ser
acompanhados de lesões pustulares ou bolhosas. O impetígo não bolhoso é normalmente causado por
Streptococcus pyogenes, beta hemolítico do grupo A, enquanto que Staphylococcus aureus tem sido
associado com a doença na forma bolhosa.
As lesões do impetígo não-bolhoso iniciam-se como pápulas eritematosas pequenas, que então
formam vesículas (1 a 2 cm de diâmetro). Dentro de poucos dias as vesículas formam pús e se
rompem. O exsudato purulento seca formando crostas finas características de coloração âmbar ou
castanha, circundadas por um halo eritematoso. O exame microbiológico do material da lesão produz
cultura pura de estreptococcos do grupo A ou cultura mista de S. pyogenes e S. aureus, embora o
estafilococo seja geralmente considerado mais uma invasão secundária do que patógeno primário.
O impetigo bolhoso causado por S. aureus é menos comum do que o causado por S. pyogenes e
ocorre geralmente em crianças recém-nascidas. As lesões começam como vesículas e depois formam
grupos característicos de bolhas superficiais flácidas (0,5 a 3,0 cm de diâmetro) com o mínimo ou
nenhuma eritema circundante. As bolhas apresentam parede fina e rompem-se facilmente, revelando
camada cutânea básica semelhante a queimadura de segundo grau, caracterizada como síndrome da
pele escaldada. O exsudato pode ser seroso ou purulento e forma uma crosta fina marrom em
desidratação.
ERISIPELA E CELULITE
A erisipela é uma infecção cutânea geralmente causada por estreptococo do grupo A, tendo sido
descritos raros casos devidos a estreptococos C e G. A infecção envolve principalmente a derme e as
partes mais superficiais do tecido subcutâneo com envolvimento proeminente dos linfáticos
superficiais. A erisipela apresenta uma área cutânea endurecida, edematosa, avermelhada e dolorida,
eventualmente com pequenas vesículas ou bolhas na superfície cutânea. O quadro clínico típico é
caracterizado pelo aparecimento de alterações cutâneas com bordas elevadas e nitidamente

Mod - 13
demarcadas com pele adjacente normal ou não envolvida. O ataque agudo de febre e calafrio é
notório com invariável presença de linfoadenopatia.
Ao contrário da erisipela, a margem da área de celulite é pouco definida sem elevação central. O
estreptococo do grupo A e o S. aureus são considerados os agentes etiológicos mais comuns. Algumas
espécies de Vibrio e Aeromonas podem causar celulite após introdução do microrganismo através da
ferida ou laceração ocorrida durante a natação em água doce ou água do mar. A celulite causada por
H. influenzae é relativamente rara, mas a forma distinta desta infecção é que ela está geralmente
associada com bacteremia e afeta tipicamente crianças de seis meses a 3 anos de idade.
Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico de impetigo é feito geralmente através das características clínicas das lesões. A
confirmação bacteriológica geralmente não é necessária, mas pode-se cultivar em Ágar sangue o
material obtido da base da lesão após lavagem com água e sabão, assepsia local com álcool a 70% e
remoção da crosta. Evidência sorológica de infecção recente por Streptococcus do grupo A poderá ser
utilizado no diagnóstico retrospectivo. A detecção do anticorpo anti-Dnase B é um indicador mais
sensível de infecção cutânea pelo estreptococo do que o título de ASLO (anti-estreptolisina O),
provavelmente devido à inibição de estreptolisina pelos lipídios da pele presentes na lesão.
FOLICULITE
É uma infecção e inflamação dos folículos pilosos geralmente iniciada pelo bloqueio do folículo ou por
pequenos traumas. A infecção é caracterizada por pápulas ou pústulas côncavas, perfuradas por pêlo
circundado por um halo eritematoso. A infecção é em geral causada pelo S. aureus. Embora a
etiologia da foliculite possa ser confirmada por cultura do pús ou exsudato da lesão, esta prática
geralmente não é necessária. Outras causas menos comuns de foliculite incluem membros da família
Enterobacteriaceae (especialmente Proteus sp). Esta pode ocorrer em pacientes com Acne vulgaris
que recebem antibióticos orais por um período prolongado de tempo. Recentemente foram verificados
surtos de foliculite através do uso de banheiras de hidromassagem e piscinas contaminadas com
Pseudomonas aeruginosa. A erupção cutânea consiste de coceira, pápulas eritematosas ou pápulo-
pustulosas.
A erupção não é única em aparência, mas tem distribuição característica envolvendo principalmente
as nádegas, quadris, coxas e axilas. Estas são áreas onde se localizam as glândulas sudoríparas
apócrinas as quais tendem a ser ocluídas quando se usam roupas apertadas. Além da erupção, muitos
pacientes manifestam febre baixa, cefaléia, indisposição, dor de ouvido (devido à otite externa
concomitante) e dor no peito (devido à mastite). A doença pode levar várias semanas, mas é
geralmente autolimitada, de cura espontânea, não necessitando de terapia específica.
Na foliculite estafilocócica, geralmente a bactéria não é vista no Gram e nem na cultura. Já na
foliculite por Pseudomonas, o microrganismo pode ser recuperado de pústulas maiores, embora na
maioria dos casos a cultura também se apresenta negativa.
FURUNCULOSE E CARBÚNCULO
O furúnculo é um abscesso que se inicia no folículo piloso como um nódulo avermelhado, tornando-se
doloroso e amolecido. O carbúnculo é mais profundo e extenso, apresentando-se freqüentemente
como abscessos subcutâneos múltiplos envolvendo vários folículos e glândulas sebáceas, drenados
através dos folículos pilosos.
O carbúnculo pode estar associado com febre, mal-estar e pode se complicar pela celulite ou
bacteremia. Tanto o furúnculo como o carbúnculo ocorrem em tecido cutâneo pela fricção e
abafamento dos sítios onde se encontram os folículos (virilha, axila, pescoço e face). O S. aureus é o
patógeno mais freqüente. Tratamento com compressas quentes é geralmente adequado para
pequenos furúnculos localizados. Antibióticos anti-estafilocócicos tais como oxacilina e clindamicina
podem ser necessários na presença de febre ou na existência de celulite circundante, especialmente
se o furúnculo ou carbúnculo estiveram localizados na face.
PARONÍQUIA
É uma infecção superficial na prega da unha que pode ser aguda ou crônica. As infecções agudas são
devidas a Staphylococcus aureus, que poderá ser cultivado de drenagem purulenta.

Mod - 14
Tratamento com compressas quentes são geralmente adequadas, embora a incisão cirúrgica e
drenagem sejam necessárias. A paroníquia crônica é geralmente associada com imersões freqüentes
das mãos em água de sabão, sendo o agente mais comum a Candida sp.
Poderá ser confirmado pela cultura do aspirado ou drenagem do pús em aerobiose no Ágar Sangue.
Diagnóstico de lesões eritematosas superficiais
Doenças e Síndromes Agente etiológico mais
freqüente
Impetigo Streptococcus pyogenes,
Gram, Cultura em Ágar Sangue ou Ágar
Chocolate
Erisipela Streptococcus pyogenes (grupo A),
eventualmente outros sorogrupos
(G,C ou B)
Gram, Cultura em Ágar Sangue, Ágar
chocolate, Caldo trypticase soja
Celulite Streptococcus pyogenes, S. aureus
Menos freqüentes:
Enterobactérias, Pasteurella spp.,
Aeromonas spp., Clostridium spp.,
B. anthracis, Erysipelotrix spp.
Gram, Cultura em Ágar Sangue, Ágar
Chocolate, Ágar Mac Conkey, Caldo
tioglicolato, Caldo trypticase soja.
Foliculite, Furúnculos e
Carbúnculo
Staphylococcus aureus Gram, Cultura em Ágar Sangue
Paroníquia Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Candida
spp.
Gram, Cultura em Ágar em Sangue
Micoses superficiais Candida spp., Epidermophyton
spp., Microsporum spp.
KOH 10%, Ágar Sabouraud, Dextrose +
cloranfenicol e cicloheximida
ULCERAÇÕES E NÓDULOS: ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO
Nas ulcerações cutâneas geralmente há uma perda parcial do tecido dérmico ou epidérmico. Nódulos
são focos inflamatórios onde a maior parte da camada superficial cutânea está intacta. Uma variedade
de bactérias e fungos causa lesões nodulares ou ulceradas do tecido cutâneo, ou ambas, após
inoculação direta. Exemplos importantes incluem: Corynebacterium diphtheriae, Bacillus anthracis,
Nocardia spp., Mycobacterium marinum e Sporotrix schenckii.
Alternativamente, as infecções cutâneas podem ocorrer após a disseminação hematogênica de
microrganismos que eclodem na pele provenientes de outros focos de infecção. Por exemplo, P.
brasiliensis e Cryptococcus neoformans podem apresentar a infecção pulmonar primária com
disseminação hematogênica para sítios extrapulmonares, tais como tecidos moles e cutâneos. A
microscopia e a cultura são os principais métodos para diagnóstico laboratorial. Contudo, existem
alguns testes sorológicos disponíveis para certos microrganismos, incluindo alguns fungos.
Diagnóstico de ulcerações e nódulos
Doenças e Síndromes Agente Etiológico Diagnóstico Laboratorial
Lesões esporotricóides Sporotrix schenckii,
Mycobacterium marinum
Gram, Ziehl, PAS, Gomori Methenamina,
auramina, cultura de biópsia para
Mycobacterium, Ágar Sangue (selado com
parafilme durante 4 semanas), Sabouraud
dextrose com cloranfenicol e cicloheximida.

Mod - 15
Blastomicose,
Criptococose
Paracoccidioides brasiliensis,
Cryptococcus neoformans
Cultura em Ágar Sangue, Sabouraud, dextrose
+ cloranfenicol + ciclohexemida, Tinta da china
e/ou calcofluor para C. neoformans.
Difteria cutânea Corynebacterium diphtheriae Coloração de Gram/ Albert Layburn, Meios de
Loefler e Ágar cistina-telurito.
Antraz Bacillus anthracis Cultura em Ágar Sangue e Ágar Sangue telurito
FÍSTULAS E QUEIMADOS: ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO
FÍSTULAS
Os principais agentes etiológicos e os recursos para diagnóstico laboratorial encontram-se na Tabela
abaixo.
Fístula é uma comunicação entre o tecido profundo infectado ou abscesso através do tecido
subcutâneo abrindo-se sobre a superfície cutânea. Isto ocorre em infecções profundas como em
osteomielites, piomiosites, linfadenites ou abscessos intra-abdominais. As infecções de próteses como
as de quadril e fêmur, cirurgias cada vez mais freqüentes, são causas comuns de fístulas de longa
duração, cujo tratamento não responde ao uso isolado de antimicrobianos exigindo quase sempre a
retirada da prótese. Em muitos casos a infecção é polimicrobiana e os germes que colonizam as
porções cutâneas da fístula podem ser diferentes dos encontrados no tecido profundo. Por esta razão
as culturas feitas a partir do material que exsuda para a superfície cutânea da fístula podem ser
enganosas.
Vários microrganismos de infecções do tecido mole são caracterizados através do trato fistulizado. O
Staphylococcus aureus produz abscessos profundos (carbúnculo) e secreta pús espesso. A linfadenite
cervical causada por micobactéria, especialmente a tuberculose cervical, pode produzir drenagem
crônica da fístula denominada escrófulo. A actinomicose classicamente definida como queixo granuloso
é uma infecção cérvico-facial extremamente dolorida e edemaciada ao redor do ângulo do queixo que
drena secreção aquosa contendo os denominados grãos de enxofre (devido a cor amarelada). Estes
grânulos amarelados são constituídos de massas bacterianas, medindo geralmente 2 mm de diâmetro.
Quando não tratada, a actinomicose progride para uma fistulização crônica.
A fonte de tal microrganismo é a cavidade oral do próprio paciente e a má higiene bucal
provavelmente constitui o fator desencadeante. A maduromicose plantar ocorre quando os
microrganismos do solo como Nocardia sp e vários fungos (ex: Petriellidium boydii, Madurella
mycetomatis e Phialophora verrucosa), são inoculados em tecidos moles do pé e produzem múltiplos
abscessos com fístulas e às vezes osteomielites.
A cultura é extremamente prejudicada pela dificuldade na obtenção das amostras clínicas
provenientes do trato fistulizado. Existe uma baixa correlação entre os resultados de cultura do
material superficial e aqueles obtidos de tecidos profundos infectados. Se for realizada uma
exploração cirúrgica, pode-se então fazer cultura do material obtido das porções mais profundas da
fístula. É possível ainda obter material para cultura através de punção ou cateterização da fístula com
cuidados de assepsia. Se aparecerem sintomas generalizados como febre e calafrios é indicada a
realização da hemocultura, que poderá revelar microrganismos mais significativos.
O procedimento para cultura pode ser o mesmo feito com feridas cirúrgicas e deve ser programado
para recuperar tanto bactérias aeróbias como anaeróbias.
Diagnóstico de Fístulas
Doenças e Síndromes Agente Etiológico Diagnóstico Laboratorial
Actinomicose Actinomyces spp. Gram, cultura em anaerobiose à 37ºC, em Ágar
Sangue e em caldo por 1-2 semanas.
Maduromicos e Madurella mycetomatis,
Phialophora verrucosa,
KOH 10%, cultura em Ágar Sabouraud com e

Mod - 16
Maduromicos podal Petriellidium boydii sem cloranfenicol + Cicloheximida.
Tuberculose Mycobacterium tuberculosis Ziehl-Neelsen, auramina, cultura em meio de
Lowenstein-Jensen, PCR
Infecções mistas ou
foco crônico
Staphylococcus aureu,
Enterobactérias, Pseudomonas
spp.
Gram, cultura do aspirado ou do tecido profundo
em ágar-sangue e ágar Mac Conkey
QUEIMADOS
Historicamente, o estreptococo hemolítico e o estafilococo foram os microrganismos mais comumente
encontrados em infecções de queimados. Com o advento dos antimicrobianos, tais infecções foram
substituídas por Staphylococcus aureus oxacilina-resistentes (ORSA), bacilos Gram negativos,
notadamente Pseudomonas aeruginosa e leveduras como a Candida albicans ou fungos filamentosos
como Fusarium sp.
A superfície queimada contém tecido morto e fluido rico em proteínas. Microrganismos da flora do
próprio paciente ou do meio ambiente colonizam esta superfície. O crescimento dos germes sobre tal
superfície continua até que esteja presente uma densa carga microbiana. Quando a concentração
bacteriana for grande o suficiente, ocorre infiltração dos tecidos mais profundos provocando infecção
generalizada com bacteremia. Os estudos sugerem que a ocorrência de invasão, seguida de
complicações está associada à contagem bacteriana de 105
UFC/grama de tecido. Isto leva ao
desenvolvimento de métodos quantitativos, tanto em esfregaços como em culturas como também
para as biópsias cirurgicamente removidas das queimaduras.
Foi demonstrado que culturas somente de tecidos superficiais são inadequados e freqüentemente
enganosos. Conseqüentemente, a cultura de tecido profundo é empregada em muitos laboratórios,
apesar de tal procedimento ser também controverso devido à dificuldade na interpretação. Embora a
biópsia tenha sido amplamente empregada, os resultados mostram inadequações. As queimaduras
nem sempre são colonizadas e a seleção dos sítios da biópsia é importante. Este conceito levou ao
emprego de uma variedade de técnicas para estimar em que profundidade os microrganismos se
disseminam. Tais métodos incluem uma variedade de técnicas histopatológicas e microbiológicas.
Cultura e bacterioscópico quantitativo - o esfregaço e a cultura quantitativa são realizadas com
biópsias removidas cirurgicamente da queimadura. Enquanto alguns preferem no mínimo 0,5g de
tecido outros aceitam uma porção menor. Escolhe-se uma área com sinais de infecção, após limpeza
do local retira-se um fragmento de tecido vivo que deve ser acondicionado em recipiente estéril.
No laboratório a biópsia é pesada, empregando-se balança com precisão de 0,001 g. O tecido então é
homogeneizado em caldo ou salina com volume conhecido utilizando-se um liqüidificador ou
homogeinizador elétrico. O material é diluído à razão de 10 até 10-5
(peso/vol.) e semeado em vários
meios de cultura, incluindo o ágar sangue e ágar Mac Conkey e em casos suspeitos cultura para
bactérias anaeróbias estritas. Os germes isolados são identificados e submetidos a estudos de
sensibilidade. E o valor quantitativo de cada microrganismo isolado é calculado a partir do peso inicial
da biópsia e da diluição empregada.
Os métodos para testar a sensibilidade de drogas de uso tópico foram desenvolvidos, porém não são
de emprego rotineiro por falta de padronização e porque o significado clínico continua duvidoso.
O bacterioscópico quantitativo pode ser realizado ao mesmo tempo, segundo o método desenvolvido
por Magee e cols. Uma quantidade conhecida do homogeneizado é espalhada por uma área total de 1
cm2
em uma lâmina e deixado para secar. A coloração é feita e 10 campos são examinados com
objetiva de imersão com aumento de 100 vezes. Uma série de cálculos permite a determinação de
contagem bacteriana em termos de microrganismos por grama de tecido.
Técnicas histopatológicas - as técnicas histopatológicas foram usadas para detectar infecções fúngicas
e na tentativa de localizar o microrganismo no tecido queimado.
Os métodos histopatológicos apresentam uma série de desvantagens:
A quantidade do tecido examinado é muito pequena sendo limitado para pequenos cortes feitos a
partir de biópsia.

Mod - 17
O reconhecimento do germe em corte histológico é muito mais difícil em lâminas coradas
necessitando de microscopista experiente.
A concentração bacteriana necessária para permitir seu reconhecimento embora ainda não
estabelecida parece ser ao redor de 105 UFC ou mais por grama de tecido.
O método histopatológico necessita de cultura simultânea para obter a identificação e o
antibiograma dos microrganismos.
Embora a correlação entre cultura e exame histopatológico, em geral, seja boa, às vezes ocorrem
discrepâncias.
FERIDAS CIRÚRGICAS: ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO
A infecção em ferida cirúrgica ocorre quando a mesma é contaminada com microrganismos,
geralmente em período intra-operatório ou imediatamente no peri-operatório. A fonte de bactérias
pode incluir sítios colonizados do corpo dos pacientes, tais como, as narinas, cavidade oral, trato
genital feminino, trato alimentar e a pele. A equipe médica e de enfermagem representam fonte
potencial de infecção assim como o ambiente do hospital.
Os fatores de risco do hospedeiro que podem contribuir para a patogênese da infecção cirúrgica
incluem obesidade, diabetes melitus, insuficiência vascular e imunodeficiências. Os fatores
microbiológicos incluem a carga microbiana e a virulência de cada germe. Podem contribuir para a
probabilidade da infecção fatores cirúrgicos e pré-operatórios, tais como a duração da operação,
intercorrências levando a contaminações, condições hemodinâmicas com baixa perfusão tecidual, má
hemostasia, presença de corpo estranho e de tecido desvitalizado. Para iniciar uma infecção na
presença desses fatores de risco, a carga infectante do agente infeccioso, é muito menor que a
necessária para causar infecção em tecido saudável.
A taxa de infecção varia em função do grau de contaminação do sítio cirúrgico. O procedimento
cirúrgico pode ser classificado como limpo, potencialmente contaminado, contaminado e infectado.
Nesta classificação o risco de infecção pós-operatória está implícito. Além disso, as infecções de sítios
remotos, por exemplo, infecção do trato urinário, coloca o paciente em cirurgia num alto risco de
infecção pós-operatória.
Os principais patógenos são: S. aureus, S. epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter
spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Bacteroides spp., etc. Algumas feridas que parecem
infectadas podem não apresentar patógeno em cultura, enquanto outras apresentarão crescimento de
múltiplas espécies.
As feridas superficiais começam freqüentemente na sutura e podem apresentar dor, calor, edema e
rubor. O pús pode exsudar-se, principalmente quando são removidos um ou mais pontos para permitir
a livre drenagem. A exsudação mal cheirosa pode sugerir presença de bactérias anaeróbias, mas
também pode resultar de outras bactérias como Proteus spp.
Os microrganismos como Mycobacterium chelonei e Mycobacterium fortuitum podem causar infecção,
complicando a cirurgia cardíaca ou mamoplastia, cirurgia ocular e outras cirurgias limpas. Tais
microrganismos podem causar doenças crônicas desfigurantes.
O volume do pús aspirado ou o swab pesadamente impregnado com o pús pode ser examinado
microbiologicamente. O esfregaço e a coloração do Gram poderá dar algumas indicações da variedade
da flora infectante. Alguns laboratórios fazem de rotina a cultura do exudato de ferida superficial para
germes aeróbios e facultativos em ágar sangue e ágar Mac Conkey assim como cultura em caldo.
Cultura para bactérias anaeróbias de feridas superficiais na ausência clínica é caro e improdutivo.
Material purulento de feridas profundas ou de feridas que mostram bolhas de gás deve ser cultivado
para germes anaeróbios assim como para aeróbios e facultativos.
O Mycobacterium chelonei e o Mycobacterium fortuitum, embora classificados como micobactérias de
crescimento rápido e capazes de crescer em meios simples, geralmente necessitam de uma a seis
semanas para crescer em cultura primária. Tais microrganismos especialmente M. chelonei, pode ser

Mod - 18
erradamente identificado como difteróide numa cultura em caldo, a menos que se realize coloração
para pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes.
Quando se relata isolamento de microrganismos em feridas infectadas é essencial levar-se em conta a
origem da amostra clínica. Assim, todos os estafilococos coagulase-negativa isolados de feridas de
esternotomia infectadas ou associados com cirurgia vascular ou de implante ortopédico, devem ser
considerados como potencialmente patogênicos fazendo-se o antibiograma.
Inversamente, baixo número de estafilococos coagulase negativa associado com flora entérica em
ferida infectada de incisão no cólon deveria ser descartada não devendo realizar antibiograma neste
caso. A razão dessa conduta é que tal microrganismo não constitui problema clínico e irá desaparecer
quando outros patógenos forem eliminados.
Diagnóstico de Infecção de Feridas Cirúrgicas
Infecções Agente Etiológico Diagnóstico Laboratorial
Infecção pós-operatória
simples
Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus grupo A,
Enterobactérias, Enterococos,
Bacteroides spp., Clostridium spp.
Gram, Cultura do pús, aspirado ou tecido em
ágar Sangue, ágar Mac Conkey, Caldo
tioglicolato empregando cultura em aerobiose e
meio seletivo para anaeróbios em ambiente de
anaerobiose estrita.
Infecção de feridas
complicadas
Streptococcus grupo A,
Staphylococcus aureus,
Enterobactérias, Pseudomonas
spp., Aeromonas hydrophila, Vibrio
vulnificus, Bacteroides spp.,
Clostridium spp., cocos
anaeróbios, cocos microaerófilos,
Fusobacterium spp.
Gram, Cultura em aerobiose, em jarra de
anaerobiose e microaerofilia (método da vela)
do pús ou tecido. Ágar sangue, Ágar Mac
Conkey, Caldo tioglicolato, Ágar enriquecido e
seletivo para anaeróbios estritos.
INFECÇÕES COMPLICADAS E LESÕES CAUSADAS POR MORDEDURA: ASPECTOS
CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO
INFECÇÕES COMPLICADAS
As infecções complicadas da pele e de estruturas subjacentes podem ocorrer após cirurgia ou trauma.
A classificação dessas infecções é difícil devido à superposição do sítio anatômico afetado, ao
microrganismo responsável e à manifestação clínica. Muitas destas infecções são graves, de
progressão rápida, e associadas com altas taxas de mortalidade.
A gangrena infecciosa é doença rara onde as necroses bolhosas da pele podem estar associadas com
bacteremia e lesões metastáticas. Esta doença é freqüentemente fatal. A gangrena sinergística, às
vezes referida como “gangrena de Meleney”, é em geral uma complicação da cirurgia do trato
alimentar. Tal infecção inicia-se como uma úlcera próxima à ferida e pode se disseminar para afetar
mais a parede abdominal anterior. A gangrena gasosa está geralmente associada com Clostridium
perfringens, microrganismo que tanto pode colonizar a ferida sem causar doença como pode causar
celulite grave, estender-se para a musculatura evoluindo para mionecrose e, com freqüência, para o
óbito.
Esta infecção pode estar mais associada com supuração aquosa e fina do que com exsudato
purulento. Uma síndrome semelhante de necrose muscular pode ser causada por Aeromonas
hydrophila e Vibrio vulnificus, enquanto a celulite pode ainda ser causada por Vibrio spp., Klebsiella
spp., Escherichia coli e/ou outros anaeróbios que não Clostridium spp. tais como Bacteroides spp. e
cocos.
A fasciite necrotizante inicia-se geralmente como ferida cirúrgica do abdômen e dissemina-se
lateralmente para os flancos, até a linha de mamilo e desce para a região inguinal. O tecido que
recobre a pele parece normal no início da doença, tornando-se vermelho azulado conforme a doença
progride. O pús pode ser drenado através da pele dos flancos ou de outras partes da ferida original.
A “doença de Fournier” é uma forma de fasciite necrotizante que afeta a região do períneo ou escroto,
onde as camadas superficiais da pele enegrecem e descamam. Pode haver envolvimento de bactérias

Mod - 19
anaeróbias como Bacteroides spp. Fusobacterium spp., Clostridium spp. e cocos Gram-positivos, bem
como bactérias facultativas como Enterobactérias, estafilococos, enterococos. Os estreptococos
microaerófilos são vistos freqüentemente em sinergia gangrenar ou associados com S. aureus e
membros da família Enterobacteriaceae.
A infecção pode se complicar e estender-se para os músculos da perna quando há comprometimento
vascular, assim como em pacientes com diabete mellitus. Pode existir mionecrose extensiva causada
por anaeróbios como Clostridium spp., cocos anaeróbios e Bacteroides spp. em área de insuficiência
vascular. A flora facultativa também pode estar presente, incluindo Proteus spp.
As bactérias comumente isoladas de feridas infectadas incluem S. aureus, S. pyogenes (grupo A),
cocos anaeróbios, Clostridium spp., especialmente C. perfringens, membros da família
Enterobacteriaceae, Bacteroides spp. e Fusobacterium spp.
Para pesquisa laboratorial eficiente necessita-se da coleta de volume adequado (até 5mL) de aspirado
de pús ou biópsia de tecido. As amostras clínicas líquidas podem ser transportadas em tubos para
transporte de anaeróbios ou sacos plásticos com ambiente anaeróbio; se não houver disponibilidade
de nenhum desses meios de transporte, pode-se utilizar a própria seringa onde se colheu o material
clínico, enviando-se o material o mais rápido possível ao laboratório. Recomenda-se processar o
material dentro da primeira hora.
Os cortes de tecido devem ser enviados ao laboratório em tubo com salina para manter a umidade.
Tecidos para análise microbiológica não devem ser colocados em formol, podendo ser colocados em
meio de transporte.
A coloração de Gram pode indicar uma variedade de microrganismos associados com a lesão e uma
terapia presuntiva poderá ser guiada pelo resultado do Gram. No caso particular da mionecrose
causada por C. perfringens, o agente pode ser facilmente reconhecido por sua morfologia de bacilo
Gram-positivo típico com extremidade angular. Nestes casos nota-se pouca quantidade de pús na
amostra.
As amostras podem ser cultivadas em ágar sangue ou ágar Mac Conkey. Os germes facultativos
comuns irão aparecer em 24 horas. O exame microbiológico de todas essas infecções requer cultura
para bactérias anaeróbias, assim como para aeróbios e anaeróbios facultativos.
Diagnóstico de Infecções Complicadas
Quadro Clínico Agente Etiológico Diagnóstico Laboratorial
Fasciite Necrotizante S. pyogenes ou anaeróbios
associados a bactérias facultativas
Ágar sangue, Ágar Mac Conkey, Caldo
tioglicolato.
Gangrena de Fournier E. coli, P. aeruginosa, P. mirabilis,
Enterococcus spp., anaeróbios
estritos, etc.
Ágar sangue, Ágar Mac Conkey, Caldo
tioglicolato.
INFECÇÕES COMPLICADAS POR MORDEDURAS
Os ferimentos de mordeduras tanto de humanos como de animais podem ser contaminados com a
flora oral do agressor, assim como podem ser causados por traumas relacionados à cavidade oral,
tendo como primeiras lesões as causadas por dentadas ou decorrentes de mastigação.
A cultura de mordedura recente não está indicada, pois o seu resultado não tem aplicação clínica. O
melhor material para cultura é geralmente o pús aspirado da profundidade da ferida ou a cultura feita
durante a incisão e drenagem desta amostra ou debridamento da ferida infectada. Deve-se realizar
cultura tanto para bactérias aeróbias quanto para anaeróbias com uma variedade de meios de cultura
para auxiliar na separação prévia dos microrganismos misturados.
Diagnóstico de Lesões Causadas por Mordeduras

Mod - 20
Mordeduras Agente Etiológico Diagnóstico Laboratorial
Mordedura de animais Pasteurella multocida (cão e gato),
Streptobacillus moniliformis (rato),
Anaeróbios, Capnocytophaga spp.
(cão), Staphylococcus aureus (cão
e gato)
Gram, Ágar sangue, Ágar Mac Conkey,
Hemocultura
Mordedura e
arranhadura de Gatos
Bartonella henselae/quintana Histologia, cultura em ágar sangue com 5-10%
CO2. PCR
Mordeduras humanas Streptococcus viridans, S. aureus,
Eikenella corrodens,
Capnocytophaga, Anaeróbios
estritos, etc.
Gram, cultura de aeróbios em Ágar sangue,
Ágar Mac Conkey, Ágar chocolate e cultura em
anaerobiose em meio enriquecido e seletivo
para anaeróbios.

Mod - 21
4. INFECÇÕES INTESTINAIS
INTRODUÇÃO
A doença diarréica continua a figurar como o maior problema da saúde humana. Foi estimada uma
ocorrência de um bilhão de episódios de diarréia no mundo por ano em crianças abaixo de cinco anos
de idade, resultando em 5 milhões de óbitos. A diarréia é particularmente devastadora em crianças
que sofrem concomitantemente de doenças infecciosas, como sarampo, imunodeficiência e
subnutrição protéica, fatores muito freqüentes nos países em desenvolvimento. Em tais países,
estima-se que a criança apresenta três a quatro vezes mais episódios de diarréia por ano do que as
que vivem em países de elevado nível de saneamento básico e com sistemas adequados de
suprimento de água.
Embora a morbidade e a mortalidade devido à doença diarréica sejam mais importantes em crianças
lactentes, esta enfermidade tem impacto importante também em adultos. Os adultos em média
sofrem de um a dois episódios de diarréia anualmente. Este fato resulta em custos econômicos devido
à utilização das fontes de recursos para saúde e perda da produtividade.
As causas das síndromes gastrointestinais acompanhadas de dor, diarréia ou desinteria podem ser:
Infecciosas, causadas por bactérias, fungos (menos freqüentes), vírus, parasitas e protozoários.
Não infecciosas, alérgicas, causadas por erro alimentar, envenenamento, etc.
O custo para se fazer um exame de fezes de qualquer paciente para todos os patógenos em potencial
descritos na literatura é proibitivo. Devem ser desenvolvidas estratégias para assegurar a maior taxa
de positividade possível, uma vez que a coprocultura tem um custo alto por resultado positivo.
A identificação daqueles casos de doenças diarréicas causadas por agentes que necessitam de terapia
que não seja apenas a hidratação oral é de particular importância. Também é importante identificar o
agente etiológico responsável por surtos de toxinfecção alimentar, para que as técnicas de manuseio
alimentar possam ser notificadas para prevenir transmissões posteriores.
A maioria dos casos de diarréia comunitária em adultos é de causa inflamatória e, as fezes, podem ser
triadas para verificar a presença de leucócitos através da coloração de azul de metileno. Entretanto, a
sensibilidade da pesquisa de leucócitos nas fezes é menor que 90%. A ausência de leucócitos não
poderá descartar agentes causadores de diarréia inflamatória, mas a presença destes pode diferenciar
dos agentes causadores de diarréia não inflamatória, incluindo microrganismos toxigênicos como
Vibrios, E. coli (ETEC), agentes virais e certos agentes parasitários.
Nos meses de inverno, as crianças com diarréia devem ser triadas primeiro para Rotavirus e, somente
quando o exame for negativo, as amostras fecais devem ser testadas para outros patógenos
bacterianos.
Estudos de vigilância realizados por Laboratórios de Referência, como triagem de fezes para vários
agentes por um período de 3 a 6 meses e a avaliação do impacto destes estudos na taxa de
positividade do exame de fezes, poderão auxiliar na determinação de quais microrganismos deverão
ser incluídos na triagem de rotina pelos laboratórios que atendem a comunidade.
Um outro papel importante que o laboratório desempenha no controle da diarréia de pacientes da
comunidade é na detecção de surtos de fontes comuns. O laboratório deve notificar as autoridades da
Saúde Pública toda vez que houver crescente isolamento de patógenos entéricos. Por exemplo, em
muitas instituições infantis como a creche, o isolamento de mais de um caso de Shigella spp. em
crianças menores de cinco anos de idade, dentro de um período de uma semana, poderá sugerir um
surto de shigelose.
A diarréia de origem hospitalar é descrita na literatura como um episódio que ocorreu após três dias
de internação. Esta definição é razoável quando se reconhece que certos pacientes, serão admitidos
no hospital devido a sintomas de diarréia (especialmente em crianças pequenas) ou pode ter episódio
de diarréia auto-limitada, geralmente induzida por vírus durante ou próximo ao momento da
internação.
Em crianças, o Rotavírus é a causa principal de infecção hospitalar sendo este o único agente para o
qual as fezes de crianças com diarréia desenvolvida no hospital devem ser rotineiramente

Mod - 22
pesquisadas. Em adultos, os estudos têm mostrado que o Clostridium difficile é o único agente
bacteriano confiavelmente detectado em fezes de pacientes com diarréia de origem hospitalar.
Deve-se entender também que alguns pacientes, particularmente os imunocomprometidos e em
destaque os portadores de HIV, podem estar infectados com mais que um agente e que o encontro de
um agente infeccioso não exclui a possibilidade da presença de outros; assim, o exame deve ser
realizado de forma completa.
PRINCIPAIS CAUSAS INFECCIOSAS DE DESINTERIA
Evacuação acompanhada
de tenesmo, sangue, muco
e dor
- Desinteria bacilar: Shigella spp., E. coli (EIEC)
- Campylobacter jejuni
- Desinteria amebiana: Entamoeba histolytica
- Outros protozoários: Balantidium coli, Giardia lamblia
- Parasitas: Schistosoma mansoni, Strongyloides stercoralis, Trichinella spiralis,
Cyclospora spp., Microsporidium spp.
- Vibrio cholerae e Vibrio parahaemolyticus
- Febre tifóide: Salmonella typhi e outras Salmoneloses
- Yersiniose - Yersinia enterocolítica
- Proctite gonorreica, sifilítica, por Chlamydia e herpética
Diarréia
- Intoxicação alimentar por Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium
perfringens, Clostridium botulinum
- E. coli enterotoxigenica (ETEC)
- E. coli enterohemorrágica (EHEC)
- E. coli enteropatogênica (EPEC)
- E. coli entero-agregativa (EaggEC)
- E. coli difusamente aderente (DAEC)
- Enterocolite necrotizante do recém-nascido, enterocolite pseudomembranosa
(Clostridium difficile), diverticulite, tiflite ou enterocolite do neutropênico/
imunossuprimido
- Helicobacter pylori
- Rotavirus
- Norwalk vírus
Nas últimas duas décadas o conhecimento sobre agentes virais, bacterianos e protozoários e os
mecanismos pelos quais a diarréia é produzida (induzida) expandiu-se bastante. Por exemplo:
Retocolite ulcerativa e doença de Crohn.
Diarréia crônica causada por Cryptosporidium spp. e por Isospora spp., reconhecidos como um dos
maiores problemas em pacientes aidéticos
Surtos de diarréia devido à contaminação da rede de água pública com Giardia lamblia.
A detecção do patógenos entéricos bacterianos é complicada pela presença de microflora fecal normal
abundante e complexa. Tal flora aparece logo após o nascimento, envolvendo o intestino grosso
durante o primeiro mês de vida, principalmente em resposta à mudança da dieta alimentar. Por volta
do primeiro aniversário, a microflora intestinal é totalmente estabelecida e permanece durante a vida
inteira, a menos que seja induzida uma grande mudança pela terapia antimicrobiana.
A flora fecal obtida de adulto normal contém entre 1011
-1012
microrganismos por grama de fezes, das
quais 99% são anaeróbios estritos, predominantemente os pertencentes aos gêneros: Bacteroides,
Fusobacterium, Bifidobacterium, Eubacterium e Propionibacterium. Quando comparados com a
microflora fecal facultativa, esta é mais modesta em número e variedade, com 108
- 109
organismos
por grama de fezes.
O desafio para o microbiologista clínico é a tentativa de detectar vários enteropatógenos em meio
incrivelmente complexo. As infecções intestinais ocorrem em função de fatores ligados ao hospedeiro,
como baixa acidez gástrica que reduz significativamente a dose infectante, como sua microbiota,
imunidade, motilidade, etc. E fatores ligados ao agente, destacando-se os fatores de virulência e
inóculo.

Mod - 23
Dose infectante de patógenos intestinais
Shigella 10 – 102
UFC/ml
Campylobacter jejuni 102
– 106
UFC/ml
Salmonella 105
UFC/ml
E. coli 108
UFC/ml
Vibrio cholerae 108
UFC/ml
Giardia lamblia 10 – 102
cistos
Entamoeba histolytica 10 – 102
cistos
Cryptosporidium parvum 1 – 103
oocistos
ESCHERICHIA COLI
As cepas mais importantes com potencial de causar diarréia são: E. coli enterohemorrágica (EHEC) ou
produtora de toxina Shiga, E. coli enterotoxinogênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli
enteroinvasora (EIEC). Outras E. coli produtoras de toxina e outros fatores de virulência, como a E.coli
enteroagregativa (EaggEC) foram descritas, mas de importância clínica ainda não bem definida.
EHEC - E. coli produtoras de toxina Shiga (verocitotoxina) características são a O157:H7, mas mais de
uma centena de outros sorotipos podem produzir esta toxina. A E. coli O157:H7 é a mais bem
estudada e esta relacionada a síndrome hemolítico urêmica, caracterizada por trombocitopenia,
anemia hemolítica einsuficiência renal aguda. Em geral é encontrada em produtos de origem animal
como carne, leite e derivados, mas pode também ser disseminada através de água não clorada,
alimentos, etc. Dose infectante é baixa, por isso pode ser transmitida de pessoa a pessoa. A
sorotipagem é o método de triagem mais comum, existindo antisoro específico para O:157 (simples)
ou teste com partículas de latex, devendo a cepa ser enviada ao laboratório de referência para
confirmação.
ETEC - E. coli produtoras e enterotoxinas LT e ST, não são distinguidas de outras E. coli por métodos
bioquímicos e sua caracterização somente é realizada por laboratórios de referência, o que dificulta
seu diagnóstico. É comum em crianças e uma das causas da diarréia dos viajantes. Raramente
encontrada em surtos.
EPEC - As E. coli enteropatogênicas conhecidas como clássicas, são dezenas de sorotipos de E. coli
não produtoras de enterotoxina e não invasoras, que são causa freqüente de diarréia em crianças em
países em desenvolvimento, podendo ocorrer em surtos hospitalares. O quadro clínico característico é
a diarréia severa, não sanguinolenta, prolongada, associada à má-absorção e desnutrição. O
diagnóstico é realizado por triagem com soros polivalentes contendo anticorpos contra antígenos
somáticos (O) e capsulares (K) específicos para os sorotipos prevalentes. Existem comercialmente
soros monovalentes para caracterização específica. A sorotipagem pode dar resultado falso positivo,
que pode ser reduzido com sorologia para antigenos H ou provas de virulência em Laboratórios de
referência .
EIEC - São E. coli que invadem as células epitelias do cólon, causando síndrome semelhante à
causada pela Shigella com diarréia aquosa, cólica e eventualmente diarréia sanguinolenta. São menos
freqüentemente isoladas que as E. coli anteriormente descritas. Em geral as cepas são lisina
desaminase negativas e imóveis. Existem comercialmente soros polivalentes e monovalentes contra
os sorotipos prevalentes. A duração do período de incubação pode sugerir alguma etiologia específica
principalmente quando há surtos.

Mod - 24
Sintomas associados a patogenia da doença diarréica
Variável Produção de Toxina Invasão Tecidual
Consistência das fezes Aquosa Amolecida
Volume fecal Grande Pequena
Vômito Presente Ausente
Febre Ausente presente
Desidratação Importante Leve
Sintomas após inoculação Poucas horas a 2 dias 1 a 3 dias
Leucócitos nas fezes Negativo presentes
Sangue e muco nas fezes Negativo presentes
Local de infecção Intestino delgado Intestino grosso
A procura do agente etiológico de diarréia, desenteria ou dor abdominal, deve-se contar com a
colaboração importante do médico, dando informações clínicas e se possível a suspeita clínica para
orientar quais os agentes a serem pesquisados. Constituem informações importantes:
Idade do paciente
Principais sintomas: diarréia, presença de sangue, pus ou muco, tenesmo, dor abdominal,
freqüência e volume das evacuações, febre, quadro simultâneo em outras pessoas do convívio.
É imunossuprimido? Diarréia após uso de antibióticos? etc.
Pedido específico quando suspeitar de agentes como cólera e campylobacter.
No exame proto-parasitológico é necessário especificar a pesquisa de Cryptosporidium spp. e
Isospora belli.
ASSOCIAÇÕES ENTRE OS ASPECTOS CLÍNCIOS E OS AGENTES ETIOLÓGICOS
Ingestão de frutos do mar: em especial ostras, induz a pesquisa de Vibrio parahaemolyticus, e
virus Norwalk.
Viagem a países tropicais:
- sem leucócitos nas fezes: E. coli enterotoxinogenica (ETEC), Rotavirus e Norwalk virus, ou
parasitas.
- com leucócitos nas fezes: Shigella spp., Salmonella spp., E. coli (EIEC), Campylobacter jejuni
e Entamoeba histolytica.
Disenteria (muco, sangue e pus, com dor a evacuação): amebíase, shigelose, E. coli (EIEC).
Fezes com sangue, sem leucócitos fecais: deve-se suspeitar de EHEC (O157:H7), pode estar
acompanhada de síndrome hemolítico-urêmica, principalmente em crianças. Existe a possibilidade
de amebíase.
Diarréia sanguinolenta com leucócitos: salmonelose, campilobacteriose, shigelose e E.coli (EIEC).
Diarréia secretória, cujo quadro importante é a desidratação podendo evoluir para o choque e
cujas fezes apresentam aspecto de água de arroz, sugerindo o diagnóstico de cólera.
Diarréia e vômito significativo, em crianças pequenas sugere Rotavirus.
Diarréia crônica ou subaguda, com ou sem flatulência, pode-se direcionar o exame para o
diagnóstico de giardíase. Outras causas de (>10 dias), com perda de peso, lembrar de
ciclosporiase e criptosporidiose. Ou na suspeita de uma síndrome apendicular pode-se sugerir uma
yersiniose.

Mod - 25
Intoxicação com incubação de curta duração, acompanhado de vômito, pode-se sugerir uma
intoxicação de origem alimentar causada por toxina de Staphylococcus aureus ou Bacillus cereus.
Dor abdominal sugerindo apendicite, lembrar de Yersinia enterocolítica.
Diarréia acompanhada de artrite: Yersinia enterocolitica
Em pacientes imunossuprimidos considerar:
- Vírus: Citomegalovirus, Herpes simplex virus, virus Coxsackie, Rotavirus,
- Bactérias: Salmonella spp., complexo Mycobacterium avium
- Parasitas: Cryptosporidium spp., Isospora belli, Strongyloides stercoralis, Entamoeba coli, e
Giardia lamblia.
Em surtos de gastroenterocolite, deve ser considerada a presença dos seguintes patógenos: S.
aureus, B. cereus, C. perfringens, Cryptosporidium spp., ETEC, Vibrio spp., Salmonella spp.,
Campylobacter spp., Shigella spp., EIEC e Cyclospora spp. Na toxi-infecção alimentar, a doença
resulta da ingestão direta de enterotoxinas pré-formadas no alimento contaminado, sendo os
exemplos mais comuns o Staphylococcus aureus enterotoxigênico, B. cereus e C. perfringens.
Gastroenterite viral é a segunda maior causa de doença em países desenvolvidos, após as
infecções virais do trato respiratório; e o Rotavirus é a maior causa de gastroenterite viral em
países desenvolvidos e em desenvolvimento.
Mecanismos de patogenicidade dos principais agentes de diarréia
Produção de Toxina Invasão Adesão
Aeromonas, Bacilus cereus Campylobacter spp. E. coli enteropatogênica
Clostridium difficile, C. perfringens E. coli enteroinvasora E. coli enteroaderente
E. coli enterotoxinogenica ETEC Plesiomonas shigeloides E. coli enterohemorragica
E coli enterohemorrágica EHEC Salmonella spp.
Staphylococcus aureus Shigella spp.
Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus Yersinia enterocolitica
Doenças gastrointestinais de origem alimentar (alimentos e água)
Bactérias
Agente etiológico Início dos
sintomas
Dados clínicos mais comuns Diagnóstico
Bacillus cereus
- toxina de vômito
1-6 h Vômitos, diarréia ocasional;
Comum em surtos de toxi-
infecção alimentar.
Isolamento nas fezes ou no
alimento: 105
UFC/g. Bacillus
cereus (Seletive Medium
Oxoid).
Bacillus cereus
- toxina de diarréia
6-24 h Diarréia e dor abdominal. Idem
Campylobacter 2-5 até 10 d Diarréia geralmente
sanguinolenta, dor abdominal e
febre.
Coprocultura em meio
específico (Karmali).
Clostridium botulinum 2 h a 8 d
média: 12-48h
Disturbios visuais, fraqueza
progressiva, com paralisia
descendente e bilateral. Sem
diarréia.
Pesquisa de toxina no soro,
fezes, coprocultura.
Clostridium perfringens 6-24 h Diarréia, cólicas abdominais. Isolamento nas fezes ou no
alimento > 105
UFC/g.

Mod - 26
E. coli
Enterohemorrágica
(EHEC) O157:H7
1-10 d
média: 4-5 d
6% das crianças com sindrome
hemolítico-urêmica, adultos.
Púrpura trombocitopênica e
insuficiência renal aguda;
diarréia sanguinolenta é
característica , fortes cólicas
abdominais.
Isolamento de E.coli O157:H7
nas fezes e/ou alimento –
(soroaglutinação) CHROmagar
O157.
E. coli
enterotoxinogênica
(ETEC)
6-48 h Diarréia, naúseas, cólicas
abdominais.
Coprocultura para isolamento
e testes p/ enterotoxina
ST/LT.
E. coli enteropatogênica
(EPEC)
Variável Diarréia, febre, cólicas
abdominais.
e sorotipagem.
E. coli enteroinvasora
(EIEC)
Variável Diarréia que pode se
sanguinolenta, febre, cólicas
abdominais.
e sorotipagem.
Listeria monocytogenes
– forma diarréia
9-32 h Diarréia, febre, cólicas
abdominais.
Coprocultura em caldo de
enriquecimento (caldo Fraser,
caldo Listeria-Oxoid) e meio
seletivo (Listeria Seletive
Medium / Oxoid).
Salmonella typhi 3-60 d
média: 7-14 d
Febre, anorexia, indisposição,
cefaléia, mialgia, diarréia e
constipação podem se alternar.
enriquecimento e meios
seletivos; titulos de anticorpos
específicos.
Outras salmoneloses 6-10 d
média: 6-48 h
Diarréia, em geral com febre e
cólicas abdominais.
seletivos Salmonella-Shigella,
Hektoen.
Shigella spp. 12 h a 6 d
média: 2-4 d
Diarréia com tenesmo, muco,
múltiplas evacuações de
pequeno volume, cólicas e febre.
Coprocultura com caldo de
seletivos (Salmonella-
Shigella).
Staphylococcus aureus 30 min. a 8 h
média: 2-4 h
Vômitos e diarréia. Comum em
surtos de toxi-infecção
alimentar.
Coprocultura em meio seletivo
(Baird-Parker, Vogel-Johnson
ou Ágar manitol sal) e
demonstração de toxina.
Vibrio cholerae e outros 1-5 d Diarréia aquosa geralmente
acompanhada de vômitos.
Coprocultura em meio seletivo
(Ágar TCBS) e isolamento de
cepa produtora de toxina.
Vibrio parahaemolyticus 4-30 h Diarréia. Coprocultura em meio TCBS.
Yersinia enterocolitica 1-10 d
média: 4-6 d
Diarréia e dor abdominal
geralmente severa.
Isolamento em meio seletivo
ou Salmonella-Shigella com
incubação em geladeira.
Vírus
sintomas
Rota vírus 15-77 h
média: 1-2 d
Inicio súbito, com vômitos e
diarréia, principalmente em
crianças, ocasionalmente dor
abdominal e sintomas
respiratórios. Surtos
hospitalares.
Testes por aglutinação com
particulas de látex ou Elisa
Imunoensaio (EIA) com
anticorpos poli ou
monoclonais.

Mod - 27
Norwalk (calicivírus ) e
outros enterovírus
15-77 h
média: 1-2 d
Vômitos, cólicas, diarréia e
cefaléia.
Laboratórios de Saúde Pública.
Enviar fezes conservadas a
menos 20o
C.
Parasitas
sintomas
Cryptosporidium parvum 2-28 d
média: 7 d
Diarréia, náusea, vômito e
febre.
Pesquisa com Ziehl modificado
ou imunofluorescência / Elisa.
Cyclospora cayetanensis 1- 11 d
média: 7 d
Fadiga, diarréia insidiosa. Pesquisa nas fezes.
Giardia lamblia 3-25 d
média: 7 d
Diarréia, flatulência, cólicas,
náuseas e fadiga.
Fezes, aspirado duodenal ou
biópsias - pesquisa direta ou
técnica imunológicas.
Uma história de emprego recente de antibioticoterapia prolongada deve ser considerada para
direcionar a pesquisa de toxina de Clostridium difficile como uma das etiologias. Outras
possibilidades são o S. aureus, Candida spp. e P. aeruginosa.
Os antibióticos mais frequentemente associados à diarréia por C. difficile são: cefalosporinas,
ampicilina, amoxicilina, outros derivados de penicilinas, macrolídeos, tetraciclinas e sulfazotrim.
Quando possível selecionar porções de fezes contendo muco, e/ou sangue e/ou pús.
A pesquisa de eosinófilos no muco positiva é sugestiva de diarréia de causa alérgica.
Diarréia por toxina tem curta duração, pesquisa de leucócitos, sangue e presença de muco
negativa. Diagnóstico laboratorial difícil, pois o agente costuma não estar presente.
Para cultura de Campylobacter há necessidade de meio de cultura específico.
Pesquisa de leucócitos e eosinófilos: deve-se enviar fezes frescas para exame (não swab) ou em
meio de transporte.
MEIOS DE TRANSPORTE
Salina glicerinada e tamponada é indicada para Salmonella e Shigella.
Cary Blair é indicado para todos os patógenos bacterianos intestinais, exceto Shigella. No caso do
Clostridium difficile, as fezes devem ser congeladas a menos 20o
C ou submetidas ao teste
rapidamente.
Fezes e aspirados gastrointestinais podem ser transportados sob refrigeração em frascos estéreis,
e biópsias podem ser conservadas com um pouco de salina em frasco estéril. Em geral o meio de
transporte inviabiliza a pesquisa de leucócitos nas fezes, sugestivo de agente invasor.
Materiais inapropriados para processamento: fezes ou material do trato digestivo transportado a
temperatura ambiente sem meio de transporte, swab seco ou sem sinais de fezes, biópsias secas.
Quando não houver informações clínicas ou pedido específico, a rotina recomendada é a pesquisa dos
seguintes agentes:
Salmonella, Shigella, Aeromonas, Plesiomonas, Yersinia: podem ser isolados em Mac Conkey e
Salmonella-Shigella. Recomenda-se também incluir a cultura para Campylobacter, que exige meio
específico. No caso de fezes com sangue, pesquisar EHEC.
Em coprocultura de crianças até 1 ano considera-se rotina a pesquisa de Salmonella, Shigella,
EPEC, (E. coli enteropatogênica), EIEC (E. coli enteroinvasora) e EHEC (E. coli entero-
hemorrágica). Deve-se incluir também a pesquisa de Yersinia enterocolítica, Aeromonas e
Plesiomonas.

Mod - 28
CARACTERÍSTICAS DE ALGUNS MEIOS SÓLIDOS
Ágar Mac Conkey e Ágar Eosin Metilene Blue (EMB) são meios diferenciais, mas não seletivos entre
os Gram negativos entéricos.
O Ágar Salmonella-Shigella funciona bem para para as Salmonella mas pode inibir Shigella.
O Ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) é recomendado para Salmonella e Shigella, mesmo as mais
exigentes.
Ágar Hektoen entérico (HE) é adequado para Salmonella e Shigella
Ágar verde brilhante (VB) é seletivo para Salmonella sp, mas não é indicado para Salmonella typhi
e S. paratyphi.
Ágar sulfito de bismuto (Wilson & Blair) é seletivo para Salmonella.
Caldos de enriquecimento:
Indicado para detectar baixo número de Salmonella ou Campylobacter em portadores. Muitos
laboratórios estão abandonando o uso de caldos de enriquecimento pela baixa recuperação de
patógenos.
Caldo GN (Gram Negativo) - enriquecimento de Salmonella e Shigella spp Caldo Selenito F -
principalmente Salmonella spp Caldo tetrationato - apenas algumas especies de Salmonella spp e
exclui S. typhi.
Campy-tioglicolato - apenas para pesquisa de portadores de C. jejuni Salina fosfatada e tamponada
pH 7,6 - para semear fezes e conservar em geladeira por três semanas para pesquisa de portadores
de Yersinia enterocolitica, mas não indicado para rotina.
RELATÓRIO DE RESULTADOS
Com o reconhecimento do número crescente de agentes bacterianos causadores de diarréia, tornou-se
importante a identificação específica de microrganismos para o qual as amostras fecais são
examinadas.
É incorreto emitir o resultado como “não foram isolados patógenos”, se as fezes foram cultivadas
somente para recuperar alguns patógenos. Ao invés disso o relatório deve afirmar “não foram
isoladas Salmonella, Shigella e Campylobacter” ou para algum outro patógeno efetivamente
pesquisado.
O protocolo deverá prever também laudos relatando a ausência da flora fecal Gram negativa e a
presença de quantidade significativa de microrganismos como S. aureus, leveduras e
Pseudomonas aeruginosa.
Se as amostras fecais ou as cepas isoladas forem enviadas ao Laboratório de Referência para
trabalho posterior, tais como pesquisa da presença de toxina de C. difficile ou sorotipagem de
cepas de Salmonella, o relatório para os referidos exames deve incluir o nome do laboratório de
referência e as provas realizadas (sorotipagem determinação das toxinas, etc.)
Procedimentos Gerais para o Isolamento dos principais Agentes Bacterianos de Infecção
Intestinal
Microrganismo Mecanismo de
Patogenicidade
Técnica Enriquecimento Meios de cultura
Campylobacter, C.
jejuni
Invasão Culturas
incubadas em
ambiente de
microaerofilia
à 42ºC.
não Ágar p/ Campylobacter com
suplementos de antibióticos
como o meio de Skirrow, Campy-
BAP(Blaser), etc.
Escherichia coli
Enteropatogênica,
E. coli Invasora
Enterotoxinas
(LT e ST) -
Invasão
24-48 h
aerobiose, 35-
37o
C.
Não Ágar Mac Conkey ou Ágar eosina
azul de metileno.

Mod - 29
E. coli
enterohemorrágica
O157:H7 e outras
Verotoxinas
(toxina Shiga-
like)
24-48h
aerobiose, 35-
37o
C.
não Ágar diferencial: Ágar Mac
Conkey sorbitol (SMAC) ou Ágar
Mac Conkey
Salmonella spp. Invasão 24-48h
aerobiose, 35-
37o
C.
Selenito F *,
Caldo
tetrationato *,
Caldo GN *.
Ágar Salmonella-Shigella, Mac
Conkey ou Ágar xilose-lisina-
desoxicolato (XLD) ou Ágar
Hektoen enterico (HE)
Vibrio cholerae, V.
parahaemolyticus
Toxina colérica
Toxinas
24-48h
aerobiose, 35-
37o
C.
Água peptonada
alcalina por 6-12
h.
Ágar TCBS, cresce em Mac
Conkey.
Yersinia
enterocolitica
Invasão Salina
glicerinada
tamponada à 4-
5ºC por três
semanas, não
recomendado.
Ágar Salmonella-Shigella, Ágar
Mac Conkey e meio seletivo:
Ágar cefsulodina- irgasan-
novobiocina
* atualmente questiona-se a necessidade do uso de caldos de enriquecimento, ficando a critério de cada usuário.

Mod - 30
5. INFECÇÕES ABDOMINAIS
AGENTES MICROBIANOS MAIS FREQUENTES
Intrabdominais (peritonite pós-trauma de vísceras ocas): Enterobactérias (Escherichia coli,
Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp.), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Enterococcus spp., Anaeróbios (Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp.,
Peptostreptococcus spp., Propionibacterium spp.).
Abscesso intrabdominal: incluindo apendicite, diverticulite. As mesmas bactérias do ítem anterior,
e ainda: Clostridium spp., Eubacterium spp., S. pyogenes e Streptococcus spp.
Peritonite Bacteriana Espontânea Primária: Enterobactérias (2/3), S. pneumoniae (15%),
enterococos (6-10%) e anaeróbios < 1%.
Peritonite associada a diálise peritonial crônica: S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa,
enterobactérias e 20% estéril.
Infecções hepáticas, incluindo abscessos: Streptococcus spp., Escherichia coli, Proteus spp.,
Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Enterococcus spp., Entamoeba
histolytica, Leishmania donovani (kalazar), microsporidiose.
Granuloma hepático: M. tuberculosis, Mycobacterium spp., Brucella spp., Histoplasma capsulatum,
Coxiella burnetii, T. pallidum (sífilis secundária), Echinococcus spp., Schistosoma spp.,
Citomegalovírus, vírus Epstein-Barr. Pacientes da America do Norte ou outros continentes pode-se
incluir a Francisella tularensis e Coccidioides immitis.
Infecções pancreáticas: E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus
spp., Candida spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Trulopsis glabrata, Haemophilus spp.,
Corynebacterium spp., Serratia marcescens.
Abscesso esplênico: os anteriores, e ainda Salmonella spp., Shigella spp., Bacteroides spp.,
Fusobacterium spp., Propionibacterium spp., Clostridium spp., Fusobacterium spp., Aspergillus
spp., Leishmania donovani, microsporidiose.
COLETA E TRANSPORTE DO MATERIAL
Estas amostras são habitualmente colhidas através de procedimentos invasivos: punções,
laparoscopia ou durante ato cirúrgico. Deverão ser observados cuidados de assepsia para que a
amostra coletada não seja contaminada. A secreção ou líquidos (peritoneal, ascítico) serão aspirados
com o auxílio de agulha/seringa estéreis, colocados em frasco com meio de transporte para
anaeróbios facultativos e estritos (caldo de tioglicolato) e encaminhados logo ao laboratório de
microbiologia.
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
No laboratório de microbiologia, estas amostras serão processadas nas seguintes etapas:
Avaliação da qualidade do material encaminhado: identificação adequada, frasco/meio de
transporte correto, volume da amostra suficiente para os testes requeridos, data/horário da
coleta.
Coloração de Gram do esfregaço do material em lâmina: serão observados forma, coloração e
agrupamento dos microrganismos, além da presença de células (leucócitos íntegros ou
degenerados, inclusões bacterianas, etc). Se houver suspeita de microrganismos álcool-ácido
resistentes, preparar também lâminas para coloração de Ziehl Neelsen e auramina, e na suspeita
de fungos, preparação de azul de lactofenol ou de algodão e calcofluor.
Semeadura em meios adequados:
- Meios de cultura para bactérias aeróbias: Ágar sangue, Ágar Mac Conkey - incubar a 35ºC
durante 18 a 24 horas, verificar crescimento bacteriano em ambas as placas; se negativo,
incubar mais 24 hs; se positivo, identificar o(s) microrganismo(s).

Mod - 31
- Ágar chocolate suplementado - incubar a 35ºC em jarra com 5% CO2 durante 18 a 24 horas,
verificando o crescimento bacteriano; se negativo, reincubar; se positivo, proceder a
identificação do microrganismo.
- Meios de cultura para bactérias anaeróbias estritas: Ágar infusão de cérebro coração ou
Brucella Ágar acrescido de vitamina K e hemina - incubar a 35ºC em jarra com gerador de
anaerobiose durante 48 hs; verificar crescimento; se negativo, repicar a amostra do
tioglicolato suplementado com hemina e vitamina K a cada 48 h até completar 7 dias; se
positivo, proceder à identificação da bactéria. Pode-se semear em paralelo em meio seletivo e
enriquecido para anaeróbios como o Ágar sangue com hemácias rompidas, adicionado de
Kanamicina e Vancomicina (LKV) seletivo para Bacteroides e Prevotella.
- Se houver suspeita clínica de micobactérias, semear também em meios especiais (Lowenstein
Jensen ou Middlebrook); aguardar 60 dias para diagnosticar a cultura como negativa.
- Se houver suspeita clínica de fungos, semear também em Ágar Sabouraud glicose; incubar a
temperatura ambiente durante 4 semanas.

Mod - 32
6. INFECÇÕES DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
INTRODUÇÃO
O sistema nervoso central (SNC) compreende o cérebro e a medula, envolvendo ainda meninges,
vasos sanguíneos, nervos cranianos e espinhais.
Principais processos infecciosos que comprometem o SNC
Meningite aguda
Meningite crônica
Encefalite, mielite e neurite
Abscesso cerebral
Empiema subdural, abscesso epidural e flebite intracraniana supurativa
Infecções associadas a procedimentos invasivos e dispositivos implantados no SNC
Natureza dos processos infecciosos do SNC
Bactérias
Vírus
Fungos
Protozoários
Via de acesso dos agentes infecciosos ao SNC
Via hematogênica (principal)
Via direta, através de trauma e procedimentos invasivos (cirúrgicos)
Por contiguidade (rinofaringe, mediastino posterior, espaço retroperitonial, etc.)
Ascensão de vírus por nervos periféricos
Principais causas de meningite aguda infecciosa
Bacteriana: bacterioscopia positiva (Gram), cultura e/ou pesquisa de antígenos positiva. S.
pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, Enterobactérias, Streptococcus agalactiae (grupo B),
Listeria monocytogenes, Staphylococcus spp., M. tuberculosis
Meningite por outros agentes ou não determinada
Foco supurativo para-meníngeo (abscesso cerebral, sinusite paranasal, empiema subdural,
abscesso epidural, etc.)
Espiroquetas: T. pallidum, Borrelia burgdorferi (doença de Lyme, Leptospira spp.)
Rickettsias
Protozoários: Naegleria fowleri, Strongiloides stercoralis
Vírus: Echovirus e Coxackievirus, Sarampo, Arbovírus, Herpesvírus, Coriomeningite linfocítica,
HIV, Adenovírus, Poliovírus
Fungos: Cryptococcus spp., Candida spp., Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp. e outros
fungos filamentososos oportunistas
Pneumocistis carinii e Paracoccidioides brasiliensis
Causas mais frequentes de meningite infecciosa crônica
Meninges Lesões Focais Encefalite
tuberculose
cryptococose
histoplasmose
candidíase
sífilis
brucelose
actinomicose
blastomicose
cisticercose
aspergilose
nocardiose
esquistossomose
toxoplasmose
citomegalovírus
enterovírus
sarampo
outras encefalites a
vírus

Mod - 33
Causas mais frequentes de encefalomielite
Vírus (a mais importante) Enterovírus e herpes-virus
Riquetsias Doença de Lyme
Bacteriana Mycoplasma spp., brucelose, listeriose e erlichiose,
endocardite bacteriana subaguda, sífilis e leptospirose,
tuberculose, Nocardia e Actinomicose
Fúngica Criptococose, histoplasmose, Pneumocystis carinii
Amebas Naegleria e Acanthamoeba
Protozoários Toxoplasma, plasmodium, tripanosomíase
Outras Doença de Behçet, Doença da arranhadura do gato
Principais agentes etiológicos do Abscesso Cerebral
Streptococcus spp. (viridans) 60-70%
Bacteroides spp. 20-40%
Enterobactérias 23-33%
Staphylococcus aureus 10-15%
Fungos 10-15%
S. pneumoniae <1%
H. influenzae <1%
Nocardia spp., Listeria spp. <1%
Protozoários e helmintos <1%
Em populações de pacientes imunocomprometidos e distribuições regionais podem evidenciar
predomínio diferente dos seguintes agentes etiológicos:
Bactérias: M. tuberculosis e Nocardia spp.
Fungos: Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus spp. e outros fungos oportunistas
Parasitas: estrongiloidíase, Entamoeba histolytica, cisticercose e toxoplasmose
DADOS EPIDEMIOLÓGICOS E ETIOLOGIA DE PROCESSOS INFECCIOSOS DO SNC
Idade
0 a 4 semanas - E. coli, S. agalactiae (grupo B), L. monocytogenes, Klebsiella pneumoniae,
Enterococcus spp. e Herpes simplex virus 2
4-12 semanas - S. agalactiae, E. coli, L. monocytogenes, H. influenzae
3 meses a 10 anos - vírus, pneumococo, H. influenzae e meningococo, enterovirus, herpes vírus 1.
Adulto jovem - vírus e meningococo
Adulto - pneumococo e meningococo
Idosos - pneumococo, Gram negativos, Listeria monocytogenes.
INFECÇÃO HOSPITALAR
Enterobactérias, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Candida spp., Staphylococcus spp.

Mod - 34
OUTROS DADOS EPIDEMIOLÓGICOS
Surtos epidêmicos Meningococo, vírus, especialmente enterovirus
Nadar em lagoas Amebas (protozoários), Aeromonas spp.
Contato com hamster, ratos e
animais silvestres
Coriomeningite linfocítica, Pasteurella spp.
Inundações Leptospirose
Contato com pombos, cavernas Criptococose, histoplasmose
Prisão, AIDS Tuberculose
Meningite recurrente Pneumococo
Infecção do trato respiratório
superior
Vírus, hemófilos, pneumococo, meningococo
Associado à pneumonia comunitária Pneumococo, hemófilos
Associado à sinusite e otite Pneumococo, Haemophilus, anaeróbios
Associado à celulite Streptococcus spp., Staphylococcus spp.
Abscesso cerebral Anaeróbios (Actinomyces spp. e outros), Nocardia spp.
Trauma craniano Fechado - pneumococo, Gram negativos
Aberto - Gram negativos, Staphylococcus spp.
Fístula liquórica
(otorréia ou rinorréia)
Pneumococo, Gram negativos, Staphylococcus spp., Haemophilus
influenzae
Diabetes Pneumococo, Gram negativos, Staphylococcus spp., Cryptococcus
spp.
Alcoolismo e esplenectomia Pneumococo
Endocardite bacteriana Streptococcus spp. e outros Gram positivos
Petéquias e rash cutâneo Meningococo, sarampo, echovírus, leptospirose
Prótese em SNC S. Epidermidis, S. aureus e outros gram positivos, Acinetobacter
spp., Pseudomonas spp., enterobactérias
Leucemia, linfoma, corticoterapia Pneumococo, Gram negativos, Cryptococcus spp., M. tuberculosis
AIDS e imunossupressão severa
(transplantes)
Cryptococcus spp., M. tuberculosis, Aspergillus spp. e outros fungos
filamentosos, Pneumocistis carinii
Fatores Predisponentes e Etiologia de Abscesso Cerebral
Otite média e mastoidite Estreptococos aeróbios e anaeróbios, Bacteroides fragilis,
Enterobacterias
Sinusite frontoetmoidal e sinusite esfenoidal Streptococcus spp., Bacteroides spp., Enterobactérias, S.
aureus, Haemophilus spp.
Sepse dental Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Streptococcus spp.
Trauma craniano penetrante infecção pós-
cirurgica
Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterobactérias,
Clostridium spp
Doença cardíaca congênita Streptococcus spp., H. influenzae

Mod - 35
Abscesso pulmonar, empiema e
bronquiectasia
Fusobacterium spp., Actinomyces spp., Bacteroides spp.,
Streptococcus spp, Nocardia spp
Endocardite bacteriana Staphylococcus aureus, Streptoccoccus spp.
Paciente imunocomprometido Toxoplasma gondii, Fungos, Enterobactérias, Nocardia spp.
DADOS LABORATORIAIS RELEVANTES
Gram do sedimento pode revelar a etiologia: bacteriana, fúngica (fungos leveduriformes ou
filamentosos), tendo uma sensibilidade de 60 a 90% e especificidade próxima de 100% quando
realizada por profissionais bem treinados.
A positividade depende da concentração bacteriana, variando de 25% quando a concentração de
UFC (unidades formadoras de colonias) for 103
ou menos, até 97% quando a concentração for
igual ou superior a 105
UFC.
A positividade do Gram também varia conforme o agente etiológico, sendo de 90% para o
pneumococo, 86% para o hemófilos, 75% para o meningococo, menos de 50% para Listeria
monocytogenes e 50% para outros Gram negativos. A coloração de Gram não cora bactérias como
os micoplasmas e, evidentemente, não detecta os vírus.
Chances de se obter informações sobre a etiologia pelo Gram ou pela cultura se reduzem a menos
de 50% quando há uso prévio de antimicrobianos, podendo o LCR ficar estéril em 90-100% dos
casos após 24 a 36 horas de antibioticoterapia adequada.
Tinta da china e calcofluor: detecta Cryptococcus ou presença de movimentos amebóides
(amebas)
Coloração de Ziehl Neelsen e auramina: micobactérias
Aglutinação com partículas de látex (sensibilidade de 70 a 90%): existem testes disponíveis para
detectar meningococo (A e C), hemófilos tipo B, pneumococo (polivalente), Streptococcus do
grupo B, E. coli K1 e Cryptococcus spp. Alguns kits não incluem o meningococo B ou podem ter
uma sensibilidade inferior para este antígeno. Existem também testes baseados em coaglutinação
de Staphylococcus, que tem uma sensibilidade um pouco inferior à aglutinação pelo látex. Estes
testes vem sendo cada vez menos utilizados pelo elevado custo.
Teste do Limulus pode ser utilizado para detectar endotoxina de bactérias Gram negativas, tendo
alta sensibilidade e especificidade para concentrações ≥ 103
UFC/ml.
Cultura em Ágar chocolate pode confirmar a etiologia bacteriana e permitir o estudo das
sensibilidades aos antimicrobianos.
Os vírus podem ser pesquisados por métodos diretos ou cultura para vírus com tipagem. A
pesquisa monoclonal e o PCR representam os métodos de maior praticidade, especificidade e
sensibildade que se dispõe na atualidade.
PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS - LCR
Devido à importância vital do SNC, e, portanto, a gravidade do quadro clínico que acompanha a
maioria das doenças e a urgência do diagnóstico em uma área topográfica estéril, a eficiência é um
aspecto crítico (rapidez, testes adequados e cuidados para evitar contaminação). Obter qualquer
amostra antes de iniciar uso de antimicrobianos.
LCR deve ter máxima prioridade devendo ser processado imediatamente. Avalie e anote o volume e o
aspecto do LCR.
LCR por punção lombar ou de reservatório de próteses (vide técnica para coleta de LCR)
Coletar o segundo tubo, obtendo idealmente os seguintes volumes:
- 1-2 ml para Gram, pesquisa de antígenos e cultura (na falta de plantão de microbiologia pode ser
semeda a cultura [5 a 10 gotas] diretamente durante a punção para coleta do LCR, em tubos de
ágar chocolate, previamente aquecidos a 35o
C, preparados há menos de 30 dias); pode-se semear

Mod - 36
um tubo com ágar sangue (base Mueller Hinton ou Ágar brucella) e um tubo com caldo tioglicolato
caso haja suspeita de anaeróbios
- 2 ml para exame direto e cultura para fungos (se indicado)
- 2 ml para coloração de Ziehl e cultura para micobactérias (se indicado)
- 2-3 ml para provas virológicas (se indicado)
Exame da cultura
Durante 72 horas observe diariamente a presença de crescimento nas placas e tubos com ágar
chocolate. Pode-se prolongar a incubação para o total de sete dias.
No tubo com caldo deve ser observada turvação diariamente e descartado após 7 dias. Caso haja
crescimento, fazer um Gram e semear em placa de ágar chocolate para isolamento, identificação e
antibiograma.
Em casos de hemófilos e neisserias fazer o teste da beta-lactamase com discos de nitrocefina
(Cefinase)
Se positivo, comunicar o médico imediatamente.
Em caso de pneumococos, testar a penicilina usando discos de oxacilina 1 micrograma. Se halo
para oxacilina ≥ 20mm, a cepa é sensível à penicilina. Halo ≤ 19 mm encaminhar a cepa a um
Laboratório de Referência ou fazer teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM), podendo ser
usado o E-test:
- Penicilina ≤ 0,06 microgramos/ml = cepa sensível
- Penicilina 0,12 a 1 microgramos/ml = cepa de sensibilidade intermediaria.
- Penicilina ≥ 2,0 microgramos/ml = cepa resistente
Interpretação do exame
Contagem de glóbulos brancos = > 1.200 mm3
sugere meningite bacteriana (valores menores não
excluem).
Predomínio de mononucleares (< 50% de neutrófilos) sugere meninigite não bacteriana ou
parcialmente tratada.
Glicose < 30 mg/100 ml sugere meningite bacteriana, por micobactéria ou fúngica.
Proteínas >150 mg/100 ml sugere meningite bacteriana.
Cloretos < 110 mEq/L sugere meningite por tuberculose se afastada outra etiologia bacteriana.
Atualmente pouco utilizado devido a disponiblidade de testes mais específicos.
Lactato no LCR > 35 mg/100 ml é sugestivo de meningite bacteriana.
PESQUISA DE ANTÍGENOS
Pode detectar a presença de microrganismos, mesmo na vigência de antibioticoterapia. Os testes
detectam polissacárides em suspensão, por isso deve-se usar o sobrenadante. Alguns testes solicitam
prévia colocação da amostra para teste em banho-maria (fervente) por 5 minutos. Consulte e siga as
orientações do produto adquirido.
Colocar as gotas de látex no cartão, orientando-se conforme a indicação de cada teste.
A seguir depositar uma gota do sobrenadante do LCR ao lado da gota de latex.
Usar um bastão ou alça flambada para cada teste.
Observar a aglutinação conforme padrão e no tempo descrito por cada fabricante.
Aglutinações que ocorrerem com mais de um anticorpo devem ser relatadas como indeterminadas ou
não interpretável. Pode-se tentar diluir o LCR em salina 1:2 ou 1:4. Repetir os testes e observar os
resultados.
Rotina de Plantão
Se não for possível encaminhar ao Laboratório de Microbiologia (plantão de fim de semana) ou porque
sua rotina é lenta, o LCR deve ser processado pelo laboratório de urgência (plantão) ou por médicos
ou analistas treinados para os seguintes procedimentos:
Colher 5 a 10 gotas do LCR diretamente da punção em 1 tubo de Ágar chocolate de preparação
recente e previamente aquecido a 35o
C ou:

Mod - 37
Centrifugar 1 a 2mL do LCR entre 2.500 a 3.000 rpm, por 15 minutos.
Cuidadosamente, flambar a boca do tubo e em condições assépticas (fluxo laminar ou atrás de um
bico de Bunsen), e, para os testes de aglutinação aspirar 0,5 a 1mL do sobrenadante com ponteira
estéril (ou pipeta plástica estéril ou pipeta Pasteur com ponta fina de vidro, conectada a um bulbo
de borracha ou pêra de aspiração). Deixar 0,5 a 1mL para cultura e Gram. Flambar novamente.
Agitar no vortex o tubo com o resto do sobrenadante e sedimento. Em condições assépticas (vide
acima), semear 3-4 gotas do material em placa de ágar-chocolate e, se disponível, também em
placa de ágar-sangue e em tubo com caldo tioglicolato sem indicador.
Colocar as placas e tubo na estufa entre 35 a 37o
C, sendo a placa de Ágar chocolate em jarra com
vela e umidade (CO2 e umidade).
Depositar 1 gota do material no centro de uma lâmina de vidro previamente desengordurada em
álcool, para fazer o esfregaço.
- no caso de amostras límpidas, pode-se depositar duas gotas e fazer esfregaço menos extenso,
quando mais purulento, fazer esfregaço mais espalhado.
- deixar secar e fixar rapidamente no calor
- fazer a coloração de Gram e anotar o resultado
PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS – ABCESSO CEREBRAL
Abscesso Cerebral (vide técnica para coleta de material)
Obter o material por punção e aspiração, mantendo-o na seringa para ser enviado ao laboratório.
Como a participação de anaeróbios é importante, o material deve ser colhido em frascos com
vácuo ou na própria seringa.
Manipular material de SNC com luvas, evitar aerossol e encaminhar o mais rápido possível ao
laboratório. Amostras para virologia devem ser encaminhadas ao laboratório rapidamente à
temperatura ambiente. As pesquisas monoclonais de vírus exigem que as células estejam íntegras.
Apenas material para investigações futuras e pesquisas por métodos moleculares de agentes RNA
deve ser obrigatoriamente conservado entre -20 a -70o
C.
Amostras de aspirado de abscesso e de material obtido em cirurgia ou em necropsia:
Semear em placa de ágar chocolate e incubar em jarra com vela a 35o
C.
Semear em placa com ágar brucella e suplementos hemina e vitamina K para cultura de
anaeróbios em jarra apropriada com gerador de anaerobiose a 35o
C.
Semear em placa de ágar sangue em estufa a 35o
C.
Semear em tubo de caldo tioglicolato a 35o
C.
Fazer esfregaço, fixar e corar pelo Gram. Reservar o resto do material.
Caso o Gram revele:
- diplococos Gram negativos: sugestivo de Neisseria spp.
- cocos Gram positivos em cachos agrupados: Staphylococcus aureus (ou coagulase neg.)
- cocos Gram positivos em cadeias longas ou aos pares: Streptococcus (S. pneumoniae ou
outros estreptococos aeróbios ou anaeróbios)
- bacilos Gram positivos: Listeria spp., Corynebacterium spp. (contaminante ou em derivações),
esporulados (Bacillus ou Clostridium).
- suspeita de bacilo da tuberculose: fazer coloração de Ziehl-Neelsen ou auramina e se
confirmado, semear em Lowenstein Jensen ou outro meio especifico.
- ramificados: Actinomyces ou Nocardia (fazer Ziehl Neelsen)
- cocobacilo Gram negativo: hemófilos, Brucella, Pasteurella sp, etc.
- Acinetobacter spp. (Infecção Hospitalar (IH) em derivações e próteses do SNC)
- bacilo Gram negativo: enterobactérias, Pseudomonas spp. (IH)
- Fungos: leveduriformes ou dimórficos.
Candida - exame direto com Lactofenol e semear em ágar Sabouraud dextrose (ASD)
Cryptococcus spp. - tinta da china para melhor caracterização; semear em BHI ágar
Histoplasma capsulatum - semear em BHI, ágar glutamina
Filamentosos e oportunistas em geral - semear em ASD

Mod - 38
7. INFECÇÕES SISTÊMICAS
INTRODUÇÃO
A presença de microrganismos viáveis no sangue do paciente pode levar a um considerável aumento
da morbidade e da mortalidade. Devemos também lembrar que este fato representa uma das mais
importantes complicações do processo infeccioso, o que torna a hemocultura um exame de
significativo valor preditivo de infecção.
A maioria dos episódios sépticos é de origem hospitalar e, às vezes, resultado de microrganismos que
apresentam grande resistência aos antimicrobianos, com uma mortalidade bem superior aos episódios
que ocorrem na comunidade.
A invasão do sangue por microrganismos geralmente ocorre por um dos seguintes mecanismos:
1. Penetração a partir de um foco primário de infecção, através de vasos linfáticos e daí até o
sangue.
2. Entrada direta na corrente sanguínea, via agulhas ou outros dispositivos vasculares, como
catéteres.
A presença de bacteremia ou fungemia representa também uma falha nas defesas do hospedeiro em
localizar e neutralizar uma determinada infecção em seu foco inicial, ou também numa eventual falha
médica em remover ou drenar um foco infeccioso. Geralmente, num paciente imunocompetente, as
defesas naturais respondem prontamente à presença de microrganismos estranhos. Esta eliminação
pode ser menos eficiente quando os microrganismos são encapsulados, ou mais eficiente quando o
paciente já apresenta anticorpos contra o organismo infectante. Existem também situações em que
esta eliminação não é eficaz, como nos casos de infecções com focos intravasculares ou em
endocardites.
Conceitualmente, ainda se classificam as bacteremias em transitória, intermitentes ou contínuas. A do
tipo transitória, que em geral é rápida com duração de alguns minutos a poucas horas, é a mais
comum e ocorre após uma manipulação de algum tecido infectado (abscessos e furúnculos), durante
algum procedimento cirúrgico que envolve algum tecido contaminado ou colonizado (cavidade oral,
cistoscopia, endoscopia) ou ocorre em algumas infecções agudas como pneumonia, meningite, artrite
e osteomielite. Quando a bacteremia se manifesta, com intervalos variáveis de tempo (com o mesmo
microrganismo) é denominada de intermitente. Geralmente este tipo de bacteremia ocorre em
processos infecciosos relacionados a abscessos intra-abdominais, pneumonias e outras. A bacteremia
contínua é característica da endocardite infecciosa e de outras infecções intravasculares.
As bacteremias na grande maioria das vezes são causadas por um único microrganismo, porém em
algumas situações são de etiologia polimicrobiana.
Embora qualquer infecção localizada possa se disseminar para o sangue, a bacteremia e/ou fungemia
geralmente são mais freqüentemente devidas à dispositivos intra-vasculares (catéteres), infecções
abdominais, infecções dos tratos respiratório e urinário. Bacteremia e fungemia são termos que
simplesmente identificam a presença de bactérias ou fungos no sangue. Sepse é a presença de
sintomas clínicos de infecção na presença ou não de hemocultura positiva.
FATORES DE RISCO PARA BACTEREMIA E FUNGEMIA
As condições que predispõem um paciente ao quadro de bacteremia ou fungemia, incluem a idade,
doenças de base, medicamentos (corticóides, quimioterápicos, drogas citotóxicas) e alguns
procedimentos médicos invasivos (catéteres, procedimentos endoscópicos). Há maior risco nas faixas
etárias extremas e os pacientes com doenças hematológicas, portadores de neoplasias, diabetes
mellitus, insuficiência renal em uso de diálise, cirrose hepática, imunodepressão e queimaduras são os
mais predispostos. Alguns procedimentos cirúrgicos são também predisponentes, particularmente os
do trato geniturinário e gastrointestinal.
MICRORGANISMOS FREQÜENTEMENTE ENVOLVIDOS

Mod - 39
Destacam-se as prevalências de S. aureus e de E. coli, sendo que na última década nota-se um
significativo aumento na incidência de casos devidos a estafilococos coagulase negativos, o que pode
causar dificuldade na interpretação dos resultados microbiológicos, pois cerca de 85% destes
isolamentos podem representar contaminação ao invés de uma bacteremia verdadeira.
Entre os agentes que na última década se tornaram prevalentes, destacam-se os enterococos, os
fungos e as micobactérias relacionadas aos pacientes portadores do HIV. As bacteremias causadas por
bactérias anaeróbias são muito raras. Em crianças, o perfil de microrganismos assemelha-se ao da
população adulta (os microrganismos são similares aos que ocorrem na população adulta), mas há
uma maior prevalência de bacteremias por estafilococos, e , principalmente, por S. pneumoniae,
meningococos e hemófilos.
A identificação do microrganismo isolado fornece um valor preditivo importante.
Alguns microrganismos em cerca de 90% dos casos sugerem uma infecção verdadeira como S.
aureus, E. coli e outras enterobactérias, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae e Candida
albicans.
Outros agentes como Corynebacterium spp., Bacillus spp. e Propionibacterium acnes, raramente
representam uma verdadeira bacteremia (menos de 5% dos casos são verdadeiros).
Os S. viridans, Enterococos e Staphylococcus coagulase negativos representam em média
respectivamente 38%, 78% e 15% de bacteremias verdadeiras.
Considera-se aceitável um percentual entre 3 a 5% de hemoculturas contaminadas.
Patógenos raros relacionados à imunossupressão causada por câncer ou leucemia
Aeromonas hydrophila
Bacillus spp.
Campylobacter spp.
Capnocytophaga spp.
C. septicum
Corynebacterium jeikeium
L. monocytogenes
Mycobacterium fortuitum/chelonei
Rhodococcus equii
S. typhimurium
Streptococcus do grupo G
Streptococcus bovis
DIAGNÓSTICO EM HEMOCULTURAS
NÚMERO DE AMOSTRAS
Recomenda-se colher duas a três amostras por episódio de bacteremia ou sepse, que permite o
isolamento do agente bacteriano ou fúngico em 95% dos eventos. Duas ou três amostras também
representam volume de sangue adequado para o isolamento, também permitem interpretar pelo
número de amostras positivas o provável contaminante do isolamento do agente etiológico. Um
número maior de amostras traz pouco benefício, aumentando o custo, trabalho e depletando o
paciente.
PROCEDIMENTOS E INTERVALO DE COLETA
As amostras são coletadas por punção venosa, uma após a outra em locais diferentes, logo que inicie
o pico febril ou a bacteremia. Preferencialmente não colher de cateter, exceto para diagnóstico de
infecção ou colonização do cateter; colher uma a duas amostras periféricas e uma de cateter. Para
adultos em cada punção coleta-se 8 a 10 ml de sangue em frascos para aeróbios ou opcionalmente a
segunda ou terceira coleta em frasco para anaeróbios.
VOLUME DE SANGUE
É uma das variáveis mais críticas para a positividade do exame. Quanto maior o volume coletado,
maior será a positividade do mesmo. Temos que respeitar a idade do paciente (adulto ou criança) e o
volume recomendado de acordo com os tipos de frascos aeróbios e anaeróbios utilizados na realização
dos exames.
O volume recomendado para coleta de cada punção de adulto é de 20 a 30 ml, distribuídos pelo
número de frascos indicados pela sua capacidade e respeitando a proporção de 1 ml de sangue para
cada 10 ml ou no mínimo 5 ml de caldo.

Mod - 40
Como as bacteremias em crianças tem cerca de 100 a 1000 bactérias/ml em comparação com < 1 a
10 bactérias/ml nos adultos, o volume pode ser menor (3 a 5ml), respeitando-se também a proporção
de no mínimo 1:5 até 1:10 de sangue e meio de cultura ou orientação do fabricante.
PROCEDIMENTOS POR METODOLOGIAS MANUAIS
Embora amplamente utilizada por razões de custos, não é a metodologia mais indicada, por ser
mais trabalhosa, além de favorecer a possibilidade de contaminação das amostras examinadas.
Além do frasco contendo caldo BHI ou peptona de soja, o meio manual mais interessante inclui
uma fase líquida e outra sólida, como o meio de Castañeda, permitindo a observação de
crescimento na superfície do ágar.
Um mínimo de sete dias de incubação e agitação moderada dos frascos são fatores importantes
para uma maior positividade das amostras; pelo menos três subcultivos enriquecidos em ágar
chocolate devem ser realizados durante este prazo. Tanto os frascos de hemocultura como os
subcultivos, devem ser mantidos à temperatura de 36 a 37o
C.
O primeiro subcultivo pode ser feito após 24 horas de incubação, o segundo após 72 horas e o
terceiro após uma semana.
A grande maioria dos microrganismos é isolada nas primeiras 72 horas após a coleta do sangue.
Em suspeitas diagnósticas de microrganismos de crescimento mais lento, períodos mais
prolongados de incubação devem ser indicados. Comumente incuba-se à temperatura entre 35 a
37o
C.
A observação dos frascos pode ser feita diariamente, procurando-se evidências macroscópicas de
crescimento de microrganismos como: hemólise, turbidez, produção de gás, bolhas, película de
crescimento, grumos, etc.
SISTEMAS AUTOMATIZADOS DE HEMOCULTURA
No intuito de se processar as hemoculturas de um modo mais eficiente, nos últimos anos alguns
sistemas automatizados para a execução destes exames foram desenvolvidos.
O primeiro sistema comercial automatizado foi o Bactec modelo 460, que usa metodologia
radiométrica (Becton Dickinson Microbiology Systems). Esta metodologia detectava o crescimento
microbiano através da monitorização da concentração de CO2 marcado com carbono 14 presente no
frasco, medindo a liberação na atmosfera dos frascos devido ao metabolismo microbiano. O aparelho
registrava um valor através da sua medição por um contador de radiação beta e anotava esse valor
por um número conhecido como índice de crescimento. Atualmente essa metodologia está em uso
praticamente somente para a detecção de micobactérias e também para realização de testes de
avaliação de sensibilidade aos tuberculostáticos.
Atualmente existem no mercado diversos outros aparelhos automatizados para a realização de
hemoculturas que apresentam grande vantagem em relação às metodologias manuais, principalmente
no que se refere à rapidez dos resultados e diminuição do trabalho técnico. Geralmente os protocolos
são de cinco dias, mas a grande maioria dos resultados positivos ocorre nas primeiras 48 horas. As
metodologias utilizadas pelos novos aparelhos automatizados (Bactec 9120/9240, BacT/Alert 120/240,
ESP 128/256/384 e Vital 200/300/400) são baseadas em métodos colorimétricos, fluorescentes ou de
pressão.
Sistema Isolator ou lise centrifugação (Wampole Laboratories, Cranbury, NJ) é um tubo especial que
contém saponina como agente lisante para células brancas e vermelhas, propilenoglicol com
substância anti-espuma, polianetol sulfonato de sódio (SPS) e EDTA como anticoagulantes, e um
líquido fluoroquímico inerte para concentar os microrganismos durante a centrifugação. Para
realização da técnica é necessária uma observação criteriosa dos procedimentos técnicos
recomendados pelo fabricante, utilizando para isso os reagentes, o material e o equipamento
apropriado (incluindo centrífuga especial). Indicado para cultivo de fungos dimórficos, leveduras e
outras bactérias incluindo fastidiosas.
Inúmeros trabalhos mostram as vantagens destas metodologias e a opção da escolha do equipamento
em geral é mais relacionada ao custo do equipamento e/ou de seus frascos de consumo. Algumas
vantagens dessa metodologia são:
Maior rapidez para positividade da amostra (agitação)
Continuo monitoramento da amostra pelos sistemas totalmente automatizados
Menor risco de contaminação laboratorial, pois só faz-se repique das amostras positivas

Mod - 41
Não é necessário repicar amostra negativa
Economia de tempo, material (agulha e seringa) e menor risco de manipulação.
A principal desvantagem é o maior custo.
MEIOS DE CULTURA
Atualmente os laboratórios que ainda utilizam metodologias manuais, em sua grande maioria utilizam
meios de cultura comerciais, aeróbios e anaeróbios, para a realização de hemoculturas. Trata-se
geralmente de caldo infusão cerebro-coração (BHI) ou caldo caseína digerida da soja, para aeróbios e
facultativos e leveduras e caldo Columbia para anaeróbios que devem favorecer o crescimento da
maioria dos microrganismos, inclusive dos considerados fastidiosos.
A maioria destes meios tem na sua composição o anticoagulante SPS (0,025 a 0,05%), o qual
apresenta ação inibidora para lisozimas, apresenta certa ação inibitória frente a determinadas
concentrações de aminoglicosídeos e polimixinas, pode ter ação inibitória para algumas frações do
complemento e inibe parcialmente a fagocitose. Por outro lado este anticoagulante pode apresentar
certa ação inibidora para o isolamento de determinados microrganismos, como por exemplo, N.
meningitidis, N. gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Peptostreptococcus spp., Moraxella catarrhalis e
outros. Daí a recomendação de se acrescentar gelatina na concentração de 1,2% na composição
destes meios para inibir parcialmente o efeito nocivo do SPS quando há suspeita de um dos agentes
acima citados.
Para os laboratórios que dispõe de metodologias automatizadas, há possibilidade do uso de meios de
cultura com resinas que apresentam ação inibitória para antimicrobianos, útil pacientes que
receberam antibioticoterapia prévia.
Os frascos aeróbios devem manter área suficiente de volume de ar para permitir crescimento de
bactérias aeróbias estritas como Pseudomonas aeruginosa e leveduras, enquanto os frascos para
anaeróbios estritos devem ter uma mistura de gases livres de oxigênio, evitando-se a introdução de ar
durante a coleta. Agitação do meio é um fator importante para facilitar a multiplicação bacteriana,
principalmente dos aeróbios estritos e facultativos.
Não há evidencias que indiquem o uso rotineiro de frascos de hemocultura para anaeróbios,
associados aos frascos para aeróbios, exceto se este for o objetivo principal ou em patologias
freqüentemente associadas aos anaeróbios como processos infecciosos pélvicos, sepse de origem
abdominal, etc. Em geral os meios para aeróbios suportam o crescimento dos anaeróbios mais
comuns e a incubação não necessita ser superior a 7 dias.
Para fungos filamentosos a temperatura melhor é entre 27 a 30o
C, podendo crescer também à 37o
C.
Para leveduras 5 a 7 dias à 35o
C pode ser suficiente, enquanto que para fungos dimórficos
(Histoplasma, Paracoccidioides) pode ser necessário 4 a 6 semanas, sendo o caldo BHI o melhor.
Pacientes com infecção avançada pelo HIV tem risco elevado de infecções por M. tuberculosis e pelo
complexo Mycobacterium avium, podendo também apresentar bacteremia, bem como outros
imunossuprimidos. A inoculação do sangue concentrado pode ser feita em Ágar Lowenstein-Jensen ou
Middlebrook 7H11 ou usar os frascos específicos para Mycobacterium de sistemas automatizados
como Bactec. A concentração pode ser feita pelo sistema Isolator (lise-centrifugação).
INFECÇÃO RELACIONADA A CATETER VASCULAR
Cateteres intravenosos são importantes fontes de bacteremia e fungemia, assim como complicações
infecciosas no local da inserção. Quando existe suspeita de infecção relacionada ao cateter, as
secreções do local de inserção e a ponta do cateter podem ser cultivadas.
CULTURA SEMI-QUANTITATIVA DA SUPERFÍCIE DO CATETER (MÉTODO DE MAKI)
É o método mais utilizado para determinar a relação entre colonização do cateter e infecção. Os
mesmos cuidados de inserção devem ser adotados na retirada do cateter. A pele em volta deve ser
cuidadosamente desinfetada com solução de iodo ou PVPI, e o excesso removido com alcool a 70%.
Um segmento distal (que estava inserido na veia do paciente), de aproximadamente 5 cm do cateter é
assepticamente cortado com auxílio de tesoura estéril, colocado em um frasco estéril seco, e remetido
em um prazo mínimo ao laboratório. O segmento do cateter é rolado (evitar esfregar) 4 a 5 vezes
sobre a superfície de uma placa de ágar sangue, com auxílio de uma pinça estéril. Após incubação

Mod - 42
durante 18-24 horas à 37o
C, é realizada uma análise quantitativa e a detecção de 15 ou mais colônias
é correlacionada com o fato do cateter constituir a fonte de infecção. Técnicas quantitativas pareadas
ou não com hemocultura periférica são mais específicas que as técnicas semi-quantitativas.
TÉCNICAS QUANTITATIVAS
Segmento de cateter (lumen e/ou superfície externa)
Cultura do lumen: o lumen do cateter pode ser cultivado injetando-se salina no seu interior com
uma agulha.
Cultura da superfície externa: agita-se no mixer o segmento do cateter em salina. Faz-se cultura
quantitativa (semea-se 100 µl do lavado em Ágar sangue). É considerado significativo quando a
contagem for ≥ 102
UFC pelo segmento de cateter analisado.
AMOSTRAS PAREADAS DE SANGUE
Para diagnóstico de infecção relacionada a cateter (IRC), colher amostras pareadas: periférica e
cateter. Utilizam-se volumes iguais de sangue colhido das duas vias e semeia-se pela técnica do pour
plate. O exame quantitativo significativo para infecção do cateter deve revelar de 5 a 10x mais
bactérias por ml no sangue obtido do cateter do que na amostra periférica.

Mod - 43
8. INFECÇÕES GENITAIS
INTRODUÇÃO
Os microrganismos que colonizam o trato genital feminino incluem lactobacilos, difteróides,
Gardnerella vaginalis, estafilococos coagulase negativos, Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Enterococcus spp., estreptococos alfa e gama hemolíticos, Escherichia coli e leveduras.
A uretra masculina normalmente contém relativamente poucos microrganismos encontrados na pele,
tais como: estafilococos, micrococos, corynebactérias e estreptococos alfa hemolíticos.
Muitas infecções do trato genital feminino têm origem em microrganismos endógenos. A
patogenicidade deles pode ser facilitada por fatores do hospedeiro, como por infecções primárias
causadas por outros microrganismos como: herpes simplex vírus (HSV), o vírus papiloma humano
(HPV), Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, ou ainda com infecções específicas como
aquelas causadas pela Neisseria gonorrhoeae.
O Laboratório de Microbiologia deve estar capacitado para detectar os principais agentes das doenças
sexualmente transmissíveis: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi,
Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis.
PRINCIPAIS SÍNDROMES INFECCIOSAS DO TRATO GENITAL
Vaginite Infecciosa candidíase vulvo-vaginal · tricomoníase
Vaginose bacteriana (polimicrobiana) Gardnerella vaginalis Mobilluncus spp Mycoplasma hominis
Anaeróbios (Bacteroides não fragilis, Peptococcus spp)
Vulvo-vaginites em crianças Enterobacteriaceae Streptococcus pyogenes outros beta-
hemolíticos
Vaginite não-infecciosa irritantes químicos ou outros; alergia, hipersensibilidade e
dermatite de contato; vaginite traumática; vaginite
atrófica; vaginite atrófica pós-puerperal; doença vascular
do colágeno; vaginite idiopática
Menos comuns:
- vaginite atrófica com infecção bacteriana secundária
- corpo estranho com infecção secundária
- vaginite inflamatória descamativa
- vaginite ulcerativa associada com S. aureus (síndrome do choque tóxico)
CANDIDÍASE VULVO-VAGINAL
Os dados epidemiológicos da vulvovaginite por Cândida são incompletos. A candidíase vulvovaginal é
rara em mulheres antes da menarca. Em mulheres até os 25 anos, pelo menos um episódio de
candidíase é freqüentemente encontrado. Nas mulheres na pré-menopausa, em pelo menos 75%
delas, observa-se um episódio de candidíase vulvovaginal. Nas mulheres pós-menopausa, a incidência
é mais rara. Parece que o mecanismo imune local da vagina é responsável pela freqüência dos
episódios e a susceptibilidade é associada a uma condição de mucosa não-secretora, o que facilitaria a
implantação da levedura.
A candidíase vulvovaginal não é tradicionalmente considerada como doença sexualmente transmitida,
pois ocorre em mulheres celibatárias e a Candida spp. também faz parte da microbiota vaginal
normal. Episódio individual de candidíase vulvovaginal parece não estar relacionado à faixa etária nem
ao número de parceiros ou freqüência de relações sexuais.

Mod - 44
A candidíase vulvovaginal recorrente é definida como quatro ou mais episódios da infecção por ano e
ocorre em menos de 5% de mulheres sadias. Entretanto ela é importante em pacientes diabéticas não
controladas e nas que fazem uso de drogas imunossupressoras.
A Candida albicans é a responsável por 80-92% dos episódios de candidíase vulvo-vaginal. Mais
recentemente outras espécies como Candida (Torulopsis) glabrata e Candida krusei também foram
consideradas patogênicas.
FATORES PREDISPONENTES
Incluem gravidez, diabetes, antimicrobianos de amplo espectro e contraceptivo oral com altas taxas
de estrógenos.
O diagnóstico laboratorial é facilmente realizado no laboratório de microbiologia, a partir do conteúdo
vaginal ou secreção uretral. Podem ser utilizados os seguintes métodos:
Exame direto a fresco e/ou após coloração pelo método de Gram.
Exame colpocitológico pelo Papanicolaou.
Isolamento em meios de cultura comuns (Ágar Sangue, Ágar Sabouraud).
Identificação das leveduras por métodos automatizados ou através de provas clássicas como:
auxonograma, zimograma e pesquisa de tubo germinativo.
Antifungigrama com drogas específicas: miconazol, fluconazol, ketoconazol, itraconazol,
clotrimazol e nistatina.
Pesquisa de Candida albicans por metodologia de sondas de DNA.
TRICOMONÍASE
A Trichomonas vaginalis afeta aproximadamente 180 milhões de mulheres em todo o mundo. Em
muitos países industrializados a prevalência da tricomoníase tem diminuído. A Trichomonas vaginalis é
identificada em 30-40% dos homens, parceiros sexuais de mulheres infectadas. Ela também está
associada com outras doenças sexualmente transmitidas. Na mulher, a tricomoníase varia de
portadora assintomática até doença aguda inflamatória. Em mulheres grávidas, sem tratamento, está
associada com ruptura de membranas, nascimento prematuro e celulite pós-histerectomia.
O diagnóstico laboratorial da tricomoníase pode ser realizado através de exames diretos, cultura ou
técnicas moleculares. O pH vaginal está marcadamente elevado e há aumento do número de
leucócitos polimorfonucleares. A visualização de Trichomonas móveis pelo exame direto a fresco é
positiva em cerca de 50-70% dos casos confirmados em cultura. Embora os Trichomonas possam ser
visualizadas através de esfregaços pelo Papanicolaou, a sensibilidade é de apenas 60-70%.
Microbiologistas experientes visualizam facilmente estas estruturas pelo método de Gram que detecta
também as formas imóveis.
As técnicas de cultura possuem alta sensibilidade (95%) e devem ser realizadas quando os exames
diretos são negativos e o pH está aumentado na presença de numerosos leucócitos polimorfoncleares.
Um diagnóstico rápido pode ser realizado através de “Kits” usando sondas de DNA e anticorpos
monoclonais com sensibilidade de 90% e especificidade de 99,8%. Os testes mais freqüentemente
utilizados são:
Exame direto a fresco e/ou após coloração pelo Gram
Exame colpocitológico pelo Papanicolaou
Isolamento em meios de cultura específicos (Roiron, Kupferberg, Diamond)
Pesquisa pela metodologia de sondas de DNA

Mod - 45
VAGINOSE BACTERIANA
É a mais frequente causa de vaginite em mulheres sexualmente ativas. Além da Gardnerella vaginalis
outras bactérias estão envolvidas, tais como: Mobilluncus spp., Bacteroides spp. e Mycoplasma
hominis.
Vários estudos têm demonstrado um aumento de 2 a 7% na taxa de risco de nascimentos prematuros
em mulheres com vaginose bacteriana. A vaginose bacteriana representa uma mudança complexa na
microbiota vaginal, caracterizada pela redução na prevalência e concentração de lactobacilos
produtores de peróxido de hidrogênio e um aumento na prevalência e concentração de Gardnerella
vaginalis, Mobiluncus spp., Mycoplasma hominis, bacilos Gram negativos anaeróbios principalmente
dos gêneros Prevotella, Porphyromonas e Bacteroides.
A transmissibilidade da vaginose bacteriana foi demonstrada por Gardner e Dukes (1955) e a doença
pode ser considerada uma DST. A transmissão não é suficiente para explicar todos os casos, pois o
microrganismo é encontrado normalmente em algumas mulheres sadias e também em jovens sem
atividade sexual. Os fatores de risco para vaginose bacteriana incluem o uso de dispositivo
intrauterino e gravidez.
Os critérios para se estabelecer o diagnóstico de vaginose bacteriana são simples e podem ser usados
na clínica e no Laboratório com bastante sucesso. A presença de “clue cells”, células escamosas do
epitélio vaginal cobertas com bactérias de modo que os bordos da célula perdem a definição, é o
achado de melhor valor preditivo de vaginose bacteriana. O exame pelo Gram de secreção vaginal é o
método de escolha para visualização de “clue cells” com sensibilidade de 93% e especificidade de
70%.
A cultura para G. vaginalis é positiva em todos os casos de vaginose bacteriana, e pode ser detectada
em 50-60% de mulheres sadias assintomáticas. Desta maneira a cultura vaginal, isoladamente, não
deve fazer parte do diagnóstico de vaginose bacteriana. O uso de metodologia de sondas de DNA,
possui sensibilidade e especificidade semelhantes à cultura, mas o seu custo é muito elevado.
No diagnóstico laboratorial os seguintes testes são freqüentemente utilizados:
pH vaginal > 4,5; odor desagradável após a adição de KOH 10% à secreção
Bacterioscópico pelo Gram: ausência ou diminuição de leucócitos e de lactobacilo, presença de
“clue-cells”, grande quantidade de bacilos Gram-variáveis (lábeis)
Cultura: isolamento em meio seletivo (ágar vaginalis)
Pesquisa pelo uso de metodologia de sondas de DNA
Incidência relativa de vaginite/vaginose em mulheres com sintomas
Vaginose bacteriana Candidíase Trichomoníase
Incidência relativa 35% a 50% 20% a 25% 5% a 15%
Fatores demográficos
População dependente:
- 20%: clínicas de
planejamento familiar.
- 35%: clinicas de DST
- 10-30%: em mulheres
grávidas
Fatores de risco:
diabetes, gravidez,
contraceptivo oral, baixa
imunidade.
Transmitida
sexualmente, alta
incidência com outras
DST.
Incidência de co-infecção nas vaginites/vaginoses
Tipos de vaginites Patógenos Associados Incidência de co-infecção
Vaginose bacteriana Gardnerella vaginalis, Prevotella spp.,
Bacteróides spp., Mycoplasma hominis,
Mobiluncus spp.
- 5 a 10% com leveduras
- > 15 % com Trichomonas também com
Chlamydia trachomatis e Neisseria
gonorrhoeae

Mod - 46
Candidíase Candida spp. - 15 a 25% com vaginose bacteriana
- > 15% com Trichomonas
Tricomoníase Trichomonas vaginalis - > 10% com vaginose bacteriana
- > 15% com leveduras também com
Chlamydia trachomatis e Neisseria
gonorrhoeae
INFECÇÃO GONOCÓCICA
A gonorréia é uma doença antiga e o agente, Neisseria gonorrhoeae, foi descrito por Neisser em 1879.
Apesar de ser uma doença bem documentada de longa data, continua sendo de difícil controle. O
sucesso e a persistência histórica do gonococo como patógeno amplamente distribuído se deve ao fato
de que o homem é o único hospedeiro natural e a forma de transmissão mais comum é a via sexual.
A doença envolve primariamente o trato genito-urinário podendo ocorrer várias complicações, entre as
quais, endocardite, meningite, artrite e pielonefrite. A orofaringe do reto e a conjuntiva podem
também ser primariamente infectadas. As infecções causadas por Neisseria gonorrhoeae na mulher
incluem uretrite, cervicite, podendo invadir as glândulas de Bartholin e de Skene. A partir destas
estruturas, a infecção pode disseminar-se para o endométrio, trompas ovarianas, ovários, superfície
peritoneal e estruturas contíguas, causando a Doença Inflamatória Pélvica (DIP). Muitos casos de DIP
estão primariamente associados com outros patógenos, como Chlamydia trachomatis e uma gama
variada de bactérias anaeróbias e facultativas. A oftalmia neonatorum ocorre em recém-nascidos, de
mães portadoras, havendo contaminação no canal do parto. A infecção no homem se apresenta
usualmente sob a forma de uretrite aguda. Entre os sintomas precoces estão: a sensação de
desconforto e dor uretral.
A resposta inflamatória inicial é um corrimento mucóide, seguido por um exudato purulento que
aparece 2 a 5 dias após a relação suspeita. A infecção pode progredir da uretra anterior para a uretra
posterior em 10 a 14 dias. Os sintomas incluem aumento da disúria, poliúria e ocasionalmente febre e
dor de cabeça. As glândulas, dutos e vesículas do trato genito-urinário podem tornar-se sítios de
complicações locais. Infecção crônica da próstata, vesícula seminal e epidídimo, bem como
estreitamento uretral, podem ocorrer. Dentre os fatores que contribuem para o aumento da incidência
da gonorréia estão: a bactéria, o hospedeiro e as características clínicas da doença.
FATORES QUE ENVOLVEM A BACTÉRIA
Resistência aos antibióticos e variação antigênica. O aparecimento de cepas de gonococo pouco
sensíveis aos antibióticos tem causado muito interesse nos últimos anos, no campo das doenças
sexualmente transmissíveis (dst) e tem sido objeto de extensas investigações em muitas regiões
do mundo.
Reinfeção, o que sugere que a infecção não proporciona uma resposta protetora do hospedeiro.
Indivíduos infectados produzem resposta adequada com anticorpos anti-N. gonorrhoeae, sendo
esta resposta o IgA contra as proteínas da superfície bacteriana. Por que então estas pessoas não
se tornam imunes a reinfecção? A razão principal é que N. gonorrhoeae varia seus antígenos de
superfície, especialmente os antígenos dos “pili” de modo que a resposta IgA original se torna
rapidamente obsoleta. No caso dos “pili”, a bactéria possui um repertório antigênico que pode
chegar a 1 milhão de variações antigênicas.
FATORES QUE ENVOLVEM O HOSPEDEIRO
Aumento da promiscuidade - o risco individual de contrair a gonorréia depende não somente da
freqüência de exposição sexual, mas também da prevalência da doença na população de onde são
tomados os parceiros sexuais. Assim, indivíduos com grande número de diferentes parceiros
sexuais possuem um maior risco de contrair gonorréia. Alguns trabalhos demonstram o encontro
de gonorréia e sífilis 20 vezes mais freqüente em homens com mais de 4 parceiras sexuais do que
em homens com única parceira sexual.
Uso de contraceptivos - o uso correto do preservativo de borracha é eficaz na profilaxia da
gonorréia genital. O uso de contraceptivos orais, entretanto, aumentam entre os seus usuários o
risco de contrair a gonorréia seja pelo aumento do número de parceiros como pela maior
freqüência de relação sexual.

Mod - 47
Aumento de mobilidade populacional - altas taxas de deslocamentos geográficos e sociais
acompanhados de solidão e privação de direitos aumentam a freqüência de relações sexuais e leva
a altas taxas de revalência da gonorréia nessas populações.
Homossexualidade - a gonorréia é altamente prevalente entre os homossexuais. Em centros
urbanos os homossexuais masculinos contribuem de forma acentuada para a propagação da
gonorréia.
Recidivas - pacientes com infecções gonocócicas repetidas contribuem de forma intensa para o
aumento da incidência de gonorréia. Assim, pacientes que continuam a ter relação sexual sob as
mesmas condições e com o mesmo tipo de população, possuem alto risco de contrair uma
segunda infecção. A recidiva é um problema significativo em pacientes jovens.
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DA DOENÇA
A doença envolve primariamente o trato gênito-urinário podendo, entretanto, desenvolver várias
complicações entre as quais, endocardite, meningite, artrite e pielonefrite. O gonococo invade as
células do hospedeiro por um processo semelhante ao da fagocitose. Os sinais clínicos de infecção são
aparentemente devidos a migração de leucócitos e ativação do complemento no sítio da infecção.
A persistência do gonococo no hospedeiro é provavelmente causada pela sua fagocitose por células
epiteliais, um processo que o protege então da atividade fagocítica dos leucócitos. O gonococo produz
também uma IgA protease que inativa a IgA secretora.
O gonococo é uma bactéria frágil. As amostras clínicas submetidas a cultura devem ser semeadas
imediatamente, pois a bactéria se auto-lisa com muita facilidade e é sensível a variações de
temperatura. As amostras devem ser obtidas sempre antes do início do uso de antimicrobianos.
Quando é necessário transportar a amostra até o laboratório, medidas adequadas devem ser tomadas,
como o uso de meios de transporte adequados ao gonococo. Para amostras obtidas de articulações, a
cultura deve ser realizada em meio hipertônico contendo 20% de sacarose ou 20% de soro de cavalo,
pois nestas amostras, o gonococo se encontra na forma L, desprovida de parede celular e não cresce
nos meios habituais. A não observância dessas recomendações implica na obtenção de culturas
negativas.
Os seguintes exames podem ser utilizados:
Exame direto pelo método de Gram: esfregaços de amostras genitais femininas são muito menos
confiáveis para fins diagnósticos do que as do sexo masculino. A sensibilidade do método de Gram
neste caso é de apenas 50%, quando comparado à cultura.
Detecção de antígenos por enzima-imunoensaio.
Isolamento em meios de cultura específicos (Thayer-Martin ou similar).
Identificação das colônias através de provas bioquímicas manuais ou automatizadas,
imunofluorescência direta ou co-aglutinação.
Técnicas moleculares como pesquisa pela metodologia de sondas de DNA ou por técnicas de
amplificação (PCR).
Pesquisa de beta-lactamase.
Diagnóstico Laboratorial das Infecções por N. gonorrhoeae
Local das amostrasPaciente
Primários Secundários
Exames
Feminino Endocérvice reto, uretra, faringe Gram, Cultura e/ou
técnicas moleculares
Masculino heterossexual Uretra Gram
Masculino homossexual uretra, reto, faringe Gram, Cultura e/ou
técnicas moleculares
DIP feminino sangue, endocérvice,
reto
faringe a
, lesão pele b
, fluido
de articulação b
, uretra
Cultura e/ou técnicas
moleculares
DIP masculino sangue, uretra faringe a
, lesão pele b
, fluido
de articulação b
, reto c
Cultura e/ou técnicas
moleculares
a
- se possuir história de contato orogenital; b
- se presente; c
- se possuir história de contato anogenital

Mod - 48
INFECÇÕES POR CHLAMYDIA TRACHOMATIS
As clamídias são bactérias parasitas intracelulares obrigatórias, patógenos importantes amplamente
distribuídos através do reino animal. Somente poucas espécies são patogênicas para o homem. A
Chlamydia psittaci causa psitacose, a Chlamydia trachomatis causa infecção ocular, respiratória e no
trato genital e a Chlamydia pneumoniae causa pneumonia atípica.
Síndromes humanas por Chlamydia trachomatis
Sorotipos Sexo Síndrome
ambos tracoma, conjuntivite, queratite
A, B, Ba, C
mulher uretrite não gonocócica, cervicite, endometrite,
salpingite, peri-hepatite
homem uretrite não gonocócica, prostatite, epididimite
ambos conjuntivite, proctite, síndrome de ReiterD, E, F, G, H, I, J, K
recém-nascidos oftalmia neonatorum, pneumonia
L1, L2, L3 ambos linfogranuloma venéreo
A Chlamydia é, do ponto de vista metabólico, incapaz de produzir sua própria energia e, desta
maneira, retira ATP da célula hospedeira, sendo denominada de parasita energética. A Chlamydia
trachomatis infecta somente o homem e é usualmente transmitida por contato pessoal, isto é,
sexualmente ou através do canal do parto. No tracoma, a bactéria é transmitida por contato dos olhos
com os dedos ou com fômites contaminados.
A infecção por clamídia tornou-se altamente prevalente, mas devido sua natureza mais branda, ela
não tem sido reconhecida e, muitas vezes, permanece sem tratamento. Os estudos epidemiológicos
de infecção por clamídia têm documentado uma prevalência substancial do microrganismo em adultos
jovens e ativos sexualmente. Estes estudos relatam taxas de prevalência na faixa de 5% a 20% entre
mulheres que freqüentam clínicas de planejamento familiar; freqüências mais altas de 20-40% foram
notadas entre mulheres e jovens adolescentes sexualmente ativas que freqüentavam clinicas de DST
e em cerca de 25% de todas as mulheres atendidas em clínicas ginecológicas.
Aproximadamente 8% de todas as mulheres jovens atendidas em maternidades, sem sintomas de
infecção urogenital, são portadoras de C. trachomatis. Da mesma maneira, pelo menos 3% dos
homens atendidos em clínicas de DST, sem sintomas genito-urinários, são portadores de C.
trachomatis. Aproximadamente 50% das uretrites não gonocócicas (UNG) são causadas por esse
agente.
As infecções por clamídia coexistem freqüentemente com a gonorréia. Nos Estados Unidos e regiões
da Europa, 35-50% das mulheres com gonorréia apresentam infecção simultânea por clamídia; além
disto, os estudos mostram também que 20-25% dos homens heterossexuais com gonorréia estão
infectados também por C. trachomatis.
A uretrite é a manifestação mais comum da infecção por clamídia, no homem. Ela é duas vezes mais
freqüente que a gonorréia em algumas populações e sua incidência tem aumentado. C. trachomatis
virtualmente é responsável por todas as complicações da uretrite não gonocócica.
Na mulher as infecções causadas por Chlamydia trachomatis incluem cervicite mucopurulenta,
síndrome uretral, endometrite e salpingite. As infecções do trato genital superior causam esterilidade
ou predispõem à gravidez ectópica. As complicações na mulher são as mais graves de todas que
ocorrem com doenças por clamídias. Além disso, na mulher, o risco é duplo, para ela e para seu
recém-nascido.
Tanto Chlamydia como gonococo, graças às recentes utilizações dos testes moleculares, apresentam
atualmente uma alta possibilidade de diagnóstico. Anteriormente, o teste mais confiável capaz de

Mod - 49
identificar Chlamydia era o isolamento em cultura de células, que tem sensibilidade no máximo de 80-
90%. Embora as culturas sirvam como “padrão ouro”, elas são tecnicamente complicadas e
demoradas.
O transporte de amostras laboratoriais para cultura requer meios especiais e temperaturas específicas
de estocagem. Por outro lado, as amostras para testes moleculares podem ser coletadas em água ou
salina estéreis e transportadas à temperatura ambiente ou congeladas. Os testes moleculares para
diagnóstico de C. trachomatis produzem resultados rápidos, confiáveis e custo com tendência a cair,
atualmente já se encontrando próximo ao da cultura. A amostra adequada deve ser coletada da forma
tradicional com swab ou escova endocervical. O exame pode ser realizado à partir de urina de
primeiro jato o que pode reduzir sua sensibilidade no diagnóstico da cervicite, endometrite e
salpingite.
Os testes moleculares são mais complexos e mais caros que do que outros anteriormente utilizados,
mas produzem resultados rápidos (horas ao invés de dias) e, pela primeira vez, espécimes podem ser
coletados sem a introdução de swabs ou escovas no canal endocervical ou na uretra, pois sua
sensibilidade permite também encontrar traços do microrganismo em amostras de urina.
Os exames para o diagnóstico de Chlamydia incluem:
Exame direto, de raspado de mucosa cervical, pelo método da Imunofluorescência Direta ou por
técnica Imunoenzimática.
Isolamento em cultura de células MacCoy e identificação por técnica de Imunofluorescência.
Pesquisa por metodologia molecular: Hibridização ou captura híbrida; PCR com detecção por
hibridização; Testes sorológicos. RFC, IF-IgG, IF-IgM.
Testes laboratoriais no diagnóstico das infecções genitais por Chlamydia
Citologia Sorologia Téc. Moleculares
Cultura
Giemsa IFD EIA RFC IF-IgG IF-IgM PCR Sondas
DNA
Positiva:
material
de
raspado
de
mucosas
Não
recomen-
dada
Positiva Positiva Negativa
ou
positiva
título
baixo 1
Positiva
soros
pareados
Eventual-
mente
positiva 2
Positiva Positiva
1
- consideram-se títulos baixos até 1:16 e títulos altos de 1:32 ou mais. Maior valor diagnóstico que títulos altos é
a elevação de 4x o título entre amostras de soro no início da doença e 2 semanas após.
2
- positiva nas primeiras semanas da infecção.
IFD: imunofluorescência direta
EIA: método imuno-enzimático
RFC: reação de fixação do complemento
INFECÇÕES POR MYCOPLASMA SPP.
Alguns micoplasmas são habitantes normais do trato genito-urinário, sobretudo em mulheres. Em
ambos os sexos, a presença de micoplasma no trato genital está diretamente relacionada com o
número de parceiros sexuais.
O M. hominis pode ser isolado de 30-70% das mulheres assintomáticas, enquanto o U. realyticum é
encontrado no trato genital de 40-80% das mulheres sexualmente ativas. Além disso, outras espécies
de micoplasmas podem ocorrer no trato genital inferior, tais como: M. fermentans e M. genitalium
com pequeno significado clínico.
O M. hominis está fortemente associado à infecção das trompas ovarianas e a abscessos tubo-
ovarianos. Ele pode ser isolado através de hemoculturas em cerca de 10% das mulheres com febre
puerperal e no líquido sinovial de pacientes com artrite.
O U. urealyticum é comum no trato genital feminino, porém a sua associação com doença é discutível.
Ele tem sido associado à ocorrência de doenças pulmonares em prematuros com baixo peso que

Mod - 50
contraíram o microrganismo durante o nascimento. Existe evidência de associação entre o Ureaplasma
urealyticum e infertilidade.
Os micoplasmas são bactérias desprovidas de parede celular, são pleomórficas e somente crescem em
meios hipertônicos, contendo 20% de soro de cavalo e extrato de levedura. O método de Gram não
tem valor na pesquisa desta bactéria.
Como fazem parte da microbiota genital normal, as culturas para seu isolamento necessitam ser
quantitativas. Títulos iguais ou superiores a 103
UTC (unidades trocadoras de cor) são considerados
clinicamente significativos. Em alguns casos pode ser necessária a realização do antibiograma que é
feito em meio sólido ou líquido, utilizando-se pelo menos duas concentrações de cada antibiótico. Os
antibióticos freqüentemente utilizados incluem: tetraciclina, eritromicina, roxitromicina, ofloxacina e
tianfenicol.
Testes sorológicos não são utilizados na rotina, para infecções genitais por micoplasmas. Os principais
testes utilizados no diagnóstico de infecções genitais por micoplasmas incluem:
Cultura quantitativa de materiais, tais como: secreção vaginal, uretral, cervical, urina de 1º. jato,
esperma e líquido prostático em meios U-9, M-42 e A-7. Títulos iguais ou maiores que 103
UTC
(unidades trocadoras de cor) são clinicamente significativos.
Testes sorológicos: utilizados somente para infecções pulmonares ou articulares.
Antibiograma: tetraciclina, eritromicina, roxitromicina, ofloxacina e tianfenicol são testados
rotineiramente.
OUTRAS INFECÇÕES GENITAIS E SEUS PATÓGENOS
Amnionite Streptococcus agalactiae (grupo B) principal patógeno, Capnocytophaga
spp., E. coli, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae,
Haemophilus spp., Streptococcus pyogenes
Bartolinite N. gonorrhoeae, U. urealyticum, Enterobacterias.
Agentes mais raramente relacionados: Anaeróbios, C. trachomatis, S.
aureus.
Endometrite/salpingite Bacteroides spp., C. trachomatis, N. gonorrhoeae (importante em
salpingite), Enterococcus spp., S. agalactiae, Enterobactérias, L.
monocytogenes, Actinomyces spp. (associado ao uso de DIU)
Epididimite/orquite Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, Enterobacterias, Pseudomonas
spp.
Prostatite Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Enterobactérias,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., S. aureus (abscesso)
Úlceras genitais Cancro mole - Haemophilus ducreyi
Cancro duro - Treponema pallidum (sífilis)
Herpes genital - Herpes simplex vírus.
Uretrites e cervicites Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, Herpes simplex virus,
Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Haemophilus spp. (no
homem).

Mod - 51
9. INFECÇÕES DO TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR
INTRODUÇÃO
A maioria das infecções de vias aéreas superiores são autolimitadas, de etiologia viral, porém outras
são provocadas por bactérias e exigem tratamento antimicrobiano. Serão consideradas IVAS
(infecções de vias aéreas superiores) infecções da laringe, nasofaringe, orofaringe, nariz, seios
paranasais e ouvido médio. Como muitas vezes são indistinguíveis clinicamente, o diagnóstico
laboratorial é fundamental.
A identificação de uma bactéria patogênica ou potencialmente patogênica não necessariamente indica
seu envolvimento na infecção, pois estes microrganismos podem também ser detectados em
portadores como é o exemplo do Haemophilus influenzae. Desse modo, o conhecimento da flora
normal do trato respiratório superior é essencial para a interpretação dos resultados da cultura.
A orofaringe contém uma microbiota mista com grande densidade de bactérias aeróbias, anaeróbias
facultativas e anaeróbias estritas, incluindo Streptococcus alfa hemolíticos e não hemolíticos,
Streptococcus beta hemolíticos não pertencentes ao grupo A, Neisserias não patogênicas,
Haemophilus spp., difteróides, Staphylococcus sp, Micrococcus spp., Anaeróbios (Bacteroides spp,
Fusobacterium spp., Veillonella spp., Peptostreptococcus spp., Actinomyces spp.).
Alguns patógenos como Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae,
Neisseria meningitidis, enterobactérias e leveduras como Candida albicans podem ser componentes
transitórios da flora de orofaringe em indivíduos saudáveis, sem desenvolvimento de doença. O trato
respiratório abaixo da laringe não possui flora residente normal. A mucosa nasal anterior é
freqüentemente colonizada por Staphylococcus epidermidis e difteróides, e alguns indivíduos são
portadores intermitentes ou definitivos de Staphylococcus aureus. Por outro lado, os seios paranasais
e o ouvido médio não possuem flora microbiana.
QUADRO CLÍNICO, AGENTES ETIOLÓGICOS E DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Faringite *
O agente mais freqüente de faringite bacteriana é o Streptococcus pyogenes. Em pacientes
hospitalizados o trato respiratório superior pode ser colonizado por Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter spp., Klebsiella pneumoniae e outras enterobactérias. Esses microrganismos não
são patógenos de faringe e não devem ser reportados nos resultados de rotina. Porém se o
paciente for imunocomprometido, e houver solicitação do médico, essas bactérias serão
consideradas para laudo e teste de sensibilidade.
Alguns vírus tais como: adenovírus, herpes simplex, influenza, parainfluenza, coxsackie A e EBV
(mononucleose infecciosa), produzem faringite acompanhada de rinorréia, tosse, exantema e às
vezes febre, sendo o diagnóstico sorológico ou através de provas moleculares.
Laringite
e
Epiglotite
A laringite aguda, na grande maioria das vezes, é de etiologia viral. Culturas para pesquisa de
agentes bacterianos são indicadas apenas na suspeita de difteria. A epiglotite, também chamada
de “crupe”, geralmente tem etiologia bacteriana (Haemophilus influenzae tipo B). Mas a coleta
com “swab” diretamente da epiglote é contra-indicada por duas razões: em primeiro lugar, a
manipulação ou irritação da epiglote edemaciada pode provocar quadro de obstrução; em
segundo lugar, o isolamento de H. influenzae b pode não ocorrer.
O diagnóstico é fundamentalmente clínico, porém hemoculturas (> 50% dos casos são
bacterêmicos) podem confirmar a etiologia. O meio de cultura deve ser enriquecido com fatores
X e V ou adicionado de sangue de cavalo aquecido, sendo importante realizar teste de
suscetibilidade com pesquisa de beta lactamases.
Sinusites
Os seios paranasais comunicam-se com a cavidade nasal, sendo então susceptíveis a infecções
por microrganismos habitantes do trato respiratório superior. A sinusite aguda é freqüentemente
secundária à infecção viral de vias aéreas superiores. Outros fatores predisponentes são: alergia,
desvio do septo nasal, pólipos, e em pacientes hospitalizados, entubação orotraqueal
prolongada. A infecção de seios paranasais pode se propagar a tecidos adjacentes, como células
etmoidais (levando a celulite periorbital), abscessos cerebrais e meningites.
Os microrganismos mais comumente identificados são Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae não b, anaeróbios estritos, Streptococcus spp., e Branhamella catarrhalis. Em
sinusites de origem intra-hospitalar, os agentes mais freqüentes são: Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, e fungos como Candida spp.

Mod - 52
Otites
Otite Média: infecção do ouvido médio, geralmente acomete crianças entre 3 meses e 3 anos de
idade. O diagnóstico etiológico só pode ser feito através de cultura do fluido do ouvido médio,
mas como a obtenção deste material implica em realização de timpanocentese, não é realizado a
não ser que haja indicação clínica de drenagem. Os agentes mais comumente isolados são
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e Streptococcus pyogenes.
Otite Externa: infecção do canal auditivo externo, geralmente causada por Pseudomonas
aeruginosa, Proteus spp. e Staphylococcus aureus.
Nasofaringe
e
Mucosa
Nasal
Nasofaringe: o material coletado para diagnóstico da infecção deve ser aspirado através do
nariz; utilizado para o diagnóstico de coqueluche, Mycoplasma e alguns casos de difteria. Para
detecção de meningococo a amostra deve ser coletada com swab ou por aspiração e semeada
imediatamente em meios adequados. Deve ser lembrado que para detecção de portadores de
meningococo, deve ser coletado material com zaragatoa de arame, e semeado imediatamente
em meios adequados.
Nariz: 20 a 25% dos indivíduos sadios são portadores de Staphylococcus aureus no nariz, e no
ambiente hospitalar esta taxa pode aumentar. Alguns autores associam a colonização nasal por
este microrganismo com o aumento do risco de infecção hospitalar em pacientes submetidos a
cirurgias (cardíaca, por exemplo) e a programas de diálise peritoneal contínua (CADP). Nestes
casos de risco, colher material das narinas para pesquisa de Staphylococcus aureus, com teste
de susceptibilidade à mupirocina (antibiótico de uso tópico utilizado para erradicação do
microrganismo da mucosa nasal).
Candidíase
oral
Comum em neonatos e pacientes imunocomprometidos, principalmente após utilização de
antibióticos de largo espectro. O diagnóstico é direto, feito através de esfregaço em lâmina do
exudato corado pelo Gram ou KOH, onde são visualizadas leveduras.
Os meios de cultura mais utilizados para semeadura, de materiais obtidos das vias aéreas superiores
são o Ágar Chocolate (com sangue de cavalo) e Ágar Sangue incubados em atmosfera de 5% de CO2,
e Ágar Mac Conkey. Na rotina não se recomenda fazer enriquecimento, nem fazer uso de meios
seletivos. Na suspeita de infecções por anaeróbios usar meios e condicões apropriadas para o cultivo
destas bactérias.
Para cultura do bacilo diftérico é recomendável encaminhar a Laboratório de Saúde Pública. O meio
seletivo é o meio de Ágar Sangue cistina-telurito. O bacilo também cresce em Ágar Sangue, sendo
opcional fazer enriquecimento em Ágar Loeffler azul de metileno.
* Principais agentes etiológicos de faringites
Agente Manifestação clínica
Estimativa de
casos (%)
Rhinovirus Resfriado 20
Coronavírus Resfriado 5
Adenovirus Doença respiratória aguda ou febre
faringo-conjuntival
5
Herpes simplex vírus Gengivite, estomatite e faringite 4
Outros vírus Herpangina, mononucleose, etc ≤1
Influenza vírus gripe 2
Parainfluenza vírus resfriado 2
Streptococcus pyogenes Faringite, amigdalite e escarlatina 15-30
Streptococcus beta hemolítico
do grupo C
Faringite e amigdalite 5
C. diphtheriae Difteria raramente
Neisseriae gonorrhoeae Faringite raramente
Arcanobacterium haemolyticum Faringite raramente
Mycoplasma pneumoniae Faringite, pneumonia raramente

Mod - 53
10. INFECÇÕES DO TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR
PNEUMONIA DA COMUNIDADE
Apesar dos progressos diagnóstico-terapêuticos, as pneumonias ainda representam a causa mais
importante de morte atribuída à doença infecciosa nos países desenvolvidos, em parte pela dificuldade
de se estabelecer o agente etiológico e dirigir a terapêutica específica, pela grande diversidade de
agentes possíveis. Cerca de 30 a 60% das pneumonias adquiridas na comunidade não revelam
nenhum agente entre os mais freqüentemente pesquisados e isoladas, ficando apenas com
diagnóstico clínico ou de imagem.
Agentes mais isolados em pneumonias da comunidade
Agente Prevalência (%) Principais
sintomas
Fatores predisponentes
Streptococcus pneumoniae 20-60
Haemophilus influenzae 3-10
Staphylococcus aureus 3-5
Anaeróbios da cavidade oral 6-10
Moraxella catarrhalis 1-3
Outros Gram negativos 3-10
Chlamydia pneumoniae 5-17
Legionella pneumophila 2-8
Vírus respiratórios 2-15
Respiratórios:
- tosse
- expectoração
- dispnéia
- dor toráxica
Gerais:
- febre
- mal-estar
- mialgia
- sudorese
- fadiga
- cefaléia
- náuseas
- etc
- doença pulmonar obstrutiva
crônica
- diabetes
- alcoolismo
- crises convulsivas
- insuficiência cardíaca congestiva
- anemia falciforme
- imunossupressão
- idade avançada
- doença respiratória prévia (em
geral viral)
- ventilação mecânica
- etc
As amplas variações ocorrem em diferentes populações e outros fatores epidemiológicos (época do
ano, surtos, faixa etária, etc.). Nas crianças a distribuição tem particulariedades marcantes com
diferentes faixas etárias em função da experiência imunológica com os potenciais agentes infecciosos,
o que reduziu a frequência nas comunidades vacinadas.
Existe uma interessante associação entre fatores predisponentes e agentes etiológicos que podem
facilitar a pesquisa ou interpretação de achados microbiológicos.
Associação entre fatores predisponentes e agentes etiológicos
Fator Agente Etiológico Fator Agente Etiológico
Alcoolismo Streptococcus pneumoniae,
Anaeróbios, Enterobactérias
Exposição a animais
da área rural ou gata
recém-parida
Coxiella burnetii (febre Q - áreas
endêmicas)
Doença obstrutiva
pulmonar crônica e
fumante
Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae,
Moraxella catarrhalis,
Legionella spp.
Infecção por HIV
precoce
Haemophilus influenzae,
Mycobacterium tuberculosis
Asilos e outras
comunidades de
assistência
Enterobactérias, Haemophilus
influenzae, S. aureus,
Anaeróbios, Chlamydia
pneumoniae
Viagem ao sudeste
norte-americano
Coccidioides immitis

Mod - 54
Má higiene
dentária
Anaeróbios Surtos de gripe Influenzavirus, Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes
(A), Haemophilus influenzae
Exposição a
pombos ou fezes
Histoplasma capsulatum
(Histoplamose)
Pnemonia de
aspiração
Anaeróbios e pneumonia
química
Exposição a
pássaros
Chlamydia psitaci (Psitarcose) Doença pulmonar
crônica, fibrose
cística ou
bronquiectasia
Pseudomonas aeruginosa,
Burkholderia cepacia,
Exposição a
coelhos
Francisella tularensis
(Tularemia)
Usuário de drogas S. aureus, Anaeróbios,
Distribuição da freqüência de agentes etiológicos em função da idade
Idade Agente por ordem de freqüência
Do nascimento até 20 dias Streptococcus agalactiae (B), Enterobactérias, Citomegalovirus, Listeria
monocytogenes
3 semanas a 3 meses Chlamydia trachomatis, Vírus respiratório sincicial, Parainfluenza virus 3, S.
pneumoniae, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus
4 meses a 4 anos Vírus respiratório sincicial, Parainfluenza virus, influenza virus, adenovirus,
rhinovirus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma
pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis
5 a 15 anos Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumoniae,
Outras causas mais raras de pneumonia
Agentes associados a pneumonia Exposição
Anthrax (Bacillus anthracis) Animais em área rural ou suas fezes
Brucelose (Brucella spp.) Animais, leite não pasteurizado, cuidados veterinários
Leptospirose (Leptospira spp.) Roedores silvestres; água contaminada com urina de animal doente;
animais domésticos doentes
Pasteurella multocida Cães e gatos contaminados
Tifo murino (Yersinia pestis) Ratos, esquilos, coelhos e outros roedores silvestres
Hantavirus Urina, fezes e saliva de roedores silvestres
PNEUMONIA HOSPITALAR
Considerando-se as diferentes topografias associadas às infecções hospitalares, as localizadas no trato
respiratório inferior, têm grande importância pela freqüência em que ocorrem e pela morbidade
associada. Estas infecções são classificadas basicamente em quadros de traqueobronquite e
pneumonia.
A pneumonia de origem hospitalar é definida como aquela que aparece após um período maior ou
igual a 48 horas de admissão e não está incubada no momento da hospitalização. Segundo dados da
literatura, ocorre entre 6 a 10 casos a cada 1000 admissões hospitalares.

Mod - 55
Entre as pneumonias, aquelas associadas com ventilação mecânica através de entubação orotraqueal
ou traqueostomia, são as mais freqüentes. São definidas para pacientes sob ventilação mecânica em
um período igual ou superior a 48 horas. Nesta situação a incidência de infecção é de 7 a 21 vezes
maior à que ocorre em pacientes que não necessitam de respirador.
Dentre as infecções hospitalares, a infecção pulmonar é a que leva a morte com maior freqüência,
com um risco maior na Unidade de Terapia Intensiva. A prevalência de pneumonias varia entre 10 e
65%, com 13 a 55% de casos fatais. Neste mesmo tipo de Unidade, dados do National Nosocomial
Infections Surveillance (NNIS) mostram a taxa de infecção respiratória associada à ventilação
mecânica por 1000 procedimentos-dia, variando de 5 casos em UTI pediátrica a 13 casos em UTI
cirúrgica.
De uma maneira geral os microrganismos podem alcançar o trato respiratório pela aspiração de
secreções da orofaringe, pela inalação de aerossóis contendo bactérias, pela translocação de
microrganismos do trato gastrointestinal ou pela disseminação hematogênica de um foco a distância.
Ainda, para que a infecção respiratória ocorra é necessário existir a perda das defesas do hospedeiro,
um inóculo suficiente para alcançar o trato respiratório ou a presença de um microrganismo altamente
virulento.
Os agentes mais freqüentemente isolados são:
Bacilos Gram negativos
Enterobactérias: Klebsiella spp., E. coli, Enterobacter spp.
Bacilos Gram negativos não fermentadores: P. aeruginosa, Acinetobacter baumanii e outras
espécies, etc.
Cocos Gram positivos, principalmente Staphylococcus aureus.
Outros agentes, tais como Legionella pneumophila e Vírus Respiratório Sincicial (VRS) aparecem
em casos de surto e em pacientes imunodeprimidos, assim como Aspergillus spp. e Pneumocystis
carinii.
Patógenos isolados em 4.389 pneumonias em UTI nos Estados Unidos de 1992–97 NNIS
Patógenos %
Pseudomonas aeruginosa 21
Staphylococcus aureus 20
Enterobacter spp. 9
Klebsiella pneumoniae 8
Acinetobacter spp. 6
Candida albicans 5
Escherichia coli 4
Enterococcus spp. 2
Outras enterobactérias 8
Outros fungos 2,8
Vários critérios utilizados para definição de pneumonia hospitalar foram propostos. Em geral, incluem
a presença de um novo ou progressivo infiltrado pulmonar, febre, leucocitose e secreção traqueo-
brônquica purulenta.
Muitos destes achados são inespecíficos já que febre pode ser causada por diversos fatores como:
reação a drogas, infecção em outro foco, transfusão sanguínea e resposta inflamatória extra-
pulmonar.

Mod - 56
O mesmo ocorre com a congestão, presente em embolia pulmonar, atelectasia, insuficiência cardíaca,
hemorragia pulmonar, trauma pulmonar, tumor, aspiração química e reação à drogas.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS PNEUMONIAS
RECURSOS DIAGNÓSTICOS
Exame físico
Exame do escarro
Aspirado transtraqueal
Broncoscopia com fibra óptica e lavado bronco-oalveolar
Aspirado endotraqueal cego
Biópsia pulmonar
Hemocultura (1 a 16% de positividade)
Exames imunológicos (imunofluorescência, ELISA, etc.)
Punção de derrame pleural para realização de exames bioquímicos, citológicos e microbiológicos.
Raio X simples (AP + perfil)
Tomografia computadorizada
O diagnóstico das infecções do trato respiratório inferior, do ponto de vista microbiológico, é
dificultado pela contaminação da amostra, em nível do trato respiratório superior, durante a coleta.
Critérios de aceitação de amostras clínicas para exame
Amostras aceitáveis Amostras inaceitáveis
Escarro Saliva (enviada como escarro)
Aspirado traqueal ou transtraqueal Escarro coletado por 24 horas
Lavado bronco-alveolar, escovado brônquico e biópsia
brônquica
Swab endotraqueal, cânula ou tubo endotraqueal
Punção pulmonar e biópsia pulmonar
ESCARRO
Apesar de poder ser útil em pacientes com tosse produtiva e com capacidade de expectorar e a
presença de escarro purulento encontrar-se na maioria dos critérios utilizados para o diagnóstico de
pneumonias, a análise desta secreção é bastante controvertida do ponto de vista de sensibilidade e
especificidade.
Aspectos da análise macroscópica do escarro que podem ser úteis para sugestão de agentes ou
patologias: Cor, quantidade, consistência e cheiro.
Escarro purulento – pneumonia bacteriana (embora nas pneumonias por vírus ou micoplasma a
infecção secundária pode oferecer os mesmos achados em cerca de 30 a 50% dos casos)
Expectoração matinal, abundante e fétida - bronquiectasia
Expectoração escassa ou aquosa (mucóide) - pneumonias atípicas
Escarro avermelhado, mucóide - Klebsiella pneumonia
Escarro fétido associado a pneumonia aspirativa - anaeróbios
Bacterioscopia
A bacterioscopia do escarro pela coloração de Gram é um recurso simples, rápido e barato, podendo
ser muito útil para orientação terapêutica quando são atendidos os seguintes itens:
Um material purulento e representativo é analisado;
Os analistas são experientes;
Informações clínicas e/ou o clínico participam da interpretação;

Mod - 57
Os achados são bem definidos, como por exemplo, o predomínio ou presença de mais de 10
cocobacilos Gram positivos em forma de chama de vela, característicos de pneumococo em
imersão (X1000) - a especificidade nesse caso é de 85%.
Algumas medidas relacionadas à coleta e processamento da amostra podem tornar os resultados
obtidos com este espécime de maior utilidade. A remoção de próteses e gargarejo com água
imediatamente antes da coleta pode reduzir substancialmente a contaminação da amostra. O único
cuidado é impedir o uso de substâncias com conteúdo bactericida.
Prefere-se colher a primeira amostra de escarro da manhã por ser um material mais concentrado,
utilizando-se a porção mais purulenta para análise. A coleta por um período de 24 horas é
inadequada, já que durante o dia passa a ocorrer diluição da amostra, morte de alguns agentes
fastidiosos, e em contrapartida, o crescimento bacteriano de outros microrganismos.
Segundo os achados de LENTINO e LUCKS, relatados por KONEMAN et al (1997), a interpretação do
resultado das culturas de escarro em relação às pneumonias foi de que:
26,5% de amostras de escarro purulento eram de pacientes mostrando nenhum sinal clínico ou
radiológico de pneumonia.
40% das amostras de escarro provenientes de pacientes com pneumonia não eram
profundamente expectorados, refletindo a presença de secreção oral.
Somente 10% de pacientes produzindo escarro não purulento tinham pneumonia.
Somente 56,8% dos pacientes com pneumonia produziam escarro purulento.
Ainda em casos comprovados de pneumonia pneumocócica, com bacteremia e escarro revelando o
pneumococo na coloração de Gram podem apresentar cerca de 50% de culturas de escarro negativas,
o mesmo podendo ocorrer com pneumonias por Haemophylus. A presença de enterobactérias em
culturas de escarro deve ser interpretada com muita cautela, pois em cerca de 1/3 das culturas estas
bactérias provenientes da orofaringe podem contaminar o material obtido para análise. A avaliação da
qualidade do escarro, considerando a proporção entre o número de células epiteliais e leucócitos, é
um procedimento que deve ser considerado de rotina, para caracterizar a aceitabilidade da amostra
ou não.
Através da coloração de Gram (observação de pelo menos 10 campos com aumento de 10X), as
amostras devem ser classificadas em grupos de acordo com as tabelas abaixo. São significativos os
materiais do grupo 5 ou quando a quantidade de células epiteliais, neutrófilos e muco resultarem em
somatória positiva. Recomenda-se que escarros não qualificados, não sejam semeados e que o fato
seja reportado ao requisitante do exame.
Avaliação da qualidade do escarro
Grupos Células
epiteliais
Leucócitos Neutrófilos “Score” Células
Epiteliais
“Score”
Grupo 1 ≥ 25 ≤ 10 < 10 0 10-25 -1
Grupo 2 ≥ 25 10-25 10-25 +1 > 25 -2
Grupo 3 ≥ 25 ≥ 25 > 25 +2
Grupo 4 10-25 ≥ 25 Muco +1
Grupo 5 <10 ≥ 25
No caso da necessidade do processamento da amostra nestas condições, é recomendável uma
observação no laudo final do exame, dizendo que o material coletado está contaminado com material
de orofaringe. Faz-se exceção a esta regra, escarro com o objetivo de diagnosticar presença de
micobactérias, vírus, fungos (Paracocidioidis brasiliensis, Histoplasma spp., etc.) e aqueles
provenientes de pacientes imunodeprimidos.
Pneumocistis carinii - para diagnóstico de pneumonia por Pneumocistis carinii em pacientes com
HIV ou imunossuprimidos, o escarro pode ser útil em mais de 50% dos casos, pelo uso da
coloração de Giemsa ou Gomori methenamina prata ou azul de toluidina ou ainda de

Mod - 58
imunofluorescência com anticorpos monoclonais que apresentam uma sensibilidade de 80% e
especificidade de 90%.
Legionella pneumophilia - para diagnóstico de legionelose (Legionella pneumophlia) o escarro ou
outros materiais, obtidos por vias invasivas ou não, podem ser úteis no diagnóstico pela
imunofluorescência direta com anticorpos monoclonais.
Chlamydia pneumoniae - os recursos imunológicos para teste no escarro (Elisa e
imunofluorescência) oferecem baixa sensibilidade e especificidade para caracterização da
pneumonia por Chlamydia pneumoniae. Quando agentes como Mycobacterium tuberculosis,
Legionella spp., e Pneumocistis carinii são encontrados no escarro, devem ser considerados
patogênicos, independente da avaliação de qualidade do escarro.
A amostra deve ser encaminhada diretamente ao laboratório e se não processada no prazo de 1-2
horas pode resultar em perda de patógenos fastidiosos e em proliferação de bacilos Gram negativos
(enterobactérias e não fermentadores).
Indicação de outras técnicas para obtenção de material para diagnóstico de pneumonia:
- má resposta terapêutica
- gravidade do quadro ou paciente imunossuprimido
- falta de produção de escarro
- exames realizados não foram conclusivos (não isolou nada ou isolou enterobactérias, ou
Candida ou mais de um agente)
- possibilidade de superinfecção
As técnicas broncoscópicas caracterizam-se pela possibilidade de visualizar diretamente a árvore
respiratória levando a menor risco de dano e direcionamento do fibroscópio ao local desejado,
enquanto as não broncoscópicas podem ser realizadas mais rapidamente com menor risco de
desaturação de oxigênio.
ASPIRADO DE SECREÇÃO TRAQUEAL
Apesar de aspirados de secreção traqueal serem rapidamente obtidos em pacientes entubados, esta é
uma amostra bastante questionável, devido a sua baixa especificidade. Isto se deve ao fato de que a
colonização endotraqueal ocorre rapidamente após a entubação e ventilação mecânica.
A utilização de técnicas quantitativas de aspirados endotraqueais feito às cegas, com o objetivo de
diferenciar colonização de infecção com valores de corte de > 105
UFC/ml, é proposto por alguns
autores (Jourdain & cols, 1995).
A sensibilidade preditiva de pneumonia associada a ventilação foi comparável com o BAL e com a
técnica do escovado protegido, embora menos específico. Alguns trabalhos mostram até 82% de
sensibilidade e 83% de especificidade para o aspirado endotraqueal, mas não há unanimidade.
Independentemente da metodologia empregada, tende a mostrar resultados mais favoráveis
associados ao valor preditivo negativo e sua melhor indicação é quando não se pode fazer a
broncoscopia. A mortalidade da pneumonia associada à ventilação mecânica não mostrou diferença
quando a terapêutica se baseou em técnicas broncoscópicas ou não.
ASPIRADO TRANSTRAQUEAL
Trata-se de uma técnica bastante utilizada na década de 70, mas que atualmente devido aos riscos
que leva para o paciente (enfisema subcutâneo, estímulo vaso-vagal, hemoptise), está preterido em
função do aparecimento de procedimentos mais promissores. Outro fato relevante é o elevado número
de resultados falso-positivos, pelo isolamento de flora colonizadora do trato respiratório superior.
LAVADO BRÔNQUICO NÃO DIRIGIDO
Método simples, de baixo custo e seguro recomendado para rotina de vigilância bacteriológica em
pacientes ventilados mecanicamente.
No estudo que levou estas a conclusões, observou-se que durante dias anteriores ao paciente
apresentar um quadro de pneumonia, havia aumento significativo de um número inferior ou igual a
103
UFC/ml para maiores ou iguais a 105
UFC/ml; ainda revelou queda do número de colônias em
pacientes que responderam a antibioticoterapia, em contraste com aqueles que mostraram uma

Mod - 59
progressiva deterioração clínica, para os quais não existiu queda significativa na contagem de
colônias.
LAVADO BRONCO-ALVEOLAR E ESCOVADO BRONCO-ALVEOLAR
Das técnicas endoscópicas o lavado e o escovado bronco-alveolar são as mais utilizadas. O escovado
bronco-alveolar obtém um maior volume de amostra, o que aumenta a sensibilidade do método e
permite que se realize um maior número de procedimentos diagnósticos além da cultura, após a
citocentrifugação da amostra. Dentre eles incluem-se colorações para identificação de organismos
específicos, porcentagem de macrófagos e leucócitos contendo microrganismos (nas pneumonias
considera-se relevante acima de 2%), e presença de fibras de elastina como indicador de necrose
pulmonar.
São referidos valores de sensibilidade e especificidade para o lavado bronco-alveolar variando de 80-
100% e 75-100% respectivamente e para o escovado de 65-100% e 60-100%.
ESCOVADO PROTEGIDO
O volume recuperado de secreção pulmonar por um escovado é aproximadamente de 0,001ml. O
escovado é diluído em 1 ml de meio, resultando na diluição da bactéria em 100 a 1000 vezes.
Portanto o crescimento de pelo menos 103
UFC/ml em placas indica uma concentração inicial de 105
a
106
bactérias na secreção pulmonar.
BAL OU LAVADO BRONCO-ALVEOLAR
No lavado bronco-alveolar recupera-se 5 a 10 vezes o volume de bactérias do escovado, visto que a
diluição de 1 ml de secreção se faz em 10 a 100 ml de soro fisiológico, de forma que a contagem de
104
UFC/ml a partir do material recebido no laboratório, representa 105
a 106
UFC/ml na secreção
pulmonar. Em pacientes com forte suspeita clínica de pneumonia, valores a partir 102
-103
de cada
agente isolado para escovado e 103
-104
UFC/ml para o lavado podem também ser significativos; o uso
de antimicrobianos estaria recomendado.
BIÓPSIAS
Podem ser feitas de formas variadas: percutânea, através de broncoscopia, por meio do fibroscópio,
pela toracoscopia e a céu aberto. Indicado nos casos de imunocomprometidos e crianças com má
evolução à terapêutica empírica.
Punção biópsia pulmonar - trata-se de um procedimento, que quando resulta em cultura positiva, é
bastante fidedigno, já que os problemas com contaminação com a flora do trato respiratório superior
inexistem. Os relatos da literatura revelam que em situações variadas, o diagnóstico etiológico das
infecções, com esta técnica, ocorreu entre 30% a 82% dos casos estudados e falso-negativos de cerca
de 18%. Complicações mais importantes são pneumotórax e sangramento em casuísticas que variam
de 5 a 39%.
Biópsia transbrônquica - os resultados diagnósticos são semelhantes à punção pulmonar aspirativa,
mas revelaram menor índices de complicações.
Biópsia pulmonar - a biópsia a céu aberto, método definitivo para o diagnóstico das pneumonias, é
um procedimento pouco realizado. Está indicada em casos sem melhora clínica, em que não foi
possível isolar o microrganismo por outras técnicas ou que há necessidade de diagnóstico específico
com maior rapidez. Convém salientar que de nada adianta obter boas amostras para estudo
microbiológico quando se emprega técnica laboratorial convencional, isto é, morosa e de baixa
sensibilidade.
TORACOSCOPIA
A toracoscopia tem sido pouco utilizada, embora resultados sejam muito favoráveis, com achados
diagnósticos superiores a 90% e baixa taxa de complicações.
DERRAME PLEURAL
O derrame pleural costuma ocorrer, aproximadamente, em pneumonias causadas por Pneumococo
10%, Bacilos Gram negativos 50-70% e Streptococcus pyogenes (grupo A) 95%. Além da
bacterioscopia, baciloscopia (Micobacterias) e culturas (bactéria, micobactérias, fungos), o material

Mod - 60
deverá ser reservado para estudo citológico e bioquímico para afastar outras causas de derrame com
infiltrados pulmonares:
- Infarto pulmonar
- Insuficiência cardíaca
- Tumor
- Doenças do colágeno, etc.
HEMOCULTURA
Através da hemocultura também pode se isolar o microrganismo de um processo respiratório
considerando-se que isto ocorre entre 1 a 16 % dos casos, no entanto não deve ser utilizada de forma
isolada para o diagnóstico de pneumonia. É altamente específico e é indicada em pacientes com
pneumonia que necessita de hospitalização.
CONTAGENS BACTERIANAS SIGNIFICATIVAS
O cálculo dos valores limítrofes para definição de infecção para amostras do trato respiratório, deriva
da concentração de microrganismos encontrada em culturas do tecido pulmonar infectado.
Comparando-se o número de bactérias na amostra, estima-se o número na secreção original. As
infecções pulmonares clinicamente significativas contêm pelo menos 104
UFC/g de tecido.
Significado das contagens bacterianas em relação à amostra clínica
Material Volume obtido Fator de diluição Valor significativo
Escarro, aspirado, endotraqueal,
aspirado por broncoscopia
≥ 1 ml 1 105
–106
UFC/ml
Escovado brônquico protegido 1 a 10 µl diluídos em 1ml 1/100 – 1/1000 103
UFC/ml
Lavado broncoalveolar (BAL) 1ml diluído em 10 a 100 ml 1/10 – 1/100 104
UFC/ml
PACIENTES NEUTROPÊNICOS E IMUNOSSUPRIMIDOS
Além dos agentes relatados como causa de pneumonia em crianças e adultos, devem ser valorizados
achados clinicamente compatíveis de:
Bactérias: Streptococcus viridans, Corynebacterium jeikeium, Bacillus spp., Legionella spp.,
Mycobacterium spp., Nocardia spp., Rodococcus spp.
Fungos: Aspergillus spp., Fusarium spp., Candida spp., P. carinii, Cryptococcus neoformans
Protozoários: Toxoplasma gondii, Strongyloides stercoralis
PROCESSAMENTO MICROBIOLÓGICO DE AMOSTRAS
Meios recomendados para a cultura das amostras do trato respiratório:
Ágar sangue
Ágar Mac conkey
Ágar chocolate
Ágar sangue suplementado para anaeróbios, para amostras clínicas para as quais recomenda-se
fazer o isolamento de anaeróbios.
Quando é indicada cultura para Legionella spp., fungos, micobactérias, Chlamydia e vírus,
acrescentam-se os meios necessários a estas rotinas específicas. A pesquisa por
imunofluorescência com anticorpos monoclonais, e os métodos moleculares são mais
recomendados para a detecção desses microrganismos.
A semeadura da amostra e interpretação do número de colônias no caso da utilização de técnicas
quantitativas, poderá ser feita de uma das formas abaixo:
- Após homogeneização da amostra, semear 10 µl, diretamente nas placas, utilizando-se alças
calibradas descartáveis ou pipeta com ponteiras estéreis.

Mod - 61
Nº de colônias na placa
após Incubação “overnight”
Interpretação em UFC/ml
< 10 < 103
10 a 100 103
a 104
100 a 1000 104
a 105
Observação: Para o Lavado broncoalveolar considerar a diluição pelo volume injetado e multiplicar
por 100. P.ex., se a leitura for 50 colonias, multiplicar por 100 (volume da alça) e multiplicar por 100
(diluição da coleta). Resultado final = 5x10x 10 2
x10 2
= 5 x 105
UFC/ml
- Usar diluições de:
- 1/10: 10 µl com alça calibrada semeada no Ágar Chocolate
- 1/100: 1 ml do material diluído em 9 ml de solução salina e semeando-se 10 µL desta solução
com alça calibrada na placa de Ágar Chocolate
- 1/1000: usar a solução anterior e semear 1 µL com alça calibrada na placa de Ágar Mac
Conkey.
Para expressão do resultado em ml o número de colônias obtido deverá ser corrigido pelo fator da
diluição e correlacionado com a quantidade de amostra semeada.
- prepara-se uma diluição de 1:20 (0,5 ml de fluido em 9,5mL de solução salina estéril). Deste caldo
semeia-se 50 µl em cada um dos meios selecionados.
Nº de colônias na placa
após incubação
“overnight”
Interpretação em UFC/ml
2-24 103
25-249 104
≥ 250 105

Mod - 62
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Segurança e Controle
de Qualidade no
Laboratório de
Microbiologia Clínica
Módulo II

ÍNDICE
1. Regulamento Técnico para laboratórios Clínicos.............................................................1
Consulta Pública nº 50, de 05 de agosto de 2004.....................................................................1
D.O.U de 06/08/2004 ..........................................................................................................1
Resolução da Diretoria Colegiada - RDC Nº. 302, de 13 de Outubro de 2005................................1
Anexo - Regulamento técnico para funcionamento de laboratórios clínicos...................................2
Histórico ............................................................................................................................2
Objetivo ............................................................................................................................2
Abrangência .......................................................................................................................2
Definições ..........................................................................................................................2
Condições gerais.................................................................................................................5
Processos operacionais ........................................................................................................8
Registros ......................................................................................................................... 11
Garantia da qualidade........................................................................................................ 12
Controle da qualidade ........................................................................................................ 12
Disposições transitórias...................................................................................................... 13
Referências normativas e bibliográficas ................................................................................ 13
2. Requisitos básicos para laboratório de MICROBIOLOGIA..............................................16
Introdução ....................................................................................................................... 16
Infra-Estrutura Física......................................................................................................... 16
Biossegurança e controle de Qualidade................................................................................. 17
3. classificação dos laboratórios segundo o nível de biossegurança .................................19
Nível 1 de Biossegurança (NB-1) ou proteção básica (P1)........................................................ 19
Nível 2 de Biossegurança (NB-2) ou (P2) .............................................................................. 19
Classificação do organismo segundo seu potencial patogênico.................................................. 20
Classificação dos Organismos Geneticamente Modificados ....................................................... 21
4. Laboratórios NB-1, NB-2 e NB-3 ...................................................................................22
Design e infra-estrutura laboratoriais ................................................................................... 22
Accesso ........................................................................................................................... 23
Equipamentos e acessórios laboratoriais ............................................................................... 23
Gestão de segurança ......................................................................................................... 25
Saúde Ocupacional............................................................................................................ 26
Áreas de trabalho.............................................................................................................. 27
Proteçao Pessoal ............................................................................................................... 27
Segurança nos procedimentos laboratoriais........................................................................... 28
Descontaminação e descarte de resíduos .............................................................................. 30
MEDIDAS RELATIVAS À ACIDENTE e derramamento............................................................... 31
5. Precauções quanto à contaminação..............................................................................32
Cuidados relativos aos riscos de contaminação biológica ......................................................... 32
Cuidados relativos aos riscos de contaminação química........................................................... 33
6. Controle de qualidade no laboratório............................................................................35
Introdução ....................................................................................................................... 35
Objetivo .......................................................................................................................... 35
Ensaios de Proficiência....................................................................................................... 35
Parâmetros do controle de qualidade.................................................................................... 35
Controle de qualidade de Equipamentos ............................................................................... 36
Controle de qualidade de meio de cultura, REAGENTES e kits comerciais................................... 38
Controle de Qualidade de Funcionários ................................................................................. 40
7. Referências Bibliográficas.............................................................................................41

Mod II - 1
1. REGULAMENTO TÉCNICO PARA LABORATÓRIOS CLÍNICOS
CONSULTA PÚBLICA Nº 50, DE 05 DE AGOSTO DE 2004.
D.O.U DE 06/08/2004
A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso da atribuição que lhe confere
o art. 11, inciso IV, do Regulamento da ANVISA aprovado pelo Decreto nº 3.029, de 16 de abril de
1999, c/c o § 1º do art. 111 do Regimento Interno aprovado pela Portaria nº 593, de 25 de agosto de
2000, republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000, em reunião realizada em 3 de agosto de
2004, adota a seguinte Consulta Pública e eu, Diretor-Presidente, determino a sua publicação:
Art. 1º Fica aberto, a contar da data de publicação desta Consulta Pública, o prazo de 60 (sessenta)
dias para que sejam apresentadas críticas e sugestões relativas à minuta de Resolução, que define o
Regulamento Técnico para fixar os requisitos mínimos exigidos para o Funcionamento dos
Laboratórios Clínicos, em anexo.
Art. 2º Informar que o texto da proposta de Resolução de que trata o artigo 1º estará disponível na
íntegra, durante o período de consulta, no endereço eletrônico www.anvisa.gov.br e que as sugestões
deverão ser encaminhadas por escrito para o seguinte endereço: Agência Nacional de Vigilância
Sanitária – GGTES/GTOSS - SEPN 515, Bloco “B” Ed. Omega, 4º andar, Asa Norte, Brasília-DF, CEP
70.770.502, ou E-mail: gtoss@anvisa.gov.br.
Art. 3º Findo o prazo estipulado no art 1º a Agência Nacional de Vigilância Sanitária articular-se-á com
os Órgãos e Entidades envolvidos e aqueles que tenham manifestado interesse na matéria, para que
indiquem representantes nas discussões posteriores, visando a consolidação do texto final.
RESOLUÇÃO DA DIRETORIA COLEGIADA - RDC Nº. 302, DE 13 DE OUTUBRO DE
2005.
A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso da atribuição que lhe confere
o art.11, inciso IV, do Regulamento da ANVISA aprovado pelo Decreto 3.029, de 16 de abril de 1999,
c/c o § 1º do art.111 do Regimento Interno aprovado pela Portaria nº. 593, de 25 de agosto de 2000,
republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000, em reunião realizada em 10 de outubro de 2005;
considerando as disposições constitucionais e a Lei Federal nº. 8080 de 19 de setembro de
1990 que trata das condições para a promoção, proteção e recuperação da saúde, como
direito fundamental do ser humano;
considerando a necessidade de normalização do funcionamento do Laboratório Clínico e Posto
de Coleta Laboratorial;
considerando a relevância da qualidade dos exames laboratoriais para apoio ao diagnóstico
eficaz, adota a seguinte Resolução da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-Presidente substituto,
determino a sua publicação:
Art. 1º Aprovar o Regulamento Técnico para funcionamento dos serviços que realizam atividades
laboratoriais, tais como Laboratório Clinico, e Posto de Coleta Laboratorial, em anexo.
Art. 2º Estabelecer que a construção, reforma ou adaptação na estrutura física do laboratório clínico e
posto de coleta laboratorial deve ser precedida de aprovação do projeto junto à autoridade sanitária
local em conformidade com a RDC/ANVISA nº. 50, de 21 de fevereiro de 2002, e RDC/ANVISA nº.
189, de 18 de julho de 2003 suas atualizações ou instrumento legal que venha a substituí-las.
Art. 3º As Secretarias de Saúde Estaduais, Municipais e do Distrito Federal devem implementar os
procedimentos para adoção do Regulamento Técnico estabelecido por esta RDC, podendo adotar
normas de caráter suplementar, com a finalidade de adequá-lo às especificidades locais.

Mod II - 2
Art. 4º O descumprimento das determinações deste Regulamento Técnico constitui infração de
natureza sanitária sujeitando o infrator a processo e penalidades previstas na Lei nº. 6437, de 20 de
agosto de 1977, suas atualizações, ou instrumento legal que venha a substituí-la, sem prejuízo das
responsabilidades penal e civil cabíveis.
Art. 5º Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação.
FRANKLIN RUBINSTEIN
ANEXO
REGULAMENTO TÉCNICO PARA FUNCIONAMENTO DE LABORATÓRIOS CLÍNICOS
1 HISTÓRICO
O Regulamento Técnico de Funcionamento do Laboratório Clínico foi elaborado a partir de trabalho
conjunto de técnicos da ANVISA, com o Grupo de Trabalho instituído pela Portaria nº. 864, de 30 de
setembro 2003. Este Grupo de Trabalho foi composto por técnicos da ANVISA, Secretaria de Atenção
a Saúde (SAS/MS), Secretaria de Vigilância a Saúde (SVS/MS), Vigilâncias Sanitárias Estaduais,
Laboratório de Saúde Pública, Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial,
Sociedade Brasileira de Análises Clínicas, Provedores de Ensaio de Proficiência e um Consultor Técnico
com experiência na área.
A proposta de Regulamento Técnico elaborada pelo Grupo de Trabalho foi publicada como Consulta
Pública nº. 50 em 6 agosto de 2004 e ficou aberta para receber sugestões por um prazo de 60
(sessenta) dias, os quais foram prorrogados por mais 30 (trinta) dias.
As sugestões recebidas foram consolidadas pelos técnicos da Gerência Geral de Tecnologia em
Serviços de Saúde - GGTES/ANVISA, pelos componentes do Grupo de Trabalho juntamente com o
Consultor. Após discussões, as sugestões pertinentes foram incorporadas ao texto do Regulamento
Técnico, sendo produzido o documento final consensual sobre o assunto.
O presente documento é o resultado das discussões que definiram os requisitos necessários ao
funcionamento do Laboratório Clínico e Posto de Coleta Laboratorial.
2 OBJETIVO
Definir os requisitos para o funcionamento dos laboratórios clínicos e postos de coleta laboratorial
públicos ou privados que realizam atividades na área de análises clínicas, patologia clínica e citologia.
3 ABRANGÊNCIA
Esta Resolução de Diretoria Colegiada é aplicável a todos os serviços públicos ou privados, que
realizam atividades laboratoriais na área de análises clínicas, patologia clínica e citologia.
4 DEFINIÇÕES
4.1 Alvará sanitário/Licença de funcionamento/Licença sanitária: Documento expedido pelo órgão
sanitário competente Estadual, Municipal ou do Distrito Federal, que libera o funcionamento dos
estabelecimentos que exerçam atividades sob regime de vigilância sanitária.
4.2 Amostra do paciente: Parte do material biológico de origem humana utilizada para análises
laboratoriais.
4.3 Amostra laboratorial com restrição: Amostra do paciente fora das especificações, mas que ainda
pode ser utilizada para algumas análises laboratoriais.
4.4 Amostra controle: Material usado com a finalidade principal de monitorar a estabilidade e a
reprodutibilidade de um sistema analítico nas condições de uso na rotina.
4.5 Analito: Componente ou constituinte de material biológico ou amostra de paciente, passível de
pesquisa ou análise por meio de sistema analítico de laboratório clínico.

Mod II - 3
4.6 Biossegurança: Condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a
prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a
saúde humana, animal e o meio ambiente.
4.7 Calibração: Conjunto de operações que estabelece, sob condições especificadas, a
correspondência entre valores indicados por um instrumento, sistema de medição ou material de
referência, e os valores correspondentes estabelecidos por padrões.
4.8 Coleta laboratorial domiciliar: Realização da coleta de amostra de paciente em sua residência.
4.9 Coleta laboratorial em empresa: Realização da coleta de amostra de paciente no âmbito de uma
empresa.
4.10 Coleta laboratorial em unidade móvel: Realização da coleta de amostra de paciente em unidade
móvel.
4.11 Controle da qualidade: Técnicas e atividades operacionais utilizadas para monitorar o
cumprimento dos requisitos da qualidade especificados.
4.12 Controle externo da qualidade - CEQ: Atividade de avaliação do desempenho de sistemas
analíticos através de ensaios de proficiência, análise de padrões certificados e comparações
interlaboratoriais.Também chamada Avaliação Externa da Qualidade.
4.13 Controle interno da qualidade - CIQ: Procedimentos conduzidos em associação com o exame de
amostras de pacientes para avaliar se o sistema analítico está operando dentro dos limites de
tolerância pré-definidos.
4.14 Desinfecção: Processo físico ou químico que destrói ou inativa a maioria dos microrganismos
patogênicos de objetos inanimados e superfícies, com exceção de esporos bacterianos.
4.15 Ensaio de proficiência: Determinação do desempenho analítico por meio de comparações
interlaboratoriais conduzidas por provedores de ensaio de proficiência.
4.16 Equipamento laboratorial: Designação genérica para um dispositivo empregado pelo laboratório
clínico como parte integrante do processo de realização de análises laboratoriais.
4.17 Esterilização: Processo físico ou químico que destrói todas as formas de vida microbiana, ou seja,
bactérias nas formas vegetativas e esporuladas, fungos e vírus.
4.18 Fase pré-analítica: Fase que se inicia com a solicitação da análise, passando pela obtenção da
amostra e finda ao se iniciar a análise propriamente dita.
4.19 Fase analítica: Conjunto de operações, com descrição especifica, utilizada na realização das
análises de acordo com determinado método.
4.20 Fase pós-analítica: Fase que se inicia após a obtenção de resultados válidos das análises e finda
com a emissão do laudo, para a interpretação pelo solicitante.
4.21 Garantia da qualidade: Conjunto de atividades planejadas, sistematizadas e implementadas com
o objetivo de cumprir os requisitos da qualidade especificados.
4.22 Inspeção sanitária: Conjunto de procedimentos técnicos e administrativos, de competência da
autoridade sanitária local, que previnem e controlam o risco sanitário em estabelecimentos sujeitos a
este controle.

Mod II - 4
4.23 Instrução escrita: Toda e qualquer forma escrita de documentar as atividades realizadas pelo
estabelecimento e ou serviço.
4.24Instrumento laboratorial: Designação genérica para dispositivos empregados pelo laboratório
clínico que auxiliam na execução de uma tarefa analítica.
4.25 Insumo: Designação genérica do conjunto dos meios ou materiais utilizados em um processo
para geração de um produto ou serviço.
4.26 Laboratório clínico: Serviço destinado à análise de amostras de paciente, com a finalidade de
oferecer apoio ao diagnóstico e terapêutico, compreendendo as fases pré-analítica, analítica e pós-
analítica.
4.27 Laboratório de apoio: Laboratório clínico que realiza análises em amostras enviadas por outros
laboratórios clínicos.
4.28 Laudo laboratorial: Documento que contém os resultados das análises laboratoriais, validados e
autorizados pelo responsável técnico do laboratório ou seu substituto.
4.29 Limpeza: Processo sistemático e contínuo para a manutenção do asseio ou, quando necessário,
para a retirada de sujidade de uma superfície.
4.30 Material biológico humano: Tecido ou fluido constituinte do organismo humano.
4.31 Metodologia própria em laboratório clínico (in house): Reagentes ou sistemas analíticos
produzidos e validados pelo próprio laboratório clínico, exclusivamente para uso próprio, em pesquisa
ou em apoio diagnóstico.
4.32 Paciente de laboratório: Pessoa da qual é coletado o material ou amostra biológica para ser
submetida à análise laboratorial.
4.33 Posto de coleta laboratorial: Serviço vinculado a um laboratório clínico, que realiza atividade
laboratorial, mas não executa a fase analítica dos processos operacionais, exceto os exames
presenciais, cuja realização ocorre no ato da coleta.
4.34 Produto para diagnóstico de uso in vitro: Reagentes, padrões, calibradores, controles, materiais,
artigos e instrumentos, junto com as instruções para seu uso, que contribuem para realizar uma
determinação qualitativa, quantitativa ou semi-quantitativa de uma amostra biológica e que não
estejam destinados a cumprir função anatômica, física ou terapêutica alguma, que não sejam
ingeridos, injetados ou inoculados em seres humanos e que são utilizados unicamente para provar
informação sobre amostras obtidas do organismo humano.
4.35 Profissional legalmente habilitado: Profissional com formação superior inscrito no respectivo
Conselho de Classe, com suas competências atribuídas por Lei.
4.36 Rastreabilidade: Capacidade de recuperação do histórico, da aplicação ou da localização daquilo
que está sendo considerado, por meio de identificações registradas.
4.37 Responsável Técnico - RT: Profissional legalmente habilitado que assume perante a Vigilância
Sanitária a Responsabilidade Técnica do laboratório clínico ou do posto de coleta laboratorial.
4.38 Saneante: Substância ou preparação destinada à higienização, desinfecção, esterilização ou
desinfestação domiciliar, em ambientes coletivos, públicos e privados, em lugares de uso comum e no
tratamento da água.

Mod II - 5
4.39 Supervisão: Atividade realizada com a finalidade de verificar o cumprimento das especificações
estabelecidas nos processos operacionais.
4.40 Teste Laboratorial Remoto-TLR: Teste realizado por meio de um equipamento laboratorial situado
fisicamente fora da área de um laboratório clínico. Também chamado Teste Laboratorial Portátil -TLP,
do inglês Point-of-care testing -POCT.
4.41 Validação: Procedimento que fornece evidências de que um sistema apresenta desempenho
dentro das especificações da qualidade, de maneira a fornecer resultados válidos.
4.42 Verificação da calibração: Ato de demonstrar que um equipamento de medição apresenta
desempenho dentro dos limites de aceitabilidade, em situação de uso.
5 CONDIÇÕES GERAIS
51 Organização
51.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem possuir alvará atualizado, expedido
pelo órgão sanitário competente.
51.2 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem possuir um profissional legalmente
habilitado como responsável técnico.
5.1.2.1 O profissional legalmente habilitado pode assumir, perante a vigilância sanitária, a
responsabilidade técnica por no máximo: 02 (dois) laboratórios clínicos ou 02 (dois) postos de coleta
laboratorial ou 01 (um) laboratório clínico e 01 (um) posto de coleta laboratorial.
51.2.2 Em caso de impedimento do responsável técnico, o laboratório clínico e o posto de coleta
laboratorial devem contar com um profissional legalmente habilitado para substituí-lo.
51.3 Todo laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial, público e privado devem estar inscritos
no Cadastro Nacional de Estabelecimentos de Saúde - CNES.
5.1.4 A direção e o responsável técnico do laboratório clínico e do posto de coleta laboratorial têm a
responsabilidade de planejar, implementar e garantir a qualidade dos processos, incluindo:
a) a equipe técnica e os recursos necessários para o desempenho de suas atribuições;
b) a proteção das informações confidenciais dos pacientes;
c) a supervisão do pessoal técnico por profissional de nível superior legalmente habilitado durante o
seu período de funcionamento;
d) os equipamentos, reagentes, insumos e produtos utilizados para diagnóstico de uso “in vitro”, em
conformidade com a legislação vigente;
e) a utilização de técnicas conforme recomendações do fabricante (equipamentos e produtos) ou com
base científica comprovada;
f) a rastreabilidade de todos os seus processos.
5.1.5 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de instruções escritas e
atualizadas das rotinas técnicas implantadas.
5.1.6 O posto de coleta laboratorial deve possuir vínculo com apenas um laboratório clínico.
5.1.6.1 Os postos de coleta laboratorial localizados em unidades públicas de saúde devem ter seu
vínculo definido formalmente pelo gestor local.

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5.1.7 O laboratório clínico deve possuir estrutura organizacional documentada.
5.1.8 As atividades de coleta domiciliar, em empresa ou em unidade móvel devem estar vinculadas a
um laboratório clínico e devem seguir os requisitos aplicáveis definidos neste Regulamento Técnico.
5.2.Recursos Humanos
5.2.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem manter disponíveis registros de
formação e qualificação de seus profissionais compatíveis com as funções desempenhadas.
5.2.2 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem promover treinamento e educação
permanente aos seus funcionários mantendo disponíveis os registros dos mesmos.
5.2.3 Todos os profissionais do laboratório clínico e do posto de coleta laboratorial devem ser
vacinados em conformidade com a legislação vigente.
5.2.4 A admissão de funcionários deve ser precedida de exames médicos em conformidade com o
PCMSO da NR-7 da Portaria MTE nº 3214 de 08/06/1978 e Lei nº 6514 de 22/12/1977, suas
atualizações ou outro instrumento legal que venha substituí-la.
5.3 Infra-Estrutura
5.3.1 A infra-estrutura física do laboratório clínico e do posto de coleta devem atender aos requisitos
da RDC/ANVISA nº. 50 de 21/02/2002, suas atualizações, ou outro instrumento legal que venha
substituí-la.
5.4 Equipamentos e Instrumentos Laboratoriais
5.4.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem:
a) possuir equipamentos e instrumentos de acordo com a complexidade do serviço e necessários ao
atendimento de sua demanda;
b) manter instruções escritas referentes a equipamento ou instrumento, as quais podem ser
substituídas ou complementadas por manuais do fabricante em língua portuguesa;
c) realizar e manter registros das manutenções preventivas e corretivas;
d) verificar ou calibrar os instrumentos a intervalos regulares, em conformidade com o uso, mantendo
os registros dos mesmos;
e) verificar a calibração de equipamentos de medição mantendo registro das mesmas.
5.4.2 Os equipamentos e instrumentos utilizados, nacionais e importados, devem estar regularizados
junto a ANVISA/MS, de acordo com a legislação vigente.
5.4.3 Os equipamentos que necessitam funcionar com temperatura controlada devem possuir registro
da verificação da mesma.
5.5 Produtos para diagnóstico de uso in vitro
5.5.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem registrar a aquisição dos produtos
para diagnóstico de uso in vitro, reagentes e insumos, de forma a garantir a rastreabilidade.
5.5.2 Os produtos para diagnóstico de uso in vitro, reagentes e insumos adquiridos devem estar
regularizados junto a ANVISA/MS de acordo com a legislação vigente.

Mod II - 7
5.5.3 O reagente ou insumo preparado ou aliquotado pelo próprio laboratório deve ser identificado
com rótulo contendo: nome, concentração, número do lote (se aplicável), data de preparação,
identificação de quem preparou (quando aplicável), data de validade, condições de armazenamento,
além de informações referentes a riscos potenciais.
5.5.3.1 Devem ser mantidos registros dos processos de preparo e do controle da qualidade dos
reagentes e insumos preparados.
5.5.4 A utilização dos reagentes e insumos deve respeitar as recomendações de uso do fabricante,
condições de preservação, armazenamento e os prazos de validade, não sendo permitida a sua
revalidação depois de expirada a validade.
5.5.5 O laboratório clínico que utilizar metodologias próprias - In House, deve documentá-las
incluindo, no mínimo:
a) descrição das etapas do processo;
b) especificação e sistemática de aprovação de insumos, reagentes e equipamentos e instrumentos.
c) sistemática de validação.
5.5.5.1 O laboratório clínico deve manter registro de todo o processo e especificar no laudo que o
teste é preparado e validado pelo próprio laboratório.
5.6 Descarte de Resíduos e Rejeitos
5.6.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem implantar o Plano de Gerenciamento
de Resíduos de Serviços de Saúde (PGRSS) atendendo aos requisitos da RDC/ANVISA n° 306 de
07/12/2004, suas atualizações, ou outro instrumento legal que venha substituí-la.
5.7 Biossegurança
5.7.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem manter atualizados e disponibilizar, a
todos os funcionários, instruções escritas de biossegurança, contemplando no mínimo os seguintes
itens:
a) normas e condutas de segurança biológica, química, física, ocupacional e ambiental;
b) instruções de uso para os equipamentos de proteção individual (EPI) e de proteção coletiva (EPC);
c) procedimentos em caso de acidentes;
d) manuseio e transporte de material e amostra biológica.
5.7.2 O Responsável Técnico pelo laboratório clínico e pelo posto de coleta laboratorial deve
documentar o nível de biossegurança dos ambientes e/ou áreas, baseado nos procedimentos
realizados, equipamentos e microorganismos envolvidos, adotando as medidas de segurança
compatíveis.
5.8 Limpeza, Desinfecção e Esterilização
5.8.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem possuir instruções de limpeza,
desinfecção e esterilização, quando aplicável, das superfícies, instalações, equipamentos, artigos e
materiais.

Mod II - 8
5.8.2 Os saneantes e os produtos usados nos processos de limpeza e desinfecção devem ser utilizados
segundo as especificações do fabricante e estarem regularizados junto a ANVISA/MS, de acordo com a
legislação vigente.
6 PROCESSOS OPERACIONAIS
6.1 Fase pré-analítica
6.1.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem disponibilizar ao paciente ou
responsável, instruções escritas e ou verbais, em linguagem acessível, orientando sobre o preparo e
coleta de amostras tendo como objetivo o entendimento do paciente.
6.1.2 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem solicitar ao paciente documento que
comprove a sua identificação para o cadastro.
6.1.2.1 Para pacientes em atendimento de urgência ou submetidos a regime de internação, a
comprovação dos dados de identificação também poderá ser obtida no prontuário médico.
6.1.3 Os critérios de aceitação e rejeição de amostras, assim como a realização de exames em
amostras com restrições devem estar definidos em instruções escritas.
6.1.4 O cadastro do paciente deve incluir as seguintes informações:
a) número de registro de identificação do paciente gerado pelo laboratório;
b) nome do paciente;
c) idade, sexo e procedência do paciente;
d) telefone e/ou endereço do paciente, quando aplicável;
e) nome e contato do responsável em caso de menor de idade ou incapacitado;
f) nome do solicitante;
g) data e hora do atendimento;
h) horário da coleta, quando aplicável;
i) exames solicitados e tipo de amostra;
j) quando necessário: informações adicionais, em conformidade com o exame (medicamento em uso,
dados do ciclo menstrual, indicação/observação clínica, dentre outros de relevância);
k) data prevista para a entrega do laudo;
l) indicação de urgência, quando aplicável.
6.1.5 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem fornecer ao paciente ambulatorial ou
ao seu responsável, um comprovante de atendimento com: número de registro, nome do paciente,
data do atendimento, data prevista de entrega do laudo, relação de exames solicitados e dados para
contato com o laboratório.
6.1.6. O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de meios que permitam a
rastreabilidade da hora do recebimento e/ou coleta da amostra.
6.1.7 A amostra deve ser identificada no momento da coleta ou da sua entrega quando coletada pelo
paciente.

Mod II - 9
6.1.7.1 Deve ser identificado o nome do funcionário que efetuou a coleta ou que recebeu a amostra de
forma a garantir a rastreabilidade.
6.1.8 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de instruções escritas que
orientem o recebimento, coleta e identificação de amostra.
6.1.9 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem possuir instruções escritas para o
transporte da amostra de paciente, estabelecendo prazo, condições de temperatura e padrão técnico
para garantir a sua integridade e estabilidade.
6.1.10 A amostra de paciente deve ser transportada e preservada em recipiente isotérmico, quando
requerido, higienizável, impermeável, garantindo a sua estabilidade desde a coleta até a realização do
exame, identificado com a simbologia de risco biológico, com os dizeres “Espécimes para Diagnóstico”
e com nome do laboratório responsável pelo envio.
6.1.11 O transporte da amostra de paciente, em áreas comuns a outros serviços ou de circulação de
pessoas, deve ser feito em condições de segurança conforme item 5.7.
6.1.12 Quando da terceirização do transporte da amostra, deve existir contrato formal obedecendo
aos critérios estabelecidos neste Regulamento.
6.1.13 Quando da importação ou exportação de “Espécimes para Diagnóstico”, devem ser seguidas a
RDC/ANVISA nº 01, de 06 de dezembro de 2002 e a Portaria MS nº 1985, de 25 de outubro de 2001,
suas atualizações ou outro instrumento legal que venha substituí-las.
6.2. Fase Analítica
6.2.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de instruções escritas,
disponíveis e atualizadas para todos os processos analíticos, podendo ser utilizadas as instruções do
fabricante.
6.2.2 O processo analítico deve ser o referenciado nas instruções de uso do fabricante, em referências
bibliográficas ou em pesquisa cientificamente válida conduzida pelo laboratório.
6.2.3 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem disponibilizar por escrito, uma
relação que identifique os exames realizados no local, em outras unidades do próprio laboratório e os
que são terceirizados.
6.2.4 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem definir mecanismos que possibilitem
a agilização da liberação dos resultados em situações de urgência.
6.2.5 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem definir limites de risco, valores
críticos ou de alerta, para os analitos com resultado que necessita tomada imediata de decisão.
6.2.5.1 O laboratório e o posto de coleta laboratorial devem definir o fluxo de comunicação ao médico,
responsável ou paciente quando houver necessidade de decisão imediata.
6.2.6 O laboratório clínico deve monitorar a fase analítica por meio de controle interno e externo da
qualidade.
6.2.7 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem definir o grau de pureza da água
reagente utilizada nas suas análises, a forma de obtenção, o controle da qualidade.
6.2.8 O laboratório clínico pode contar com laboratórios de apoio para realização de exames.
6.2.8.1 O laboratório de apoio deve seguir o estabelecido neste regulamento técnico.

Mod II - 10
6.2.9 O laboratório clínico deve:
a) manter um cadastro atualizado dos laboratórios de apoio;
b) possuir contrato formal de prestação destes serviços;
c) avaliar a qualidade dos serviços prestados pelo laboratório de apoio.
6.2.10 O laudo emitido pelo laboratório de apoio deve estar disponível e arquivado pelo prazo de 5
(cinco) anos.
6.2.11 Os serviços que realizam testes laboratoriais para detecção de anticorpos anti-HIV devem
seguir, o disposto neste Regulamento Técnico, além do disposto na Portaria MS nº. 59 de 28 de
janeiro de 2003 e na Portaria SVS nº. 34 de 28 de julho de 2005, suas atualizações ou outro
instrumento legal que venha substituí-la.
6.2.12 Os resultados laboratoriais que indiquem suspeita de doença de notificação compulsória devem
ser notificados conforme o estabelecido no Decreto no 49.974-A, de 21 de janeiro de 1961, e na
Portaria no 2325, de 08 de dezembro de 2003, suas atualizações, ou outro instrumento legal que
venha a substituí-la.
6.2.13 A execução dos Testes Laboratoriais Remotos - TLR (Point-of-care) e de testes rápidos, deve
estar vinculada a um laboratório clínico, posto de coleta ou serviço de saúde pública ambulatorial ou
hospitalar.
6.2.14 O Responsável Técnico pelo laboratório clínico é responsável por todos os TLR realizados dentro
da instituição, ou em qualquer local, incluindo, entre outros, atendimentos em hospital-dia, domicílios
e coleta laboratorial em unidade móvel.
6.2.15 A relação dos TLR que o laboratório clínico executa deve estar disponível para a autoridade
sanitária local.
6.2.15.1 O laboratório clínico deve disponibilizar nos locais de realização de TLR procedimentos
documentados orientando com relação às suas fases pré-analítica, analítica e pós-analítica, incluindo:
a) sistemática de registro e liberação de resultados provisórios;
b) procedimento para resultados potencialmente críticos;
c) sistemática de revisão de resultados e liberação de laudos por profissional habilitado.
6.2.15.2 A realização de TRL e dos testes rápidos está condicionada a emissão de laudos que
determine suas limitações diagnósticas e demais indicações estabelecidos no item 6.3.
6.2.15.3 O laboratório clínico deve manter registros dos controles da qualidade, bem como
procedimentos para a realização dos mesmos.
6.2.15.4 O laboratório clínico deve promover e manter registros de seu processo de educação
permanente para os usuários dos equipamentos de TLR.
6.3 Fase pós-analítica
6.3.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem possuir instruções escritas para
emissão de laudos, que contemplem as situações de rotina, plantões e urgências.
6.3.2 O laudo deve ser legível, sem rasuras de transcrição, escrito em língua portuguesa, datado e
assinado por profissional de nível superior legalmente habilitado.

Mod II - 11
6.3.3 O laudo deve conter no mínimo os seguintes itens:
a) identificação do laboratório;
b) endereço e telefone do laboratório;
c) identificação do Responsável Técnico (RT);
d) nº. de registro do RT no respectivo conselho de classe profissional;
e) identificação do profissional que liberou o exame;
f) nº. registro do profissional que liberou o exame no respectivo conselho de classe do profissional
g) nº. de registro do Laboratório Clínico no respectivo conselho de classe profissional;
h) nome e registro de identificação do cliente no laboratório;
i) data da coleta da amostra;
j) data de emissão do laudo;
k) nome do exame, tipo de amostra e método analítico;
l) resultado do exame e unidade de medição;
m) valores de referência, limitações técnicas da metodologia e dados para interpretação;
n) observações pertinentes.
6.3.4 Quando for aceita amostra de paciente com restrição, esta condição deve constar no laudo.
6.3.5 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial que optarem pela transcrição do laudo
emitido pelo laboratório de apoio, devem garantir a fidedignidade do mesmo, sem alterações que
possam comprometer a interpretação clínica.
6.3.6 O responsável pela liberação do laudo pode adicionar comentários de interpretação ao texto do
laboratório de apoio, considerando o estado do paciente e o contexto global dos exames do mesmo.
6.3.7 O laudo de análise do diagnóstico sorológico de Anticorpos Anti-HIV deve estar de acordo com a
Portaria MS nº 59/2003, suas atualizações ou outro instrumento legal que venha a substituí-la.
6.3.8 As cópias dos laudos de análise bem como dados brutos devem ser arquivados pelo prazo de 5
(cinco) anos, facilmente recuperáveis e de forma a garantir a sua rastreabilidade.
6.3.8.1 Caso haja necessidade de retificação em qualquer dado constante do laudo já emitido, a
mesma dever ser feita em um novo laudo onde fica clara a retificação realizada.
7 REGISTROS
7.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial devem garantir a recuperação e
disponibilidade de seus registros críticos, de modo a permitir a rastreabilidade do laudo liberado.
7.2 As alterações feitas nos registros críticos devem conter data, nome ou assinatura legível do
responsável pela alteração, preservando o dado original.

Mod II - 12
8 GARANTIA DA QUALIDADE
8.1 O laboratório clínico deve assegurar a confiabilidade dos serviços laboratoriais prestados, por meio
de, no mínimo:
a) controle interno da qualidade;
b) controle externo da qualidade (ensaios de proficiência).
9 CONTROLE DA QUALIDADE
9.1 Os programas de Controle Interno da Qualidade (CIQ) e Controle Externo da Qualidade (CEQ)
devem ser documentados, contemplando:
a) lista de analitos;
b) forma de controle e freqüência de utilização;
c) limites e critérios de aceitabilidade para os resultados dos controles;
d) avaliação e registro dos resultados dos controles.
9.2 Controle Interno da Qualidade - CIQ
9.2.1 O laboratório clínico deve realizar Controle Interno da Qualidade contemplando:
a) monitoramento do processo analítico pela análise das amostras controle, com registro dos
resultados obtidos e análise dos dados;
b) definição dos critérios de aceitação dos resultados por tipo de analito e de acordo com a
metodologia utilizada;
c) liberação ou rejeição das análises após avaliação dos resultados das amostras controle.
9.2.2 Para o CIQ, o laboratório clínico deve utilizar amostras controle comerciais, regularizados junto a
ANVISA/MS de acordo com a legislação vigente.
9.2.2.1 Formas alternativas descritas na literatura podem ser utilizadas desde que permitam a
avaliação da precisão do sistema analítico.
9.2.3 O laboratório clínico deve registrar as ações adotadas decorrentes de rejeições de resultados de
amostras controle.
9.2.4 As amostras controle devem ser analisadas da mesma forma que amostras dos pacientes.
9.3 Controle Externo da Qualidade - CEQ
9.3.1 O laboratório clínico deve participar de Ensaios de Proficiência para todos os exames realizados
na sua rotina.
9.3.1.1 Para os exames não contemplados por programas de Ensaios de Proficiência, o laboratório
clínico deve adotar formas alternativas de Controle Externo da Qualidade descritas em literatura
científica.
9.3.2 A participação em Ensaios de Proficiência deve ser individual para cada unidade do laboratório
clínico que realiza as análises.
9.3.3 A normalização sobre o funcionamento dos Provedores de Ensaios de Proficiência será definida
em resolução específica, desta ANVISA .

Mod II - 13
9.3.4 O laboratório clínico deve registrar os resultados do Controle Externo da Qualidade,
inadequações, investigação de causas e ações tomadas para os resultados rejeitados ou nos quais a
proficiência não foi obtida.
9.3.5 As amostras controle devem ser analisadas da mesma forma que as amostras dos pacientes.
10 DISPOSIÇÕES TRANSITÓRIAS
10.1 O laboratório clínico e o posto de coleta laboratorial têm o prazo de 180 (cento e oitenta) dias
para se adequarem ao estabelecido neste Regulamento Técnico a partir da data de sua publicação.
11 REFERÊNCIAS NORMATIVAS E BIBLIOGRÁFICAS
11.1 BRASIL. Presidência da República. Decreto nº. 49.974-A, de 21 de janeiro de 1961.
Regulamenta, sob a denominação de Código Nacional de Saúde, a Lei nº. 2.321, de 3 de setembro de
1954, de "Normas Gerais sobre Defesa e Proteção da Saúde". Diário Oficial da União da República
Federativa do Brasil, Brasília, 6 fev.1961.
11.2 BRASIL. Congresso Nacional. Lei nº. 6360 de 23 de setembro de 1976. Dispõe sobre a vigilância
sanitária a que ficam sujeitos os medicamentos, as drogas, os insumos farmacêuticos e correlatos,
cosméticos, saneantes e outros produtos, e dá outras providências. Diário Oficial da União da
República Federativa do Brasil, Brasília, 24 set. 1976.
11.3 BRASIL. Congresso Nacional. Lei nº. 6437 de 20 de agosto de 1977. Configura infrações à
legislação sanitária federal, estabelece as sanções respectivas, e dá outras providências. Diário Oficial
da União da República Federativa do Brasil, Brasília, 24 ago. 1977.
11.4 BRASIL. Congresso Nacional. Lei n 8078, de 11 de setembro de 1990. Código de Defesa do
Consumidor. Diário Oficial da União da República Federativa do Brasil, Brasília, v. 128, n. 176, supl. p.
1, 12 de set. 1990.
11.5 BRASIL. Ministério da Saúde. Manual de Processamento de Artigos e Superfícies em
Estabelecimentos de Saúde. 2ª edição. Brasília, Centro de Documentação. 1994
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/processamento_artigos.pdf
11.6 BRASIL. Ministério da Saúde. Manual de Conduta - Exposição Ocupacional a Material Biológico:
Hepatite e HIV / Coordenação Nacional de DST e AIDS - Brasília: Ministério da Saúde 1999. 20p.
http://dtr2001.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_condutas_hepatite_hiv.pdf
11.7 BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Biossegurança em Laboratórios
Biomédicos e de Microbiologia. 4ª edição. Brasília. 2000.
http://dtr2001.saude.gov.br/svs/pub/pub22.htm
11.8 BRASIL Ministério da Saúde. Secretaria Executiva. Subsecretaria de Assuntos
Administrativos.Vocabulário da Saúde em Qualidade e Melhoria da Gestão / Secretaria Executiva,
Subsecretaria de Assuntos Administrativos; elaboração de Jeová Dias Martins. -Brasília: Ministério da
Saúde, 2002. 98 p. (Série F. Comunicação e Educação em Saúde).
11.9 BRASIL. Ministério da Saúde. Glossário do Ministério da Saúde: projeto terminologia em saúde /
Ministério da Saúde - Brasília. Ministério da Saúde, 2004.
11.10 BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Portaria nº. 8, de 23 de janeiro
de 1996. Dispõe sobre o registro de produtos para diagnóstico de uso in vitro na Secretaria de
Vigilância Sanitária. Diário Oficial da União da República Federativa do Brasil, Brasília, 24 jan. 1996.

Mod II - 14
11.11 BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº. 1985, de 25 de outubro de 2001. Aprova o
Regulamento Técnico MERCOSUL para Transporte no MERCOSUL de Substâncias Infecciosas e
Amostras para Diagnóstico, no MERCOSUL que consta como Anexo e faz parte da presente Portaria.
Diário Oficial da União da República Federativa do Brasil, Brasília, 06 nov. 2001.
11.12. BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº. 1.943, de 18 de outubro de 2001 Define a relação de
doenças de notificação compulsória para todo território nacional. Diário Oficial da União da República
Federativa do Brasil, Brasília, 24 out. 2001.
11.13 BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº. 787, de 23 de outubro de 2002 - parte 1. Manual de
Apoio aos Gestores do SUS - Organização da Rede de Laboratórios Clínicos. Diário Oficial da União da
República Federativa do Brasil, Brasília, 24 out. 2002.
11.14 BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº. 788, de 23 de outubro de 2002. Manual de Apoio aos
Gestores do Sistema Único de Saúde - SUS para a Organização dos Postos de Coleta da Rede de
Laboratórios Clínicos. Diário Oficial da União da República Federativa do Brasil, Brasília, 24 out. 2002.
11.15 BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº. 59, de 28 de janeiro de 2003. Dispõe sobre a sub-
rede de laboratórios do Programa Nacional de DST e Aids. Diário Oficial da União da República
Federativa do Brasil, Brasília, Edição Extra, 30 jan. 2003.
11.16 BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº.34 de 28 de julho de 2005 Regulamenta o uso de
testes rápidos para diagnóstico da infecção pelo HIV em situações especiais. Diário Oficial da União da
República Federativa do Brasil, Brasília, Edição de 29 jul. 2005.
11.17 BRASIL. Ministério do Trabalho. Gabinete do Ministro. Portaria nº. 3.214, de 08 de junho de
1978. Dispõe sobre a Aprovação das Normas Regulamentadoras -NR- do Capítulo V, Título II, da
Consolidação das Leis do Trabalho, relativas à Segurança e Medicina do TrabaIho. Diário Oficial da
República Federativa do Brasil, Brasília, 06 jul. 1978.
11.18 BRASIL. Ministério do Trabalho. Portaria nº. 8, de 08 de maio de 1996- NR 07. Altera Norma
Regulamentadora NR-7- Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional. Diário Oficial da União
da República Federativa do Brasil, Brasília, v. 134, nº. 91, p. 8202, 13 mai. 1996.
11.19 BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº. 185,
de 22 de outubro de 2001. Aprova o Regulamento Técnico que consta no anexo desta Resolução, que
trata do registro, alteração, revalidação e cancelamento do registro de produtos médicos na Agência
Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Diário Oficial da União da República Federativa do Brasil,
Brasília, 24 out. 2001.
de 21 de fevereiro de 2002. Dispõe sobre o Regulamento Técnico para planejamento, programação,
elaboração e avaliação de projetos físicos de estabelecimentos assistenciais de saúde. Diário Oficial da
União da República Federativa do Brasil. Brasília, 20 mar. 2002.
de 23 de setembro de 2002. Regula os produtos para a saúde. Diário Oficial da União da República
Federativa do Brasil, Brasília, 03 out. 2002.
de 06 dezembro de 2002. Aprovar, conforme Anexo, o Regulamento Técnico para fins de vigilância
sanitária de mercadorias importadas. Retificação - Diário Oficial da União da República Federativa do
Brasil, Brasília, 10 jan. 2003 - Prorrogada pela Resolução RDC nº. 20, de 30 de janeiro de 2003.

Mod II - 15
de 25 de fevereiro de 2003. Dispõe sobre o Regulamento Técnico para o gerenciamento de resíduos
de serviços de saúde Diário Oficial da União da República Federativa do Brasil, Brasília, 05 mar. 2003.
11.23 IATA - Dangerous Good Regulations (DGR) 44ª. Edicion, 2003.
11.24 ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas - Gestão da qualidade no laboratório clínico -
NBR 14500 - jun 2000.
11.25 ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas - Glossário de termos para uso no laboratório
clínico e no diagnóstico in vitro - NBR - 14501 - mar 2001.
11.26 ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas - Diagnóstico in vitro - Recomendações e
critérios para aquisição, recepção, transporte e armazenamento de produtos - NBR 14711 - jun 2001.
11.27 ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas - Laboratório Clínico - NBR 14785 - dez de
2001.
11.28 ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas - Laboratório Clínico - Requisitos de segurança
- NBR 14785 - dez 2001.
11.29 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Guideline for the Safe Transport of Infectious Substances and
Diagnostic Specimens, Who/EMC/97.3. [online]. Available from World Wide Web:
http://www.who.int/emc/pdfs/emc97_3.pdf

Mod II - 16
2. REQUISITOS BÁSICOS PARA LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
INTRODUÇÃO
Elaborar e viabilizar normas para coleta, conservação e transporte de material de interesse clínico;
Estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes,
que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de importância
clínica, por gênero e, se possível, por espécie;
Determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas;
Efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização;
Divulgar e implementar normas de biossegurança;
Participar junto com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do rastreamento
epidemiológico dos surtos de infecção hospitalar;
Fornecer periodicamente dados relacionados com a etiologia das infecções hospitalares e da
resistência às drogas;
Executar outras atividades afins de natureza não rotineira e de relevância em determinadas
situações como, por exemplo, estudos microbiológicos de materiais inanimados, portadores,
desinfetantes, etc.
INFRA-ESTRUTURA FÍSICA
RECURSOS MATERIAIS
O equipamento mínimo para funcionamento de um laboratório de microbiologia consiste em:
estufa bacteriológica
forno de Pasteur
autoclave
microscópio binocular
centrifugador de baixa rotação
homogeneizador
banho-maria de pequena dimensão
destilador para água
balança para tarar tubos
balança comum com uma ou duas casas
decimais
bico de Bunsen
geladeira
capela de fluxo laminar
Além desse equipamento mínimo, o laboratório poderá contar com outros aparelhos opcionais:
microscópio estereoscópico
congelador (-20o
C ou -70o
C)
bomba de vácuo para filtração com membranas
potenciômetro
balança analítica
RECURSOS HUMANOS
É recomendável que a supervisão técnico-científica do laboratório esteja a cargo de médico ou
profissional de nível superior, especializado em microbiologia, e, se possível, em tempo integral.

Mod II - 17
BIOSSEGURANÇA E CONTROLE DE QUALIDADE
Nota-se que os laboratórios e hospitais são estruturas prestadoras de serviços em saúde, e portanto,
estão constantemente envolvidos em manejo de riscos. Este é estabelecido para evitar e reduzir ao
mínimo as possibilidades de acidentes ou práticas de alto risco que potencialmente podem causar
dano tanto aos funcionários como aos pacientes. Sendo assim o manejo de risco deve garantir não
somente um ambiente de trabalho seguro, mas também condições adequadas para que os pacientes
possam se submeter aos procedimentos clínicos mais avançados e obter diagnósticos confiáveis.
Dessa forma o manejo de risco tem como objetivo a implantação de práticas de segurança laboratorial
e de controle de qualidade dos serviços.
SEGURANÇA LABORATORIAL
Pode ser definida como sendo um conjunto de ações voltadas para a prevenção, minimização ou
eliminação de riscos inerentes a estas atividades e que podem comprometer a saúde do homem, dos
animais, do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.
A rotina do Laboratório de Microbiologia envolve exposição tanto com material clínico e reagentes
químicos como com potenciais agentes patogênicos concentrados em meio de cultura. Assim
profissionais da área de saúde e outros trabalhadores que exercem suas atividades em laboratórios,
estão sob risco de desenvolver doença por exposição a agentes infecciosos, produtos químicos tóxicos
e inflamáveis, entre outros.
Atualmente, com a sofisticação das novas técnicas de diagnóstico, observamos profissionais de outras
áreas, tais como físicos, químicos, analistas de sistemas, etc, envolvidos em atividades com exposição
a agentes infecciosos e por outro lado, microbiologistas manipulando substâncias químicas ou
materiais radioativos.
A responsabilidade legal pela segurança em ambientes de trabalho cabe aos administradores de
hospitais e laboratórios. No entanto, os funcionários também são responsáveis pela sua adesão às
técnicas microbiológicas seguras e da incorporação das normas de biossegurança ao seu trabalho
diário delineadas no “Manual de Segurança de Laboratório”.
Deve-se designar um encarregado ou uma comissão de segurança cujas atribuições incluem a
redação, publicação e implementação das normas e instruções de segurança. Dentre os regulamentos
de segurança inclui-se medidas de proteção pessoal; manuseio de equipamentos, amostras e
materiais; e outras precauções. Os funcionários devem ser informados destas normas e instruções
através de cursos e treinamentos regularmente programados. Cabe também ao encarregado/comissão
de segurança juntamente com os administradores/supervisores dos hospitais e laboratórios de ajustar
e corrigir falhas ou irregularidades de conduta.
CONTROLE DE QUALIDADE
Para o programa básico de controle de qualidade em microbiologia, deve-se incluir, além de uma lista
de itens específicos, o senso comum, o bom julgamento e uma constante atenção aos detalhes. Para o
controle de qualidade deve-se estabelecer o padrão mínimo e delinear as diversas etapas que devem
ser seguidas para o controle diário e vigilância de todas as facetas do programa.
As diretrizes para o controle de qualidade devem constar em um manual, no qual estejam detalhadas
práticas tais como procedimentos para monitorar o funcionamento dos equipamentos, o controle da
reatividade dos meios e reagentes, os prazos de validade, os resultados de todos os testes, etc.
Devem ser elaborados formulários adequados para coletar dados, de modo que qualquer
anormalidade possa ser facilmente detectada. O encarregado também deve revisar todos os registros
de controle e verificar que sejam anotadas todas as incidências fora do controle e as respectivas ações
corretivas tomadas.
Os laboratórios devem também dispor de uma lista de inspeção para realizar avaliações pontuais dos
controles de qualidade – um requerimento para credenciamento de laboratórios e/ou auditoria e
fiscalização sanitária.
Procedimento Operacional Padrão (POP)

Mod II - 18
Para melhoria na qualidade dentro do laboratório recomenda-se a elaboração de POPs, ou seja,
protocolos que descrevem detalhadamente cada atividade realizada no laboratório, desde a coleta até
a emissão do resultado final, incluindo utilização de equipamentos, procedimentos técnicos e inclusive
cuidados de biossegurança e condutas a serem adotadas em acidentes.
Os POPs têm como objetivo padronizar todas as ações para que diferentes técnicos possam
compreender e executar, da mesma maneira, uma determinada tarefa, garantindo assim qualidade.
Esses protocolos devem estar escritos de forma clara e completa possibilitando a compreensão e
adesão de todos.
Os POPs devem estar disponíveis em local de acesso e conhecido de todos os profissionais que atuam
no ambiente laboratorial, revisados e atualizados periodicamente e devem ser assinados pelo
responsável do laboratório.

Mod II - 19
3. CLASSIFICAÇÃO DOS LABORATÓRIOS SEGUNDO O NÍVEL DE
BIOSSEGURANÇA
CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) é responsável pela maioria das atribuições
relativas ao estabelecimento de normas, análise de risco, acompanhamento, emissão de certificados
de qualidade em biossegurança (CQB) para o desenvolvimento de atividades em laboratório nessa
área, definição do nível de biossegurança e classificação dos OGM (organismos geneticamente
modificados). Também caberá à comissão emitir parecer técnico prévio conclusivo sobre a
biossegurança desses organismos e seus derivados nas atividades de pesquisa e uso comercial.
As características físicas estruturais e de contenção de um laboratório determinam o tipo de
microrganismo que pode ser manipulado em suas dependências.
NÍVEL 1 DE BIOSSEGURANÇA (NB-1) OU PROTEÇÃO BÁSICA (P1)
As práticas, o equipamento de segurança e o projeto das instalações são apropriados para o
treinamento educacional secundário ou para o treinamento de técnicos, e de professores de técnicas
laboratoriais. É adequado ao trabalho que envolva agente com o menor grau de risco para o pessoal
do laboratório e para o meio ambiente. O Bacillus subtilis, o Naegleria gruberi, o vírus da hepatite
canina infecciosa e organismos livres sob as Diretrizes do NIH (National Institute of Health) de DNA
Recombinantes são exemplos de microorganismos que preenchem todos estes requisitos descritos
acima. Muitos agentes que geralmente não estão associados a processos patológicos em homens são,
entretanto, patógenos oportunos e que podem causar uma infecção em jovens, idosos e indivíduos
imunosupressivos ou imunodeprimidos. As cepas de vacina que tenham passado por múltiplas
passagens in vivo não deverão ser consideradas não virulentas simplesmente por serem cepas de
vacinas.
O laboratório, neste caso, não está separado das demais dependências do edifício. O trabalho é
conduzido, em geral, em bancada. Os equipamentos de contenção específicos não são exigidos. O
pessoal de laboratório deverá ter treinamento específico nos procedimentos realizados no laboratório e
deverão ser supervisionados por cientista com treinamento em microbiologia ou ciência correlata.
NÍVEL 2 DE BIOSSEGURANÇA (NB-2) OU (P2)
As práticas, os equipamentos, a planta e a construção das instalações são aplicáveis aos laboratórios
clínicos, de diagnóstico, laboratórios escolas e outros laboratórios onde o trabalho é realizado com um
maior espectro de agentes nativos de risco moderado presentes na comunidade e que estejam
associados a uma patologia humana de gravidade variável. Com boas técnicas de microbiologia, esses
agentes podem ser usados de maneira segura em atividades conduzidas sobre uma bancada aberta,
uma vez que o potencial para a produção de borrifos e aerossóis é baixo. O vírus da hepatite B, o HIV,
a salmonela e o Toxoplasma spp. são exemplos de microorganismos designados para este nível de
contenção. O Nível de Biossegurança 2 é adequado para qualquer trabalho que envolva sangue
humano, líquidos corporais, tecidos ou linhas de células humanas primárias onde a presença de um
agente infeccioso pode ser desconhecido.
(1) O pessoal de laboratório deve ter treinamento técnico específico no manejo de agentes
patogênicos e devem ser supervisionados por cientistas componentes;
(2) O acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos operacionais;
(3) Determinados procedimentos nos quais exista possibilidade de formação de aerossóis infecciosos,
devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica ou outro equipamento de contenção
física.
É aplicável para laboratórios clínicos, de diagnóstico, ensino e pesquisa ou de produção onde o
trabalho com agentes exóticos possa causar doenças sérias ou potencialmente fatais como resultado
de exposição por inalação. A equipe laboratorial deve possuir treinamento específico no manejo de

Mod II - 20
agentes patogênicos e potencialmente letais devendo ser supervisionados por competentes cientistas
que possuam vasta experiência com estes agentes.
Todos os procedimentos que envolverem a manipulação de material infeccioso devem ser conduzidos
dentro de cabines de segurança biológica ou outro sistema de contenção física. Os manipuladores
devem usar roupas de proteção individual.
O laboratório deverá ter instalações compatíveis para o NB-3. Para alguns casos, quando não
existirem as condições específicas para o NB-3, particularmente em instalações laboratoriais sem área
de acesso específica, com ambientes selados ou fluxo de ar unidirecional, as atividades de rotina e
operações repetitivas podem ser realizadas em laboratório com instalações NB-2, desde que
acrescidas das práticas recomendadas para NB-3 e do uso de equipamentos de contenção para NB-3.
Cabe ao Pesquisador Principal a decisão de implementar essas modificações, comunicando-as a CIBio
e CTNBio.
As práticas, o equipamento de segurança, o planejamento e construção das dependências são
aplicáveis para laboratórios clínicos, de diagnósticos, laboratório escola, de pesquisa ou de produções.
Nestes locais, realiza-se o trabalho com agentes nativos ou exóticos que possuam um potencial de
transmissão via respiratória e que podem causar infecções sérias e potencialmente fatais. O
Mycobacterium tuberculosis, o vírus da encefalite de St. Louis e a Coxiella burnetii são exemplos de
microorganismos determinados para este nível. Os riscos primários causados aos trabalhadores que
lidam com estes agentes incluem a auto-inoculação, a ingestão e a exposição aos aerossóis
infecciosos.
São poucos laboratórios no mundo que possuem instalações compatíveis com nível 4 de
biossegurança.
CLASSIFICAÇÃO DO ORGANISMO SEGUNDO SEU POTENCIAL PATOGÊNICO
Classe
de
Risco 1
(baixo risco individual e baixo risco para a comunidade) - organismo que não causa
doença ao homem ou animal. Ex: microrganismos usados na produção de cerveja,
vinho, pão e queijo. (Lactobacillus casei, Penicillium camembertii, S. cerevisiae, etc).
Classe
de
Risco 2
(risco individual moderado e risco limitado para a comunidade) - patógeno que causa
doença ao homem ou aos animais, mas que não consiste em sério risco, a quem o
manipula em condições de contenção, à comunidade, aos seres vivos e ao meio
ambiente. As exposições laboratoriais podem causar infecção, mas a existência de
medidas eficazes de tratamento e prevenção limita o risco.
Exemplo: bactérias - Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus;
vírus - EBV, herpes; fungos - Candida albicans; parasitas - Plasmodium, Schistosoma
Classe
de
Risco 3
(elevado risco individual e risco limitado para a comunidade) - patógeno que
geralmente causa doenças graves ao homem ou aos animais e pode representar um
sério risco a quem o manipula. Pode representar um risco se disseminado na
comunidade, mas usualmente existem medidas de tratamento e de prevenção.
Exemplos: bactérias - Bacillus anthracis, Brucella, Chlamydia psittaci, Mycobacterium
tuberculosis; vírus - hepatites B e C, HTLV 1 e 2, HIV, febre amarela, dengue; fungos -
Blastomyces dermatiolis, Histoplasma; parasitas - Echinococcus, Leishmania,
Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi
Classe
de
Risco 4
(elevado risco individual e elevado risco para a comunidade) - patógeno que representa
grande ameaça para o ser humano e para aos animais, representando grande risco a
quem o manipula e tendo grande poder de transmissibilidade de um indivíduo a outro.
Normalmente não existem medidas preventivas e de tratamento para esses agentes.
Exemplos: Vírus de febres hemorrágicas, Febre de Lassa, Machupo, Ébola, arenavírus e
certos arbovírus.

Mod II - 21
CLASSIFICAÇÃO DOS ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Os OGMs são classificados em Grupo I e Grupo II, conforme o Anexo I da Lei 8.974/95. A classificação
dos OGMs em Grupo I ou Grupo II considera os riscos associados à classe de risco e às características
do organismo receptor ou parental.
OGM DO GRUPO I
Receptor ou parental
-não patogênico.
-isento de agentes adventícios.
- com amplo histórico documentado de utilização segura, ou com a incorporação de barreiras
biológicas que, sem interferir no crescimento ótimo em reator ou fermentador, permita uma
sobrevivência e multiplicação limitadas, sem efeitos negativos para o meio ambiente.
Vetor/Inserto
-deve ser adequadamente caracterizado quanto a todos os aspectos, destacando-se aqueles que
possam representar riscos ao homem e ao meio ambiente, e desprovido de seqüências nocivas
conhecidas.
-deve ser de tamanho limitado, no que for possível, às seqüências genéticas necessárias para realizar
a função projetada.
-não deve incrementar a estabilidade do organismo modificado no meio ambiente.
-deve ser escassamente mobilizável.
- não deve transmitir nenhum marcador de resistência a organismos que, de acordo com os
conhecimentos disponíveis, não o adquira de forma natural.
Microorganismos geneticamente modificados
-não-patogênicos.
-que ofereçam a mesma segurança que o organismo receptor ou parental no reator ou fermentador,
mas com sobrevivência e/ou multiplicação limitadas, sem efeitos negativos para o meio ambiente.
Outros microorganismos geneticamente modificados que poderiam incluir-se no Grupo I, desde que
reúnam as condições estipuladas no item anterior
- microrganismos construídos inteiramente a partir de um único receptor procariótico (incluindo
plasmídeos e vírus endógenos) ou de um único receptor eucariótico (incluindo cloroplastos,
mitocôndrias e plasmídeos, mas excluindo os vírus).
- organismos compostos inteiramente por seqüências genéticas de diferentes espécies que troquem
tais seqüências mediante processos fisiológicos conhecidos.
OGM DO GRUPO II
Todos aqueles não incluídos no grupo II, ou seja, qualquer organismo resultante de organismo
receptor ou parental classificado como patogênico para o homem e animais como classe de risco 2, 3,
ou 4.
Nota: Os laboratórios clínicos e de diagnósticos são geralmente classificados como Nível 2
ou 3 de Biossegurança.

Mod II - 22
4. LABORATÓRIOS NB-1, NB-2 E NB-3
DESIGN E INFRA-ESTRUTURA LABORATORIAIS
Espaço suficiente deve ser projetado de modo a permitir a execução dos procedimentos
laboratoriais de forma organizada e segura, e acesso fácil para limpeza e descontaminação.
Paredes, tetos, pavimentos e bancadas devem ser duráveis, lisas, facilmente laváveis,
impermeáveis a líquidos, resistentes ao calor moderado e aos produtos químicos e desinfetantes
normalmente utilizados no laboratório; o piso deve ser antiderrapante e a exposição de tubulações
deve ser evitada, quando possível.
Nos laboratórios NB-3, aberturas, para manutenção de encanamentos, existentes nas paredes,
tetos e pavimentos devem ser selados para facilitar a descontaminação. Dutos e espaços entre
portas e esquadrias também devem permitir o selamento para facilitar a descontaminação.
A iluminação deve ser adequada para todas as atividades.
Espaço para o armazenamento de insumos e suprimentos deve ser adequado para uso imediato,
evitando assim o aglomeramento nas bancadas e áreas de circulação; espaço adicional para
estoque de insumos e suprimentos laboratoriais deve ser projetado em locais fora das áreas de
trabalho.
Locais específicos para o armazenamento e o manuseio seguro de solventes, materiais radioativos
e gases comprimidos e liquefeitos devem ser proporcionados.
Pertences pessoais dos trabalhadores devem ser mantidos em locais fora das instalações do
laboratório. Os laboratórios NB-3 devem dispor de sala para a troca de roupas.
Cada laboratório deve possuir uma pia para lavagem das mãos, preferencialmente próxima à
saída. Recomendamos a construção de pias que funcionem automaticamente ou que sejam
acionadas com o pé ou com o joelho.
As portas devem ter abertura para fora, serem corta-fogo, dotadas com visores de vidro e que se
fechem automaticamente. É exigido um sistema de portas com trancas em dependências que
abrigarem agentes restritos. Para os laboratórios NB-3 as portas devem ser duplas e que
disponham de um sistema de intertravamento; um dispositivo para saída de emergência deve ser
instalado.
Uma autoclave deve estar disponível no interior ou próximo ao laboratório.
Os sistemas de segurança devem atender emergências elétricas e de incêndio, e os locais que se
encontram o chuveiro e lavador de olho.
As áreas de primeiro-socorro devem estar adequadamente equipadas e de fácil acesso.
Recomenda-se um sistema de ventilação mecânico que oferecem uma circulação interna do ar
sem recirculação; ou janelas que abrem e providas de telas de proteção contra insetos.
Para NB-3:
- O sistema de ventilação deve ser construído para permitir descontaminação de gases e que
mantenha um fluxo de ar unidirecional adequado para o laboratório; o ar circulado no
laboratório não deve ser reciclado para outras áreas do estabelecimento. No entanto, o ar
pode ser filtrado com filtros HEPA, e então recondicionado e recirculado no próprio do
laboratório. O ar de exaustão do laboratório (exceto das cabines de segurança) pode ser
descartado para fora das instalações; recomenda-se que o descarte através de filtros HEPA.
- O ar exaurido das cabines de segurança biológica deve ser retirado diretamente para fora do
ambiente de trabalho através do sistema de exaustão do edifício. Estas deverão estar
conectadas de maneira que evitem qualquer interferência no equilíbrio do ar das cabines ou do
sistema de exaustão do edifício. Quando as cabines de segurança biológica Classe III forem
utilizadas, estas deverão estar conectadas diretamente ao sistema de exaustores.
- Centrífugas de fluxo contínuo ou outros equipamentos que possam produzir aerossóis deverão
ser refreadas através de dispositivos que liberem o ar através de filtros HEPA antes de serem
descarregados do laboratório. Esses sistemas HEPA deverão ser testados anualmente. Uma
outra alternativa seria jogar o ar de saída das cabines para fora, em locais distantes de áreas
ocupadas ou das entradas de ar.

Mod II - 23
- As linhas de vácuo deverão ser protegidas por sifões contendo desinfetantes líquidos e filtros
HEPA, ou o equivalente. Os filtros deverão ser substituídos quando necessário. Uma alternativa
é usar uma bomba a vácuo portátil (também adequadamente protegida com sifões e filtros).
- As janelas devem ser fechadas, lacradas e resistentes a danos físicos.
Deve haver suprimento de boa qualidade de gás, eletricidade assim como de luz de emergência; o
gerador é aconselhável para os equipamentos essenciais como estufas, cabine de segurança
biológica, refrigeradores, etc. A manutenção regular e eficiente desses serviços é obrigatória.
A água de torneira, não é própria para uso no Laboratório Clínico; deve ser providenciado um
sistema adequado de suprimento de água purificada a fim de evitar interferências nos testes ou
ensaios.
Segurança contra incêndios e atos de vandalismo deve ser considerado; portanto portas e janelas
apropriadas e chaves de uso restrito são fundamentais.
Considere a construção de novos laboratórios longe de área públicas.
Laboratórios NB-3 devem estar localizados isoladamente de áreas que são abertas ao tráfego
interno irrestrito; deve ser projetado de modo a impedir a entrada de insetos e outros organismos
indesejáveis.
O projeto da instalação e os procedimentos operacionais do NB-3 devem ser documentados. Os
parâmetros operacionais e das instalações deverão ser verificados quanto ao funcionamento ideal
antes que o estabelecimento inicie suas atividades. As instalações deverão ser verificadas pelo
menos uma vez ao ano.
ACCESSO
Para NB-1, o acesso ao laboratório deve ser limitado ou restrito de acordo com a definição do
chefe de laboratório, quando estiver sendo realizado experimento ou trabalhos com amostras e
culturas; além dessas exigências, nos laboratórios NB-2 e NB-3, o chefe de laboratório tem a
responsabilidade de limitar o acesso; cabe ao mesmo avaliar cada situação e autorizar quem
poderá entrar ou trabalhar no laboratório.
Menores de idade não devem ser autorizadas ou permitidas dentro do laboratório.
As pessoas que apresentarem um risco maior de contaminação ou que possam ter sérias
conseqüências caso sejam contaminadas, não devem ser permitidas dentro dos laboratórios NB-2
e NB-3 ou na sala de animais.
NB-2 e NB-3: as portas devem ser mantidas fechadas e adequadamente identificadas: o símbolo
de “Risco Biológico” deverá ser colocado na entrada do laboratório onde agentes etiológicos
estiverem sendo utilizados. Este sinal de alerta deverá conter informações como o(s) nome(s) o(s)
agente(s) manipulado(s), o nível de biossegurança, as imunizações necessárias, o nome e número
do telefone do pesquisador, o tipo de equipamento de proteção individual que deverá ser usado no
laboratório e os procedimentos necessários para entrar e sair do laboratório.
É proibida a admissão de plantas e animais que não estejam relacionados ao trabalho em
execução no laboratório.
Nos laboratórios NB-3 nenhum indivíduo deve trabalhar sozinho; no mínimo duas pessoas devem
estar nas instalações do laboratório.
EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS LABORATORIAIS
O chefe de laboratório deve assegurar que os equipamentos e acessórios apropriados estejam
disponíveis e que sejam utilizados adequadamente. Os equipamentos devem ser selecionados
baseados nas seguintes premissas:
- Projetado para evitar ou limitar o contato do operador e o material infectante.
- Desenvolvido com materiais impermeáveis a líquidos, resistentes à corrosão e que atendem aos
requerimentos estruturais.
- projetado e instalado para facilitar a operação, manutenção, limpeza e descontaminação; vidraria
e outros produtos quebráveis devem ser evitados sempre que possível.

Mod II - 24
- Especificações devem ser consultadas para se certificar que o equipamento e/ou acessório possui
os dispositivos de segurança.
EQUIPAMENTOS ESSENCIAIS DE SEGURANÇA
Pipetas automáticas, bulbos de borracha ou outros disponíveis; é impróprio e arriscado pipetar
com a boca.
Cabines de segurança biológica para os laboratórios NB-2 e NB-3 (vide descrição)
Alças de plástico descartáveis.
Tubos e frascos com rosca.
Autoclaves
Obs.: Equipamentos como autoclaves e cabines de segurança biológica devem ser certificadas; a
calibração dever ser efetuada regularmente de acordo com as instruções do fabricante.
EQUIPAMENTOS DE CONTENÇÃO EXIGIDOS
Para os laboratórios NB-1 não são exigidos equipamentos de contenção de agentes classificados no
Grupo de Risco 1.
Para os laboratórios NB-2, devem ser utilizadas Cabines de Segurança Biológica Classe I ou II,
conforme a classificação, ou outro dispositivo de contenção pessoal ou de contenção física sempre
que:
Sejam realizados procedimentos com elevado potencial de criação de aerossóis, como
centrifugação, trituração, homogeneização, agitação vigorosa, ruptura por sonicação, abertura de
recipientes contendo material onde a pressão interna possa ser diferente da pressão ambiental,
inoculação intranasal em animais e em cultura de tecidos infectados.
Altas concentrações ou grandes volumes de organismos contendo DNA/RNA recombinante. Tais
materiais só poderão ser centrifugados fora de cabines de segurança se forem utilizadas
centrífugas de segurança e frascos lacrados. Estes só deverão ser abertos no interior da cabine de
segurança biológica.
As cabines devem ser instaladas, de forma que a variação da entrada e saída de ar da sala, não
provoque alteração nos padrões de contenção de seu funcionamento. As cabines de segurança
biológica devem estar localizadas longe de portas, janelas que possam ser abertas, áreas laboratoriais
muito cheias e que possuam outros equipamentos potencialmente dilaceradores, de forma que sejam
mantidos os parâmetros de fluxo de ar nestas cabines de segurança biológica.
Para os laboratórios NB-3, devem ser utilizadas Cabines de Segurança Biológica Classe I, II ou
III conforme a classificação, ou outra combinação apropriada de dispositivos de proteção pessoal e
contenção física sempre que:
Houver manipulação de culturas e de material clínico ou ambiental, operações de desafio de
animais, cultivo de tecidos ou fluidos infectados de animais em experimentação ou ovos
embrionados, e necropsia de animais em experimentação. Cabine de segurança biológica classe III
deve ser utilizada no caso de procedimentos de alto risco envolvendo microrganismo classificado
na classe 3.
Estas cabines deverão estar localizadas distantes de passagens, portas, venezianas, almoxarifado
sistemas de ventilação e áreas do laboratório que possuam um grande movimento.
Cabine de segurança biológica classe I
É uma modificação da cabine usada no laboratório químico. É uma cabine ventilada com fluxo de ar do
ambiente, podendo ter a frente totalmente aberta ou com painel frontal ou painel frontal fechado com
luvas de borracha. Possui duto de exaustão com filtro HEPA. Não há proteção para o experimento
somente para o operador e o ambiente. Dentro da cabine são colocadas lâmpadas U.V. É
recomendada para trabalho com agentes de risco biológico dos grupos 1, 2 e 3.
Cabine de segurança biológica classe II
A cabine classe II é conhecida com o nome de Cabine de Segurança Biológica de Fluxo Laminar de Ar.
O Princípio fundamental é a proteção do operador, do meio ambiente e do experimento ou produto.
Possui uma abertura frontal que permite o acesso a superfície de trabalho. Altura de segurança da

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abertura do painel frontal é de 20 cm, podendo ter um alarme que previne contra a abertura
excessiva do painel. Possui filtro HEPA.
Cabine de segurança biológica classe II A
Fluxo laminar de AR vertical com tiro frontal de ar de 75 pés/min. O ar contaminado após filtragem
pelo filtro HEPA do exaustor passa ao ambiente onde a cabine está instalada (a cabine deve ter pelo
menos 20 cm de afastamento do teto). Não se deve usar este tipo de cabine com substâncias tóxicas,
explosivas, inflamáveis ou radioativas pela elevada percentagem de recirculação do ar (recircula 70
%). É recomendada para trabalho com agentes de risco biológico das classes 1 e 2.
Cabine de segurança biológica classe II B1
Esta cabine possui filtro. O ar que entra na cabine atravessa o filtro HEPA abaixo da área de trabalho,
30 % do ar recirculam enquanto que 70% saem através do filtro exaustor. O tiro de ar no seu interior
é de 100 pés/min. Usada para agentes biológicos tratados com mínimas quantidades de produtos
químicos tóxicos e traços de radionucleotídeos. É recomendada para o trabalho com agentes de risco
biológico das classes 1, 2 e 3.
É uma cabine de total esgotamento de ar. O ar entra pelo topo da cabine atravessa o pré-filtro e o
filtro HEPA sobre a área de trabalho. O tiro frontal de ar no seu interior é de 100 pés/min. O ar
filtrado, atravessa somente uma vez a área de trabalho. O esgotamento do ar deve ser realizado
através do filtro HEPA conduzindo-o, por um duto, para o exterior. Pode ser usado para agentes
biológicos tratados com produtos químicos e radionucleotídeos. É recomendada para trabalho com
agentes de risco biológico das classes 1, 2 e 3.
É igual a Cabine de Segurança Biológica Classe II. A velocidade de fluxo de ar no seu interior é de 75
a 100 pés/min. O ar é esgotado totalmente através de um filtro HEPA por um duto para o exterior. É
recomendada para o trabalho com agentes de risco biológico das classes 1, 2 e 3.
Cabine de segurança biológica classe III
É uma cabine de contenção máxima. É totalmente fechada com ventilação própria, construída em aço
inox à prova de escape de ar e opera com pressão negativa. O trabalho se efetua com luvas de
borracha presas à cabine. Para purificar o ar contaminado são instalados 2 filtros HEPA em série ou
um filtro HEPA e um incinerador. A introdução e retirada de materiais se efetuam por meio de
autoclaves de porta dupla ou comporta de ar de porta dupla, recipiente de imersão com desinfetante.
Pode conter todos os serviços como: refrigeradores, estufas, freezers, centrífugas, banho-maria,
microscópio e sistema de manuseio de animais. NÃO PODE CONTER GÁS. Os dejetos líquidos são
recolhidos em um depósito para serem descontaminados antes de serem lançados ao sistema de
esgoto. Máxima proteção ao pessoal, meio ambiente e produto. É recomendada para o trabalho com
agentes de risco biológico da classe 4 e material de pesquisa de DNA de alto risco.
GESTÃO DE SEGURANÇA
O chefe de laboratório deve estabelecer políticas e procedimentos com ampla informação a todos
que trabalhem no laboratório sobre o potencial de risco relacionado ao trabalho, bem como sobre
os requisitos específicos para entrada e saída do laboratório e das salas onde ocorra manipulação
de animais.
Caberá ao diretor o responsável imediato do laboratório assegurar que antes que o trabalho com
os organismos designados para o NB-3 se inicie, toda a equipe do laboratório demonstre estar
apto para as práticas e técnicas padrão de microbiologia e demonstrar habilidade também nas
práticas e operações específicas do laboratório. Podendo estar incluído uma experiência anterior
em manipulação de patógenos humanos ou culturas de células, ou um treinamento específico
proporcionado por peritos em técnicas microbiológicas seguras.
O responsável imediato pelo laboratório deve assegurar o desenvolvimento e implementação de
um plano de gestão de segurança assim como um manual de operação; os procedimentos devem
ser preparados de acordo com as especificidades das atividades realizadas e incorporados aos

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procedimentos operacionais padrões (POP) ou a um manual de biossegurança específico do
laboratório.
O chefe de laboratório (subordinado ao diretor ou ao responsável imediato) deve assegurar o
treinamento regular em segurança em laboratório.
Todo o pessoal deve ser orientado para a necessidade de ler seguir as especificações de cada
rotina de trabalho, procedimentos de biossegurança e práticas estabelecidas no Manual.
Uma cópia do manual deve estar disponível e acessível no laboratório
Quando necessário, deve ser providenciado um programa rotineiro de controle de insetos e
roedores.
Uma falha na contenção de organismos patogênicos pode ser resultado de acidentes causados por
produtos químicos, radiação, incêndio e por mal funcionamento do sistema elétrico. Portanto é de
extrema importância que se mantenha uma segurança de alto padrão nessas áreas em qualquer
laboratório de microbiologia.
O desenvolvimento, implementação e treinamento de um plano de emergência é necessário nos
laboratórios NB-2 e NB-3.
SAÚDE OCUPACIONAL
O administrador e/ou diretor juntamente com o chefe de laboratório é responsável em assegurar a
implementação de um programa de controle médico de saúde ocupacional. As seguintes medidas são
recomendadas:
avaliação médica e subseqüente tratamento; todos os registros médicos devem ser registrados.
Imunização ou exame quanto aos agentes manipulados ou potencialmente presentes no
laboratório (por exemplo, vacina contra a hepatite B ou teste cutâneo para a tuberculose).
Exclusão de indivíduos altamente susceptíveis (P.ex. grávidas) de áreas de trabalho com alto risco
biológico.
O uso de equipamentos e acessórios de proteção pessoal assim como a adesão aos procedimentos
recomendados.
NB-1
Embora os microrganismos de classe 1 não sejam patogênicos, o trabalhador deve fazer um exame
médico e seu histórico médico deve ser registrado. Doenças ou acidentes laboratoriais devem ser
registrados e todos os trabalhadores devem ser informados e conscientes da importância das boas
práticas no laboratório de microbiologia.
NB-2
Avaliação médica antes da contratação do trabalhador é necessária; o histórico médico deve ser
registrado.
Amostras referência de soro do pessoal do laboratório ou de outras pessoas possivelmente
expostas ao risco, inclusive pessoal de limpeza e de manutenção devem ser coletada; amostras
adicionais devem ser obtidas periodicamente dependendo do agente manipulado e das atividades
exercidas nas das instalações laboratoriais.
Registros de doenças e ausências devem ser mantidos pela gerência do laboratório; é de
responsabilidade do trabalhador informar o chefe de laboratório de todas as ausências resultantes
de problemas de saúde.
Mulheres devem tomar conhecimento do risco que existe para o feto da exposição ocupacional a
certos microrganismos como, por exemplo, o vírus da rubéola.
NB-3
Além das exigências citadas no NB-2:
Invivíduos que são imunocomprometidos não devem ser contratados para trabalhar nas
instalações do laboratório.

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Após uma avaliação clínica satisfatória, deve-se providenciar para o trabalhador uma notificação
com a foto do mesmo e que descreva que este é um funcionário de um laboratório de nível 3 de
biossegurança. A notificação pode incluir informações para contato, inclusive do chefe ou diretor
do laboratório, médico ou encarregado da biossegurança do laboratório.
Deve-se realizar anualmente radiografia de tórax para os funcionários que se dedicam à rotina de
tuberculose (seguir as orientações do Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar)
Os trabalhadores devem ser apropriadamente imunizados ou examinados quanto aos agentes
manipulados ou potencialmente presentes no laboratório (por exemplo, vacina para hepatite B ou
teste cutâneo para tuberculose); exames periódicos são recomendados.
ÁREAS DE TRABALHO
O laboratório deve ser mantido limpo, arrumado e livre de materiais que não são pertinentes ao
trabalho.
As superfícies das bancadas devem ser desinfetadas no final do trabalho ou ao fim do dia ou
sempre que ocorrer derramamento ou borrifada de material potencialmente perigoso.
Todos os materiais, espécimes e culturas devem ser desinfetados antes do descarte ou da
lavagem para a reutilização.
É proibido comer, beber, fumar e aplicar cosméticos nas áreas de trabalho; alimentos devem ser
guardados em áreas específicas para este fim, fora do laboratório.
Avisos como “não comer”, “não beber” e “não fumar” devem ser expostos claramente nas
PROTEÇAO PESSOAL
No interior do laboratório, os freqüentadores devem utilizar roupas apropriadas como aventais,
gorros, máscaras etc. Antes de sair do laboratório para áreas externas (biblioteca, cantina,
escritório administrativo), a roupa protetora deve ser retirada e deixada no laboratório e
guardados em locais diferentemente do vestuário pessoal.
Avental para proteção deve ser usado abotoados durante os procedimentos de rotina; deve ser
de mangas longas e, se possível, de tecido sanfonado (tipo avental cirúrgico). NB-3: as roupas de
proteção devem incluir aventais com uma frente inteira ou macacão, gorros e proteção pés
quando apropriado; antes de ser lavada a roupa deverá ser descontaminada e deverá ser trocada
depois de contaminada.
As máscaras cirúrgicas e protetores oculares (óculos com proteção lateral) são
obrigatórios para evitar a exposição das mucosas da boca e dos olhos e impedir o risco de inalação
nos procedimentos que possam produzir aerossóis ou causar borrifamento de sangue; também
devem ser usados no manuseio de material biológico e diante de fontes de radiação de ultravioleta
artificial.
NB-3: quando apropriado, equipamentos respiratórios devem ser utilizados em salas que
contenham animais infectados
Devem ser usadas luvas quando houver um contato direto com materiais e superfícies
potencialmente infecciosas ou equipamentos contaminados. O mais adequado é usar dois pares de
luvas. Essas luvas devem ser desprezadas quando estiverem contaminadas, quando o trabalho
com materiais infecciosos for concluído ou quando a integridade da luva estiver comprometida.
Luvas descartáveis não poderão ser lavadas, reutilizadas ou usadas para tocar superfícies “limpas”
(teclado, telefones, etc.), e não devem ser usadas fora do laboratório. Alternativas como luvas de
látex com talco deverão estar disponíveis.
1. Luva plástica – descartável, deve ser desprezada após cada uso. Indicações: para proteção
exclusiva do usuário em situações como colheita de sangue, recebimento ou entrega de
material biológico, etc.
2. Luva doméstica – que pode ser antiderrapante; não descartável. Seu uso é indicado para
lavagem e desinfecção de materiais e superfícies. Após o uso, lavar as mãos enluvadas com
água e sabão e descontaminar as luvas em solução de hipoclorito a 0,5%, por 30 a 60
minutos.

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3. Luva cirúrgica (látex) – de preferência descartável, mas pode ser reprocessada, embora
com restrições. Indicada para uso em técnicas assépticas (para proteção do paciente e do
usuário), tais como cateterização vesical, exames endoscópicos, punção para obtenção de
liquor, líquido articular, líquido pleural, etc.
Lavar as mãos freqüentemente: Fazendo-se ou não do uso de luvas, lavar as mãos sempre
que houver mudança de atividade, após a manipulação de materiais infecciosos, após a remoção
das luvas, antes de saírem do laboratório e antes de comer, beber e mesmo fumar. A lavagem
deve envolver mãos e antebraços, usando-se água e sabão líquido. Friccionar com álcool a 70%
contendo 1% a 2% de glicerina. Outra opção é o uso de solução degermante à base de iodeto de
polivinilpirrolidona (PVP-I) a 10%. Usar de preferência toalhas descartáveis.
Não comer e beber no local de trabalho, assim como não armazenar bebidas e comidas nas
Não fumar, pois há um aumento do risco de contaminação com microrganismos potencialmente
patogênicos ou com produtos químicos; risco de incêndio e inconveniência com relação aos
colegas de trabalho.
Prender os cabelos; evitar o uso de anéis, pulseiras e o uso de roupa social de mangas compridas.
Não passar cosméticos nas instalações do laboratório.
Não manusear lentes de contato e quando utilizados, proteger com óculos de segurança. As lentes
de contato absorvem certos solventes e podem ser perigosas em casos de respingo e
derramamentos.
Não usar calçados abertos no laboratório como sandálias, chinelos.
SEGURANÇA NOS PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
Culturas, tecidos e amostras de fluídos corpóreos ou dejetos potencialmente infecciosos devem ser
colocados em um recipiente com uma tampa que evite o vazamento durante a coleta, o manuseio,
o processamento, o armazenamento, o transporte ou o embarque.
Nos laboratórios NB-2 e NB-3, todas as manipulações abertas que envolvam materiais infecciosos
deverão ser conduzidas no interior das cabines de segurança biológica ou de outros dispositivos de
contenção física.
Pipetagem com a boca deve ser proibido.
Nenhum tipo de material deve ser levado à boca; etiquetas ou rótulos não devem ser lambidos.
Material descartável (seringas, agulhas, luvas, toalhas, etc.) deve ser utilizado sempre que
possível.
Todo procedimento técnico deve ser executado minimizando a formação de aerossóis; sempre que
houver uma probabilidade de formação de aerossol, o trabalho deve ser conduzido na cabine de
segurança.
VIDRARIAS, SERINGAS E AGULHAS
Todos os vidros que contenham reagentes devem ser rotulados e datados.
O uso de agulhas e seringas deve ser limitado e elas não devem ser utilizadas como pipetadores
ou qualquer outro propósito que não seja de injeção parenteral ou aspiração de fluídos de animais
de laboratório e de garrafas de diafragmas.
Extrema precaução deve ser tomada quando forem manuseadas agulhas e seringas de modo a
evitar a auto-inoculação e a produção de aerossóis durante o uso e o descarte.
Devem ser usadas somente seringas com agulha fixa ou agulha e seringa em uma unidade única
descartável usada para injeção ou aspiração de materiais infecciosos. As seringas que possuem
um envoltório para a agulha, ou sistemas sem agulha e outros dispositivos de segurança deverão
ser utilizados quando necessários.
Vidros quebrados não devem ser manipulados diretamente com a mão, devem ser removidos
através de meios mecânicos como uma vassoura e uma pá de lixo, pinças ou fórceps. Os
recipientes que contêm agulhas, equipamentos cortantes e vidros quebrados contaminados
deverão passar por um processo de descontaminação antes de serem desprezados, de acordo com
os regulamentos locais, estaduais ou federais.

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MANUSEIO DE AMOSTRAS
As amostras devem ser colhidas em recipientes resistentes, com vedação adequada para evitar
derramamento e perdas. Todas as mostras devem ser consideradas potencialmente perigosas.
Usar luvas descartáveis sempre que o trabalho envolver contato com material bilógico.
Se for evidenciada ruptura, escoamento ou mancha no recipiente com a amostra, transferir a
maior quantidade possível da amostra para outro recipiente esterilizado e propriamente
identificado.
BOAS PRÁTICAS PARA CENTRIFUGAÇÃO
Antes de centrifugar qualquer material, os tubos, frascos ou garrafas devem ser verificados quanto
à presença de rachaduras. Os amortecedores de borracha no fundo dos rotores devem ser
trocados com periodicidade e qualquer fragmento de vidro que possa estar presente deve ser
removido.
Assegurar que a centrífuga esteja perfeitamente equilibrada antes do uso. Os anéis dos rotores e
os suportes dos tubos para assegurar o equilíbrio de pesos devem ser verificados.
Esperar que a centrifugação cesse por completo antes de abrir a tampa para remover o material.
Em caso de derramamento e/ou quebra de um tubo dentro da centrífuga, o interior da centrífuga
deve ser desinfetado por completo.
Recomenda-se a desinfecção da centrífuga a cada dia de uso.
BOAS PRÁTICAS PARA DNA/RNA RECOMBINANTE
Quando organismos contendo moléculas de DNA/RNA recombinantes estiverem sendo
manipulados são exigidos requisitos especiais para a entrada de pessoal no laboratório (por
exemplo, vacinação). Deve ser colocado um aviso sinalizando o risco, identificando o agente e o
nome do chefe de laboratório, endereço completo e diferentes possibilidades de sua localização ou
outra pessoa responsável. Todos os requisitos necessários para a entrada no laboratório devem
estar assinalados na porta de entrada.
Cuidados especiais devem ser tomados para impedir contaminação da pele com organismos
contendo moléculas de DNA/RNA recombinantes; devem ser usadas luvas no manejo de animais
em experimentação e sempre que houver possibilidade de contato da pele com o OGM.
Devem ser usadas somente seringas com agulha fixa ou agulha e seringa em uma unidade única
nas atividades de injeção ou aspiração de fluídos contendo moléculas de DNA/RNA recombinantes.
Derramamentos ou acidentes que resultem em exposição a organismo contendo moléculas de
DNA/RNA recombinante devem ser imediatamente notificados à CIBio e à CTNBio, com
providências de avaliação médica, vigilância e tratamento, sendo mantido registro dos acidentes e
das providências adotadas.
SEGURANÇA ELÉTRICA
Todos os trabalhadores devem conhecer a localização dos interruptores principais e de circuitos.
Nenhum instrumento deve ser reparado enquanto o mesmo estiver conectado à tomada.
As saídas não devem ser sobrecarregadas; nunca utilizar tomadas de tipo múltiplo.
Todos os equipamentos devem ser providos de fio terra
Todas as descargas, incluindo os pequenos zumbidos, devem ser imediatamente investigadas
Os fios de extensão devem ser utilizados apenas em concordância com conjunto de políticas e
procedimentos gerais do estabelecimento.
MANUSEIO DE PRODUTOS QUÍMICOS
Os armários e vasilhas de segurança para armazenamento devem estar localizados em áreas
distantes das saídas e de fonte de calor, chamas e faíscas. A área de depósito deve ser ventilada e
seu acesso limitado.

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Todos os recipientes devem estar claramente rotulados com indicação de: conteúdo, aviso de
perigo, precauções especiais, data de recebimento e preparação, data de abertura para uso, data
de vencimento, fabricante
DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DE RESÍDUOS
Todos os resíduos do laboratório e do biotério deverão ser descontaminados antes de serem
descartados através de um método de descontaminação aprovado como, por exemplo,
esterilização por calor úmido (autoclave). Os materiais que forem ser descontaminados fora do
próprio laboratório deverão ser colocados em recipientes inquebráveis, à prova de vazamentos e
hermeticamente fechados para serem transportados ao local desejado.
Os materiais para a descontaminação na autoclave devem ser colocados em recipientes ou sacos
plásticos apropriados e autocláveis.
Um sistema de separação e identificação do material infeccioso e seus respectivos recipientes são
recomendados:
- Não contaminado (não infeccioso) – resíduo que pode ser reciclado, reutilizado ou
descartado como lixo doméstico.
- Contaminado perfurocortante (infeccioso) – resíduo como agulhas, seringas, lancetas e
outros assemelhados devem ser descartados em recipientes estanques, rígidos, com tampa, e
identificados com símbolo e expressão de resíduo infectante. As agulhas não devem ser
entortadas, quebradas, recapeadas ou removidas da seringa após o uso. Agulhas e seringas
devem ser imediatamente colocadas em recipientes resistentes à prova de perfurações,
localizados convenientemente, e descontaminadas na autoclave antes do descarte. As seringas
não podem ser esvaziadas para reaproveitamento; as seringas descartáveis, utilizadas com ou
sem agulha devem ser depositadas nos recipientes e autoclavadas antes do descarte.
- Contaminado para descontaminação e reutilização – recipientes, preferencialmente
plásticos, com desinfetantes preparados diariamente, devem ser colocados em todas as áreas
de trabalho. O material a ser reutilizado ou reciclado deve permanecer em contato com o
desinfetante o tempo que for necessário, segundo as instruções do fabricante do produto. Após
a desinfecção, o desinfetante e o material deve ser adequadamente descontaminado na
autoclave. Em seguida, o desinfetante deve ser descartado e o material então lavado para a
reutilização. Em nenhuma circunstância o material contaminado deve ser submetido a uma
pré-lavagem.
- Contaminado para descarte – resíduo deve ser descontaminado na autoclave em
recipientes resistentes a vazamento antes do descarte. Após autoclavagem, este deve ser
colocado em recipiente próprio para transporte, também resistente a vazamento e danos
físicos, e vedado apropriadamente.
- Contaminado para incineração – resíduo para descarte na incineração. A incineração de
resíduo biológico deve seguir as normas estabelecidas pelas autoridades locais.
DESINFETANTES E QUÍMICOS
O manual de segurança deve incluir quais e as finalidades dos desinfetantes a serem utilizados e
as instruções de diluição recomendadas para cada desinfetante. O fabricante deve providenciar
todas especificações relevantes. Hipoclorito de sódio e desinfetantes fenólicos são os mais
recomendados para fins laboratoriais.
Para casos especiais, álcool, iodo e outros oxidantes podem ser efetivos desde que comprovado
que o agente a ser destruído não seja resistente ao procedimento.
Microonda, ultravioleta e radiação ionizante não são apropriadas.
RESÍDUOS QUÍMICOS TÓXICOS
Usar luvas de borracha, avental de borracha e óculos de proteção.
O resíduo deve ser armazenado no local onde é gerado, em ambiente específico e arejado,
acondicionado em saco plástico branco, dentro de suas próprias embalagens primárias. Para o
caso da inexistência de suas embalagens, devem-se utilizar frascos de até dois litros, resistentes,
com tampa rosqueada, vedante e identificado com o nome e fórmula do produto químico, símbolo
e expressão de resíduo químico tóxico.

Mod II - 31
O descarte de solventes orgânicos solúveis em água com volumes < 500 ml e de orgânicos
insolúveis em água com volumes < 100 ml pode ser na pia:
- Retirar todos os objetos da pia designada especialmente para descarte.
- Deixar escorrer, sem respingos, uma corrente de água fria dentro da pia.
- Verter lentamente o líquido, o mais próximo possível do ralo, sem produzir respingos.
- Manter a corrente de água fria por vários minutos após a eliminação do líquido.
Dependendo do volume gerado e o tempo de acondicionamento para o tratamento ou disposição
final, o laboratório deve também possuir local específico para o abrigo de resíduos, fora da
unidade geradora e fora da edificação do estabelecimento.
MEDIDAS RELATIVAS À ACIDENTE E DERRAMAMENTO
Adotar manuais de primeiros socorros, acompanhados de treinamento e orientação verbal, sempre
que necessário.
Manter os equipamentos de segurança em lugar visível, de fácil acesso e à imediata disposição do
acidentado. Os equipamentos são:
1. um chuveiro de emergência, com grande fluxo de água
2. um lavador de olhos
3. Kit de primeiro socorros
4. extintores de incêndio, vistoriados regularmente
5. mantas contra fogo
Respingos, derramamento e acidentes resultantes de uma exposição de produtos químicos e
materiais infecciosos aos organismos deverão ser imediatamente notificados ao diretor do
laboratório. A avaliação médica, a vigilância e o tratamento deverão ser providenciados e registros
do acidente e das providências adotadas deverão ser mantidos por escrito.
DERRAMAMENTO DE PRODUTO BIOLÓGICO
Vazamentos de materiais infecciosos deverão ser descontaminados, contidos e limpos pela equipe
de profissionais especializados ou por outras pessoas adequadamente treinadas e equipadas para
trabalharem com material infeccioso concentrado. Os procedimentos para remoção do vazamento
deverão ser desenvolvidos.
Em caso de exposição percutânea, recomenda-se lavagem exaustiva com água e sabão ou solução
anti-séptica de degermante (PVP Iodo ou clorexidina). Após a exposição em mucosa, está
recomendada a lavagem exaustiva com água ou solução.fisiológica. A indicação do uso de anti-
retrovirais deve ser baseada em uma avaliação criteriosa do risco de transmissão do HIV em
função do tipo de acidente ocorrido e da toxicidade dessas medicações.
De acordo com o Manual de Condutas em Exposição Ocupacional ao Material Biológico do
Ministério da Saúde, após a exposição ao material biológico, cuidados locais com a área exposta
devem ser imediatamente iniciados.
DERRAMAMENTO DE PRODUTO QUÍMICO LÍQUIDO
Confinar o líquido derramado em área pequena o quanto possível.
Neutralizar os ácidos com carbonato de sadio.
Neutralizar as bases com ácido bórico a 1%.
Para grandes quantidades de ácidos ou bases, lavar a área com jato forte e abundante de água
após a neutralização.
Em derramamento de líquidos tóxicos e inflamáveis, utilizar um absorvente para reduzir a pressão
de vapor e evitar possível combustão do líquido.

Mod II - 32
5. PRECAUÇÕES QUANTO À CONTAMINAÇÃO
CUIDADOS RELATIVOS AOS RISCOS DE CONTAMINAÇÃO BIOLÓGICA
O Laboratório de Microbiologia recebe diariamente grande número de amostras de fluidos corporais e
outros espécimes clínicos que são potencialmente infecciosos. Os agentes infecciosos mais perigosos,
no que diz respeito ao risco de contaminação, são os vírus da hepatite e HIV, bacilos da tuberculose,
salmonelas, fungos, protozoários, etc.
É difícil quantificar o risco no trabalho em laboratórios, com relação aos agentes infecciosos.Tem-se
por base, porém, que o risco individual aumenta com a freqüência e com os níveis de contato com o
agente infeccioso. O primeiro cuidado a ser tomado no laboratório que trabalha com espécimes
clínicos é com o risco de exposição à infecção.
Por outro lado, deve-se considerar que os riscos são influenciados por uma relação variável entre o
agente infectante, o hospedeiro e a atividade desempenhada. Fatores aplicáveis ao agente incluem a
virulência, a carga infectante, o ciclo e a toxigenicidade. Algumas das principais variáveis que influem
o risco do hospedeiro são: idade, sexo, raça, gravidez, uso de antimicrobianos, imunidade (vacinação
prévia), e o uso de drogas imunossupressoras.
Finalmente, a natureza da atividade laboratorial (por exemplo: diagnóstico, produção, pesquisa) pode
afetar significativamente o risco pessoal devido ao tipo, quantidade e concentração dos agentes
empregados, a manipulação dos agentes e a eficácia primária e secundária dos equipamentos de
proteção e práticas de laboratório.
Deve-se ter conhecimento das principais vias de transmissão para a adoção de cuidados especiais.
Exemplo: a hepatite A tem um período de incubação de 15-35 dias; a urina e as fezes contêm vírus e
a infecção geralmente ocorre pela ingestão de alimentos e bebidas contaminadas. No que se refere à
hepatite B, cujo período de incubação é de 40-120 dias, o sangue é a principal fonte de infecção e os
acidentes, com perfurocortantes, a via mais importante de aquisição entre profissionais de saúde.
Como o laboratório não pode dispor de informações detalhadas de cada paciente, é ainda importante
tratar todas as amostras como sendo potencialmente infecciosas.
Existem várias portas de entrada de microrganismos, mas, no laboratório, a via respiratória tem maior
importância. Três fatores principais contribuem para isto: a facilidade com que partículas pequenas
são produzidas por técnicas comuns de laboratório, o fato de muitas destas partículas serem
suficientemente pequenas, não capturadas no trato respiratório superior, e a habilidade que a maioria
dos patógenos tem de invadir o pulmão.
PRODUÇÃO DE AEROSSÓIS
O uso incorreto de equipamento de laboratório como pipetas, alças de inoculação, agulhas,seringas,
centrífugas e homogeneizadores, pode produzir grandes quantidades de aerossóis potencialmente
infectantes.
Exemplos de procedimentos que produzem aerossóis:
destampar frascos que foram fechados com tampa de pressão.
esvaziar seringas, eliminar o ar das seringas.
quebrar frascos que contenham cultura de microrganismos.
centrifugar tubos ou frascos sem tampa adequada.
Quando houver risco de contaminação por aerossóis, recomenda-se o emprego de cabines de
segurança biológica (fluxo laminar), juntamente com o uso de luvas, máscaras e óculos de proteção.
Nestas condições, manusear frascos e seringas envolvendo-os com gaze ou algodão, embebidos em
álcool a 70% ou hipoclorito a 0,5%.
PIPETAGEM DE MATERIAL CLÍNICO

Mod II - 33
É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico (sangue, liquor, urina, etc.) ou de
suspensões bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que possível, pipetas automáticas ou bulbos de
borracha.
FLAMBAGEM DE ALÇA BACTERIOLÓGICA
A flambagem da alça bacteriológica durante a manipulação do material biológico ou na transferência
de massa bacteriana (raspado de colônias) deve ser feita através de chama, que deve estar entre o
manipulador e a alça. Recomenda-se esgotar a alça num frasco contendo álcool a 95% e areia.
Quando se trabalha com Mycobacterium tuberculosis é recomendável o emprego de fenol a 0,5% ou
hipoclorito a 0,5% e areia, flambando-se a alça em seguida..
DISSEMINAÇÃO DE ESPOROS DE FUNGOS
Ao se trabalhar com fungos, particularmente os filamentosos, recomenda-se o uso de cabines
biológicas apenas com proteção de vidro ou acrílico, sem fluxo de ar.
CUIDADOS RELATIVOS AOS RISCOS DE CONTAMINAÇÃO QUÍMICA
O laboratorista está diariamente em contato com produtos químicos potencialmente perigosos, cujos
efeitos geralmente se apresentam logo após eventuais acidentes, que podem ocorrer por:
contato direto: com a pele (quebra de recipiente, derramamento de líquidos, etc.); com a boca
(durante a pipetagem); com o esôfago e o estômago (ingestão acidental);
inalação de vapores e pós finos, com conseqüentes danos pulmonares; absorção (efeitos tóxicos
no nível da medula óssea, dos rins e do fígado).
Não se deve pipetar diretamente com a boca produto químico irritante ou tóxico, deve-se fazer uso de
buretas ou pró-pipetas de borracha.
PRODUTOS QUÍMICOS CORROSIVOS
Utilizar material descartável (seringas, agulhas ,luvas, toalhas, etc.).
Manter no laboratório somente o suficiente para o uso. O restante deve ser armazenado em
outras salas.
Transferir materiais de estoque para o laboratório, com bastante cuidado.
Manter os recipientes de uso em prateleiras localizadas da altura dos olhos para baixo,.evitando-
se riscos de queda e derramamento.
Nas diluições, nunca se deve juntar água ao ácido concentrado. Sempre adicionar o ácido à água
sob resfriamento, de preferência.
Evitar a respiração junto de vapores de ácidos e evitar contato destes com a pele e com os olhos.
Não pipetar diretamente com a boca.
PRODUTOS QUÍMICOS TÓXICOS
Venenos, como cianetos e barbitúricos, devem ser mantidos trancados em armários.
Solventes orgânicos (benzeno, tetracloreto de carbono e outros hidrocarbonetos halogenados):
técnicas que usam estes solventes devem ser feitas em salas separadas e bem ventiladas ou em
cabines de exaustão.
1. Clorofórmio: não inflamável, porém não se deve permitir que seus vapores entrem em
contato com fogo ou metais aquecidos, para evitar a formação do gás fosfogênio, que é
tóxico.
2. Éter e acetona: altamente inflamáveis. A conservação implica a aplicação das normas de
segurança quanto ao risco de explosão.
Gases tóxicos:
1. Monóxido de carbono: concentrações até 1% no ar são perigosas se respiradas por uma
hora ou mais. Acima de 1% podem ser fatais.

Mod II - 34
2. Dióxido de carbono (gelo-seco): concentrações perigosas podem ser atingidas em salas
mal ventiladas.
PRODUTOS QUÍMICOS CARCINOGÊNICOS
Tem sido dispensada atenção cada vez maior a certas aminas aromáticas, compostos azo e nitrosos,
entre os quais benzidina e codianisidina, de uso corrente em laboratórios de análises clínicas. Entre as
precauções se inclui mantê-los em recipientes bem fechados, rotulados como “carcinogênicos”. Evitar
contato com a pele.
CLASSIFICAÇÃO DOS PRODUTOS QUÍMICOS
Inflamáveis
Classe Ponto de Inflamabilidade Ponto de ebulição Exemplos
IA 4,4o
C 18,3o
C Éter, acetaldeído
IB 22,7o
C 37,7o
C Etanol, acetona, gasolina
IC 22,7o
C 37,2o
C Álcool isopropílico, xileno
Combustíveis
Classe Ponto de Inflamabilidade Exemplos
II 37,7o
C a 54,4o
C Etilenoglicol,ácido acético glacial
III 60o
C Anilina, glicerol, óleo mineral

Mod II - 35
6. CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATÓRIO
INTRODUÇÃO
Um dos procedimentos mais importantes para dirigir as atividades diárias de um laboratório de
microbiologia é um manual atualizado de procedimentos ou procedimento operacional padrão (POP).
Todas as atividades e respectivos protocolos devem estar claramente delineados e colocados em local
acessível do laboratório para a consulta regular pelos trabalhadores.
A forma como os procedimentos devem ser desenvolvidos e implementados deve ser determinada
pelo responsável imediato do laboratório.
Seguem os principais itens que devem constar no manual de procedimento:
Nome, endereço e telefone de todos os trabalhadores do laboratório.
Lista de todos os planos de ação e regulamentos geral do laboratório.
Lista da localização exata dos equipamentos, meio de culturas, reagentes, e outros suplementos,
incluindo descrição completa das fórmulas e instruções para o uso e preparo.
Descrição completa de todos os formulários, informes e arquivos utilizados no laboratório de
microbiologia.
Descrição detalhada de todas as técnicas e procedimentos efetuados no laboratório
Lista de todos os esquemas de identificação utilizados para identificar e classificar os
microrganismos.
Nome, endereço, telefone, procedimentos e planos de ação de laboratórios de referência
relacionados com o envio de amostras.
Inclusão de todos os procedimentos de controle de qualidade com detalhes específicos quanto a
freqüência e modo como cada item deve ser realizado.
Para inspeção do laboratório é exigido que o manual de procedimentos seja revisto e atualizado ao
menos uma vez ao ano e que constem as iniciais do diretor ou chefe de laboratório em cada
procedimento, indicando que a atualização foi efetuada.
OBJETIVO
O laboratório clínico de microbiologia é responsável em providenciar informação precisa e relevante
quanto ao diagnóstico do paciente. O valor e a precisão clínica das análises do material clínico e o
respectivo isolamento do microrganismo são dependentes do programa de qualidade, que por sua vez,
avalia a qualidade do material; documenta a validade do método aplicado; monitora a performance
dos procedimentos, reagentes, meios, instrumentos e do indivíduo que executou a análise; e verifica
os resultados do teste quanto aos erros e relevância clínica. Um programa de qualidade efetivo
depende de um processo de avaliação contínuo e do seu aprimoramento.
ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA
O desempenho dos exames de laboratório clínico é realizado através de ensaios de proficiência. Este
programa consiste na avaliação de amostras por evento. Há um número estabelecido de eventos
anuais de testes em cada área de atividade: bacteriologia, micologia, parasitologia e virologia. As
amostras de proficiência devem ser analisadas pelos trabalhadores que habitualmente realizam as
análises em questão, de acordo com os procedimentos de rotina e juntamente com as amostras de
pacientes.
O laboratório que não atender os requisitos dos ensaios de proficiência deve documentar a fonte do
problema, revisar o programa em vigor e tomar medidas corretivas.
PARÂMETROS DO CONTROLE DE QUALIDADE

Mod II - 36
Parâmetros Diretrizes
Coleta e transporte de
amostra
- Descreve as instruções de coleta e transporte
- Estabelece o critério de aceitação e rejeição das amostras
Performance dos
equipamentos e
instrumentos
- Documenta a verificação do funcionamento do equipamento e uso freqüente que
assegura o funcionamento apropriado
- documenta a manutenção regular
- documenta os registros de manutenção do equipamento
Meios de cultura
prontos
- Mantém o protocolo de controle de qualidade do fabricante
- Obtém a garantia por escrito quanto aos padrões de embalagem, rotulagem e
protocolo
- Inspeciona as condições dos meios, placas de petri, hemólises, excesso de
bolhas, contaminação, volume, temperatura
- Documenta as falhas e as medidas corretivas, e informa o fabricante
- Executa teste de CQ até a falha ser corrigida
Meios de cultura
preparado no
laboratório
- Registra a quantidade, o número do lote, método de esterilização, a data de
preparo, prazo de validade, pH e nome do preparador
- Avalia quanto a coloração, consistência, inclinação, hemólise, excesso de bolhas
e contaminação
- Executa o teste de CQ com os microrganismos de propriedades fisiológicas e
bioquímicas conhecidas
Reagentes
e
suplementos
- Rotula os frascos quanto ao conteúdo, concentração, requerimentos para
estoque, data de fabricação e de recebimento, prazo de validade número do lote,
volume
- Armazena de acordo com as recomendações do fabricante
- Executa o teste de controle negativo e positivo antes do uso
- Descarta aqueles que falharam na performance
Kits comerciais - Testa cada lote novo ou em cada entrega
- Segue as recomendações do fabricante para teste de CQ
Funcionários
- Utiliza funcionários suficientemente qualificados para trabalho complexo e
volumoso
- Documenta as atividades de treinamento contínuo
- Providencia aos funcionários por escrito padrões de performance
- Avalia funcionários anualmente
Registro de CQ
- Registra todos os resultados em um formulário de CQ
- Relata ao chefe e/ou responsável resultados “anormais” e as medidas de
correção no formulário de CQ
- Mantém os registros por pelo menos dois anos
Manual de
Procedimento
- Define os procedimentos, limites de tolerância, aceitação da amostra, preparo do
reagente, CQ, cálculos e laudos
- Revisa anualmente
- Aprova e data todas as mudanças
- Torna disponível na área de trabalho
CONTROLE DE QUALIDADE DE EQUIPAMENTOS
Em todos os laboratórios de microbiologia deve ser estabelecido um programa de manutenção
preventiva para assegurar o funcionamento apropriado de todos os equipamentos elétricos ou
mecânicos.
Os equipamentos devem ser controlados em intervalos de tempo pré-estabelecidos.

Mod II - 37
As peças devem ser trocadas após um período específico de uso, mesmo que não pareçam
alteradas.
A manutenção pode ser executada tanto pelo fabricante como pelo setor de serviços de
engenharia do laboratório, quando existente.
Os trabalhadores do laboratório devem realizar todos os controles e registrar conforme instruídos
em impressos ou manual de manutenção; isto permite a detecção imediata de desvios e portanto
a adoção de medidas corretivas apropriadas antes que comprometam os resultados.
As temperaturas dos equipamentos devem ser medidas diariamente com termômetros calibrados.
Qualquer leitura que resulte em valores fora dos limites de tolerância definidos pelo s controle de
qualidade, deve-se determinar a causa e corrigir o problema.
Procedimentos para o controle de qualidade de alguns equipamentos
Equipamento Procedimento Intervalo Limites de Tolerância
Refrigeradores Registro de temperatura * Diário ou contínuo 2o
C a 8o
C
Congeladores Registro de temperatura * Diário ou contínuo -8o
C a -20o
C
-60o
C a -75o
C
Estufas Registro de temperatura * Diário ou contínuo 35,5o
C ± 1o
C
Estufas CO2 Medida do conteúdo de
CO2:
- Usar analisador de
gases sanguíneos ou
dispositivo Fyrite 1
Diário ou duas vezes ao
dia
5 a 10%
Banhos Registro de temperatura * Diário 36o
C a 38o
C
55o
C a 57o
C
Aquecedores Registro de temperatura * Diário ± 1o
C do estabelecido
Autoclaves Teste com tiras de
esporos (Bacillus
stearothermophilus
Ao menos semanalmente O não crescimento de
esporos indica corrida
estéril.
Medidor de pH Testes com soluções para
calibrar pH
A cada uso ± 0,1 unidade de pH do
padão em uso.
Jarras de anaerobiose Tira indicadora com azul
de metileno
A cada uso A conversãp da tira de
azul para branco indica
baixa tensão de CO2.
Câmera anaeróbia com
luvas
Cultivo de Clostridium
novyi tipo B
Solução indicadora de azul
de metileno
Periódico O crescimento indica
baixa tensão de O2.
Utilizada apenas quando é
preciso uma tensão de O2
extremamente baixa.
A solução permanece
incolor se a tensão de O2
for baixa.
Rotador de sorologia Contagem de rpm A cada uso 180 rpm ± 10 rpm
Centrífugas Controlar revoluções com
tacômetro
Mensalmente Dentro de 5% do
estabelecido no indicador.
Cabines de segurança Medir a velocidade do ar
através da abertura para
o rosto 2
Semestral ou
trimestralmente
Fluxo de 1,52m de fluxo
de ar/minuto ± 0,152
m/minuto.
* cada termômetro de controle deve ser calibrado contra um termômetro padrão.
1
- Bacharach Instrument Co, Pittsburgh, PA.
2
- Velometer Jr., Alnor Instrument Co., Chicago, IL.

Mod II - 38
CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIO DE CULTURA, REAGENTES E KITS COMERCIAIS
Embora é aceito por auditores, inspetores de laboratório os registros de qualidade documentados
pelos fabricantes de meios de cultura, recomenda-se um controle de qualidade periódico desses
produtos pelo laboratório.
Os microrganismos empregados para o controle de qualidade devem ser mantidos no laboratório por
meio de subcultivos de isolados recuperados como parte do trabalho de rotina ou microrganismo de
referência como os da ATCC.
ALGUMAS RECOMENDAÇÕES
Cada bateria de meios deve ser controlada com os quesitos mais exigentes para o crescimento ou
para a produção de atividade bioquímica. A disponibilidade de cepas do laboratório pode ser
necessária para suplementar aquelas comercialmente disponíveis.
Cada tubo de cultura, placa de meio e reagente deve ter uma etiqueta que identifique claramente
o conteúdo e as datas de preparo e vencimento.
Cada bateria de tubos e placas deve ser também controlada quanto à esterilidade, principalmente
aqueles nos quais são adicionados suplementos após a esterilização. As provas de esterilidade
devem ser feitas visualmente e por meio de subcultivos. Determinados meios seletivos, por
exemplo, podem surpimir o crescimento visível de bactérias, mas as células viáveis podem
aparecer nos subcultivos.
Os meios preparados devem ser visualmente avaliados para sinais de deterioração como
descoloração, turvação, mudança de cor e desidratação.
Os reagentes e testes usados para identificação de micobactéria devem ser verificados uma vez ao
dia, quando utilizados, com uma espécie de micobactéria que resulte uma reação positiva. Para
verificação de fixação de ferro, o teste deve ser monitorado para controle negativo e positivo.
Os reagentes e testes utilizados para identificação de fungos devem ser examinados uma vez por
semana, quando utilizados, para controle positivo. O reagente nitrato que determina sua
assimilação é monitorado com peptona.
Todos os discos para susceptibilidade antimicrobiana devem estar avaliados ao menos uma vez
por semana com microrganismo padrão de qualidade, de sensibilidade conhecida como E. coli
(ATCC 25922), S. aureus (ATCC 25923), S. fecalis (ATCC 29212) e P. Aeruginosa (ATCC 27853).
Os kits comerciais devem ser examinados a cada entrega e a cada lote, conforme as
recomendações do fabricante.
Os componentes de um kit não devem ser utilizados com um kit de lote diferente, a não ser
quando especificado pelo fabricante.
Atenção: A freqüência das provas de controle de qualidade dos produtos comerciais utilizados no
laboratório deve ser determinado pelo chefe ou responsável imediato do laboratório, conforme as
instruções dos respectivos fabricantes ou referências em literatura.
Microrganismo-controle e reações para o controle de qualidade dos meios de cultura
Meio Microrganismo Reações
Ágar Sangue Streptococcus do Grupo A
Streptococcus pneumoniae
Bom crescimento, beta-hemólise
Bom crescimento, alfa-hemólise
Ágar bile-esculina Espécies de Enterococcus
Streptococcus alfa-hemolítico
não do grupo D
Bom crescimento, cor negra
Nenhum crescimento, sem coloração do
meio
Ágar chocolate Haemophilus influenzae
Bom crescimento
Bom crescimento
Ágar uréia de Christensen Proteus mirabilis
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Toda a superfície de cor rosa (positivo)
Inclinação do meio rosa (positivo parcial)
Cor amarela (negativo)

Mod II - 39
Ágar citrato de Simmons Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Crescimento ou cor azul (positivo)
Sem crescimento, permanece verde
(negativo)
Ágar cistina-tripticase (ACT)
- Dextrose Neisseria gonorrhoeae
Branhamella catarrhalis
Cor amarela (positivo)
Não modifica a cor (negativo)
- Sacarose Escherichia coli
- Maltose Espécies de Salmonella ou
Neisseria meningitidis
- Lactose Neisseria lactamicus
Descarboxilases
- Lisina Klebsiella pneumoniae
Enterobacter sakasakii
Cor azulada (positivo)
- Arginina Enterobacter cloacae
Proteus mirabilis
- Ornitina Proteu mirabilis
DNAse Serratia marcescens
Enterobacter cloacae
Zona de clarificação (adicionar HCl 1 N)
Sem zona de clarificação
Ágar eosina azul-de-metileno Escherichia coli
Shigella flexneri
Bom crescimento, brilho verde metálico
Bom crescimento, púrpuras, sem brilho
Bom crescimento, transparentes (lactose-
negativas)
Ágar de Hecktoen Salmonella typhimurium
Shigella flexneri
Escherichia coli
Verdes com centro negro
Verdes transparentes
Crescimento algo inibido, alaranjadas
Indol Escherichia coli
Cor vermelha (positivo)
Ausência de cor vermelha (negativo)
Ágar lisina-ferro Salmonella typhimurium
Shigella flexneri
Proteus mirabilis
Profundidade e inclinação púrpura + H2S
Inclinação púrpura/profundidade amarela
Inclinação vermelha/profundidade amarela
Ágar MacConkey Escherichia coli
Proteus mirabilis
Espécies de Enterococcus
Colônias vermelhas (lactose-positivas)
Colônias incolores, sem disseminação
Sem crescimento
Malonato Escherichia coli
Sem crescimento
Bom crescimento, cor azul (positivo)
Motilidade Proteus mirabilis
Meio turvo (positivo)
Sem borda plumosa em estria (negativo)
Caldo ou ágar nitrato Escherichia coli
Acinetobacter lwoffi
Cor vermelha ao adicionar reativos
Ausência de cor vermelha (negativo)
Ágar sangue fenletil álcool Espécies de Streptococcus
Escherichia coli
Bom crescimento
Sem crescimento
o-Nitrofil-beta-D-
galactopiranosídeo (ONPG)
Serratia marcescens
Salmonella typhimurium
Incolor (negativo)
Fenilalanina desaminase Proteus mirabilis
Escherichia coli
Cor verde (adicionar FeCl3 a 10%)
Ausência de cor verde (negativo)
Ágar Salmonella-Shigella Salmonella typhimurium Colônias incolores, centro negro

Mod II - 40
Escherichia coli Sem crescimento
Voges-Proskauer Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Cor vermelha (adicionar reativos)
Não desenvolve cor (negativo)
Ágar xilose-lisina-dextrose
(XLD)
Espécies de Salmonella
Escherichia coli
Espécies de Shigella
Colônias vermelhas (lisina-positivas)
Colônias amarelas (positiva para açúcares)
Colônia transparentes (negativo)
Procedimentos adicionais quanto ao controle de qualidade estão especificadas nos dos
módulos seguintes.
CONTROLE DE QUALIDADE DE FUNCIONÁRIOS
O controle de qualidade dos funcionários requer um programa de educação permanente efetivo. O
treinamento deve ser prático e ser uma atividade regular. Os trabalhadores envolvidos com as
atividades do laboratório devem ser estimulados a participar com freqüência em cursos, seminários e
similares, tanto localmente quanto ao nível nacional.
Os resultados dos procedimentos devem ser conferidos pelo responsável designado quanto à exatidão,
reprodutibilidade e concordância com os padrões de controle de qualidade.
Todos os trabalhadores envolvidos com atividades rotineiras do laboratório de microbiologia, inclusive
os que exercem suas tarefas em turnos alternativos, devem ter acesso ao programa de ensaios de
proficiência.
Reuniões regulares para informar os trabalhadores do laboratório quanto às mudanças e sugestões de
melhorias nos procedimentos laboratoriais são recomendáveis.

Mod II - 41
1. August, M.J., Hindler, J.A., Huber, T.W., Sewel, D.L. e Cumitech A. Quality control and quality
assurance practices in clinical microbiology. Coord. Ed. A.S. Wessfeld, American Society for
Microbiology, Washington, D.C., 1990.
2. Isenberg, H.D. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbi-
ology, Washington, D.C., 1992.
3. Ministério da Saúde. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia.
Fundação Nacional da Saúde, Brasília, 2001.
4. Ministério da Saúde. Manual de Conduta - Exposição Ocupacional a Material Biológico:
Hepatite e HIV. Coordenação Nacional de DST e AIDS, Ministério da Saúde, Brasília, 1999.
5. Ministério da Saúde. Manual de condutas em exposição ocupacional a material biológico.
Secretaria de Políticas de Saúde, Brasília, 1999.
6. Ministério da Saúde. Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o
controle da infecção hospitalar. Secretaria Nacional de Assistência à Saúde, Brasília, 1991.
7. Ministério da Saúde. Manual de Processamento de Artigos e Superfícies em
Estabelecimentos de Saúde. 2ª Edição, Centro de Documentação Brasília, 1994.
8. World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 2nd.
Ed., WHO, Genebra, 2003.

Procedimentos
Laboratoriais: da
Requisição do Exame à
Análise Microbiológica
Módulo III

ÍNDICE
1. Requisição de Exames Microbiológicos ............................................................................1
Modelos para Requisição de exames Microbiológicos .................................................................1
Exames especiais de interesse da CCIH ..................................................................................4
2. Coleta, Transporte e Conservação de Amostra.................................................................5
Introdução .........................................................................................................................5
Aspectos básicos da coleta e do transporte de amostra .............................................................5
Instruções para Hemoculturas ...............................................................................................7
Instruções para Ponta de Cateter Intravascular........................................................................9
Instruções para Ponta de Sonda Vesical..................................................................................9
Instruções para Escarro...................................................................................................... 10
Instruções para Secreção Traqueal....................................................................................... 10
Instruções para Aspirado Transtraquial (ATT) ........................................................................ 10
Instruções para Lavado Bronco-Alveolar (BAL)....................................................................... 10
Instruções para Secreção de Orofaringe................................................................................ 11
Instruções para Fluidos Orgânicos Estéreis ............................................................................ 11
Instruções para Feridas, Abscessos e Exsudatos..................................................................... 12
Instruções para Amostras de Tecido Subcutâneo e Amostras de Pele ........................................ 12
Instruções para Biópsia da Pele ........................................................................................... 13
Instruções para Tecido Ósseo.............................................................................................. 13
Instruções para Lesões Superficiais - coleta para fungos - micológico direto............................... 13
Instruções para Secreção de Ouvido..................................................................................... 13
Instruções para Secreção Ocular.......................................................................................... 13
Instruções para Material Genital .......................................................................................... 14
Instruções para Secreção Anal............................................................................................. 16
Instruções para Fezes ........................................................................................................ 17
Instruções para Urina......................................................................................................... 17
Instruções para Anaeróbios................................................................................................. 18
3. Microscopia e coloração.................................................................................................20
Direto sem Coloração......................................................................................................... 20
Coloração de GRAM ........................................................................................................... 21
Outras Colorações ............................................................................................................. 25
4. Semeadura em meios de cultura....................................................................................28
Material Clínico e os respectivos meios de cultura e microscopia............................................... 28
Procedimentos para SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA ....................................................... 30
5. Identificação..................................................................................................................35
Meios de cultura................................................................................................................ 35
Coloração de Gram ............................................................................................................ 35
Esquema geral de identificação bacteriana ............................................................................ 36
6. Manutenção e estoque de culturas.................................................................................38
Manuntenção das culturas .................................................................................................. 38
Estoque de culturas Bacterianas por ≥ 1 ano ......................................................................... 39
Estoque de culturas Bacterianas por < 1 ano ......................................................................... 40
Estoque de micobactérias por ≥ 1 ano.................................................................................. 40
Estoque de micobactérias por < 6 meses .............................................................................. 41
Estoque de cultura de fungos por ≥ 1 ano............................................................................. 41
Estoque de cultura de fungos por < 6 meses ......................................................................... 42
Coleções de cultura............................................................................................................ 42
7. Referências bibliográficas..............................................................................................43

mod III - 1
1. REQUISIÇÃO DE EXAMES MICROBIOLÓGICOS
Deve-se lembrar que o envolvimento do médico com o laboratório de microbiologia pode com
freqüência ser muito útil para ambos, propiciando melhor orientação técnica, mais objetividade,
facilitando a interpretação de resultados, etc.
A importância do relacionamento médico com o laboratório deve-se ao fato de que a microbiologia
envolve etapas interpretativas para muitos exames. Por exemplo, aqueles que envolvem flora
(mucosas), ou no caso de agentes específicos em que são fundamentais a escolha de meios seletivos,
o uso de meios enriquecedores, o uso de suplementos, a ampliação do tempo de cultivo, a variação na
temperatura de incubação, a adição de novos testes, etc.
O médico muitas vezes considera um desperdício de tempo o preenchimento de uma requisição de
exame microbiológico.
O microbiologista ou responsável pela rotina deverá conferir as requisições ou pedidos de exame de
cada material para verificar a existência de pedido.
Os itens abaixo servem apenas de roteiro para destacar informações que podem ser muito úteis e
valorizadas em diferentes etapas do processamento do exame.
Identificação clara do paciente (modelo 1)
Informações sobre o paciente que são relevantes para o diagnóstico do processo infecioso (modelo
2)
Descrição da amostra (modelo 3)
Natureza do Teste Solicitado (modelo 4)
Fatores que podem comprometer o exame microbiológico:
Hipótese diagnóstica mal elaborada.
Informações mal colhidas, incompletas, ou não devidamente interpretadas, etc.
Requisição inadequada da análise laboratorial.
Coleta, conservação e transporte inadequados.
Falhas técnicas no processamento da análise.
Demora na liberação de resultado.
Má interpretação dos resultados.
MODELOS PARA REQUISIÇÃO DE EXAMES MICROBIOLÓGICOS
MODELO 1
Nome ________________________ Sobrenome ________________________ Iniciais ________
Registro n.º (do hospital ou serviço) ___________________________________________________________
Data de nascimento ____/____/____ (evitar confusão com homônimos e com a faixa etária)
Sexo: M ( ) F ( ) (por exemplo, a interpretação de bacteriúria pode ser diferente para a mulher)
Clínica ( ) Leito ( ) Ambulatório ( )
Campo para identificação do exame no Laboratório (número da análise microbiológica e seção do
laboratório) _____________________________________________________________________________

mod III - 2
MODELO 2
Hipótese diagnóstica _____________________________________________________________
Dados clínicos (descrever objetivamente os achados clínicos mais significativos, lesões cutâneas ou de
mucosas, local e características do sítio de infecção, etc.) __________________________________________
Dados epidemiológicos relevantes (viagem ou excursão, se vive em área endêmica de alguma doença
infecciosa como malária, riquetsioses, cólera, etc.; doença ocupacional, por exemplo, contato com animais;
acidentes - mordida, trauma, picada de carrapato, enchentes, etc.; envolvimento em surto de infecção
hospitalar, etc.) ___________________________________________________________________________
Outros dados laboratoriais importantes (dados laboratoriais que evidenciem o sítio do processo infeccioso:
RX, tomografia, urina rotina, hemograma, etc.) ____________________________________________
Provável origem do processo infeccioso: comunitário ( ) hospitalar ( )
Relacionado ao procedimento invasivo? Qual? (se hospitalar e se relacionado ao procedimento invasivo -
sonda vesical, cateter, traqueostomia, diálise, alimentação parenteral, cirurgia) ________________________
Cirurgia? Qual? __________________________________________________________________
Existe infecção em outra topografia? Qual? _________________________________________________
Fez uso nos últimos dez dias de antibióticos? Quais? (descrever os motivos do uso) ________________
Existe comprometimento imunológico? Sim ( ) Não ( )
(prematuridade, transplante de órgãos, uso de imunossupressores, diabetes, câncer, aids, leucemia, anemia
falciforme, talassemia, hemofilia, esplenectomia, cirrose, etc.; doença oportunista? Qual?)
É paciente transferido ou de alta de outro hospital nos últimos 30 dias? Sim ( ) Não ( )
É portador, colonizado ou infectado de bactérias multirresistentes? Sim ( ) Não ( )
Para urocultura informar: sintomático ( ) assintomático ( )
Data do pedido ____/____/____
Nome legível do médico/CRM, carimbo e/ou telefone de contato (facilita a comunicação para situações
emergenciais. Por exemplo, isolamento de M. tuberculosis, isolamento de nova cepa multirresistente, etc)
Data ____/____/____ hora da coleta ___________________
Nome e identificação de quem colheu o material (permite reavaliação de procedimentos e reciclagem, por
exemplo, quando se detecta excesso de contaminação em uroculturas, etc) ___________________________
Observações (comentários, quando necessários, sobre o procedimento de coleta. Por exemplo, acidentes ou
dificuldades para obtenção do material, condições do paciente, quantidade, etc) _______________________

mod III - 3
MODELO 3
Hemocultura: Sangue periférico ( ) Sangue colhido de cateter ( )
Urocultura: Jato médio ( ) Sonda de alívio ( ) Sonda vesical de demora ( )
Punção suprapúbica ( ) Saco coletor ( )
Trato Respiratório: Orofaringe ( ) Escarro ( ) Aspirado Traqueal ( )
Lavado bronco-alveolar ( ) Escovado brônquico ( )
Outros ( )
Lesões, secreções, abscessos ( )
Descrever topografia: ____________________________________________________________
Nível da coleta: superficial ( ) profunda ( )
Via de obtenção do material: Punção ( ) Swab ( ) Raspado ( )
Drenagem ( ) Fístula( ) Outros ( ) ___________
Líquidos cavitários: Líquor ( ) Líquido pleural ( ) Pericárdico ( )
Sinovial ( ) Ascítico ( )
Próteses ( ) Pontas de cateter ( )
Outros: ________________________________________________________________________
MODELO 4
Exame microscópico: A fresco ( )
Campo escuro ( )
Direto ( )
Com coloração: Gram ( )
Ziehl ( )
Giemsa ( )
Outro ( )
Pesquisa de: Pneumocistis carinii ( ) Cryptosporidium ( ) Isospora belli ( )
Cultura: Rotina bacteriológica ( )
Rotina para fungos ( )
Rotina para micobactérias ( )
Rotina para vírus ( )
Específicos: Rotina para anaeróbios ( )
Micoplasma ( )
Legionella spp. ( )
Helicobacter spp. ( )
Outros testes: (em geral realizados sob consulta) _______________________________________________

mod III - 4
EXAMES ESPECIAIS DE INTERESSE DA CCIH
Controle de medicamentos
Frascos de soros
Bolsas de sangue
Portadores
Equipamentos
Outros
TESTES ESPECIAIS
Aglutinação com látex para meningite.
Testes imunológicos diretamente no material clínico: Chlamydia trachomatis (genital),
Streptococcus pyogenes (orofaringe).
Pesquisa de toxinas (S. aureus, Limulus teste para endotoxinas de Gram (-) Clostridium difficile
etc.)
Tipagem para fins epidemiológicos em investigação de surtos ou fontes de infecção hospitalar.
PCR (polimerase chain reaction) para micobactérias, etc.
Exames quantitativos (exceto os de rotina, como urina, cateter vascular e lavado broncoalveolar).
Por exemplo, hemocultura de sangue periférico ou de cateter, biópsia de tecidos, líquido de diálise
peritoneal, etc.
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Rotina (Kirby – Baner).
Antibiograma com drogas não padronizadas.
Outros testes - Concentração Inibitória Mínima (CIM), E-test.
Pesquisa de antimicrobianos no sangue, LCR, etc., poder bactericida do soro.
Teste de sensibilidade de fungos a drogas, etc.

mod III - 5
2. COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRA
INTRODUÇÃO
Todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é conseqüência da qualidade da amostra
recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser
eleito o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes.
A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e
favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado.
Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um
“falso” agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada.
O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível e
correta o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia.
Na amostra devem estar identificados:
Nome e registro do paciente
Leito ou ambulatório e especialidade
Material colhido
Data, hora e quem realizou a coleta
ASPECTOS BÁSICOS DA COLETA E DO TRANSPORTE DE AMOSTRA
COLETA
Quem coleta o material deve ser devidamente treinado e periodicamente reciclado nesta atividade.
Deve saber que o material deverá ser destinado, o mais brevemente possível, ao laboratório. Deve
conhecer ou obter instruções sobre conservação e/ou transporte do material caso este não possa ser
realizado imediatamente.
Considerações gerais da coleta microbiológica
Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível.
Instruir claramente o paciente sobre o procedimento.
Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos.
Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado.
Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos causadores de
diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase
aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal. Na suspeita de febre tifóide, a fase da doença
irá determinar o melhor local da coleta (sangue/fezes).
Quantidade suficiente de material deve ser coletado para permitir uma completa análise
microbiológica. Caso a quantidade seja pequena, priorizar os exames.
• pedido do exame deve conter as informações descritas no módulo anterior (ver requisição de
exame).
Considerações de segurança
Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento.
Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica.
Usar frascos e meios de transporte apropriados.
Não manusear a amostra em trânsito: paciente e laboratório.

mod III - 6
Não contaminar a superfície externa do frasco de coleta e verificar se ele está firmemente vedado.
(caso ocorram respingos ou contaminação na parte externa do frasco, fazer descontaminação com
álcool 70% ou outra solução descontaminante disponível)
Não contaminar a requisição médica que acompanha o material.
As amostras deverão ser transportadas em sacos plásticos fechados.
Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessários.
Colocar a identificação no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rótulos.
Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratório.
TRANSPORTE DAS AMOSTRAS
Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao laboratório para:
Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório de microbiologia
trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos.
Evitar o contato prolongado dos microorganismos com anestésicos utilizados durante a coleta, pois
eles poderão exercer atividade bactericida.
Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado
broncoalveolar.
Consultar o laboratório para verificar a disponibilidade dos meios de transporte.
Tempo crítico para entrega da amostra ao laboratório e meios de transporte
Amostra Tempo Crítico Frascos e Meios de Transporte
Liquor Imediatamente (nao refrigerar) Tubo seco estéril
Líquido pleural Imediatamente (nao refrigerar) Tubo seco estéril
Swab Imediatamente (nao refrigerar) Tubo seco estéril ou meio semi-solido (Stuart,
Amies)
Suspeita de
anaeróbios
30 minutos Meio de transporte apropriado Evitar o transporte
em seringa com agulha
Feridas e tecidos 30 minutos de ou até 12 horas
(meio de transporte)
Meio de transporte apropriado
Hemocultura 30 minutos (não refrigerar) Frascos com meios de cultura para rotina manual
ou automatizada
Trato respiratório 30 minutos Tubo seco estéril
Trato gastrointestinal 1 hora Tubo seco estéril
Urina 1 hora ou refrigerada até 24 horas Pote seco estéril
Fezes 12 horas se em meio de transporte Cary Blair meio modificado para transporte de
fezes, com pH 8,4. Boa recuperação também
para Vibrio sp e Campylobacter sp
CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO PARA AMOSTRAS CLÍNICAS
O recebimento criterioso das amostras clínicas pelo laboratório de microbiologia garante uma melhor
correlação clínico/laboratorial.
O microbiologista ou responsável pela rotina deverá verificar se a amostra está apropriadamente
identificada, se a quantidade de material é suficiente e observar o aspecto da amostra - purulento,
límpido, hemorrágico, etc.

mod III - 7
Principais erros de identificação
Discrepância entre a identificação da amostra e o pedido médico.
Falta de identificação da amostra.
Origem da amostra ou tipo de amostra não identificada.
Teste a ser realizado não especificado.
Amostras Inadequadas
Material clínico recebido em solução de fixação (formalina).
Ponta de cateter de Foley.
Material conservado inadequadamente com relação a temperatura (urinas colhidas há mais de 24
horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou colhidas há mais de duas horas, sem refrigeração).
Frascos não estéreis.
Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação na superfície
externa.
Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo dia e da mesma origem.
Swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos.
Swab seco.
Culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas.
Amostras com as características acima descritas são inadequadas e demandam um contato prévio
com o médico solicitante para melhores esclarecimentos.
Amostras não recomendadas para o exame microbiológico por fornecerem resultados
questionáveis
Amostra Procedimento
Swab de amostra de queimadura processar biópsia ou aspirado
Swab de úlcera de decúbito processar biópsia ou aspirado
Swab de abscesso perirretal processar biópsia ou aspirado
Swab de lesão de gangrena processar biópsia ou aspirado
Swab de lesão periodontal processar biópsia ou aspirado
Swab de úlcera varicosa processar biópsia ou aspirado
Vômito não processar
Material de colostomia não processar
Ponta de cateter de Foley não processar
Aspirado gástrico de recém-nascido não processar
INSTRUÇÕES PARA HEMOCULTURAS
TÉCNICAS DE COLETA
Colher antes da administração de antibióticos.
Lavar as mãos e secá-las.
Remover os selos da tampa dos frascos de hemocultura e fazer assepsia prévia nas tampas com
álcool 70%.

mod III - 8
Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não deverá mais ser
tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com álcool 70% de forma circular e de dentro para fora.
Aplicar solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) também com movimentos
circulares e de dentro para fora. Para ação adequada do iodo, deixar secar por um a dois minutos
antes de efetuar a coleta.
Coletar a quantidade de sangue e o número de amostras recomendados de acordo com as
orientações descritas ou se discriminadas no pedido médico.
Remover o iodo do braço do paciente com álcool 70% para evitar reação alérgica.
Identificar cada frasco com todas as informações padronizadas e enviar ao laboratório juntamente
com a solicitação médica devidamente preenchida.
Observações:
Não é recomendada a técnica de coleta através de cateteres ou cânulas quando se podem utilizar
punções venosas.
Punções arteriais não trazem benefícios na recuperação dos microrganismos quando comparadas
com punções venosas.
Não se recomenda a troca de agulhas entre a punção de coleta e distribuição do sangue no frasco
de hemocultura.
Método de coleta do sangue e o volume coletado influenciam diretamente no sucesso de
recuperação de microrganismos e uma interpretação adequada dos resultados.
Cada instituição deverá ter suas normas de coleta particularizadas de acordo com o tipo de
sistema utilizado (manual x automatizado) e do tipo de paciente.
Fatores que influenciam diretamente os resultados de hemoculturas:
Volume de sangue coletado por frasco:
O volume ideal corresponde a 10% do volume total do frasco de coleta. Quanto maior o volume de
sangue inoculado no meio de cultura, por amostra, melhor recuperação do microrganismo,
respeitando-se a proporção sangue/meio citada, pois o sangue em desproporção com o meio pode
inibir o crescimento de microrganismos. Frascos que possibilitem uma coleta de até 10 ml são os mais
indicados. Exemplo: frascos com 40 ml coletar de 4 ml a 5 ml de sangue. O anticoagulante
recomendado é o SPS (Polianetolsulfonato sódico).
Método de anti-sepsia:
A execução de técnica de anti-sepsia para reduzir os riscos de contaminação de hemocultura.
IDENTIFICAÇÃO DOS FRASCOS E PEDIDO MÉDICO
Nome do paciente
Hora e local da coleta
Anotar uso de antibióticos
Possível diagnóstico
TRANSPORTE
Nunca refrigerar o frasco.
Manter o frasco em temperatura ambiente e encaminhar o mais rápido possível para o laboratório.
NÚMERO DE FRASCOS
Deverá ser considerado de acordo com a condição clínica do paciente.
Um total de três culturas em 24 horas costuma ser suficiente para descartar bacteremia ou
endocardite (Coletas acima de quatro amostras não trouxeram maior índice de recuperação
microbiana em diferentes trabalhos clínicos).
Dados recentes sugerem que o número de frascos anaeróbios coletados deve ser adaptado de
acordo com a patologia.

mod III - 9
Adultos e Adolescentes
Endocardite bacteriana aguda: coletar três amostras de punções venosas diferentes (braço direito
e esquerdo), com intervalo de 15 a 30 minutos, 1 a 2 horas antes da antibioticoterapia
Endocardite bacteriana subaguda: coletar três amostras, nas primeiras 24 horas, com intervalo
mínimo de 15 minutos, com punções venosas diferentes. Colher, de preferência, as duas primeiras
antes do início da febre. Se, após 24 horas de cultivo, não apresentarem crescimento bacteriano,
colher mais três amostras.
Infecções sistêmicas e localizadas como sepsis aguda, meningite, osteomielite, artrite ou
pneumonia bacteriana aguda: coletar duas amostras de punções venosas diferentes, antes da
antibioticoterapia, com intervalos de cinco minutos entre as punções. Se possível, 10 ml a 20 ml
por amostra.
Bacteremia de origem indeterminada: coletar quatro a seis amostras de punções venosas
diferentes em 48 horas. Se, após 24 horas de cultivo, não apresentarem crescimento bacteriano,
colher mais duas amostras.
Paciente com picos febris regulares: coletar não mais que três amostras antes do início da febre (1
hora); evitar o pico febril.
Crianças
Coletar amostras com 0,5 ml a 3 ml.
Duas culturas são recomendadas para diagnóstico de bacteremias em recém-nascidos.
INSTRUÇÕES PARA PONTA DE CATETER INTRAVASCULAR
Cateteres intravenosos são importantes fontes de bacteremia e fungemia, bem como causadores de
complicações infecciosas no local da inserção. Quando existe suspeita de colonização no cateter, com
a possibilidade de evolução para septicemia, a ponta do cateter deve ser cultivada.
TÉCNICAS DE RETIRADA DA PONTA DE CATETER
Cultura semi-quantitativa (Método de Maki) da ponta de cateter é importante para determinar a
relação entre colonização do cateter e sepsis. O resultado obtido, entretanto, depende de técnicas de
retirada adequadas. Deve ser salientado que os mesmos cuidados de desinfecção utilizados
na introdução do cateter devem ser adotados no momento da retirada. São eles:
Fazer uma rigorosa anti-sepsia da pele ao redor do cateter com álcool 70%, seguida de uma
solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%, que deverá ser removida com álcool 70%
para evitar queimadura pelo iodo ou reação alérgica.
Remover o cateter e, assepticamente, cortar 5 cm da parte mais distal, ou seja, a que estava mais
profundamente introduzida na pele. Não usar tesouras embebidas em soluções anti-sépticas.
Colocar o pedaço do cateter num frasco estéril, sem meio de cultura. O material deve ser
transportado imediatamente ao laboratório evitando sua excessiva secagem.
A presença de um número maior ou igual a 15 colônias de um único tipo de bactéria sugere que a
ponta de cateter pode estar sendo fonte de infecção.
Cateteres aceitáveis para cultura semi-quantitativa: Central, CVP, Hickman, Broviac, periférico,
arterial, umbilical, alimentação parenteral e Swan-Ganz.
INSTRUÇÕES PARA PONTA DE SONDA VESICAL
Não realizar cultura de ponta de sonda vesical, porque o crescimento bacteriano representa a flora da
uretra distal. Recomenda-se cultura de urina após 48 horas da retirada da sonda na monitorização de
processos infecciosos.
Uroculturas realizadas antes deste período podem fornecer resultados positivos sem que eles estejam,
necessariamente, associados à infecção.

mod III - 10
INSTRUÇÕES PARA ESCARRO
Existem ocasiões em que o paciente deve participar ativamente da coleta de material, como no caso
do escarro. A melhor coleta é feita sob a supervisão direta da equipe de enfermagem ou do
fisioterapeuta.
Lembrar que este material não é considerado ideal para avaliação microbiológica do trato respiratório.
Hemocultura, lavado brônquico ou aspirado transtraqueal podem fornecer resultados mais confiáveis.
Orientar o paciente da importância da coleta do escarro e não da saliva. As amostras de saliva são
impróprias para análise bacteriológica, pois não representam o processo infeccioso.
Colher somente uma amostra por dia, se possível o primeiro escarro da manhã, antes da ingestão
de alimentos.
Orientar o paciente para escovar os dentes, somente com água (não utilizar pasta dental) e
enxaguar a boca várias vezes, inclusive com gargarejos.
Respirar fundo várias vezes e tossir profundamente, recolhendo a amostra em um frasco de boca
larga. Se o material obtido for escasso, coletar a amostra depois de nebulização.
Encaminhar imediatamente ao laboratório.
Na suspeita de infecção por micobactérias ou fungos, coletar pelo menos três amostras, em dias
consecutivos (somente uma amostra por dia).
Em caso de pacientes com dificuldades para escarrar, esta amostra poderá ser induzida por
inalação ou ser realizada coleta por aspiração transtraqueal.
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO TRAQUEAL
A coleta deste material é realizada em pacientes entubados, através de sonda de aspiração. Os
resultados microbiológicos dessas amostras podem refletir colonização local, sendo a interpretação
clínica extremamente complicada.
Como procedimento para diagnóstico etiológico de pneumonias hospitalares, não se recomenda esse
procedimento, que poderá levar a condutas terapêuticas inadequadas.
INSTRUÇÕES PARA ASPIRADO TRANSTRAQUIAL (ATT)
O procedimento é realizado por equipe médica especializada. O material é obtido diretamente por
material transtraqueal, evitando-se contaminação com o trato respiratório alto.
INSTRUÇÕES PARA LAVADO BRONCO-ALVEOLAR (BAL)
Utilizado para obtenção etiológica das pneumonias associadas a ventilação mecânica e em paciente
imunodeprimidos, sendo considerado o método mais fidedigno para investigação microbiológica do
trato respiratório inferior.
Os agentes etiológicos da pneumonia estão geralmente presentes em altas concentrações nas
secreções pulmonares ( >105
- 106
UFC/ml). O valor de corte sugerido para distinguir colonização de
infecção é de 105
UFC/ml. Este valor foi determinado por alguns estudos, podendo ocorrer variações.
O tempo do transporte da amostra é essencial, devendo estar em torno de 30 minutos, sendo o
máximo aceitável de 1 a 2 horas. O material deverá ser obtido antes das biópsias de escovados para
se evitar excesso de sangue.
Este procedimento deve ser realizado por equipe médica especializada:
Colher as alíquotas em recipientes distintos:

mod III - 11
‫ـ‬ A primeira alíquota deverá ser colocada em frasco identificado como primeira amostra
(utilizada para esfregaços microbiológicos).
‫ـ‬ Todas as outras amostras poderão ser coletadas em um único frasco estéril (POOL). Somente
estas amostras deverão ser utilizadas para a cultura quantitativa, evitando falsas contagens.
CULTURA PARA ANAERÓBIOS DO TRATO RESPIRATÓRIO:
Coletar tecido pulmonar, aspirado transtraqueal, aspirado percutâneo, aspirado transcutâneo e lavado
brônquico via cateter protegido.
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO DE OROFARINGE
A contaminação com saliva, que contém uma flora bacteriana variada, pode dificultar o
isolamento do verdadeiro agente infeccioso.
As amostras devem ser cultivadas para recuperação do Streptococcus pyogenes.
Solicitar ao paciente que abra bem a boca.
Usando abaixador de língua e swab estéril, fazer esfregaços sobre as amígdalas e faringe
posterior, evitando tocar na língua e na mucosa bucal.
Procurar o material nas áreas com hiperemia próximas aos pontos de supuração ou remover o pus
ou a placa, colhendo o material abaixo da mucosa.
Coletar a amostra exatamente na área inflamada, evitando outros sítios na cavidade oral.
Colher dois swabs.
Enviar imediatamente ao laboratório para evitar a excessiva secagem do material.
INSTRUÇÕES PARA FLUIDOS ORGÂNICOS ESTÉREIS
(Líquidos: Pleural, Ascítico, Biliar, de Articulações e outros)
Proceder a anti-sepsia no sítio da punção com álcool 70% e com solução de iodo (tintura de iodo
1% a 2 % ou PVPI 10%), que deverá ser removida após o procedimento, com álcool de 70% para
evitar queimadura ou reação alérgica.
Obter a amostra através de punção percutânea ou cirúrgica. Quanto maior o volume da amostra,
maior a probabilidade de isolamento do agente etiológico. Coleta por procedimento médico.
Encaminhar o líquido coletado em tubo seco e estéril ou inoculado diretamente nos frascos do
equipamento de automação de hemoculturas.
Transportar imediatamente ao laboratório, com a orientação do tipo de cultura (aeróbia,
anaeróbia, fungos, micobactérias, etc.) necessariamente especificada no pedido médico.
LIQUOR
Procedimento realizado por equipe médica especializada.
Recomenda-se jejum.
Caso a coleta permita somente a disponibilidade de um tubo, o laboratório de microbiologia deverá
ser o primeiro a manipulá-lo. Caso haja coleta de dois ou mais tubos, o Laboratório de
Microbiologia deverá ficar com o tubo que contiver menos sangue.
Ao transportar a amostra, nunca refrigerar.
Transportar a amostra imediatamente ao laboratório, acompanhada de pedido médico
adequadamente preenchido, nos casos de paciente com idade crítica.
Os exames a serem realizados devem ser especificados e priorizados de acordo com o volume
coletado.

mod III - 12
INSTRUÇÕES PARA FERIDAS, ABSCESSOS E EXSUDATOS
O termo “secreção de ferida” não é apropriado como informação da origem do material coletado. O
sítio anatômico específico, bem como as informações adicionais (material de ferida superficial ou
profunda), são extremamente valiosos para o laboratório, auxiliando na interpretação dos resultados.
As margens e superfície da lesão devem ser descontaminadas com solução de povidine iodine
(PVPI) e soro fisiológico (metade/metade).
Proceder à limpeza com solução fisiológica.
Coletar o material purulento localizado na parte mais profunda da ferida, utilizando-se, de
preferência, aspirado com seringa e agulha. Quando a punção com agulha não for possível, aspirar
o material somente com seringa tipo insulina.
Swabs (menos recomendados) serão utilizados quando os procedimentos acima citados não forem
possíveis. A escarificação das bordas após anti-sepsia pode produzir material seroso que é
adequado para cultura.
Observações:
A descontaminação da superfície das lesões ou abscessos abertos, antes da coleta do material, é
crítica para interpretação do resultado.
Não coletar o pus emergente. O material das margens da lesão e a parte mais profunda do sítio
escolhido são mais representativos e possuem maior viabilidade de microrganismos.
A cultura de lesões secas e crostas não é recomendada, a menos que a obtenção de exsudato não
seja possível.
A coleta de ferida de queimadura deve ser realizada após extensa limpeza e debridamento da
lesão. Biópsia da pele é a técnica mais recomendada.
CULTURA PARA ANAERÓBIOS DE SECREÇÕES DE FERIDAS E ABSCESSOS
Aspirar o material com agulha e seringa após descontaminação da superfície com PVPI a 10%,
deixando em contato com a superfície por um minuto. Quando o uso de agulha for contra-indicado,
aspirar o material com cateter plástico flexível ou diretamente com seringa, sem agulha.
INSTRUÇÕES PARA AMOSTRAS DE TECIDO SUBCUTÂNEO E AMOSTRAS DE PELE
A superfície da ferida de queimadura estará colonizada pela microbiota do próprio paciente e/ ou pelos
microrganismos do meio ambiente em que se encontra. Quando a colonização de bactérias for grande,
pode ocorrer infecção subcutânea, resultando numa bacteremia. Cultura somente da superfície pode
levar a erros e é desaconselhável. Portanto, biópsia de tecido profundo é o mais indicado.
Os microrganismos não ficam distribuídos somente na ferida queimada. Por isso, recomenda-se
coletar amostras de áreas adjacentes da queimadura.
Desinfetar a superfície com solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2 % ou PVPI a 10%), que
deverá ser removida com álcool 70% para evitar queimadura e reação alérgica. No caso de
pacientes queimados usar solução aquosa de PVPI a 10% e ou solução fisiológica.
Deixar secar antes de coletar a amostra.
Coletar amostra de punção de biópsia (3 mm a 4 mm) para cultura.
CONSIDERAÇÕES PARA COLETA DE TECIDO SUBCUTÂNEO E AMOSTRAS DE TECIDO
Cultura Procedimento
Bactéria Aspirado ou amostra de biópsia são preferíveis ao invés de swab
Anaeróbio Não é comum para queimaduras, úlceras, nódulos ou infecções
superficiais da pele; usado para mordeduras e traumas

mod III - 13
Fungo Usada para diagnosticar dermatófitos, leveduras, filamentos e fungos
dimórficos
Micobactéria Útil no diagnóstico de M. marimum, M. fortuitum e M. chelonei
INSTRUÇÕES PARA BIÓPSIA DA PELE
Descontaminar a superfície com solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2 % ou PVPI a 10%), que
deverá ser removida com solução fisiológica para evitar queimadura e reação alérgica.
Procedimento médico, coletar 3 mm a 4 mm de amostra.
Colocar num recipiente estéril, sem formalina, com meio de cultura líquido forne-cido pelo
laboratório.
INSTRUÇÕES PARA TECIDO ÓSSEO
Obter amostra óssea através de biópsia ou curetagem.
Colocar num recipiente estéril contendo NaCl 0,85% estéril (solução fisiológica).
Não usar formalina.
INSTRUÇÕES PARA LESÕES SUPERFICIAIS - coleta para fungos - micológico direto
Limpar a superfície com água destilada ou soro fisiológico estéreis; não utilizar iodo.
Usando um bisturi, raspar as bordas da lesão.
Amostra do couro cabeludo inclui cabelo, que é seletivamente coletado para exame.
Amostra de unha - obter raspado e/ou material abaixo da unha.
Os materiais obtidos podem ser colocados em placa de Petri estéril e identificados separadamente
para cada sítio a ser investigado (por exemplo, unha da mão direita, raspado do pé esquerdo, raspado
da região plantar, etc.).
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO DE OUVIDO
CONDUTO AUDITIVO EXTERNO E MÉDIO (ATÉ A MEMBRANA TIMPÂNICA).
Remover secreção superficial com um swab umedecido em salina estéril e com outro swab obter
material fazendo rotação no canal.
Inserir ,em seguida, no meio de transporte (Stuart).
CONDUTO AUDITIVO INTERNO
Membrana timpânica rompida: o médico deve proceder como no item anterior e com espéculo ou
cone de otoscópio coletar material com swab e em seguida inserir no meio de transporte. Com
outro swab, fazer esfregaço para coloração Gram.
Membrana íntegra: usar seringa para puncionar a membrana ou sistema apropriado para
aspiração e coletor, que deverão ser encaminhados imediata-mente ao laboratório para
processamento ou introduzir em meio de transporte para conservação e fazer lâmina para
bacterioscopia.
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO OCULAR

mod III - 14
As culturas deverão ser coletadas antes da aplicação de antibióticos, soluções, colírios ou outros
medicamentos.
Desprezar a secreção purulenta superficial e, com swab colher o material da parte interna da
pálpebra inferior.
Identificar corretamente a amostra e enviar imediatamente ao laboratório, evitando a excessiva
secagem do material.
INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
AMOSTRAS E SÍTIOS GENITAIS PARA CULTURA
Não indicados para o Cultivo de
Anaeróbios
Indicados para o Cultivo de
Anaeróbios
TRATO
FEMININO
Endocérvix
Vagina
Uretra
Placenta
Vulva
externo feminino Genital
Períneo
Placenta (origem de cesárea)
Endométrio
Falópio de Trompa
Aspirado cervical
Ovário
Glândulas de Bartholin
TRATO
MASCULINO
Uretra
Fluido prostático
Fluido Seminal
Observações:
A seleção de materiais genitais, bem como sua coleta adequada, são fatores importantes na
interpretação das culturas deste tipo de material, uma vez que estes possuem uma quantidade
grande de microrganismos comensais.
Culturas vaginais de rotina não são indicadas pelo motivo acima exposto.
Culturas anaeróbias são limitadas a certos materiais, conforme tabela anterior.
Muitos agentes de infecção genital em mulheres são limitados a certos sítios anatômicos, conforme
tabela a seguir.
Nos casos de suspeita de infecção por Chlamydia trachomatis deverá ser solicitado exame por
imunofluorescência ou por biologia molecular (PCR). Pode ocorrer associação entre infecções por
Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae.
Material purulento, proveniente da glândula de Bartholin, poderá ser obtido diretamente do ducto,
após massagem digital ou colhida através de seringa.
Endométrio: este tipo de material é melhor coletado por curetagem. Recomenda-se o uso de
swabs protegidos para coleta via cérvix, para evitar contaminação com a flora vaginal.
DIP (Doença Inflamatória Pélvica):o material é coletado por técnica invasiva. O líquido peritoneal
pode ser coletado por aspiração do fundo de saco vaginal (culdocentese). Material retirado
diretamente dos ovários ou trompas é coletado cirurgicamente.
Vulva: raspados, aspirados ou biópsia não têm muito valor para cultura a não ser em casos de
suspeita de sífilis. Nos casos de suspeita de sífilis, a lesão deverá sofrer uma abrasão cuidadosa
com gaze seca até que um fluido seroso comece a fluir, tomando cuidado para evitar
sangramento, o que acarreta interferência no exame em campo escuro. Após o acúmulo de fluido
seroso, colocar uma gota em uma lâmina limpa e examinar imediatamente.
DIU (Dispositivo Intra-Uterino): deve ser removido pelo médico evitando-se contaminação cervical
ou vaginal. Coloque todo o DIU dentro de um recipiente estéril para ser transportado para o
laboratório.
Cultura semi-quantitativa para Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum podem ser
realizadas com kits comercializados. Consultar a bula para maiores informações. Infecções por
Chlamydia trachomatis: não aceitar secreção vaginal para pesquisa de Chlamydia, uma vez que
este microrganismo não pode crescer nas células epiteliais escamosas da vagina Chlamydia são

mod III - 15
parasitas intracelulares obrigatórios do epitélio colunar do cérvix. Realizar coleta de material
endocervical, raspando-se o endocérvix para obter células e secreção. O swab deverá ser
inoculado imediatamente em meio de transporte especial ou preparar as lâminas para coloração
especial.
Detecção de estreptococos do grupo “B” em mulheres: culturas cervicais não são aceitáveis e não
se devem utilizar espéculos. Sugere-se coleta com swab do intróito vaginal e outro do orifício
anorretal. Os swabs devem ser colocados em meios de transporte.
Secreção prostática: poderá ser coletada após massagem digital pelo reto, podendo ser
acompanhada de amostras de urina pré e pós-massagem. O material ejaculado também poderá
ser submetido à análise.
Na suspeita de Neisseria gonorrhoeae em mulheres, a cultura é o método de escolha, sendo o
material coletado do endocérvix. O encaminhamento deve ser feito em meio de transporte ou
plaqueado imediatamente.
SECREÇÃO CERVICAL E VAGINAL
Amostra a ser coletada Exames realizados Material necessário para coleta
SECREÇÃO VAGINAL Bacterioscopia
Cultura para fungo/aeróbio
Bacterioscopia
Swab seco para duas lâminas
Swab com meio de transporte
Swab seco para duas lâminas
SECREÇÃO
ENDOCERVICAL
Cultura para micoplasma e ureaplasma
PCR para Chlamydia
PCR para HPV
Meio de transporte específico
Preparo da paciente
Recomenda-se:
Não estar menstruada
Evitar ducha e cremes vaginais na véspera da coleta
Três dias de abstinência sexual
Coleta Vaginal
Inserir um espéculo (sem lubrificante; usar água morna) na vagina.
Retirar o excesso de muco cervical com swab de algodão.
Inserir os swabs indicados, rodar por alguns segundos sobre o fundo do saco, retirar e voltar aos
meios indicados no kit:
‫ـ‬ Swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca.
‫ـ‬ Swab do meio de transporte para cultura aeróbia/fungos.
Coleta endocervical
Inserir um espéculo (sem lubrificante) na vagina e retirar o excesso de muco cervical com swab de
algodão.
Inserir os swabs indicados no canal endocervical até a ponta do swab não ser mais visível, rodar
por alguns segundos, retirar evitando o contato com a parede vaginal, e voltar aos meios
indicados no kit:
‫ـ‬ Swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca.
‫ـ‬ Swab seco: Mycoplasma/Ureaplasma - mergulhar o swab dentro da solução do tubo fornecido
e agitar. Remover o swab e identificar o tubo.
‫ـ‬ Swab do meio de transporte específico para Chlamydia trachomatis - mergulhar o swab dentro
da solução do tubo fornecido e agitar vigorosamente.
Comprimir o swab contra a parede do tubo. Qualquer excesso de muco deve ser retirado da
amostra.
Remover o swab e identificar o tubo.

mod III - 16
Cultura para anaeróbios do trato genital feminino
Descontaminar o canal cervical com swab embebido de PVPI aquoso a 10%.
Coletar amostra do trato genital superior de forma a obter material celular da parede uterina.
Amostras coletadas por laparoscopia, culdocenteses ou cirurgia, também são apropriadas para cultura
de anaeróbios.
Cultura de dispositivo intra-uterino (DIU) tem valor estratégico para cultivo anaeróbio de Actinomyces
sp.
SECREÇÃO URETRAL
A rapidez na entrega da amostra ao laboratório depende do sucesso da cultura.
N. gonorrhoeae é uma bactéria muito sensível e pode morrer rapidamente se não for semeada
imediatamente após a coleta.
Desprezar as primeiras gotas da secreção.
Coletar a secreção purulenta, de preferência pela manhã, antes da primeira micção ou há pelo
menos duas horas ou mais, sem ter urinado.
Coletar com alça bacteriológica descartável ou swab estéril fino.
Colocar a amostra em meio de transporte e realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção
fresca.
Encaminhar imediatamente para o laboratório.
Em pacientes assintomáticos, deve-se coletar a amostra através de massagem prostática ou com
pequeno swab inserido alguns centímetros na uretra.
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO ANAL
Inserir o swab cerca de 1 cm do canal anal e fazer movimentos de lado a lado para coletar
material das criptas anais.
Colocar a amostra em meio de transporte e enviar o swab imediatamente ao laboratório.
CONSIDERAÇÕES PARA COLETA DE SECREÇÕES DO TRATO ANO-GENITAL
Cultura Amostra recomendada
Bactéria Fluido prostático, cervical, vaginal
Fungo Anal, vaginal ou cervical
Anaeróbio Aspirado do epidídimo, fluido amniótico, fluido de abscesso
Trichomonas vaginalis Vaginal, fluido prostático
Nisseria gonorrhoeae Cervical, uretral, anal
Chlamydia trachomatis Raspado uretral ou cervical
Treponema pallidium Lesão genital
Obs.: lesões secundárias de sífilis são mais comumente encontradas
em membranas mucosas e pele (incluindo palmas da mão e solas do
pé); mas qualquer parte do corpo pode ser afetada.
Haemophilus ducreyi Úlcera da área perianal e genitália e nódulo inguinal
Mycoplasma hominis Canal endocervical e uretra

mod III - 17
INSTRUÇÕES PARA FEZES
Devem ser coletadas no início ou fase aguda da doença, quando os patógenos estão usualmente
presentes em maior número e, preferencialmente, antes da antibioticoterapia.
Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte (Cary Blair ou salina
glicerinada tamponada), fornecido pelo laboratório, em quantidade equivalente a uma colher de
sobremesa. Preferir sempre as porções mucosas e sanguinolentas.
Fechar bem o frasco e agitar o material.
Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar em geladeira a 4ºC, no
máximo por um período de 12 horas. Marcar o horário da coleta.
SWAB RETAL
Usar swab de algodão, certificando-se de que a ponta da haste que suporta o algodão está bem
revestida.
Umedecer o swab em salina estéril (não usar gel lubrificante) e inserir no esfíncter retal, fazendo
movimentos rotatórios.
Ao retirar, certifique-se que existe coloração fecal no algodão. O número de swabs depende das
investigações solicitadas.
Identificar a amostra e enviar ao laboratório no intervalo de 30 minutos ou utilizar o meio de
transporte fornecido.
INSTRUÇÕES PARA URINA
A coleta deve ser feita pela manhã, preferencialmente da primeira micção do dia, ou então após
retenção vesical de duas a três horas.
CRIANÇAS
Assepsia rigorosa prévia dos genitais com água e sabão neutro, e posterior secagem com gaze estéril.
Modo de coleta:
O Ideal é jato intermediário (jato médio) espontâneo. Bem indicado em crianças que urinam sob
comando, usado também em lactentes. Em lactentes em que não se consegue coletar através do jato
médio, pode-se usar o saco coletor de urina, porém a troca deve ser realizada de 30 em 30 minutos e,
ao trocar o coletor, refazer a assepsia. Em casos especiais (RN, lactentes de baixo peso, resultados
repetidamente duvidosos) indicar punção vesical suprapúbica, que deverá ser realizada por médico.
ADULTOS SEXO FEMININO
A coleta de amostras do sexo feminino deve ser supervisionada pessoalmente por uma enfermeira ou
auxiliar treinada. O processamento laboratorial deve ser feito dentro de duas horas. Caso não seja
possível, as amostras deverão ser refrigeradas a 4ºC até o momento da semeadura (no máximo de 24
horas).
Remover toda a roupa da cintura para baixo e sentar no vaso sanitário.
Separar as pernas tanto quanto for possível.
Afastar os grandes lábios com uma das mãos e continuar assim enquanto fizer a higiene e coleta
do material.
Usar uma gaze embebida em sabão neutro, lavar de frente para trás e certificar-se que está
limpando por entre as dobras da pele, o melhor possível.
Enxaguar com uma gaze umedecida, sempre no sentido de frente para trás.
Continuar afastando os grandes lábios para urinar. O primeiro jato de urina deve ser desprezado
no vaso sanitário. Colher o jato médio urinário no frasco fornecido pela enfermagem (um pouco
mais da metade do frasco). Evite encher o frasco.

mod III - 18
Fechar bem o frasco e caso haja algum respingo na parte externa do frasco, lave-o e enxugue-o.
ADULTOS SEXO MASCULINO
A coleta deve ser feita pela manhã, preferencialmente da primeira micção do dia, ou então após
retenção vesical de duas a três horas.
Pacientes cateterizados com sistema de drenagem fechada:
Colher a urina puncionando-se o cateter na proximidade da junção com o tubo de drenagem.
Não colher a urina da bolsa coletora.
No pedido laboratorial deverá constar que o paciente está cateterizado.
Observação:
Não aceitar, sem exceção, as coletas de 24 horas dos materiais clínicos para cultura, particularmente
de urina para o isolamento de micobactérias, devido a possível contaminação do material.
INSTRUÇÕES PARA ANAERÓBIOS
Anaeróbios podem estar envolvidos em infecções nas mais diversas partes do organismo humano. A
coleta deve ser feita evitando-se contaminação com a flora normal endógena. Na solicitação médica
deve constar também cultura para germes aeróbios. A boa comunicação entre o corpo clínico e o
laboratório com o fornecimento de informações como impressão clínica, estado do paciente ou
suspeita de organismo incomum assegura o sucesso da cultura anaeróbia.
Sempre que possível, mediante uma solicitação de cultura para anaeróbios, a amostra deve ser
coletada através de aspirado com agulha e seringa ou através de fragmentos do tecido infectado.
A coleta com swab é a menos recomendada pelas seguintes razões:
Material pode ser facilmente contaminado com organismos presentes na pele ou na superfície
mucosa.
Os anaeróbios ficarão expostos ao oxigênio ambiente.
Material está sujeito à secagem excessiva.
A quantidade de material encaminhada é relativamente pequena.
São menos satisfatórios que os aspirados para preparação de esfregaços utilizados na análise
microscópica, assim como para exame direto macroscópico (grânulos de enxofre - típico em
actinomicose).
O uso de swab com meio de transporte específico deverá ser utilizado como última opção.
AVALIAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA CULTURA DE ANAERÓBIOS
Sítio Amostra Aceitável Amostra Inaceitável
CABEÇA E PESCOÇO
‫ـ‬ Aspirado do abscesso coletado com
agulha e seringa após descontaminação
da superfície
‫ـ‬ Material de biópsia coletado por cirurgia
‫ـ‬ Swab obtido por cirurgia quando for
impraticável a aspiração
‫ـ‬ Swab de orofaringe e nasofaringe
‫ـ‬ Swab gengival
‫ـ‬ Material superficial coletado com
swab
PULMÃO
‫ـ‬ Aspirado transtraqueal
‫ـ‬ Material obtido de punção pulmonar
percutânea
‫ـ‬ Material de biópsia obtido
cirurgicamente
‫ـ‬ Amostra broncoscópica obtida com
cateter “double-lumen”evitando
‫ـ‬ Escarro expectorado
‫ـ‬ Escarro induzido
‫ـ‬ Aspirado endotraqueal Material
broncoscópico não coletado
adequadamente

mod III - 19
contaminação
SNC ‫ـ‬ Liquor
‫ـ‬ Aspirado de abscesso obtido com
agulha e seringa
‫ـ‬ Material de biópsia obtido por cirurgia
‫ـ‬ Swab aeróbio
ABDÔMEN
‫ـ‬ Fluido peritoneal obtido com agulha e
seringa
‫ـ‬ Aspirado de abscesso obtido com
agulha e seringa
‫ـ‬ Bile
‫ـ‬ Swab aeróbio
TRATO
URINÁRIO
‫ـ‬ Aspirado suprapúbico ‫ـ‬ Urina Urina de cateter
TRATO GENITAL
FEMININO
‫ـ‬ Material de laparoscopia
‫ـ‬ Aspirado endometrial obtido por sucção
ou curetagem após descontaminação
‫ـ‬ DIU (Dispositivo intrauterino), somente
para Actinomyces sp
‫ـ‬ Swab vaginal ou cervical
OSSOS E
ARTICULAÇÕES ‫ـ‬ Aspirado obtido com agulha e seringa
‫ـ‬ Material de superfície coletado
com Swab
TECIDOS MOLES
‫ـ‬ Aspirado obtido com agulha e seringa
‫ـ‬ Aspirado do trato sinusal obtido com
cateter plástico
‫ـ‬ Aspirado profundo de ferida aberta
obtido após descontaminação da pele
‫ـ‬ Material de superfície coletado da
pele ou bordos da ferida
‫ـ‬ Material coletado com Swab
ESTÔMAGO E
INTESTINO
DELGADO
‫ـ‬ Somente na Síndrome de Alça Cega ou
Síndrome de Má Absorção
INTESTINO GROSSO ‫ـ‬ Somente para cultura ou pesquisa de
toxinas quando houver suspeita de C.
difficile ou C. botulinum
TEMPO DE TRANSPORTE X VOLUME DE AMOSTRA E/OU MÉTODO COLETADO
Amostra Tempo ótimo para transporte ao laboratório
Aspirados:
‫ـ‬ inferior a 1ml
‫ـ‬ superior a 1m
‫ـ‬ 15 minutos – temperatura ambiente
Meio de transporte anaeróbio ‫ـ‬ 2 horas – temperatura ambiente
Tecido ou material de biópsia
‫ـ‬ recipiente estéril
‫ـ‬ meio de transporte ou bolsa anaeróbia
‫ـ‬ 2 horas – temperatura ambiente
Swabs anaeróbios
‫ـ‬ em tubo com atmosfera anaeróbia
‫ـ‬ em meio de transporte anaeróbio
‫ـ‬ 1 hora – temperatura ambiente
‫ـ‬ 2 horas – temperatura ambiente

mod III - 20
3. MICROSCOPIA E COLORAÇÃO
DIRETO SEM COLORAÇÃO
SALINA
Material Indicação Técnica
‫ـ‬ Salina (soro
fisiológico - 0,85%
de cloreto de
sódio)
‫ـ‬ Lâmina
‫ـ‬ Lamínula
‫ـ‬ Permite observar a morfologia
bacteriana e avaliar a existência
de motilidade
‫ـ‬ Usada para pesquisa a fresco de
Trichomonas em secreções,
fungos (leveduri-formes ou
filamentosos) e em diferentes
materiais, etc.
‫ـ‬ Gotejar a salina (uma gota) no centro
de uma lâmina de microscopia e nela
suspender uma colônia ou uma alçada
do material a ser investigado
‫ـ‬ Cobrir com uma lamínula e examinar
ao microscópio, com objetiva de 40X
ou 100X (óleo de imersão)
HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO
‫ـ‬ Hidróxido de
Potássio em
solução aquosa a
10% ou 20%
‫ـ‬ Lâmina
‫ـ‬ Lamínula
‫ـ‬ Usado para pesquisa de fungos
(leveduriformes e particularmente
filamentosos) em material
biológico na presença de muco,
restos celulares, pêlos, unhas,
etc.
‫ـ‬ Facilita a microscopia por
dissolver a queratina e o muco,
destacando as estruturas
fúngicas, quando presentes.
‫ـ‬ Colocar uma pequena amostra do
material a ser pesquisado no centro
da lâmina
‫ـ‬ Suspender o material com uma a duas
gotas de KOH
‫ـ‬ Cobrir com lamínula e aguardar 30
minutos ou
‫ـ‬ Aquecer ligeiramente a lâmina para
acelerar o clareamento
‫ـ‬ Examinar com objetiva de 10X ou
40X, fechando o diafragma
‫ـ‬ As lâminas poderão ser colocadas em
câmara úmida e, após 24 horas,
realizar uma segunda leitura
microscópica
EXAME EM CAMPO ESCURO
‫ـ‬ Microscópio com
condensador de
campo escuro e,
quando possível,
objetiva de 100X
com íris
‫ـ‬ Lâmina
‫ـ‬ Lamínula
‫ـ‬ Salina
‫ـ‬ Óleo de imersão.
‫ـ‬ Para observar a motilidade de
bactérias dificilmente observadas
em microscopia direta com salina,
como é o caso do Treponema
pallidum e da Leptospira sp
‫ـ‬ Pode ser usada também para
observar a motilidade do
Campylobacter sp e outras
bactérias
Para o Treponema pallidum:
‫ـ‬ Atritar as bordas da lesão suspeita
com um swab ou alça bacteriológica
‫ـ‬ Colher o exsudato com a própria alça
ou fazer um imprint com a lâmina
‫ـ‬ Cobrir com a lamínula (utilizar uma
gota de salina)
‫ـ‬ Realizar a pesquisa rapidamente
Para o Leptospira:
‫ـ‬ Utilizar a urina recém-emitida,
centrifugada e examinado o
sedimento
‫ـ‬ Em campo escuro, colocar óleo de
imersão entre o condensador e a
parte inferior da lâmina (encostar o
condensador na lâmina)
‫ـ‬ Observar com objetiva de 40X para
obter o foco
‫ـ‬ Avaliar as condições do material,
fazendo-se, a seguir, a bacterioscopia
por imersão, com objetiva de 100X.

mod III - 21
TINTA DA CHINA
‫ـ‬ Tinta da China
(nanquim)
‫ـ‬ Lâmina
‫ـ‬ Lamínula
‫ـ‬ Principalmente para pesquisa de
criptococos em liquor ou outros
materiais, permitindo destacar a
cápsula deste fungo contra um
fundo negro
‫ـ‬ Suspender o sedimento do liquor ou
uma colônia do meio de cultura em
uma gota de tinta da China,
fazendo-se um filme bem delgado
entre a lâmina e a lamínula
‫ـ‬ Observar com objetivas de 10X e
40X
‫ـ‬ Caso esteja muito espesso,
adicionar uma pequena gota de
salina esterilizada na suspensão
para facilitar a observação
‫ـ‬ Erro comum: confundir linfócitos
com criptococos. A diferenciação é
feita através da observação do
núcleo refringente e gemulação do
fungo.
COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e
comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica é um teste adicional
rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da
amostra clínica analisada.
As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram envolvem considerações relacionadas com as
características da coloração, tamanho, forma e agrupamento das células. Estas características podem
ser influenciadas por vários fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera
de incubação e a presença de substâncias inibidoras.
Não se pode deixar de destacar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil
quando for corretamente realizada (do ponto de vista técnico) e interpretada por profissionais
experientes.
UTILIZAÇÃO
Para bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrganismos em meios
sólidos ou líquidos.
Nas amostras analisadas de culturas jovens (<< 24h) de meio de cultura sem inibidores e
amostras clínicas recém-coletadas (são as que fornecem melhores resultados).
Na verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços de cultura em caldo.
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSÁRIOS *
Lâminas de vidro limpas e desengorduradas 7,5
cm x 2,5 cm
Tubos estéreis
Alça bacteriológica
Meio de cultura
Pipeta e ponteiras estéreis
Luvas (quando necessário)
Cronômetro
Salina estéril 0,85%
Centrífuga e/ou citocentrífuga
Lata para descartar o material contaminado
Incinerador ou bico de Bunsen
Óleo de imersão
Agitador tipo Vortex
Lâminas de bisturi
Chapa com aquecimento brando para
fixação dos esfregaços (50ºC)
Microscópio
Metanol ou etanol absoluto para fixação

mod III - 22
* Observação: Os materiais citados acima são opcionais, dependendo da amostra clínica coletada e
da rotina laboratorial.
ESFREGAÇOS
Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para
facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para revelar as características do
agrupamento. Utilizar, de preferência, lâminas limpas e novas (não oxidadas). Os melhores resultados
serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso.
Técnica para preparo do esfregaço:
Identificar a lâmina de maneira segura.
Rolar toda a superfície do swab sobre a lâmina para não destruir as células.
Fixar rapidamente na chama.
Quando material é escasso, demarcar a área do esfregaço.
Proceder o método de coloração mais apropriado.
Material Clínico
Amostra
coletada com
swab
‫ـ‬ Rodar o swab suavemente pela lâmina limpa, evitando a destruição dos elementos
celulares e dos grupamentos
‫ـ‬ Quando somente um swab for coletado, colocá-lo em um tubo estéril contendo uma
pequena quantidade de salina estéril (0,4 ml) e agitar (vortex)
‫ـ‬ Comprimir o swab contra as paredes do tubo e utilizá-lo para fazer o esfregaço. O
restante do material pode ser inoculado nos meios de cultura.
‫ـ‬ Observação: materiais clínicos coletados com swab são menos recomendados para
cultura. Coletar, sempre que possível, dois swabs: um será utilizado para fazer o
esfregaço e o outro para cultura.
Aspirados,
exsudatos, etc.
‫ـ‬ Materiais recebidos em seringas serão transferidos para um tubo estéril e agitados
(vortex), quando necessário
‫ـ‬ Selecionar a porção mais purulenta ou mucosa com pipeta ou alça bacteriológica
‫ـ‬ Amostras muito espessas ou purulentas podem ser diluídas com uma gota de salina
estéril e espalhadas sobre uma grande área da lâmina formando um esfregaço delgado
Escarro
‫ـ‬ Com auxílio de alça bacteriológica ou um palito de madeira, “pescar” uma porção
purulenta do escarro que seja representativa
‫ـ‬ Rolar esta porção na parede do frasco para separar do material salivar
‫ـ‬ Em seguida, colocar o material na extremidade de uma lâmina limpa confeccionando
um esfregaço delgado
‫ـ‬ Quando a quantidade de saliva for grande e pequenas porções purulentas forem
visíveis, transferir a amostra para uma placa de Petri para facilitar a retirada do
material representativo
Liquor ou
outros fluidos
orgânicos
‫ـ‬ Alguns laboratórios utilizam a citocentrífuga (cytospin) para concentrar os líquidos
orgânicos e fazer os esfregaços. Este método tem sido utilizado para aumentar a
sensibilidade da coloração de Gram, diminuir o tempo de centrifugação e agilizar o
resultado. Materiais aparentemente límpidos devem ser previamente centrifugados a
2.000-5.000 rpm /15 minutos e o esfregaço feito a partir do sedimento
‫ـ‬ Após a centrifugação, remover o sobrenadante com uma pipeta estéril, deixando,
‫ـ‬ aproximadamente, 0,5 ml de sedimento
‫ـ‬ Colocar uma gota do sedimento numa lâmina limpa, sem espalhar e deixar secar
‫ـ‬ Para aumentar a concentração do fluido a ser examinado, adicionar uma segunda gota
na mesma área da lâmina, anteriormente utilizada
Urina jato
médio
‫ـ‬ Homogeneizar bem o material e utilizar uma gota da amostra, sem centrifugação
Biópsias ou
fragmentos de
tecido
‫ـ‬ Colocar o material em uma placa de Petri estéril
‫ـ‬ Triturar com auxílio de um bisturi
‫ـ‬ Preparar os esfregaços fazendo vários imprints numa lâmina limpa, de preferência,
estéril

mod III - 23
Cultura em caldo
Transferir uma a duas gotas para uma lâmina limpa utilizando alça bacteriológica ou pipeta;
Espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregaço delgado.
Meio sólido
Utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa;
Transferir uma pequena porção da colônia com alça bacteriológica;
Misturar suavemente para obter um esfregaço levemente turvo e homogêneo.
Observação: para evitar a formação de aerossóis, nunca misturar o material vigorosamente.
Fixação do Esfregaço
Calor
Todo o esfregaço, antes de ser submetido a coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo
fixado com calor brando (50ºC). A fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia
celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração. Deixar a
lâmina esfriar antes de iniciar a coloração.
Metanol ou Etanol
A fixação pelo metanol ou etanol também pode ser utilizada. Além de prevenir a lise das hemácias,
evita que os esfregaços, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da coloração. Deixar
o esfregaço secar numa superfície plana; após, colocar uma a duas gotas de álcool (1min), drenando
o excesso, sem lavar. Não aquecer a lâmina antes da coloração.
PREPARO DO REAGENTE PARA A COLORAÇÃO DE GRAM (MODIFICADO POR HUCKER)
Cristal-violeta - solução estoque:
Solução A –
Cristal-violeta 40 g
Álcool etílico a 95% 400 ml
Solução B –
Oxalato de amônio 16 g
Água destilada 1600 ml
Validade das soluções A e B: 1 ano em temperatura ambiente
Cristal-violeta - solução de uso:
Solução A 40 ml
Solução B 160 ml
Misturar as duas soluções.
Deixar em repouso e filtrar após 24 horas.
Lugol (mordente):
Iodo metálico 1 g
Iodeto de potássio 2 g
Validade: seis meses em temperatura ambiente
Misturar o iodo e o iodeto de potássio em um graal, até que estejam bem homogeneizados;
Acrescentar água lentamente para dissolução completa. Guardar em frasco de âmbar.
Precauções: a solução de iodo/iodeto de potássio é corrosiva. Evitar inalação, ingestão ou contato
com a pele.

mod III - 24
Descolorantes:
Álcool etílico a 95% – agente descolorante lento ou
Álcool etílico a 95% e acetona (v/v) – agente descolorante intermediário.
Exige maior habilidade por parte do operador para que não ocorra hiperdescoloração.
Validade: um ano armazenado em frasco de âmbar a temperatura ambiente.
Precauções: etanol e acetona são inflamáveis.
Contracorante:
Solução de reserva -
safranina 5 g
álcool etílico a 95% 500 ml
Solução de trabalho -
solução de reserva 10 ml
água reagente 90 ml
Validade: um ano em temperatura ambiente ou fucsina básica a 0,1% ou 0,2% em água reagente; e
seis meses em temperatura ambiente – frasco de âmbar.
Misturar suavemente até a dissolução.
COLORAÇÃO
Cobrir a área com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto.
Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com a própria solução de iodo ou água da
torneira.(Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células
Gram-positivas).
Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de um minuto.
Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:1), até que o solvente escorra incolor.
Alternar com água corrente (jato fraco). O tempo usualmente utilizado nesta etapa é de cerca de
10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das
células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode resultar em pouca retirada do
cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactérias Gram-negativas).
Cobrir o esfregaço com a solução de safranina (ou Fucsina básica 0.1% a 0.2%), por cerca de 30
segundos.
Lavar com água corrente.
Deixar secar ao ar, em temperatura branda (50ºC).
COMO REPORTAR OS RESULTADOS
As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta enquanto
as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de
fundo (fucsina) e se apresentam róseas.
LEITURA DO GRAM
Utilizando a objetiva de menor aumento (10X), fazer uma análise do esfregaço como um todo,
avaliando:
‫ـ‬ a qualidade da coloração e a espessura do esfregaço;
‫ـ‬ se o material clínico coletado é apropriado para cultura, observando a quantidade relativa de
leucócitos, hemácias, células epiteliais;
‫ـ‬ a presença de bactérias pertencentes a microbiota normal, indicando uma coleta inadequada
da amostra clínica;
‫ـ‬ localização e agrupamento bacteriano;
‫ـ‬ filamentos, pseudo-hifas e leveduras.

mod III - 25
Passar para a objetiva de imersão (100X) e examinar várias áreas para melhor avaliação da
coloração e dos diferentes tipos de microrganismos presentes, principalmente perto de células
inflamatórias.
Sistema de Quantificação
Células e Polimorfonucleares (PMN)
Média em 10 campos (10X de aumento) Microrganismos
Média em 15 a 20 campos (100 X aumento)
Neg. + ++ +++ + ++ +++ ++++
Neg. Raras Pouca Muitas Raros Poucos Muitos Numerosos
0 1-9 10-24 >>25 <<1 1-5 6-19 >>20
CAUSAS COMUNS DE ERRO
Precipitação do corante ÞÞ simula cocos Gram-positivos.
Uso de lâminas que não tenham sido pré-limpas ou desengorduradas.
Espessura do esfregaço ÞÞ pode corar irregularmente.
Superaquecimento na fixação pelo calor ÞÞ destruição da morfologia.
A descoloração insuficiente com álcool-acetona permite a retenção do cristal-violeta, o que
dificulta a observação de bactérias Gram-negativas. Por outro lado, esfregaços obtidos de culturas
velhas ou contendo numerosas bactérias mortas ou expostas à ação de antibióticos apresentam
irregularidades na coloração. As bactérias Gram-positivas perdem a capacidadede de reter o
cristal-violeta, apresentando-se Gram-negativas; as Gram-negativas podem corar-semais
fracamente pela safranina, podendo simular a ocorrência de infecções mistas (Gram-
positivas/Gram-negativas).
A discordância de resultado entre o esfregaço corado pelo Gram e a cultura pode estar relacionada
com a coleta ou meios de transportes e conservantes inadequados.
Um resultado positivo de Gram com cultura negativa pode sugerir contaminação do corante,
presença de agentes antimicrobianos na amostra do paciente ou falha no crescimento de
microrganismos devido às condições utilizadas (atmosfera, ação seletiva dos meios de cultura,
etc.).
Verificar diariamente a aparência dos reagentes. Se a solução de cristal-violeta precipitar, refiltre
antes de usar. A evaporação pode afetar a eficácia dos reagentes. Recomenda-seque as soluções
de trabalho sejam trocadas regularmente, dependen-do da demanda.
Diariamente e quando novos reagentes forem preparados, corar, juntamente com os esfregaços
da rotina, lâminas controles. Esfregaços de Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus
epidermidis (ATCC 12228) ou Staphylococcus aureus (ATCC 25922) são preparados e fixados.
Resultados esperados:
‫ـ‬ bacilos Gram-negativos, coloração rósea.
‫ـ‬ cocos Gram-positivos, coloração violeta.
Sistema de revisão dos resultados do Gram:
‫ـ‬ a revisão diária de lâminas de Gram, selecionadas pelo supervisor, pode ajudar a
determinar a necessidade de treinamento e adicionar informações de relevância clínica.
‫ـ‬ comparar resultados da cultura com a leitura do Gram.
Fazer manutenção preventiva e limpeza dos microscópios.
OUTRAS COLORAÇÕES

mod III - 26
ALBERT LAYBORN (CORINEBACTÉRIAS)
Solução A
Azul-de-toluidina 0,15g
Verde-malaquita 0,20g
Ácido acético glacial 1ml
Álcool 95 2ml
Água destilada 100ml
Solução B
Iodo 2g
Iodeto de potássio 3g
Água destilada 300ml
Execução
Corar três minutos com solução A;
Escorrer e, lavar com água corrente, cobrir com solução B;
Após dois minutos, lavar com água corrente rapidamente;
Enxugar com papel de filtro e secar sem passar na chama.
Observar o corpo bacteriano corado em verde e os grânulos metacromáticos (castanho- escuro).
COLORAÇÃO DE FLAGELOS -IMPREGNAÇÃO PELO MÉTODO DE RHODES
Mordente
Ácido tânico, solução aquosa a 10% 10ml
Alúmen de potássio (solução aquosa saturada) 5ml
Óleo de anilina, solução saturada 1ml
Dissolver, por agitação, o precipitado que se forma.
Completar com cloreto férrico, soluçãoa 5%, 1ml.
Nitrato de prata amoniacal
Dissolver 5g em 10ml de água destilada.
Separar 5ml e, ao restante, acrescentar, gota a gota, solução concentrada de amônio, agitando
sempre até formar-se um precipitado castanho que volta a se dissolver.
Juntar gota a gota a solução inicial de nitrato de prata que se havia separado, até surgir leve
turvação que persiste com a agitação.
Execução
Preparar esfregaço;
Filtrar o mordente sobre o esfregaço e deixar três a cinco minutos;
Lavar abundantemente com água;
Cobrir com o nitrato de prata amoniacal e aquecer suavemente até a emissão de vapores, por três
a cinco minutos.
Resultado
Células em castanho-escuro e os flagelos mais claros em fundo ligeiramente granuloso.
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
Solução de carbolfucsina
Fucsina básica 0,3 g
Álcool etílico a 95% 10 ml
Cristais de fenol derretidos 5 ml
Dissolver a fucsina básica no álcool e o fenol na água. Misturar as duas soluções.
Deixar repousar por vários dias antes de usar.

mod III - 27
Ácido-álcool
Álcool etílico 97 ml
Ácido clorídrico concentrado 3 ml
Coloração de fundo (azul-de-metileno)
Azul-de-metileno 0,3 ml
Execução
Cobrir a superfície da lâmina com a solução de carbolfucsina.
Aquecer a lâmina coberta com o corante, lentamente com auxílio de um bico de Bunsen, até a
emissão de vapores, tomando o cuidado para não deixar ferver.
Aquecer com calor baixo ou intermitente por um período de três a cinco minutos.
Deixar a lâmina esfriar.
Lavar a lâmina com água corrente.
Cobrir a lâmina com solução de alcool - ácido a 3% e descorar o esfregaço até que o corante não
drene mais da lâmina.
Lavar a lâmina com água corrente e esgotando todo resíduo da mesma.
Cobrir a lâmina com o corante de contraste (azul de metileno), por 20 a 30 segundos.
Lavar a lâmina com água corrente e deixar secar naturalmente sem forçar com papel de filtro.
Examinar o esfregaço com objetiva de imersão no aumento de 100x.

mod III - 28
4. SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA
MATERIAL CLÍNICO E OS RESPECTIVOS MEIOS DE CULTURA E MICROSCOPIA
Meios de cultura para semeadura dos principais materiais clínicos e indicação de exames
microscópicos.
Meios De Cultura 1
Material
AC AS MC TIO Outro L J SAB MYC
Lâmina
Abscesso profundo X X X uma
Ferida cutânea/cirúrgica X X X X X uma
Abscesso cerebral X X X X X X X duas
Abscesso pulmonar X X X X duas
Biópsia X X X duas
Coprocultura (fezes) X SS não
Líquido de Diálise X X X uma
Endométrio/ Amniótico X X X uma
Escarro piogênicos X X duas
Escarro para Tuberculose X uma
Esperma/ Prostático X X uma
Fístula/ Dreno X X não
Gânglio X X X X X X duas
Lavado Brônquico (BAL) X X X X X uma
Líquor (LCR) X X X X X duas
Nasal/ Orofaringe X X não
Osso (Biópsia / Aspirado) X X X uma
Ocular X X X duas
Orofaringe X X uma
Ouvido X X X uma
Peritonial/ Ascítico X X X X uma
Pleural X X X X duas
Ponta de cateter X não
Sangue/ Hemocultura X X uma
Uretral X X TM uma
Urina CLED uma
Vaginal/ Endocervical X X X TM uma
1
- AC = ágar chocolate; AS = ágar sangue; MC = ágar Mac Conkey; TIO = caldo tioglicolato; LJ = ágar Lowenstein
Jensen; SAB = ágar Sabouraud; MYC = Mycosel; SS = ágar Salmonella-Shigella; TM = ágar Thayer Martin
(opcional); CLED = ágar CLED

mod III - 29
Cultura para fungos ou micobactérias
Para fungos: Sabouraud e Mycosel, ver orientação específica para semeadura
Para micobactérias: Lowenstein Jensen, materiais contaminados com flora devem ser previamente
descontaminados (escarro, urina, lavado bronquio-alveolar, fezes)
Coprocultura
Recomendava-se semear em caldo enriquecedor do tipo Selenito, Tetrationato, etc., que tem valor
duvidoso, sendo atualmente indicado para pesquisa de portadores.
Escarro para tuberculose
Deve ser conservado em geladeira ou tratado para descontaminação, antes de semear em
Lowenstein Jensen.
Lavado brônquico
Homogeneizar o material em vortex;
Centrifugar parte do material e fazer duas lâminas com o sedimento;
Se houver pedido de pesquisa de micobactérias e fungos, fazer quatro lâminas;
Semear 10 µL com alça descartável ou calibrada e semear em Ágar Chocolate para contagem de
colônias (1/100);
Diluir 1 ml da amostra em 9,0 ml de salina estéril, homogeneizar e semear 10 µL em Ágar
Chocolate para contagem de colônias (1/1.000);
Semear desta mesma diluição com a alça de 1 µL em Ágar Mac Conkey para contagem de colônias
(1/10.000).
Líquido Céfalo Raquidiano (LCR)
Centrifugar por 10 minutos/ 2.000 rpm (rotações por minuto), quando purulento, semear sem
centrifugar;
Semear em Ágar Chocolate + Ágar Sangue + Caldo Tioglicolato.
Quando solicitado, pesquisar Criptococos, usando coloração com Tinta da China.
Ponta de cateter
Cinco cm da ponta do cateter deve ser rolada 5 vezes sobre a placa de Ágar Sangue, utilizando a
técnica semi-quantitativa de Maki.
Quando enviado pedaço maior de cateter pode-se injetar 1 ml de salina cultivando separadamente
(lúmen); a superfície externa pode ser semeada pela técnica de Maki.
Hemoculturas positivas
Semear em Ágar Chocolate e fazer bacterioscopia (Gram).
Frascos para micobactérias, fazer bacterioscopia (Ziehl).
Urina
Dever ser semeada com alça calibrada de 10 µL em Ágar CLED (Brolacin).
Se houver pedido de bacterioscopia: colocar 10 µL da urina sobre uma lâmina nova e deixar secar,
corar pelo Gram, e verificar a presença de bactérias.
Para diagnóstico da tuberculose: deve ser guardada em geladeira ou descontaminada antes de
semear.
Secreção vaginal, endocervical, uretral e urina
Fazer exame à fresco de secreção vaginal para pesquisa de Trichomonas;
Centrifugar a urina para pesquisa de Trichomonas;
Na cultura para Neisseria gonorrhoeae é suficiente Ágar-Chocolate; para melhorar o isolamento,
semear material endocervical e uretral, utilizando o meio seletivo de Thayer Martin.
Mycoplasma e Ureaplasma swab uretral ou endocervical, removendo previamente a secreção e
colhendo as células da mucosa por rotação do swab no canal; usar meio de transporte específico.
Para amostras sólidas: biópsias, gânglios, amostras de tecidos, etc

mod III - 30
Fragmentar o material com um gral e pistilo de porcelana ou vidro estéreis contendo 1-2 ml de
salina estéril ou caldo BHI (Brain Heart Infusion) ou TSB (Tripticase Soy Broth);
Semear os fragmentos ou a porção líquida, e guardar o restante do material na geladeira para
eventual uso.
Estudos quantitativos são trabalhosos pois dependem de pesar o material sólido, triturá-lo, diluir em
volume definido de caldo (BHI, TSB ou Tioglicolato), bem como semear volume definido (10 ou 100mL
com pipeta calibrada, usando ponteira estéril). O cálculo para a contagem de colônias deve levar em
conta o número de gramas de tecido usado e a diluição do caldo (UFC/grama de tecido).
Líquido de diálise
Recomenda-se fazer cultura quantitativa semeando-se como urina, com alça calibrada e contagem
de colônias, usando alça de 10 µL e liberando o resultado em UFC/ml (multiplicando por 100).
Paralelamente faz-se cultura qualitativa semeando 2 a 3 ml em 5 ml de caldo (TSB, BHI ou
Tioglicolato). No caso de cultura quantitativa negativa e qualitativa positiva, relatar: cultura
positiva para (nome da bactéria isolada), menor que 102
UFC/ml.
Casos especiais
No caso de secreção prostática, em que o material é bastante escasso, e existe contaminação
uretral, recomenda-se semear rapidamente após a coleta com alça calibrada de 10 ml, e o
resultado deve-se relatar em UFC/ml (multiplicando o número de colônias significativas do mesmo
agente por 100), como para uroculturas.
Para outros materiais escassos colhidos com swab em meio de transporte (material de vesículas, swab
de córnea ou conjuntiva, uretral, etc.), pode-se semear diretamente o swab nos meios de cultura
indicados, ou tentar obter uma concentração do material do swab colocando-o em tubo estéril com 0,5
ml de salina estéril. Em seguida, agitar no vortex (mixer), centrifugar e utilizar o sedimento como
inóculo, ou fazer esfregaço para bacterioscopia.
Escolha de meios de cultura seletivos em relação ao agente
Agente Meio específico de acordo com manuais de fabricantes
Bordetella pertussis Ágar sangue Bordet-Gengou
Brucella spp Brucella agar
Campylobacter jejuni Campylobacter agar
Corynebacterium diphtheriae Ágar cisitina-telurito
Legionella spp Ágar carvão-extrato de levedura tamponado
Listeria monocytogenes Ágar Listeria McBride
Mycoplasma/ureaplasma Transporte: Meio B10 Shepard Cultura: Meio A7 Shepard
Neisseria Thayer Martin
Neisseria meningitidis Thayer Martin
Vibrio spp TCBS
Obs: existem meios cromogênicos
específicos para diferentes patógenos
Salmonella spp. e S. typhi, E. coli O 157. Para algumas
espécies de Candida, Listeria monocytogenes, etc.
PROCEDIMENTOS PARA SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA
SEMEADURA QUALITATIVA
Organizar as placas, pré-aquecidas em estufa (ideal para fastidiosos), ou à temperatura ambiente,
sobre a bancada conforme o material a ser semeado.
Identificá-las com o número da amostra e iniciais do paciente.

mod III - 31
Separar as lâminas correspondentes à cada exame, a serem preparadas e identificá-las.
Homogenizar o material, quando líquido (urina, LCR, sangue, pleural, etc.).
Escolher a porção mais purulenta no caso de secreções, ou no caso de fezes, a parte com sangue,
muco ou pus.
Os swabs deverão ser rolados sobre os meios de cultura, seguindo a sequência dos mais ricos
para os mais seletivos (Ágar Chocolate, Ágar Sangue, Mac Conkey).
Com material muito líquido (LCR, pleural não purulento) concentrar o material por centrifugação a
2.500 rpm (1500 g) por 10-15 minutos e semear o sedimento.
Na semeadura de rotina pode-se utilizar placas com divisões de dois e três compartimentos para
racionalização de gastos, mas seu uso exige maior habilidade na semeadura a fim de se obter
colônias isoladas. Ex.:
‫ـ‬ hemocultura em placa tríplice: Ágar sangue, Ágar chocolate e Ágar Mac Conkey.
‫ـ‬ secreções em placa dupla: Ágar sangue e Ágar Mac Conkey, proceder uma semeadura que
permita o crescimento de colônias isoladas, etc.
Técnica de Semeadura Qualitativa
A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o próprio swab (do meio de transporte), ou
amostra do material removida com alça (estéril) flambada e semeada de forma a obter um gradiente
decrescente de concentração do inóculo, que permita o isolamento de todas as colônias diferentes.
Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para
aprimorar a técnica de semeadura e isolamento de colônias.
SEMEADURA QUANTITATIVA
Materiais indicados ou recomendados
Urina
BAL (lavado bronco alveolar)
Aspirado traqueal
Biópsia de tecido
Líquido de diálise
Secreção prostática
Cateter (técnica de Maki e outras)
Técnica de Semeadura Quantitativa
O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do
número de UFC (unidades formadoras de colônia) obtidas após incubação. Utilizam-se dois artifícios
para o efeito de diluição do material:
Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 µL. O número de UFC obtido deverá ser
multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo ao volume inoculado; 1.000, 100 ou 10,
respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por alça calibrada
ou pipeta com ponteira estéril.
Técnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluição seriada do material em escala decimal, isto é,
1:10, 1:100, 1:1.000 … O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção
para 1 ml, relativo à diluição utilizada; 10, 100, 1.000 ..., respectivamente.
Procedimentos gerais
Descarregar o material num canto da placa;
Flambar a alça;
Esfriar a alça em um canto do ágar;
Semear partindo da ponta da primeira semeadura.
A cada mudança de direção flambar a alça e esfriá-la.

mod III - 32
Homogeneizar o material com agitação manual em diferentes direções ou em vortex (mixer).
Obter o volume definido pela técnica com o auxílio de uma pipeta com ponteira estéril ou alça
calibrada. No caso da alça, observar a integridade da película formada até depositá-la na parte
superior da placa. Ainda com a alça, sem flambar até o final da semeadura, distribuir o material
em linha reta até a outra extremidade. Perpendicularmente, distribuir o material por toda a
superfície de maneira uniforme. Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes, ou até que a
superfície da placa esteja seca, alterando a direção da estria (vide figura abaixo).
Evitar o uso de placas úmidas e, após semeada, não incubar caso haja umidade na superfície do
ágar.
Evitar o rompimento do ágar, estriando o material suavemente.
Uma suspensão com 105
UFC/ml deve resultar em um tapete de colônias que cubra toda a
superfície do ágar de maneira uniforme, com colônias confluentes.
INCUBAÇÃO
A incubação deve seguir alguns parâmetros determinados.
Atmosfera
Para bactérias não exigentes em secreções, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera
ambiente.
Para bactérias exigentes tais como: pneumococos, hemófilos e Neisserias ou fastidiosos incubar
em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 3-5% de CO2).
Para Campylobacter é necessário tensão de 5 a 10% de CO2 e restrição de O2 sendo conveniente o
uso de geradores específicos.
Para bactérias anaeróbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita.
Temperatura
36o
C +/- 1o
C é a temperatura para a grande maioria das bactérias da rotina, incluindo os
anaeróbios e micobactérias.
Fungos podem ser cultivados a 30o
C ou 25 e 35o
C.
Temperatura à 42o
C pode ser necessário para isolar espécies de Campylobacter, Acinetobacter
aumannii, e algumas espécies de Pseudomonas.
Umidade
Bactérias fastidiosas e exigentes (neisserias patogênicas e hemófilos) crescem melhor se forem
incubadas num recipiente com tensão de 5% de CO2 com um chumaço de algodão embebido em
água estéril.
Tempo
Em geral a primeira leitura é realizada com 18 a 24 horas de incubação ou em casos de urgência
para iniciar a identificação e antibiograma, a partir de 6 horas é possível visualizar crescimento de
algumas enterobactérias.
Para anaeróbios é recomendável a primeira leitura com 48 a 72 horas de incubação.
a) Inóculo Inicial b) Espalhamento

mod III - 33
Para bactérias exigentes ou de crescimento lento o período de incubação pode ser bastante
prolongado: Micobactérias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas
até 45 dias).
Leitura
Alguns aspectos são fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnóstico
presuntivo e direcionar o exame.
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DAS COLÔNIAS
Tamanho
O tamanho das colônias deverá ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode
formar colônias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa:
Puntiforme (<1 mm de diâmetro) - colônias muito pequenas, características de bactérias mais
exigentes.
Pequena (até 2 mm de diâmetro) – Shigella e Yersinia costumam crescer em MaC Conkey e
Salmonella-Shigella como colônias pequenas e lactose negativa. Stenotrophomonas maltophilia,
Acinetobacter spp, Enterococcus spp, pneumococos, Streptococcus spp. Cândida spp e alguns
esfafilococos coagulase negativo também costumam formar colônias pequenas.
Média (até 3 mm de diâmetro) – Enterobactérias, não fermentadores e Estafilococos.
Grandes (mais de 4 mm de diâmetro) – Bacillus spp, algumas enterobactérias como Klebsiella e
Enterobacter, o mesmo ocorre com não fermentadores como Pseudomonas. Vale lembrar a
formação de véu, característico do gênero Proteus, Comamonas e algumas cepas de
Pseudomonas.
Cor
A coloração dependerá do meio de cultura utilizado.
Meios não diferenciais – pode-se identificar a coloração características de alguns microrganismos:
S. aureus – amarelo
Micrococcus – amarelo
Serratia – avermelhado
Roseomonas - róseo
Pseudomonas – diferentes tons de verde e castanho
Enterococcus casseliflavus – amarelo
Meios diferenciais – a coloração da colônia sofre interferência das reações que ocorrem com
substratos dos meios de cultura:
Utilização da lactose no Mac Conkey – vermelho
Utilização da lactose no CLED – amarelo
Utilização do manitol em Ágar manitol salgado – amarelo
Produção de H2S no Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella – negro
Hemólise
Baseada na lise de hemácias contidas no Ágar Sangue (5%)
Lise total – denominada beta-hemólise, ocorre a formação de halo de transparência ao redor e/ou
sob a colônia: S. pyogenes, S. agalactiae, Listeria, S. aureus, S. haemolyticcus, Enterococcus.
Lise parcial – denominada alfa-hemólise, há formação de halo com coloração esverdeada: S.
viridans, S. pneumoniae, Enterococcus.
Ausência de lise – definida como gama-hemólise, meio de cultura inalterado: Enterococcus,
Estafilococos coagulase negativo.
Forma da colônia
Redonda – E. coli, Klebsiella, Serratia, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Estafilococos,
Estreptococos
Irregular – Pseudomonas, Proteus, Providencia, Morganella, Bacillus

mod III - 34
Produção de véu – Proteus, Comamonas, Pseudomonas
Filamentosas – fungos filamentosos
Formando pontas, como estrelas – Cândida
Com depressão no centro – Pneumococo
Cerebriforme – Pseudomonas stutzeri
Elevada – Klebsiella, Bacillus
Chata – Enterobacter, Pseudomonas
Consistência
Friável, quebradiça - Moraxella
Mucóide – Klebsiella, Pseudomonas,
Bacillus
Seca – E. coli, Citrobacter, S. aureus
Butirosa (manteiga) – Candida
Cheiro
Eikenella corrodens – cheiro de cloro
Pseudomonas – cheiro adocicado
Anaeróbios – cheiro fétido
Densidade
Opaca: E. coli, Candida, S. aureus
Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococo
AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO E CONTAGEM
Cultura Quantitativa
Avaliar a homogeneidade de crescimento pela placa
Contar separadamente todas as colônias diferentes, até 300 UFC
Para a contagem deve-se marcar com uma caneta o verso de cada unidade contada, para evitar
que se conte duas vezes a mesma colônia
Contagens maiores devem ser determinadas por estimativa
‫ـ‬ Dividir a placa em 4 ou 8 partes
‫ـ‬ Observar a homogeneidade do crescimento e contar as partes que sejam mais
representativas do crescimento total
‫ـ‬ Contar o número de UFC da parte escolhida e multiplicar pelo total de partes
Converter o número de UFC contadas em UFC/ml ou UFC/g, conforme o material analisado
Utilizar o fator de correção:
do volume:
‫ـ‬ 1 µL – multiplicar por 1.000
‫ـ‬ 10µL – multiplicar por 100
‫ـ‬ 100µL – multiplicar por 10
e/ou diluição:
‫ـ‬ diluição 1:10 – multiplicar por 10
Cultura Semi-quantitativa e Qualitativa
Para a maioria das culturas não se padroniza o volume do inóculo e semeia-se o swab e/ou com a
alça, com a finalidade apenas de obter colônias isoladas para posterior identificação (secreções
cutâneo-mucosas, fezes, etc.).
Para estes materiais o objetivo pode ser encontrar um patógeno específico entre bactérias da
microbiota considerada normal na área de onde foi obtida a amostra clínica (S. pyogenes em
orofaringe, Salmonella e Shigella em fezes, N. gonorrhoeae em secreção uretral, etc). Outras vezes
deve-se relatar as bactérias potencialmente patogênicas e descrever a relação entre as colônias
isoladas (predomínio de..., presença de... ou raras colônias de...) Ex: Cultura de ferida cirúrgica =
predomínio de S. aureus, presença de P. aeruginosa e raras colônias de E. coli, e ignorar raras
colônias de staphylococcus coagulase negativo, ou de estreptococos alfa hemolíticos, corineformes,
quando bactérias potencialmente patogênicas forem isoladas.

mod III - 35
5. IDENTIFICAÇÃO
MEIOS DE CULTURA
O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras
informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio
de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.
Ágar sangue (AS) – meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria
dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto
algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos
Ágar chocolate (AC) – meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das
bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento
dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfa- hemolíticas
Ágar Mac Conkey (MC) – meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de
lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo.
‫ـ‬ Lactose positiva – coloração avermelhada
‫ـ‬ Lactose negativa – coloração inalterada
‫ـ‬ Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus
Ágar Salmonela-Shigella (SS) – meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a
utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra)
Ágar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a
utilização de lactose (coloração alaranjada) e produção de H2S (coloração negra)
Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) – meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e
nistatina inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de
Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N.
meningitidis e N. gonorrhoeae
COLORAÇÃO DE GRAM
Deve-se realizar a coloração de Gram para todas as colônias crescidas em meios não seletivos
quando o aspecto deixar dúvidas quanto a sua classificação.
Com uma agulha microbiológica estéril, pegar pequena porção de uma colônia isolada e passar
para uma lâmina limpa e identificada.
Para facilitar a leitura, pode-se homogeneizar o material com uma gota de solução salina estéril
em movimentos centrífugos.
Aguardar para que seque e fixar rapidamente sobre a chama.
Correlação entre as principais bactérias de importância clínica e os tipos morfotinturiais:
GRAM POSITIVOS
Cadeias longas - estreptococos aeróbios e anaeróbios
Cachos – estafilococos e peptococos (anaeróbio).Cocos
Cachos e tétrades – Micrococcus, Stomatococcus, Aerococcus spp
Aos pares – Enterococcus
Gram variável – Gardnerella
Coco-bacilo
(podem formar
cadeias curtas)
Em chama de vela – S. pneumoniae
Retos e curtos – Lactobacillus, Erisipelotrix, Listeria, Rhodococcus

mod III - 36
Ramificados – Nocardia, Streptomyces, Actinomyces,
Propionibacterium (anaeróbico)
Difteróides – Corynebacterium
Bacilos
Esporulados – Bacillus, Clostridium
GRAM NEGATIVOS
Cocos (visualizados
aos pares)
Neisseria, Moraxella, Branhamella, Acinetobacter, Veillonella
(anaeróbio)
Coco-bacilo Haemophillus (pleomórfico, ora coco-bacilo, ora bacilo), Brucella,
Bordetella, Pasteurella, Actinobacillus, Bacteróidesa
(anaeróbicos), Enterobactérias
Curvos – Campylobacter, Helicobacter, Vibrio
Helicoidais – Arcobacter e Borrelia. Leptospira e Treponema (não
visíveis ao Gram)
Retos – Enterobactérias, não fermentadores
Extremidades afiladas – Fusobacterium (anaeróbio)
Bacilos
Extremidade bifurcada – Bifidobacterium (anaeróbio)
ESQUEMA GERAL DE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
CRESCIMENTO BACTERIANO
Observar as características das diferentes colônias crescidas em cada meio de cultura utilizado.
Lembrar que o tamanho das colônias de um mesmo agente pode ser variável, conforme a
proximidade com outras colônias.
Por exemplo, semeadura em Ágar sangue (AS) e Mac Conkey (MC):
‫ـ‬ Observar quantos tipos de colônia cresceram em cada ágar.
‫ـ‬ As colônias que cresceram somente em AS devem ser de microrganismo Gram positivo ou
mais exigente.
‫ـ‬ Todas as colônias presentes no MC, microrganismos Gram negativo, devem apresentar
correspondente no AS.
A escolha dos meios utilizados para cada material deve estar relacionada aos agentes esperados.
Crescimento dos microrganismos nos principais meios de cultura utilizados na rotina
Mais provável Ágar
Chocolate
Ágar
Sangue
CLED Mac
Conkey
Salm.-
Shigella
Caldo
TIO
Gram negativo, leveduras e enterococo + + + + + +
Gram positivo + + + neg neg +
Gram negativos exigentes + + neg neg neg neg
Haemophilus + neg neg neg neg neg
Anaeróbios neg neg neg neg neg + *
+ Meio dá suporte ao crescimento
- Meio não dá suporte ao crescimento
* Principalmente em coluna alta

mod III - 37
Optar entre o crescimento a ser valorizado e o que deverá ser ignorado
Muitas vezes é impossível definir o significado clínico de um isolado sem conhecer sua
identificação.
Todo crescimento deve ser classificado como patógeno em potencial ou mero contaminante. Para
tanto, deve-se reunir evidências microbiológicas, clínicas e epidemiológicas:
‫ـ‬ Conhecer os principais patógenos esperados para cada material biológico
‫ـ‬ Obter o máximo de informações sobre o quadro clínico apresentado
‫ـ‬ Os componentes da microbiota residente (Micrococcus, Estafilococos coagulase negativo, S.
viridans...) apresentam menor valor preditivo positivo como agentes infecciosos, sendo de fácil
interpretação na maioria dos casos. Entretanto, em condições específicas podem participar
como agentes patogênicos. Por exemplo:
Duas ou mais hemoculturas periféricas com S. viridans podem ser consideradas como
possível diagnóstico de bacteremia por este agente, devendo ser investigada a possibilidade
de endocardite
‫ـ‬ Observar se a cultura é pura ou se existem diferentes tipo de colônias, neste caso, se há
predomínio de um tipo.
‫ـ‬ As culturas puras apresentam maior valor preditivo positivo para diagnóstico, especialmente
em sítios intensamente colonizados.
‫ـ‬ Por exemplo: cultura pura de Pseudomonas aeruginosa ou Candida em coprocultura.
Entretanto, podem ocorrer também como contaminantes. Por exemplo: cultura pura de S.
viridans em swab de orofaringe
‫ـ‬ Sempre que possível, deve-se traçar um paralelo entre os achados da bacterioscopia direta
do material e o resultado da cultura, buscando:
Valorizar achados de cultura – bacterioscopia com predomínio de cocobacilos pleomórficos
em BAL e isolamento de Haemophillus em cultura, ainda que em baixas contagens por
dificuldades de crescimento
Definir contaminantes – presença de abundantes células epiteliais na bacterioscopia da
urina não centrifugada ou em escarro, denotando a contaminação com a microbiota local
Detectar falhas nas condições de coleta e/ou processamento laboratorial e uso de
antimicrobianos– Bacterioscopia de liquor, líquido articular ou secreção conjuntival com
diplococos Gram negativo aos pares intracelulares e cultura negativa
Caracterização de infecção por anaeróbios – cultura negativa com bacterioscopia
revelando microrganismos com características morfológicas de anaeróbios
Quantificação – em culturas quantitativas os achados da bacterioscopia direta devem
coincidir com as contagens obtidas em cultura (urocultura, BAL, aspirado traqueal ...)
COLORAÇÃO DE GRAM DAS COLÔNIAS ISOLADAS
Sempre que utilizar meio não seletivo.
Quando utilizar meios seletivos e desejar confirmar a concordância entre a classificação
morfotinturial e o meio utilizado.
Para verificar a presença de leveduras, neste caso o exame direto com salina é suficiente.
DIRECIONAMENTO DA IDENTIFICAÇÃO
De acordo com o crescimento em meio seletivo e o resultado da bacterioscopia, seguir a rotina
específica.

mod III - 38
6. MANUTENÇÃO E ESTOQUE DE CULTURAS
MANUNTENÇÃO DAS CULTURAS
PREPARO DE CULTURAS
Uma vez obtida uma cultura satisfatória, a mesma deve ser mantida pura e viável e para isso é
preciso:
‫ـ‬ transferir periodicamente a cultura em um meio de cultura adequado;
‫ـ‬ incubar até que a cultura atinja a fase estacionária máxima de crescimento;
‫ـ‬ e estocar em temperatura apropriada para impedir maior crescimento.
A cultura é preparada usualmente a partir de uma cutura anterior ou originalmente do estoque. Ao
cultivar a cultura desejada procura-se obter uma cultura que contenha somente o microrgansimo
desejado, um número uniforme da população, que seja viável e que apresente resistência a condições
desfavoráveis. O sucesso no preparo da cultura está também relacionado com o preparo e
esterilização do meio de cultura, da inoculação e do tempo e temperatura de incubação.
A temperatura de incubação geralmente é próxima da temperatura ótima para aquela espécie. Tanto a
temperatura quanto o tempo de incubação são freqüentemente ajustadas de modo que a cultura
esteja pronta na hora em que ela for utilizada. Do contrário, a cultura deve ser esfriada para impedir
um desenvolvimento superior ao desejado.
As culturas podem preservadas em tubos e então tranferidas periodicamente para meios de preparo
recente. Os intervalos de tempo em que são feitas as transferências variam de acordo com o
microrganismo. Quando este procedimento é adotado na manutenção de uma coleção de culturas,
considerar o meio próprio de cada espécie, a temperatura adequada de armazenamento e o tempo de
tranferência.
Observar que a transferência frequente de uma cultura instável pode levar a mudanças indesejáveis
nas suas características.
PUREZA DAS CULTURAS
Para assegurar a pureza das culturas, estas devem ser obtidas periodicamente de uma cultura e
verificadas regularmente quanto à pureza.
Os métodos para avaliar a pureza da cultura variam com o tipo de cultura a ser testada.
Exame microscópico: a contaminação é indicada pela aparência e pelo número elevado dos
mesmos.
Semeadura em meio nutritivo: permite o crescimento de contaminantes.
Testes bioquímicos: provas para presença de substâncias produzidas por contaminantes.
VIABILIDADE DA CULTURA
A viabilidade é avaliada pela taxa de crescimento e atividade metabólica. A deterioração das culturas
pode resultar do manuseio incorreto, do cultivo inadequado, de transferências freqüentes por um
longo período, meio de cultura imprópio, mutação e ataque da bactéria por um bacteriófago.
ESTOQUE DE CULTURAS
O estoque de culturas deve ser preparado de modo que as culturas sejam armazenadas e preservadas
por um longo período sem transferência. Tais culturas tendem a permanecerem estáveis e são
utilizadas como fonte de cultura caso a cultura ativa seja perdida e/ou deteriorada.
As culturas podem ser estocadas pelos seguintes métodos:
‫ـ‬ liofilização (freeze drying)
‫ـ‬ refrigeração em ≤ - 50o
C

mod III - 39
‫ـ‬ refrigeração em nitrogênio líquido (-196o
C)
‫ـ‬ vedação com parafina ou camada de óleo mineral em ágar inclinado
ESTOQUE DE CULTURAS BACTERIANAS POR ≥ 1 ANO
LIOFILIZAÇÃO
A liofilização é um método comum e reconhecido para preservação de microrganismo. É um método
denominado também de “freeze-drying”, cujo processo implica na estabilização da cultura de modo a
não mais permitir atividade biológica ou reações químicas. A cultura é primeiramente congelada e em
seguida a umidade presente é reduzida por sublimação (primeira etapa de dessecação) e por desorção
(segunda etapa de dessecação).
Para o processo de liofilização alguns fatores influenciam na recuperação e estabilidade da população
do micoorganismo. Estes fatores são os seguintes:
Fase log, estacionária e lag de um microrganismo específico semeada em meio de cultura.
Propriedades físico-químicas do meio de cultura.
Temperatura da fase de congelamento do microrganismo.
A taxa de liofilização e extensão da remoção da umidade.
O estoque de microrganismo liofilizado com relação à temperatura e exposição à umidade.
Composição fisico-química do solvente e o período de hidratação.
Obter cepas comerciais e estocá-las conforme as instruções do fabricante.
CONSERVAÇÃO EM BAIXA TEMPERATURA E EM NITROGÊNIO LÍQUIDO
A fácil disponibilidade de refrigeradores e de tanque de refrigeração com nitrogênio líquido
proporciona um outro meio de estoque de culturas. Este tipo de conservação tem sido
comprovadamente satisfatório e adotado também como uma alternativa para microrganismos que não
podem ser mantidos liofilizados. Neste método, as células são congeladas junto com um agente
protetor como glicerol.
Preparo do meio de conservação:
Utilizar ágar sangue de carneiro, sangue de coelho ou caldo soja tripticaseina (soybean-casein
digest) esterilizado contendo 15% de glicerol; o caldo soja tripticaseina pode ser estocado a 4o
C
até 6 meses.
Adicionar o meio em tubos estéreis que serão utilizados para o estoque da cultura e identificá-los.
Inoculação:
A partir de uma cultura semeada em meio apropriado, preparar uma densa suspensão de células e
agitar bem.
Preparar um número suficiente de tubos para estoque de cepas por um ano. Mantenha dois tubos
como estoque permanente.
Resfriar a - 50o
C ou abaixo. À - 50o
C, as cepas podem ser mantidas por um ano. Já à -70o
C ou em
líquido de nitrogênio, as culturas podem ser mantidas indefinidamente. Via de regra, deve-se
substituir os não fastidiosos a cada 5 anos e os fastidiosos a cada 3 anos.
Recuperação das cepas estocadas:
Retirar o tubo do refrigerador ou do tanque de refrigeração e descongelar em água morna.
Semear em meio sólido e não refrigerar novamente o tubo utilizado.
Modo alternativo
Retirar o tubo e obter com a alça uma porção congelada da suspensão bacteriana
Semear em meio sólido e retornar o tubo ao refrigerador; as cepas devem ser semeadas duas
vezes antes de serem utilizadas como controles.
Verificar anualmente a viabilidade da cultura.

mod III - 40
CONSERVAÇÃO COM ÓLEO MINERAL
Muitas bactérias podem ser conservadas cobrindo-se o crescimento em ágar inclinado com óleo
mineral estéril. O óleo deve cobrir completamente o meio alcançando 1 cm acima da extremidade do
bisel. A conservação nessas condições varia conforme a espécie, mas é geralmente possível por vários
anos.
A recuperação da cepa se faz removendo com uma alça parte da cultura sob o óleo e semeando-a
para um meio recente.
ESTOQUE DE CULTURAS BACTERIANAS POR < 1 ANO
MEIOS COMERCIAIS
Ágar cistina-tripticase sem carboidrato para estafilococos, estreptococos e outros fastidiosos;
adicionar 1 ml de soro de cavalo estéril no meio.
Meio com carne cozida sem glicose para anaeróbios e anaeróbios facultativos; armazenar em
temperatura ambiente.
Ágar soja tripticaseina para fastidiosos
Ágar sangue e ágar chocolate inclinado para estreptococos fatidiosos e Haemophilus spp;
armazenar até duas semanas.
INOCLULAÇÃO
Identificar os tubos.
Inocular com uma cepa cultivada no respectivo meio.
Incubar overnight, vedar e armazenar em temperatura ambiente ou 5o
C.
RECUPERAÇÃO DAS CEPAS ESTOCADAS
Retirar parte da cultura contida no tubo e semear em meio sólido.
Incubar overnight.
Preparar novos estoques o quanto necessário ou por 6 meses.
Alguns exemplos de exigências para a preservação de algumas espécies de bactérias.
Bactéria Meio Intervalo Temperatura
de incubação
Temperatura
de estocagem
Neisseria spp. Ágar cistina-tripticase 1 mês 35o
C 35o
C
Bacillus spp. Ágar nutritivo 12 meses 28o
C 10o
C
Pseudomonas spp. Ágar nutritivo 3 meses 28o
C 10o
C
Clostridium spp. Meio com carne cozida 6 meses ou mais 28o
C ambiente
Mycobacterium spp. Ágar glicerina 4 meses 30o
C 10o
C
ESTOQUE DE MICOBACTÉRIAS POR ≥ 1 ANO
CONSERVAÇÃO EM BAIXA TEMPERATURA
Semear a micobactéria em caldo Middlebrook e colocar em tubos indentificados.
Ou supender a cultura em leite desnatado ou caldo brucella com 15% de glicerol.
Para ambas alternativas, armazenar a -70o
C.

mod III - 41
Para recuperação da cepa:
‫ـ‬ descongelar rapidamente em banho-maria a 37o
C.
‫ـ‬ a suspensão estoque pode ser descongelada e novamente refrigerada várias vezes sem perda
da viabilidade das células.
CONSERVAÇÃO A 4O
C
Semear a espécie em ágar inclinado à base de ovo.
Armazenar a 4o
C até 1 ano.
ESTOQUE DE MICOBACTÉRIAS POR < 6 MESES
Semear a espécie em ágar inclinado à base de ovo.
Armazenar em temperatura ambiente no escuro até 6 meses.
ESTOQUE DE CULTURA DE FUNGOS POR ≥ 1 ANO
CONSERVAÇÃO DA CULTURA EM ÁGUA
É o método mais simples e confiável:
Adicionar 2 a 3 ml de água esterilizada sobre esporos viáveis semeados em ágar inclinado de
batata dextrose.
Suspender cuidadosamente no próprio tubo a conídia sem machucar o meio de cultura.
Remover a suspensão e coloca-la em um tubo estéril.
Fechar o tubo firmemente e identificá-lo adequadamente.
Armazenar em temperatura ambiente; o microrganismo pode permanecer viável por vários anos.
Para a recuperação da espécie:
‫ـ‬ agitar bem o tubo e inocular uma gota em ágar batata dextrose.
CONSERVAÇÃO COM ÓLEO MINERAL
Cubrir completamente a cultura semeada em ágar inclinado de batata dextrose com óleo mineral
estéril.
Vedar o tubo firmemente e identificá-lo.
Incubar em temperatura mabiente.
Para a recuperação da cultura:
‫ـ‬ passar na chama o tubo;
‫ـ‬ obter parte do crecimento com a alça estéril;
‫ـ‬ escoar o óleo;
‫ـ‬ inoclular em caldo Sabouraud ou ágar inclinado;
‫ـ‬ incubar 30o
C até o obter o crescimento da cultura.
CONSERVAÇÃO EM BAIXA TEMPERATURA
Congelar a -70o
C esporos viáveis semeados em ágar inclinado de batata dextrose; o tubo deve ser
de boa qualidade, senão o mesmo pode quebrar.
Para a recuperação da cultura:
‫ـ‬ retirar do refrigerador;
‫ـ‬ Remover imediatamente parte do crescimento do ágar;
‫ـ‬ inocular em ágar batata dextrose;
‫ـ‬ retornar o tubo original (estoque) ao refrigerador; caso descongele, preparar uma nova
cultura.

mod III - 42
ESTOQUE DE CULTURA DE FUNGOS POR < 6 MESES
Armazenar a 4o
C cultura de esporos viáveis semeados em ágar batata dextrose até seis meses; os
fastidiosos nessecitam ser transferidos para meio de preparo recente mais freqüentemente.
Atenção ao fato de que a transferência freqüente resulta em culturas atípicas e inativas.
COLEÇÕES DE CULTURA
Em todo mundo há organizações que mantêm culturas puras autênticas de microrganismos. Estas
estão disponíveis para diversas finalidades e assim desempenham um papel fundamental para os
microbiologistas tanto nos serviços prestados quanto nas pesquisas experimentais.
Para informações sobre coleções de cultura no mundo e os respectivos países registrados no WDCM
(World Data Center for Microorganism), acessar – www.wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html

mod III - 43
1. Ballows, A.J., Hausler, W.J., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D. and Shadomy, H.J. Manual of
clinical microbiology, 5 th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991.
2. Baron, F.J., and Finegold, S.M. Diagnostic Microbiology, 8 th ed., CV Mosby, St. Louis, 1990.
3. Bartlett, J.G., Ruan, K.J., Smith, T.F. and Wilson, W.R. Laboratory diagnosis of lower
respiratory tract infections. CUMITECH 7A, Coordinating ed., J.A. Washington II, American
Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987.
4. Clarridge, J.E., Pezzlo, M.T. and Vosti, K.L. Laboratory Diagnosis of urinary tract infections.
CUMITECH 2A, Coordinating ed., A.S. Weissfeld, American Society for Microbiology, Washington,
D.C., 1987.
5. Forbes, B.A. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 10th Ed., CV Mosby, St. Louis, 1998.
6. Gilligan, P.H., Janda, J.M., Karmali, M.A and Miller, J.M. Laboratory Diagnosis of Bacterial
Diarrhea. CUMITECH 12A, Coordinating ed., F.S. Nolte. American Society for Microbiology,
Washington, D.C., 1992.
7. Isenberg, H.D. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbi-
ology, Washington, D.C., 1992.
8. Isenberg, H.D. Essential procedures for Clinical Microbiology. American Society for Micro-
biology, Washington, D.C., 1992.
9. Isenberg, H.D., Schoenknecht, F.D. and A. VON. G., Collection and processing of
bacteriological specimens. CUMITECH 9, Coordinating ed., S.J. Rubin. American Society for
Microbiology, Washington, D.C., 1979.
10. Koneman, E.W. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed., Lippincot,
Philadelphia, 1997.
11. Miller, J.M. A Guide to Specimen Management in Clinical Microbiology. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.,1996.
12. MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA NACIONAL DE ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Manual de
procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle da infecção hospitalar.
Brasília, 1991.
13. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C. and Yolken, R.H. Manual of Clinical
Microbiology, 6th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1995.
14. NCCLS. Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals, 2nd. Ed., Approved Guide-line.
NCCLS document GP2-A2 (ISBN 1-56238-156-3) NCCLS, Villanova, 1992.
15. Reller, L.B., MURRAY, P.R. and Mac Lowry, J.D. Blood Cultures II. CUMITECH 1A, Coordinating
ed., J.A. Washington II, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1982.
16. Rodloff, A.C., Appelbaum, P.C. and Zabransky, R.F., Practical Anaerobic Bacteriology.
CUMITECH 5A, Coordinating ed., A.C. Rodloff, American Society for Microbiology, Washington,
D.C., 1991.

Descrição dos Meios de
Cultura Empregados
nos Exames
Microbiológicos
Módulo IV

ÍNDICE
1. Introdução ........................................................................................................................1
Procedimentos gerais...........................................................................................................1
2. Meios de cultura para transporte e conservação ...............................................................2
Cary Blair...........................................................................................................................2
Salina Tamponada ...............................................................................................................2
Meio Stuart ........................................................................................................................3
Ágar nutriente ....................................................................................................................4
3. Meios para crescimento e isolamento................................................................................6
Ágar Chocolate....................................................................................................................6
Ágar Thayer-Martin Chocolate ...............................................................................................7
Ágar Salmonella-Shigella (ss)................................................................................................7
Caldo Selenito.....................................................................................................................8
Caldo Tetrationato ...............................................................................................................9
Caldo Tioglicolato com indicador .......................................................................................... 10
Caldo Tioglicolato sem indicador .......................................................................................... 11
Ágar Mac Conkey .............................................................................................................. 12
Ágar Sangue..................................................................................................................... 13
Ágar CLED – cystine lactose electrolyte deficient .................................................................... 14
Caldo BHI – brain heart infusion .......................................................................................... 15
Löwenstein Jensen............................................................................................................. 16
Meio bifásico: Löwenstein e Middlebrook ............................................................................... 18
Ágar Mycosel .................................................................................................................... 19
Ágar Sabouraud ................................................................................................................ 20
4. Meios comerciais para provas de identificação ................................................................22
Base de nitrogênio para leveduras – Yeast Nitrogen Base ........................................................ 22
Ágar Citrato Simmons ........................................................................................................ 23
Ágar Bílis-Esculina ............................................................................................................. 24
Ágar Sangue - CAMP.......................................................................................................... 25
Caldo base de Moeller ........................................................................................................ 26
Ágar Dnase ...................................................................................................................... 28
Ágar Esculina.................................................................................................................... 30
Ágar Fenilalanina............................................................................................................... 31
CTA – Cystine Tryticase Agar .............................................................................................. 32
Caldo Triptona e SIM ......................................................................................................... 33
Meio Caldo Triptona ........................................................................................................... 34
Caldo Malonato ................................................................................................................. 35
Caldo Nitrato .................................................................................................................... 36
Meio base para oxidação e fermentação - OF......................................................................... 38
Ágar TSI – triplo açúcar ferro .............................................................................................. 40
Ágar base uréia (christensen).............................................................................................. 41
5. Fórmulas e produtos para provas de identificação ..........................................................43
Para prova de catalase ....................................................................................................... 43
Para prova de coagulase..................................................................................................... 43
Para prova de gelatinase .................................................................................................... 45
Para prova de lecitinase ..................................................................................................... 46
Para prova de oxidase........................................................................................................ 47
Para fermentação de carboidratos........................................................................................ 48
Para a prova de hidrólise .................................................................................................... 49
Para crescimento a 42 e 44°c.............................................................................................. 50
Para teste de motilidade..................................................................................................... 51
Para prova de tolerância ao NaCl 6,5%................................................................................. 55
6. Discos para identificação.................................................................................................57
Bacitracina ....................................................................................................................... 57
Novobiocina...................................................................................................................... 57
Optoquina ........................................................................................................................ 58
7. Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos ...................................................60
HTM – haemophilus test médium ......................................................................................... 60
Ágar Mueller Hinton ........................................................................................................... 61
Ágar Mueller Hinton Sangue................................................................................................ 62
8. Referências bibliográficas ...............................................................................................64

Mod IV - 1
1. INTRODUÇÃO
PROCEDIMENTOS GERAIS
PREPARAÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio
fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.
Os meios preparados não comerciais, devem ser pesados separadamente em papel manteiga ou
papel alumínio e adicionados em um único frasco (normalmente em béquer), hidratar em pequena
quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante
da água.
Sempre que for necessário levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex, aquecer sobre a tela de
amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen.
Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes;
Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15
minutos e a temperatura de 121ºC.
Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,22
micra, recomendado para partículas bacterianas.
Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;
Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou
materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por
igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.
CONTROLE DE QUALIDADE DE ESTERILIDADE E CRESCIMENTO
Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ±
1°C por 24 horas para o controle de esterilizade.
Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.
Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de
referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.
Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de
qualidade de crescimento realizados.
RECOMENDAÇÕES GERAIS
Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o controle
de crescimento de que realmente está funcionando.
Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.
Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para alguns
meios de cultura.
Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio
(tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 11 por 100 mm).
As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro.
Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de
fabricação, data de validade e tipo de armazenamento.
Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para evitar o
ressecamento.
Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada
facilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plásticos,
procurando tirar o excesso de ar.

Mod IV - 2
2. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO
CARY BLAIR
PRINCÍPIO
meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos
patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio.
A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de
microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.
O que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina balanceada de
tampão fosfato inorgânico e omitindo da fórmula o azul de metileno.
UTILIDADE
Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos.
FÓRMULA/ PRODUTO
Meios comercial: Meio de transporte Cary Blair.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;
Fundir completamente;
Distribuir 7 ml por tubo;
Esterilizar em autoclave;
Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para solidificar.
pH: 7,4 +/- 0,2
Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri ATCC 12022.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas.
INOCULAÇÃO
Introduzir um "swab" estéril de madeira nas fezes recém coletadas;
Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste,
de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura;
Fechar o tubo;
Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: Branco opalescente.
Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
RECOMENDAÇÕES
Não deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta após a semeadura.
Não semear fezes coletadas com mais de 6 horas.
SALINA TAMPONADA

Mod IV - 3
PRINCÍPIO
Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável.
UTILIDADE
Meio de transporte de fezes.
FÓRMULA /PRODUTO
Fórmula:
‫ـ‬ NaCl 4,2 g
‫ـ‬ Fosfato dipotássico anidro 3,1 g
‫ـ‬ Glicerina bidestilada 300 ml
‫ـ‬ Água destilada 700 ml
PROCEDIMENTOS
Distribuir 10 ml em cada tubo de 16 x 160 mm;
Esterilizar em autoclave.
Shigella flexneri ATCC 12022
INOCULAÇÃO
Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar;
Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAÇÃO
O crescimento é indicado pela turbidez do meio.
Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey.
Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses.
MEIO STUART
PRINCÍPIO
A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de
microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.
UTILIDADE
Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos.
Conservação de microorganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus,
Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
FÓRMULA / PRODUTO
Meios comercial: Meio de transporte STUART
PROCEDIMENTOS

Mod IV - 4
Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para que solidifiquem.
pH: 7,4 +/- 0,2
Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento):
Haemophilus influenzae ATCC 10211
Shigella flexneri ATCC 12022
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Bordetella pertussis ATCC 9340
Conservar embalado de 4 a 8°C por 1 a 2 semanas.
INOCULAÇÃO
O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab" estéril com haste de madeira;
Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste,
de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura;
Fechar o tubo;
Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: Branco opalescente.
Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
RECOMENDAÇÕES
Não deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta após a semeadura.
ÁGAR NUTRIENTE
PRINCÍPIO
O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos
procedimentos do laboratório de Microbiologia.
UTILIDADE
nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para
análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à
exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras.
uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente
neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da
crioconservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC).
Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos.
FÓRMULA / PRODUTO
Produto: Nutriente Ágar
Fórmula:
‫ـ‬ Extrato de carne 3 g
‫ـ‬ Peptona 5 g
‫ـ‬ Ágar ágar 15 g
‫ـ‬ pH: 6,8 +/- 0,2

Mod IV - 5
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar os componentes;
Fundir;
Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície
em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
Crescimento bom a excelente:
Escherichia coli ATCC 25922
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.
INOCULAÇÃO
Estriar a superfície inclinada do meio;
Incubar.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: branco opalescente
Positivo: Crescimento na superfície do ágar;
Negativo: Ausência de crescimento.
RECOMENDAÇÕES
Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do ágar.
Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses.
Conservar as cepas após o crescimento no meio em temperatura ambiente.
Por ser um meio nutritivo, a ausência de crescimento não deverá ocorrer.

Mod IV - 6
3. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
ÁGAR CHOCOLATE
PRINCÍPIO
Meio de Ágar Chocolate é amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes,
embora cresçam neste meio quase todos os tipos de microrganismos.
À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz
com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o
crescimento dos microrganismos exigentes.
Observação: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os
suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à
aproximadamente 50ºC.
UTILIDADE
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella
catarrhalis e Moraxella spp.
FÓRMULA / PRODUTO
Meios comerciais: BHI Ágar *, Columbia Ágar Base, Blood Ágar Base, Mueller Hinton Ágar.
Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado.
Recomenda-se o uso da base de BHI Ágar, por apresentar melhor crescimento das cepas
exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.
PROCEDIMENTOS
Esfriar a base à temperatura de aproximadamente 80ºC;
Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 ml de base;
Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma cor castanho escuro
(chocolate);
Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro.
Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211.
Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.
INOCULAÇÃO
Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento;
Incubar a 35ºC por 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).
Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp,
Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.
Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.
RECOMENDAÇÕES
Lembrar que é um meio rico e crescem vários tipos de microrganismos.

Mod IV - 7
Fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e corar pela técnica de Gram, para confirmar se
trata-se ou não de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram
negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomérficos).
Não usar sangue de cavalo vencido.
Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser
abundante. Sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de
identificação, para não correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.
ÁGAR THAYER-MARTIN CHOCOLATE
PRINCÍPIO
É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria
gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o
crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios
contaminados.
UTILIDADE
Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do
material de investigação.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Thayer-Martin Ágar Base.
Sangue desfibrinado de carneiro.
Suplemento I: mistura de inibidores (antibióticos).
Suplemento II: mistura de fatores de crescimento.
PROCEDIMENTOS
Dissolver os suplementos liofilizados conforme instruções do fabricante (normalmente em água
destilada estéril que já acompanha o kit) e reservar;
Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante (normalmente prepara-se 200 ml de
base para cada frasco de suplementos I e II );
Esfriar a base a 80ºC;
Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base;
Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma cor castanho escura
(chocolate);
Deixar resfriar a base a 50ºC;
Adicionar assepticamente à base resfriada os suplementos previamente dissolvidos;
Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas;
Distribuir em placas de Petri de 90 mm ou 4 ml por tubos e inclinar para a superfície ficar em
forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
PRINCÍPIO
Ágar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem
microrganismos Gram positivos.
A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positiva
(bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho
neutro resultando na formação de colônias de cor rosa), e bactérias que não fermentam a lactose
formam colônias transparentes.
Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de
colônias de cor negra no centro.

Mod IV - 8
UTILIDADE
Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Ágar SS.
PROCEDIMENTOS
Aquecer o meio até fundir o ágar;
Não autoclavar;
Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis;
Deixar em temperatura ambiente até resfriar;
Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C.
Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028.
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAÇÃO
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas;
Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: vermelho alaranjado.
Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella.
Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.
Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp.
As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.
As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
Conservar embalado de 4 a 8°C por 3 meses.
RECOMENDAÇÕES
Ausência de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas.
Não autoclavar, pois a alta temperatura degrada o açúcar contido no meio.
CALDO SELENITO
PRINCÍPIO
Tem propriedades que inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.
UTILIDADE
Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de
fezes, urina e alimentos.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Selenito
Novobiocina
PROCEDIMENTOS

Mod IV - 9
Aquecer até levantar fervura, homogeneizando de vez em quando;
Não autoclavar;
Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o véu de
Proteus spp.);
Distribuir 7 ml em tubos estéreis de 15x150 mm com tampa de rosca.
Crescimento:
Preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028
na escala 0,5 de Mac Farland;
Semear 0,01 ml da suspensão na placa de SS;
Incubar a placa a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
‫ـ‬ Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium.
‫ـ‬ Negativo: não á crescimento de Escherichia coli.
INOCULAÇÃO
Inocular 3 a 4 alçadas da amostra de fezes no meio de cultura;
Incubar a 35±1°C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: vermelho tijolo.
Após incubação, semear com o auxílio de uma alça bacteriológica em meios seletivos e
enriquecidos (SS, Mac Conkey, XLD, Hectoen).
CALDO TETRATIONATO
PRINCÍPIO
Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição
da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais.
UTILIDADE
Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Tetrationato.
Solução de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes de semeada a amostra
de fezes.
‫ـ‬ Iodo metálico 6,0 g
‫ـ‬ Iodeto de potássio 5,0 g
‫ـ‬ Água destilada 20,0 ml
PROCEDIMENTOS
Caldo tetrationato
Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante;
Aquecer até ferver;
Distribuir 10 ml em tubos estéreis com tampa de rosca;
Não autoclavar.
Solução de iodeto de potássio
Macerar o iodeto de potássio e o iodo em um graal;
Adicionar água aos poucos até dissolver completamente;
Colocar em frasco âmbar.

Mod IV - 10
Crescimento:
Preparar uma suspensão de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma cepa de Escherichia coli
ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland;
Semear 0,01 ml da suspensão em uma placa de SS;
Se houver crescimento de Salmonella e inibição de Escherichia coli, liberar o lote para uso.
INOCULAÇÃO
Adicionar 0,2 ml da solução de iodo no tubo;
Inocular 1a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente;
Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: límpido com precipitado branco.
O crescimento é indicado pela turbidez do meio.
Após incubação, semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey.
Tetrationato: Conservar de 4 a 8°C por até 4 meses.
Solução de iodo: Conservar em frasco âmbar a temperatura ambiente por até 12 meses.
Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090.
INOCULAÇAO
Usar a técnica de semeadura por esgotamento;
Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumaço de algodão embebido em água);
Incubação por 48 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).
Colônias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria
meningitidis.
Fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e corar pela técnica de Gram, para confirmar se
trata-se ou não de Neisseria (diplococos Gram negativos reniformes).
Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificação com testes de oxidase e provas de
fermentação.
RECOMENDAÇÕES
Antes de semear o material biológico aquecer o meio de cultura em estufa à 35ºC, pois
temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisserias;
Não usar meio, suplementos e sangue vencidos;
Se não for incubado em CO2 e não houver crescimento, pode ser um resultado falso - negativo,
pois as Neisserias necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento;
Se não houver crescimento, incubar até 5 dias.
CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR

Mod IV - 11
PRINCÍPIO
O meio de Tioglicolato dá suporte para o crescimento de vários microrganismos. O potencial de
oxidação e redução baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espécies preservadas com
mercúrio.
A resazurina e o azul de metileno são indicadores da posição de oxidação de aeróbios e a dextrose
incluída na fórmula é para os microrganismos que tem crescimento vigoroso na presença do
carboidrato.
UTILIDADE
Usado para o cultivo de microrganismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios.
Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Tioglicolato caldo com indicador
PROCEDIMENTOS
Aquecer em bico de Bunsen, até dissolver completamente;
pH: 7,2 +/- 0,2
Crescimento bom a excelente: Bacillus subtilis ATCC 6633, Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
Temperatura ambiente: 3 meses.
Entre 4 a 8ºC: 6 meses.
INOCULAÇÃO
Com auxílio da alça bacteriológica, inocular o material biológico introduzindo a alça até a metade
do tubo;
Retirar a alça sem agitar o tubo;
Incubar à 35 =/- 1ºC por 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original: amarelo claro.
Presença de crescimento: turvação do meio.
Ausência de crescimento: meio permanece inalterado.
Crescimento de microrganismos anaeróbios: crescimento na profundidade do meio.
Crescimento de microrganismos aeróbios: crescimento na superfície do meio.
RECOMENDAÇÕES
Não usar o meio quando estiver com cor rosa ou esverdeado na superfície, pois indica a presença
de oxigênio no meio.
Recomenda-se o uso do meio recém preparado, porém, se não houver a presença de oxigênio,
pode-se usar um período maior.
Não usar meios que estejam turvos.
Não utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do meio.
CALDO TIOGLICOLATO SEM INDICADOR

Mod IV - 12
PRINCÍPIO
As substâncias redutoras tioglicolato, cisteína e sulfito de sódio produzem uma anaerobiose
suficiente para microrganismos anaeróbios exigentes.
UTILIDADE
Usado para o cultivo de microrganismos anaeróbios.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Tioglicolato caldo sem indicador.
PROCEDIMENTOS
Aquecer em bico de Bunsen, até dissolver completamente;
pH: 7,2 +/- 0,2
Crescimento bom a excelente: Clostridium perfringens ATCC 10543.
Temperatura ambiente: 18 meses.
INOCULAÇÃO
Com auxílio da alça bacteriológica, inocular o material biológico introduzindo a alça até o fundo do
tubo;
Retirar a alça sem agitar o tubo;
Incubar à 35 =/- 1ºC em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original: amarelo claro.
Presença de crescimento: turvação do meio.
Ausência de crescimento: meio permanece inalterado.
RECOMENDAÇÕES
Não usar meios que estejam turvos.
Se necessário, incubar um período superior à 48 horas.
ÁGAR MAC CONKEY
PRINCÍPIO
O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos
e estafilococos.
A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios, por isso
não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS.
UTILIDADE
Isolar bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou
não da lactose.

Mod IV - 13
FÓRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Ágar MacConkey.
PROCEDIMENTOS
Aquecer sob agitação até fundir o ágar completamente;
Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis;
Deixar em temperatura ambiente até resfriar;
Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (não fermentador de lactose).
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose).
INOCULAÇÃO
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas;
Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: rosa avermelhado.
Crescimento de bacilos Gram negativos.
Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.
Não há crescimento de cocos Gram positivos.
Conservar as placas embaladas de 4 a 8°C por até 3 meses.
ÁGAR SANGUE
PRINCÍPIO
O meio de Ágar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece ótimas condições de
crescimento a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a
formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e
Staphylococcus spp.
UTILIDADE
Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos.
Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Blood Ágar Base, Columbia Ágar Base, BHI Ágar, Mueller Hinton Ágar;
Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho:
‫ـ‬ 5 ml para cada 100 ml de meio base.
‫ـ‬ pH: 6,8 +/- 0,2
PROCEDIMENTOS

Mod IV - 14
Esfriar a base à +/- 50ºC;
Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base;
Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas;
Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro.
Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC
25923.
Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC
6305.
Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228.
INOCULAÇÃO
Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento;
No final da semeadura, picar o meio com a alça para verificar hemólise em profundidade;
Incubar à 35ºC 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: vermelho.
Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total dos
eritrócitos).
Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos
eritrócitos).
Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem
íntegros).
RECOMENDAÇÕES
Não usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura,
dificultando o estudo de hemólise;
Não usar sangue humano, pois alguns microrganismos não apresentam hemólise;
Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se, dificultando o
estude de hemólise;
Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser abundante,
sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, para não
correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.
ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
PRINCÍPIO
Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A
deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus.
UTILIDADE
Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Ágar Cled.

Mod IV - 15
PROCEDIMENTOS
Resfriar à +/- 50°C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis;
Deixar em temperatura ambiente até resfriar.
Positivo:
‫ـ‬ Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colônias
médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação.
‫ـ‬ Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colônias azuis
translúcidas.
Negativo: ausência de crescimento
INOCULAÇÃO
Verificar técnica de semeadura quantitativa.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: azul claro.
Colônias lactose positiva: cor amarela.
Colônias lactose negativa: cor azul.
Características de crescimento:
Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de
1,25 mm de diâmetro, as não fermentadoras de lactose colônias azuis
Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado
Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que E.coli
Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul
Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro
Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro
Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas
Corynebacterium: colônias pequenas e cinza
Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa
Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa
RECOMENDAÇÕES
Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo,
podendo assim verificar se o microrganismo é lactose negativa ou positiva;
Espécies de Shigella não crescem em meios deficientes em eletrólitos.
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
PRINCÍPIO
É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose.
A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas.

Mod IV - 16
A dextose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação.
UTILIDADE
Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não
fermentadores, leveduras e fungos.
Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos,
para realização de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C
e para teste de motilidade em lâmina.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo BHI (infusão de cérebro e coração).
PROCEDIMENTOS
Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca;
Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC 10231.
Negativo: meio sem inocular.
INOCULAÇÃO
Com o auxílio de uma alça ou fio bacteriológico, inocular a colônia ou o material a ser testado -
realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas;
Incubar a 35°C ±2 por 24 a 48 horas;
Para isolamento de fungos incubar por até 5 dias.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: amarelo claro, límpido.
Positivo: presença de turvação = crescimento bacteriano.
Negativo: ausência de turvação.
RECOMENDAÇÕES
Para cultivo de anaeróbios, acrescentar 0,1% de ágar.
Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos é necessário adição de suplementos a base
de L-cisteína, NAD (fator V) e hemina (fator X).
LÖWENSTEIN JENSEN
PRINCÍPIO
A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das
micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para
Mycobacterium tuberculosis).
UTILIDADE
Isolamento primário das micobactérias.

Mod IV - 17
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base
Ovos de galinha frescos
Meio base - fórmula:
Fosfato monopotássico 1,2 g
Sulfato de magnésio 0,12 g
Citrato de magnésio 0,3 g
L-asparagina 1,8 g
Fécula de batata 15,0 g
Glicerol 6,0 ml
Ovos totais 500 ml
Solução de Verde de malaquita a 2% 10 ml
Solução de Verde de malaquita à 2% - Fórmula:
Verde de malaquita 2 g
PROCEDIMENTOS
Preparação dos ovos:
Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias;
Deixar os ovos submersos em água e detergente comum, durante 30 minutos;
Enxaguar com água corrente cuidadosamente um a um;
Deixar os ovos submersos em álcool etílico a 70% durante 30 minutos;
Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estéril;
Reservar os ovos.
Solução de Verde de malaquita a 2%:
Pesar o verde de malaquita e adicionar a água;
Homogeneizar bem até dissolver o corante;
Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos;
Reservar a solução.
Meio comercial:
Adicionar o glicerol e aquecer o meio, agitando constantemente até ferver;
Resfriar a base à 45 - 50ºC;
Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de béquer estéril e transferir, um a um, para
uma proveta estéril de 500 ml;
Completar a proveta com ovos até completar 500 ml;
Transferir os ovos para um copo de liqüidificador estéril - se não tiver liqüidificador próprio para
laboratório, transferir os ovos para um balão de 1000 ml contendo pérolas de vidro de tamanho
médio, ambos estéreis;
Homogeneizar os ovos;
Passar os ovos para o balão que contém a base fria, filtrando em funil e gaze estéril;
Adicionar o verde de malaquita;
Homogeneizar bem;
Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfície estourarem;
Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estéril;
Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de
45º) durante 50 minutos a 85ºC - se não tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de
areia à 85ºC colocado em estufa de esterilização, também por 50 minutos, tendo o cuidado de
verificar a temperatura constantemente.
Meio não comercial:
Diluir a L-asparagina em pouca água e dissolver aquecendo lentamente no bico de Bunsen;
Acrescentar os demais componentes, exceto os ovos e o verde de malaquita;
Seguir os passos 4 ao 14 listados acima.

Mod IV - 18
Esterilização: colocar todos os tubos em estufa;
Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618
Mycobacterium avium ATCC 25291
Conservar entre 4 a 8ºC por 3 meses.
INOCULAÇÃO
Para materiais biológicos de sítios contaminados, fazer descontaminação prévia pelas técnicas
desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sódio, Corper & Stoner modificado);
Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfície do meio;
Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta até secar bem o inóculo;
Depois de seco o inóculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias à 35ºC;
Semanalmente, abrir as tampas próximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a
presença ou não de crescimento.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: verde claro
Positivo: Crescimento de colônias amarelas
Negativo: ausência de crescimento.
RECOMENDAÇÕES
Como é um meio rico em proteínas, bactérias proteolíticas contaminam o meio, liqüefazendo-o,
para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubação para tirar as culturas que possam
ter contaminado;
Não usar ovos velhos;
Não quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais;
Manter sempre mais que um béquer estéril para o caso de haver algum ovo estragado;
Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias
desenvolvem-se lentamente;
Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo
Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
MEIO BIFÁSICO: LÖWENSTEIN E MIDDLEBROOK
PRINCÍPIO
O meio é constituído de duas fases, uma sólida que é o meio de Löwenstein Jensen e uma líquida,
que é o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessários para o desenvolvimento das
micobactérias isoladas de materiais nobres.
UTILIDADE
Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactérias do sangue e de materiais paucibacilares,
como líquor, líquido pleural, biópsias, entre outros.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base
Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth
Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento).
Ovos de galinha frescos

Mod IV - 19
PROCEDIMENTOS
Meio de Löwenstein Jensen: procedimento igual ao já descrito, distribuindo 12 ml do meio em
frascos estéreis com capacidade para 100 ml (usar tampão de algodão e depois do meio pronto -
parte sólida e líquida, substituir por tampa de borracha e lacre de alumínio) e coagulando os
frascos bem inclinados.
Meio Middlebrook 7H-9 broth:
‫ـ‬ Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante;
‫ـ‬ Adicionar o glicerol, conforme instruções do fabricante;
‫ـ‬ Esterilizar em autoclave;
‫ـ‬ Resfriar a base à - 50ºC;
‫ـ‬ Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instruções do fabricante;
‫ـ‬ Homogeneizar bem;
‫ـ‬ Distribuir 15 ml em cada frasco de Löwenstein Jensen inclinado;
‫ـ‬ Fazer o controle de qualidade de esterilidade;
‫ـ‬ Lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em álcool etílico 70%
durante 30 minutos) e lacre de alumínio.
‫ـ‬ pH: 6,6 +/- 0,2
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.
Conservar os frascos embalados de 4 a 8°C por até 3 meses.
INOCULAÇÃO
Por serem materiais estéreis, não é necessário a descontaminação;
Colher assepticamente 5 ml de sangue e inocular no frasco ;
Se for outro material, inocular até 5 ml de material;
Incubar durante 60 dias à 35º /- 0,2;
Banhar o meio sólido semanalmente.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: parte sólida: verde clara, parte líquida: âmbar claro.
Positivo: turvação do meio líquido e crescimento de colônias amarelas no meio sólido.
Negativo: ausência de turvação e crescimento nos meios líquido e sólido.
RECOMENDAÇÕES
Não usar frascos com meio líquido turvo;
Volumes de inóculos inferires a 2,5 ml podem resultar em culturas falso - negativas;
Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias
desenvolvem-se lentamente;
Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo
Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
ÁGAR MYCOSEL
PRINCÍPIO

Mod IV - 20
A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatófitos o cloranfenicol
inibe o crescimento de bactérias e alguns fungos filamentosos.
UTILIDADE
Isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos, a partir de material de
investigação contaminado.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Mycosel Ágar, Mycobiotic Ágar ou Ágar seletivo para fungos patogênicos.
PROCEDIMENTOS
Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo;
Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de
45º).
pH: 6,9 +/- 0,1
Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC
10231.
Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp.
INOCULAÇÃO
Inocular sempre dois tubos ou placas;
Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa;
Se em tubo: estriar na superfície inclinada do meio;
Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro a 37ºC;
Observar diariamente a presença ou não de crescimento;
Incubar 40 dias.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: amarelo claro opalescente.
Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAÇÕES
A ausência de crescimento não indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos
podem ter o crescimento inibido neste meio.
Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o
meio contido em placas.
ÁGAR SABOURAUD
PRINCÍPIO
Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e
filamentosos.
UTILIDADE

Mod IV - 21
Cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados
a infecções superficiais.
Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Sabouraud Dextrose Ágar.
PROCEDIMENTOS
Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo;
Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de
45º).
pH: 5,6 +/- 0,1
Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.
INOCULAÇÃO
Inocular sempre dois tubos ou placas;
Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa;
Se em tubo: semear na superfície inclinada do meio;
Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro à 37ºC;
Observar diariamente a presença ou não de crescimento;
Incubar 40 dias.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: amarelo claro opalescente.
Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAÇÕES
Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o
meio contido em placas.
Não usar meios vencidos e/ou ressecados.
Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI ágar.

Mod IV - 22
4. MEIOS COMERCIAIS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
BASE DE NITROGÊNIO PARA LEVEDURAS – YEAST NITROGEN BASE
PRINCÍPIO
Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de
nitrogênio livre de carboidratos e discos de papel impregnados com carboidratos, nos quais observa-
se o crescimento ao redor, após um período de incubação.
UTILIDADE
Identificar as espécies de leveduras através da prova de assimilação de carboidratos.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrogênio para leveduras.
Discos comerciais de carboidratos.
Discos preparados no laboratório, impregnados com soluções de carboidratos a 1%:
- Carboidrato 1 g
- Água destilada 100 ml
PROCEDIMENTOS
Para os discos de carboidratos:
Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de fazer o meio;
Usar discos estéreis disponíveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de diâmetro
em autoclave;
Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar água, homogeneizar bem
até completa dissolução - carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose,
melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol;
Esterilizar por filtração (cada um em frasco separado);
Impregnar os discos previamente estéreis (embeber totalmente os discos);
Deixar os discos em estufa à 37ºC até secarem totalmente .
Para o meio base de nitrogênio:
Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante;
CARBOIDRATOS POSITIVO NEGATIVO
Glicose
Maltose
Sacarose
Lactose
Galactose
Melibiose
Celobiose
Inositol
Xilose
Rafinose
Trealose
Dulcitol
Candida albicans
Candida albicans
Candida tropicalis
Candida kefyr
Candida albicans
Candida guilliermondii
Cryptococcus neoformans
Candida albicans
Candida albicans
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei
Candida krusei

Mod IV - 23
Meio base: 4 a 10ºC por 6 meses.
Discos: refrigerado e se possível em dessecador durante 1 ano ou mais.
INOCULAÇÃO
Aquecer o tubo contendo 20 ml de meio base de nitrogênio até fundir totalmente;
Resfriar a base à 47 - 48ºC;
Fazer uma suspensão das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4 ml de água destilada
estéril, , usando um cultivo de leveduras de 24 a 72 horas;
Despejar a suspensão de leveduras no tubo contendo a base de nitrogênio;
Homogeneizar bem;
Despejar o conteúdo homogeneizado (meio base + suspensão de leveduras) em placa de Petri de
estéril de 150 mm de diâmetro;
Esperar solidificar em temperatura ambiente;
Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxílio de uma pinça flambada;
Incubar à 30ºC durante 18 a 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: amarelo palha.
Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que significa a assimilação
do açúcar pela levedura.
Negativo: Ausência de halo de crescimento. O meio permanece inalterado.
RECOMENDAÇÕES
Não usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas;
Não usar inóculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova falso - negativa;
Não adicionar a suspensão de leveduras à base com temperatura superior a 48ºC, pois pode
inativar as células e resultar em prova falso - negativa;
Após homogeneizar o meio base e suspensão de leveduras, despejar imediatamente na placa de
Petri, pois solidifica rapidamente.
ÁGAR CITRATO SIMMONS
PRINCÍPIO
Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono,
juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio.
UTILIDADE
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Citrato Simmons.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante;
Ajustar o pH para 6,9 ±0,2;
Aquecer sob agitação até fundir o ágar;
Distribuir em tubos com tampas de rosca;
Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfície
em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.

Mod IV - 24
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAÇÃO
Com o auxílio de um fio bacteriológico, inocular na superfície a colônia, não furar a base;
Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: verde
Positivo: cor azul ou crescimento no local do inóculo.
Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.
Se houver crescimento visual na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser
considerado positivo, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para
alcalino (azul).
Leitura inicial com 24 horas:
Se resultado positivo: encerrar o teste.
Se resultado negativo ou houver dúvida: reincubar por mais 24/48 horas.
Leitura com 48 horas:
Se houver crescimento visível na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser
considerado positivo, (encerrar o teste).
Se resultado negativo ou houver dúvida, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá
mudar a cor do meio para alcalino(azul).
Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas;
Após este período realizar controles negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAÇÕES
Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxigênio.
Não se devem transportar colônias de meios que contenham glicose ou outros
nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um
resultado falso positivo.
Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente
(22 a 25°C) por até 7 dias.
Não usar repiques de caldo.
Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactéria.
Para fazer o inóculo flambar o fio bacteriológico.
Não fazer inóculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).
ÁGAR BÍLIS-ESCULINA
PRINCÍPIO
A prova de Bile-Esculina é baseada na capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em
presença de bílis. A esculina é um derivado glicosídico da cumarina. As duas moléculas do
composto (glicose e 7-hidroxicumarina) estão unidas por uma ligação éster através do oxigênio.
Aa esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares.
As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS, são capazes de crescer em presença de sais biliares. A
hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina. A esculetina reage com
íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um
complexo negro.

Mod IV - 25
UTILIDADE
Separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa.
Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva.
Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores e enterobactérias, usar o meio sem
bílis (vide prova de esculina).
FÓRMULA/ PRODUTO
Meio comercial: Ágar Bílis-Esculina
Fórmula: Peptona 5 g
Extrato de carne 3 g
Bílis 40 g
Esculina 1 g
Citrato férrico 0,5 g
Ágar 15 g
pH = 7,0
PROCEDIMENTOS
Fundir o meio;
Distribuir 2,5 ml por tubo;
Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície
em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
INOCULAÇÃO
Estriar a superfície inclinada do meio;
Incubar a 35ºC 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: acinzentado
Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.
Negativo: Ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio após 72 horas
de incubação.
RECOMENDAÇÕES
Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48
horas).
Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presença de
bílis se incubados em atmosfera de CO2.
ÁGAR SANGUE - CAMP

Mod IV - 26
PRINCÍPIO
Consiste na interação da beta hemólise secretada pelo Staphylococcus aureus com o
microrganismo em estudo, que secreta uma proteína, denominada "fator CAMP", produzindo
aumento de hemólise no local da inoculação.
UTILIDADE
Separação do Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e
da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolíticos e espécies
de Listeria.
FÓRMULA/ PRODUTO
Para esta prova utiliza-se:
Placa de meio Ágar Sangue.
Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.
Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
INOCULAÇÃO
Com auxílio do fio bacteriológico, semear na superfície de meio Ágar Sangue a cepa de
Staphylococcus aureus com uma única linha reta;
Novamente com o fio bacteriológico (flambado), tocar nas colônias em estudo;
Semear uma única linha reta na superfície do meio Ágar Sangue, perpendicularmente à linha de
semeadura do S. aureus, sem tocar no inóculo do S. aureus;
Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio Ágar Sangue duas vezes, uma de cada lado da
semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inóculo já feitos (a do S. aureus e da
cepa em estudo);
(a) Inóculo do S. aureus
(b) Inóculo da cepa em estudo
INTERPRETAÇÃO
Positivo: Aumento da área de hemólise em forma de flecha no local onde estão mais próximas as
duas estrias de crescimento.
Negativo: Ausência de aumento da hemólise. Observa-se nitidamente a hemólise do S. aureus e
da cepa em estudo, inalteradas.
RECOMENDAÇÃO
Não utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem não produzir beta hemolisina.
Não tocar as estrias da semeadura das cepas, para não dar um resultado falso – negativo.
Não utilizar placas de Ágar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, já que é baseada na
hemólise das cepas.
CALDO BASE DE MOELLER
PRINCÍPIO
As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com o
grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Essa reação, conhecida como
descarboxilação, origina dióxido de carbono como produto secundário.
Emprega-se normalmente três aminoácidos para identificação dos microrganismos: lisina, ornitina
e arginina. A base de Moeller é a mais utilizada. Os produtos aminados específicos, são:

Mod IV - 27
- Lisina: Cadaverina;
- Ornitina: Putrescina;
- Arginina: Citrulina.
A conversão da arginina em citrulina é uma atividade de diidrolase, e não descarboxilase, na
qual o grupo NH2 é retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina é
convertida em ornitina, que sofre descarboxilação para formar putrescina.
A incubação deve ser em anaerobiose e para isso, é adicionado 1 ml de óleo mineral estéril após a
inoculação. No início da incubação, a glicose contida no meio é fermentada e ocorre viragem de
cor púrpura para o amarelo. Quando o aminoácido é descarboxilado, as aminas alcalinas formadas
revertem a cor do meio para púrpura original.
UTILIDADE
Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificação.
Utilizado principalmente para identificações de enterobactérias, bacilos Gram negativos não
fermentadores, estafilococos.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase.
Aminoácidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou DL arginina.
PROCEDIMENTOS
Preparar os meios com a Base de Moeller e aminoácidos;
Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminoácidos, que será usada como controle;
Seguir as recomendações do fabricante para pesar o meio Base de Moeller;
Se usar aminoácido L (levógiro), adicionar 1 grama do aminoácido para cada 100 ml de meio
base;
Se usar aminoácido DL (dextrógiro), adicionar 2 gramas do aminoácido para cada 100 ml de
meio base;
Homogeneizar bem o meio;
Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N ;
Distribuir 2 ml por tubo (usar tubos de rosca);
Positivo:
‫ـ‬ Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Enterobacter aerogenes ATCC 13047.
‫ـ‬ Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Serratia marcescens ATCC 13880.
‫ـ‬ Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Enterobacter sakazakii.
Negativo:
‫ـ‬ Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC 8454.
‫ـ‬ Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Citrobacter freundii ATCC 8454.
‫ـ‬ Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047 ou Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Conservar entre 4 a 10 ºC por 3 meses.
INOCULAÇÃO
A partir de crescimento recente, inocular a colônia em estudo no tubo contendo o aminoácido e
no tubo controle;
Colocar aproximadamente 1 ml de óleo mineral estéril em cada tubo;
Incubar à 35 +/- 1ºC em aerobiose.
INTERPRETAÇÃO

Mod IV - 28
Cor original do meio: púrpura
Positivo:
‫ـ‬ Tubo controle (sem aminoácido) : amarelo e turvo - indica que o microrganismo é viável e o
pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase.
‫ـ‬ Tubo com aminoácido: púrpura e turvo- indica a formação de aminas a partir da reação de
descarboxilação.
Negativo:
‫ـ‬ Tubos controle e com aminoácido: púrpura.
RECOMENDAÇÕES
Verificar se o inóculo foi satisfatório para o crescimento, pois a cor original do meio - púrpura, sem
apresentar turvação não significa positividade e sim, ausência de crescimento bacteriano.
Como a reação ocorre em anaerobiose, é imprescindível a adição de óleo mineral.
Pode-se autoclavar o meio já com o óleo mineral ou adicionar após a inoculação do
microrganismo.
Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos não fermentadores, é necessário um
período de incubação prolongado (24 a 72 horas).
ÁGAR DNASE
PRINCÍPIO
Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestável. Estas enzimas
hidrolisam ácido desoxirribonucléico (DNA) contido no meio de cultura após um período de
incubação. Posteriormente este meio é acidificado com HCl 1N para a revelação da prova.
UTILIDADE
Prova de identificação que separa os principais microrganismos de importância clínica, entre eles:
DNase positivos: Staphylococcus aureus , Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas
maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis.
DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactérias, demais bacilos
Gram negativos não fermentadores.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: DNase Ágar.
PROCEDIMENTOS
Pode-se revelar a prova de duas maneiras:
Com uma solução de ácido clorídrico 1 N
Adicionando à base do meio de cultura azul de Toluidina O.
Para a revelação com ácido clorídrico 1N:
‫ـ‬ Preparar e esterilizar o meio conforme instruções do fabricante;
‫ـ‬ Esfriar o meio à aproximadamente 50ºC;
‫ـ‬ Distribuir em placas de petri de 50 mm de diâmetro.
Preparar uma solução de HCl 1N, seguindo a fórmula abaixo:
N= C1 (número de equivalentes grama de soluto)
V (volume da solução)

Mod IV - 29
C1 = M1 (peso molecular do soluto)
E (volume da solução)
E = M
x → x: para bases: OH desprendido na reação
para ácidos: H+
ionizáveis
para oxidantes / redutores: variação do NOX
para sais normais: valência do cátion ou ânion
Para a revelação com azul de Toluidina O:
‫ـ‬ Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;
‫ـ‬ Acrescentar para cada 1000 ml de base 0,1g de azul de Toluidina O;
‫ـ‬ Esterilizar em autoclave;
‫ـ‬ Esfriar o meio à aproximadamente 50ºC;
‫ـ‬ Distribuir em placas de petri de 50 mm de diâmetro.
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC 13880.
Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ou Escherichia coli ATCC 25922.
Meio: 4 a 10 ºC por 3 meses.
Ácido Clorídrico 1N:
‫ـ‬ Guardar em frasco âmbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, calor e umidade.
‫ـ‬ Validade: 6 meses.
INOCULAÇÃO
Para as duas técnicas de preparação, a inoculação é a mesma:
Com auxílio de um fio bacteriológico, tocar nas colônias em estudo e fazer um esfregaço circular e
denso na placa de DNase ;
Incubar à 35 +/- 1ºC 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Revelação com HCl 1 N:
Cor original do meio: amarelo claro
Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N até banhar totalmente a superfície do meio;
Aguardar aproximadamente 3 minutos ou até que o meio fique opaco.
Positivo: Presença nítida de halo claro na parte inferior e em volta da colônia.
Negativo: Ausência de halo claro em volta da colônia.
revelação com azul de toluidina o:
Cor original do meio: azul claro
Positivo: Presença de coloração rosa na parte inferior e em volta da colônia.
Negativo: Ausência de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.
RECOMENDAÇÕES
Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova;
Em uma mesma placa, pode-se fazer até 4 testes (placas de 50 mm de diâmetro);
armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N pode dar leituras falso
negativas;
Para a detecção da atividade de DNase não é necessário que haja crescimento, por isso é que a
semeadura deve ser de forma circular densa e não de estria;

Mod IV - 30
Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um período maior de
incubação (até 48 horas) para produzirem DNase;
Usar cultura jovem (até 24 horas).
ÁGAR ESCULINA
PRINCÍPIO
Verifica se a bactéria é capaz de hidrolisar a esculina.
A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto.
UTILIDADE
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores;
Para identificação de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com bílis, vide prova de Bile-
Esculina.
FÓRMULA /PRODUTO
Ágar tríptico de soja (TSA) ou base de ágar sangue 4 g
Citrato férrico 0,05 g
Esculina 0,1 g
PROCEDIMENTOS
Pesar o TSA ou a base de ágar sangue, o citrato férrico e a esculina e colocar tudo no mesmo
Erlenmeyer;
Colocar água destilada;
Ajustar o pH para 7,0;
Aquecer lentamente até fundir o ágar e dissolver o citrato férrico (lentamente porque o citrato
férrico demora a dissolver);
Distribuir 3 ml do meio em tubos com tampa de rosca;
Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfície
em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
INOCULAÇÃO
Inocular colônias de crescimento recente (18 – 24 hs);
Picar o meio e semear na superfície do ágar;
Incubar a 35 °C por 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: palha.
Positivo: marrom escuro ou preto.
Negativo: inalterado (palha).
Conservar de 4 a 8°C, de 6 a 8 semanas.
Após este período realizar controle negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAÇÕES

Mod IV - 31
A enzima glicosidase é responsável pela hidrólise da esculina em todas as enterobactérias exceto
a Escherichia coli. A Escherichia coli não possue a enzima glicosidase sendo necessário usar a
lactose, outro dissacarídeo ou outra fonte de carbono. Fazer um inóculo leve com agulha
bacteriológica e interpretar após 18-24 horas.
A produção de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o meio, isso não é uma
reação positiva.
Resultado falso positivo pode ocorrer pela produção de H²S em não fermentadores, semelhante ao
bacilo da bactéria Shewanella putrefaciens.
ÁGAR FENILALANINA
PRINCÍPIO
Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação
enzimática.
UTILIDADE
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Ágar Fenilalanina
Solução de cloreto férrico:
Cloreto férrico 10 g
Adicionar 100 ml de água destilada
Colocar em frasco âmbar.
Validade: 6 meses
A solução de cloreto férrico 10% é utilizada para revelar a atividade da enzima fenilalanina
desaminase no meio de fenilalanina.
PROCEDIMENTOS
Aquecer sob constante agitação até fundir o meio;
em forma de bico de flauta (ângulo 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 8427 ou Proteus mirabilis ATCC 12453.
INOCULAÇÃO
Fazer um inóculo denso;
Inocular colônia pura de 18 a 24 horas;
Incubar a 35°C por 18 a 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Adicionar diretamente o cloreto férrico no tubo inoculado, antes da interpretação do resultado e
distribuir o reagente sobre a superfície do meio.

Mod IV - 32
Positivo: formação de uma coloração esverdeada na superfície do meio após a adição do cloreto
férrico.
Negativo: o meio permanece inalterado.
Conservar de 4 a 8°C, de seis a oito semanas.
RECOMENDAÇÕES
Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente após a adição do reagente, pois a cor
verde desbota rapidamente. A interpretação deve ser feita em até 5 minutos.
CTA – CYSTINE TRYTICASE AGAR
PRINCÍPIO
CTA é um meio semi-sólido, recomendado para o estudo de fermentação de carboidratos de
microrganismos exigentes.
UTILIDADE
Usado para diferenciar espécies de Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e
Corynebacterium spp.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial Cystine Tryticase agar Medium.
Carboidratos mais utilizados: glicose, maltose, lactose, sacarose, frutose, mannose.
Carboidrato 10 g
pH: 7,3 +/- 0,2
PROCEDIMENTOS
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtração e reservar;
Pesar o CTA conforme instruções do fabricante, acrescentar 900 ml de água e homogeneizar bem;
Esfriar a base a aproximadamente 50ºC;
Adicionar o carboidrato esterilizado por filtração;
Distribuir em 3 ml por tubo;
Deixar os tubos esfriar na posição vertical.
POSITIVO NEGATIVO
Glicose
Maltose
Lactose
Sacarose
Frutose
Manose
Neisseria sicca
Neisseria sicca
Neisseria lactamica
Neisseria sicca
Neisseria sicca
Haemophilus parainfluenzae
Neisseria sicca
Haemophilus influenzae
Temperatura ambiente por 3 meses.

Mod IV - 33
INOCULAÇÃO
Fazer um inóculo bem denso, no centro do meio;
Incubar à 35ºC em jarra com vela acesa e gaze embebida em água de torneira para manter a
umidade da atmosfera.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: alaranjado
Positivo: cor amarela, indicando acidificação (fermentação) do meio e turvação.
Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem
turvação.
RECOMENDAÇÕES
Para provas negativas, incubar um período maior (72 horas);
Não autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato;
Fazer inóculo denso, pois inóculos fracos podem dar resultado falso negativo.
CALDO TRIPTONA E SIM
PRINCÍPIO
Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano é um
aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias resultando na produção de indol, após a
adição de reagentes de Erlich ou Kovacs.
UTILIDADE
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.
FÓRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Caldo Triptona.
Meio comercial: SIM (sulfato/indol/motilidade ágar).
Reativo Erlich
Paradimetilaminobenzaldeído 1 g
Álcool etílico (95%) 95 ml
Guardar em frasco âmbar em temperatura ambiente (22-25°C).
Cor original do reativo de Erlich: amarelo
Ou
Reativo de Kovacs (pode ser adquirido comercialmente pronto para uso) ou ser preparado no
laboratório:
Álcool isoamílico 150 ml
Paradimetilaminobenzaldeído 10,0 g
Dissolver o aldeído em álcool e adicionar lentamente o ácido clorídrico;
Guardar em frasco âmbar e no refrigerador quando não estiver em uso.
Obs: Não conservar em temperatura ambiente por longo período a cor pode ser alterada de
amarelo palha para marrom, perdendo assim a sensibilidade.
Xilol : pode ser adquirido comercialmente pronto para uso.

Mod IV - 34
PROCEDIMENTOS
Meio Caldo Triptona
Aquecer sob agitação, até fundir o meio;
Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca;
Retirar os tubos da autoclave;
Deixar esfriar em temperatura ambiente na posição vertical.
Meio SIM
Deixar solidificar em temperatura ambiente na posição vertical.
Controle qualidade para meio Caldo Triptona:
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922.
Negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Controle qualidade para meio SIM:
Microrganismo H2S INDOL MOTILIDADE
Proteus vulgaris + + +
Shigella sonnei neg neg neg
Escherichia coli neg + +
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922
INOCULAÇÃO
Meio Caldo Triptona
Fazer um inóculo leve com colônia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactérias, bacilos
Gram negativos não fermentadores ou anaeróbios);
Fazer um inóculo denso com colônia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus);
Incubar a 35°C por 24 horas (enterobactérias) ou até 48 horas (bacilos Gram negativos não
fermentadores ou anaeróbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente.
Meio SIM
Com o auxílio da agulha, inocular uma colônia no meio na posição vertical, lentamente até a base;
Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inóculo;
Incubar a 35°C por 18-24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio:
Após incubação, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs.
A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferência dos Gram negativos
não fermentadores ou anaeróbios, que podem produzir mínima quantidade de indol.
Revelação com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona
Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e
aguardar 1 minuto;
Adicionar pela parede do tubo 0,5 ml do reativo de Erlich e realizar a leitura.

Mod IV - 35
Indol positivo: aparecerá um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol.
Indol negativo: permanecerá um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol.
Revelação com reativo de Kovacs no meio SIM
Realizar a leitura da motilidade e do H²S.
Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o
crescimento bacteriano.
Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.
‫ـ‬ Motilidade positiva: microrganismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no meio
causando turbidez.
‫ـ‬ Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inóculo, em
volta continua límpido.
‫ـ‬ H²S positivo: ao longo da linha de inoculação aparecerá a cor negra.
‫ـ‬ H²S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada.
‫ـ‬ Indol positivo aparecerá um anel vermelho.
‫ـ‬ Indol for negativo aparecerá um anel amarelo.
Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8°C.
Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8°C em tubos com tampas de rosca, tubos com tampão
de algodão o meio pode ressecar antes deste prazo.
RECOMENDAÇÕES
Um ótimo pH para triptofanase é levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH ácido pode baixar a
produção do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco.
Cultura para ser testada produção de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tensão de
oxigênio baixa a produção de indol.
Indol positivo se perde após 96 horas de incubação.
Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produção,
podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espécies de
Clostridium spp.
Pequenas modificações podem ser necessárias para testar a produção de indol em não
fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilização de um meio enriquecido, como o
meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extração com xilol e revelação com
reagente de Ehrlich.
Na extração de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a
diluição do indol tornando-o fraco positivo ou negativo.
Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella
corrodens, necessitam de inóculo denso no caldo de triptona, incubação de 48 horas, extração
com xilol e revelação com reagente de Ehrlich.
CALDO MALONATO
PRINCÍPIO
Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sódio como única fonte de
carbono, resultando em alcalinização do meio.
UTILIDADE
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

Mod IV - 36
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Malonato.
PROCEDIMENTOS
Ajustar o pH 6,7 ± 0,2;
INOCULAÇÃO
Inocular colônias puras de 18 a 24 horas;
Inóculo leve;
Incubar a 35°C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: verde.
Positivo: azul.
Negativo: inalterado (verde).
Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas.
Após este período realizar controle positivo e negativo semanalmente.
RECOMENDAÇÕES
Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentação da glicose aumenta
a acidez.
Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinização, dificultando a
interpretação. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inóculo para comparação, junto
com o teste em questão, se não aparecer nenhum traço azul, incubar por mais 24 horas, liberando
o resultado negativo após incubação de 48 horas.
Cuidado ao interpretar resultados após incubação prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado)
pode parecer uma reação fraca positivo podendo ser ignorado.
CALDO NITRATO
PRINCÍPIO
Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO³) a nitrito (NO²) ou gás
nitrogênio (N²) (denitrificação).
UTILIDADE
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, anaeróbios, Haemophilus,
Neisseria e Mycobacterium.
FÓRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Caldo Nitrato.
Reagentes para revelação da reação.

Mod IV - 37
Solução A
Ácido sulfanílico 0,8 g
Ácido acético 5N 100 ml
Solução B
N,N-dimetil-l-naftilamina 0,6 g
Ácido acético 5N* 100 ml
* Ácido acético 5N
Ácido acético glacial 40 ml
Zinco em pó (pronto para uso)
PROCEDIMENTOS
Caldo nitrato
Acertar o pH 7,0;
Distribuir 3 ml do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido;
Deixar o tubo esfriar na posição vertical
Reagentes para revelação da reação.
Solução A
‫ـ‬ Dissolver o ácido sulfanílico em uma parte do ácido e depois completar com o restante do
ácido acético q.s.p. 100 ml.
Solução B
‫ـ‬ Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do ácido e completar o restante do ácido
acético q.s.p. 100 ml.
Resultado Cepa Resultado esperado
Nitrato reduzido a nitrito Enterobactérias Coloração vermelha
Nitrato a gás Pseudomonas aeruginosa Bolhas no tubo de Durhan
Nitrato não reduzido Acinetobacter baumannii Coloração vermelha somente
após adição de pó de zinco
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ATCC
INOCULAÇÃO
Fazer um inóculo denso, com colônias recentes (18 – 24 horas) no meio com alça bacteriológica;
Não agitar o tubo após inoculação;
Incubar 35±1°C por 24 a 48 horas, sendo necessário algumas vezes até 5 dias;
Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os reagentes para revelar a
reação;
Verificar a presença de bolhas dentro do tubo de Durhan.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: incolor a palha.
Verificar se há bolhas de gás dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactéria reduziu
nitrato a gás = denitrificação.
Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se houver desenvolvimento
de cor vermelho tijolo significa que a bactéria reduziu nitrato a nitrito.
Se após a adição dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar uma pitada de pó de
zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactéria não
reduziu nitrato a nitrito e o nitrato ainda permanece no meio.

Mod IV - 38
IMPORTANTE: algumas bactérias não conseguem reduzir nitrato a nitrito e só conseguem reduzir
nitrito, como por exemplo alcaligenes faecalis e oligella uretralis, havendo a necessidade de utilizar
o caldo nitrito para este fim.
RESULTADO REAGENTES A e B PÓ DE ZINCO GÁS NO TUBO DE DURHAN
reduziu + não houve reação não houve reação
nitrato a
nitrito
não reduziu neg pos neg
nitrato a
nitrito
nitrato neg neg +
reduzido
a gás
Caldo nitrato: conservar o meio de 4 a 8°C por até 6 meses.
Soluções A e B: guardar em frasco escuro na geladeira (4 a 8°C) por até 12 meses.
Ácido acético 5N: Conservar de 4 a 8°C por até 12 meses.
RECOMENDAÇÕES
Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar resultado falso positivo,
devido à alta sensibilidade do teste.
Quando for adicionado o pó de zinco, não colocar em excesso, pode resultar em falso negativo
(incolor).
MEIO BASE PARA OXIDAÇÃO E FERMENTAÇÃO - OF
PRINCÍPIO
Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou
fermentativa.
UTILIDADE
Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar
carboidratos.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio base de OF
Carboidratos (dextrose ou glicose, lactose, sacarose, xilose, maltose, manitol etc).
Vaselina líquida estéril.
PROCEDIMENTOS
Aquecer o meio até dissolver todo o ágar;
Separar volumes iguais em diferentes Beckers, dependendo do número de carboidratos que serão
preparados;
Adicionar 1g do carboidrato para cada 100 ml de meio base e homogeneizar;
Distribuir 2 ml em tubos com tampa de rosca;
Esterilizar em vapor fluente por 20 minutos (deixar a válvula de pressão da autoclave aberta e,
quando estiver saindo bastante vapor, começar marcar o tempo. Vapor fluente só pode ser feito

Mod IV - 39
em autoclave com tampas reguláveis para saída de vapor. Autoclaves horizontais não possuem
controle de saída de vapor, são automáticas);
Pode-se também esterilizar a base e adicionar os açúcares esterilizados por filtração em filtros
Millipore 0,45 µm (90 ml de base autoclavada e 10 ml de açúcar (esterilizado por filtração);
Deixar esfriar a temperatura ambiente na posição vertical.
Resultado Cepa Resultado esperado
OF-GLICOSE Oxidador Pseudomonas aeruginosa A-amarelo, F-inalterado
Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F- amarelo
Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F- inalterado
OF-FRUTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia A-amarelo, F-inalterado
Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F-inalterado
OF-LACTOSE Oxidador Burkolderia cepacia A-amarelo, F-inalterado
Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F-amarelo
OF-MALTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia A-amarelo, F-inalterado
OF-MANITOL Oxidador Burkolderia cepacia A-amarelo, F-inalterado
OF-SACAROSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia A-amarelo, F-inalterado
Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F-inalterado
OF-XILOSE Oxidador Burkolderia cepacia A-amarelo, F-inalterado
A= tubo aberto; F= tubo fechado com vaselina líquida
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
* Alcaligenes faecalis ATCC 8750 ou Moraxella catarrhalis ATCC 25238
INOCULAÇÃO
Inocular densamente até o fundo do tubo com a agulha bacteriológica, colônias provenientes de
uma placa de crescimento de 18 a 24 hs.;
Inocular dois tubos, em um dos tubos acrescentar 1,0 ml de vaselina líquida estéril, no outro tubo
não colocar vaselina;
Incubar á temperatura de 35°C por 48 horas ou mais;
Se resultado negativo, pode ser necessário até 4 dias, excepcionalmente 14 dias, observando
diariamente.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: verde
Oxidador: tubo aberto - desenvolvimento de cor amarela
tubo fechado - inalterado (verde)
Fermentador: tubo aberto e fechado - desenvolvimento de cor amarela
Assacarolítico: tubo aberto e fechado - inalterado (verde)
RECOMENDAÇÕES
Sempre antes de interpretar a reação verificar se há crescimento nos tubos, porque algumas
bactérias não crescem no meio OF, sendo necessário enriquecimento do meio, acrescentando 2 %
de soro de coelho ou cavalo.
Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto.

Mod IV - 40
ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO
PRINCÍPIO
Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol
para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de
sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo).
A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O
ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada.
Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo. A porção inclinada ou
bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior,
denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia.
Quando se prepara o meio, é importante que o bico e a profundidade tenham o comprimento igual
ao redor de 3 cm cada um, de modo que o efeito das duas câmaras seja conservado.
UTILIDADE
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato
de hidrogênio e gás.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: TSI (tríplice açúcar ferro).
PROCEDIMENTOS
Pesar o TSI conforme instruções do fabricante;
em forma de bico de flauta (ângulo de 45°).
Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Microrganismo ATCC Superfície Base H²S
Escherichia coli 25922 Ácido Ácido, gás neg
Shigella flexneri 12022 Alcalino Ácido neg
Edwardsiella tarda 15947 Alcalino Ácido +
Pseudomonas aeruginosa 27853 Alcalino Alcalino +
INOCULAÇÃO
Semear por picada até o fundo e na superfície do meio;
Incubar 24 hs a 35°C, com a tampa semi aberta.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente.
Leitura: entre 18 e 24hs.
Cor púrpura = alcalino.
Cor amarelo = ácido.
Reações ápice/base:
Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos).
Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares).

Mod IV - 41
Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado.
H²S positivo = presença de precipitado negro.
ÁPICE BASE H²S GÁS INTERPRETAÇÃO MAIS PROVÁVEL
Vermelho Vermelho neg neg Sem crescimento = bactéria exigente
Vermelho Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Não fermentador ou Gram (+)
Amarelo Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Gram (+) ou
esquecimento de picar a base
Amarelo Amarelo neg varia Enterobactérias ou Aeromonas Lac (neg)
Amarelo Amarelo + varia Samonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter
Conservar por até 6 meses de 2 a 8°C.
RECOMENDAÇÕES
Quando há produção de H²S significa que a base é sempre ácida.
Não realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas, podendo resultar em falsas reações.
Não utilizar alças bacteriológicas para não fragmentar o meio, ocasionando falsa reação de gás,
utilizar fio bacteriológico.
Qualquer traço de escurecimento no meio deve ser indicado com H²S positivo.
ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN)
PRINCÍPIO
Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela
ação da enzima urease, resultando na alcalinização do meio.
UTILIDADE
Bacilos Gram negativos fermentadores e não fermentadores, Staphylococcus e Haemophilus.
FÓRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Uréia.
Solução de uréia a 40% (40 g uréia + 100 ml de água destilada).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio de uréia conforme instruções do fabricante;
Resfriar até 50°C e adicionar assepticamente 5 ml da solução de uréia a 40% em
95 ml do meio base;
Homogeneizar e distribuir 3 ml do meio assepticamente em tubos estéreis com tampa de rosca;
Inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de bico de flauta
(ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Obs: A solução de uréia a 40% é uma solução hipertônica e o risco de contaminação é baixo,
porém, pode-se esterilizar a solução por filtração (filtro Millipore de 0,45 µm).
Esterilidade: colocar 100% do lote preparado na estufa 35 ±1°C por 24 horas. Se não houver
mudança de cor liberar para uso.

Mod IV - 42
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922
INOCULAÇÃO
Fazer um inóculo denso;
Semear na superfície do meio, não picar a base, pois a base pode servir como controle;
Incubar 35°C de 6 a 24 horas, podendo ser necessário até 6 dias.
INTERPRETAÇÃO
Positivo: alteração do meio para cor de rosa, pink.
Negativo: sem alteração de cor do meio.
Diferentes graus de hidrólise da uréia podem ocorrer:
Tubo inteiro cor pink.
Superfície do tubo cor pink, base não muda de cor.
Fracamente positivo: ápice cor pink, restante do tubo não muda de cor.
Positivo rápido: 1 – 6 horas para Proteus spp.
Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubação. Ex: algumas cepas de Klebsiella,
Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus.
Após este período realizar controle negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAÇÕES
Não aquecer a solução base da uréia, pois a uréia pode se decompor se aquecida.
Não utilizar a uréia de Stuart porque é menos sensível para detectar a presença de urease.
Não deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrólise.

Mod IV - 43
5. FÓRMULAS E PRODUTOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA PROVA DE CATALASE
PRINCÍPIO
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio.
UTILIDADE
Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus,
Bacillus, Moraxella catarrhalis.
FÓRMULA/ PRODUTO
Peróxido de Hidrogênio (H2O2) 3%.
Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
peróxido de hidrogênio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor.
Validade: ver recomendações do fabricante.
INOCULAÇÃO
Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina;
Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de hidrogênio.
INTERPRETAÇÃO
Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão do
H2O2 em água e oxigênio gasoso.
Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.
RECOMENDAÇÕES
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos podem produzir reação fraca de
catalase.
Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, não usar cepas de
Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois são catalase
negativos.
PARA PROVA DE COAGULASE
PRINCÍPIO
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, uma
vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protombrina, capaz de converter o
fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível.
Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada
e coagulase livre.
A coagulase conjugada (prova em lâmina), é também conhecida como fator de aglutinação,
encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos.

Mod IV - 44
Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de
fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.
A coagulase livre (prova em tubo), é uma substância similar à trombina e está presente em
filtrados de cultivos. É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no
plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um complexo que, por
sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos).
Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo
de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação.
UTILIDADE
Separar as espécies de Staphylococcus de importância clínica, S. aureus – coagulase positiva, das
demais espécies – coagulase negativa.
FÓRMULA / PRODUTO
Plasma de coelho com EDTA liofilizado.
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
plasma antes e depois de reconstituído, deve ser mantido refrigerado.
INOCULAÇÃO
Coagulase conjugada:
Traçar dois círculos com lápis de cera em uma lâmina de vidro;
Colocar duas gotas de água destilada ou solução fisiológica estéreis dentro de cada círculo;
Com auxílio de um fio bacteriológico agregar a colônia em estudo, homogeneizando delicadamente
em cada círculo;
Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos círculos;
No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução fisiológica estéreis, como
controle;
Homogeneizar com palito de madeira;
Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e para trás;
Observar presença de aglutinação.
Coagulase livre:
Com auxílio do fio bacteriológico, suspender colônias em estudo em caldo BHI e colocar em
estufa à 37ºC até que turve;
Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala de MacFarland;
Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 ml de plasma reconstituído e 0,5 ml do caldo BHI com
crescimento bacteriano recém turvado;
Incubar em estufa à 35ºC 4 horas;
Verificar se há presença de coágulo;
Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras
com 18 e 24 horas de incubação.

Mod IV - 45
INTERPRETAÇÃO
Coagulase conjugada:
Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos microrganismos da suspensão, após
15 segundos, no círculo que contém o plasma.
Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem presença de precipitado ou aglutinação.
A presença de precipitado ou aglutinação, torna a prova inespecífica, devendo ser repetida a prova
em tubo.
Coagulase livre:
Positiva: presença de qualquer grau de coágulo.
Negativa: ausência de coágulo.
RECOMENDAÇÕES
Para a coagulase em tubo, as provas negativas após 4 horas a 37ºC, os tubos devem ser
mantidos em temperatura ambiente, pois a incubação prolongada a 37ºC podem produzir
fibronolisinas, o que causa dissolução do coágulo durante a incubação.
Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e não agitar, pois a agitação pode desmanchar os
coágulos parcialmente formados.
Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA.
Não utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os
Enterococcus), darão resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos.
Plasma humano não é recomendado, pois contém quantidades variadas de Fator de Reação com a
Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa.
PARA PROVA DE GELATINASE
PRINCÍPIO
Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que
liquefaz/hidrolisa gelatina.
UTILIDADE
Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos
esporulados.
FÓRMULA / PRODUTO
Filme não revelado de Raio X.
Salina 0,9 % estéril ou água destilada estéril.
PROCEDIMENTOS
Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm;
Armazenar em frasco estéril.
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
INOCULAÇÃO
Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 ml de salina 0,9% estéril ou água destilada estéril.;
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazer um inóculo denso da bactéria a ser testada,
adicionar uma fita de raio x. Fazer o inóculo de colônias de crescimento de 18 a 24 horas;

Mod IV - 46
Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estéril ou água destilada estéril e a fita de Raio X,
sem inóculo.
INTERPRETAÇÃO
Positivo: emulsão de gelatina (cor verde) na porção submersa do filme torna-se transparente
(clara).
Negativo: fita permanece verde, emulsão esverdeada permanece na porção submersa do filme.
Fitas: seguir instruções do fabricante.
RECOMENDAÇÕES
Utilizar filme de Raio X não revelado.
PARA PROVA DE LECITINASE
PRINCÍPIO
Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inóculo.
UTILIDADE
Diferenciação de espécies de Bacillus e Clostridium.
FÓRMULA / PRODUTO
Fórmula - meio base:
Gema de ovo de galinha depende do volume de meio base à ser utilizado
Proteose de peptona nº 2 40 g
Fosfato dissódico 5 g
Fosfato de potássio 1 g
Cloreto de sódio 2 g
Sulfato de magnésio 0,1 g
Glicose 2 g
Solução de hemina (5 mg/ ml) 1 ml
Ágar 20 g
pH: 7,6
Solução de gema de ovo à 50%:
Gema de ovo 1 ml
Solução fisiológica estéril 1 ml
PROCEDIMENTOS
Meio base:
Pesar e hidratar todos os componentes, exceto a solução de gema de ovo;
Aquecer em bico de Bunsen até fundir o ágar;
Meio para uso:
Resfriar a 50ºC e adicionar 1 ml da solução de gema de ovo a 50%;
Homogeneizar bem e distribuir em placas de Petri de 90 mm.
Positivo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens ATCC 13124.
Negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium difficile ATCC 9689.

Mod IV - 47
Meio base (para estoque): 4 a 8ºC fechado, durante 6 meses.
Meio para uso: 4 a 8°C, embalado, durante 1 semana.
INOCULAÇÃO
Com auxílio de um fio bacteriológico, tocar nas colônias em estudo e fazer um esfregaço circular e
denso sobre a superfície do meio.
Incubar à 37ºC 24 horas em aerobiose - para cepas de Bacillus spp.;
Incubar à 37ºC 48 horas em anaerobiose - para cepas de Clostridium spp.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: amarelo.
Positivo: formação de halo branco ao redor das colônias.
Negativo: ausência de halo, meio fica inalterado.
RECOMENDAÇÕES
Não usar ovos velhos.
Não usar meio vencido.
PARA PROVA DE OXIDASE
PRINCÍPIO
O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria.
UTILIDADE
Ajuda caracterizar espécies de Neisseria, distingui não fermentadores (oxidase positiva) de
enterobactérias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva
entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.
FÓRMULA / PRODUTO
Reativo para teste de oxidade preparado no laboratório:
‫ـ‬ N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato 1g
Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso).
Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado em papel de filtro.
PROCEDIMENTOS
Reativo para teste de oxidase:
Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Becker e
adicionar 100 ml água destilada, vagarosamente para não oxidar a solução;
Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Becker com o reativo;
Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou;
Colocar o papel na estufa a 35 ±1°C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Becker para
juntar o excesso de reativo;
Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro.
Obs: Não utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das fitas.
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (desenvolvimento de cor roxa).
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 (sem alteração da cor).

Mod IV - 48
INOCULAÇÃO
Com auxílio de um palito de madeira ou plástico, espalhar a colônia a ser testada sobre a fita de
oxidase.
Observar se há formação de cor roxa de imediato.
INTERPRETAÇÃO
Cor original: branca ou levemente azulada
Oxidase positiva: produção de cor roxa imediatamente no local da inoculação da bactéria.
Oxidase negativa: não há mudança da cor do papel no local da inoculação da bactéria.
Não considerar alteração de cor tardia.
Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8°C.
Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas.
RECOMENDAÇÕES
Não fazer o teste de colônias de crescimento de meios que contenham glicose, a fermentação
inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo.
Não fazer teste de oxidase de colônias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD,
EMB).
Não usar alça ou agulha porque pode conter traços de ferro, podendo oxidar a fita e resultar em
falso positivo.
Utilizar colônias de meios não seletivos tais como: ágar sangue e ágar chocolate.
Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade.
Não cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traços de ferro.
PARA FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS
PRINCÍPIO
A fermentação de carboidratos é amplamente utilizada para a diferenciação de gêneros e
identificação de espécies bacterianas.
A prova consiste em verificar a capacidade do microrganismo fermentar ou não um determinado
carboidrato, permitindo assim verificar as suas características que auxiliaram na identificação.
UTILIDADE
Identificar e separar espécies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus
coagulase negativa.
FÓRMULA/ PRODUTO
Produto: Caldo para fermentação de carboidratos.
Carboidratos mais utilizados: arabinose, sorbitol, rafinose, trealose, manitol, entre outros.
Fórmula (base):
BHI caldo 22,5 g Carboidrato 10 g
Indicador * 1 ml Água destilada 200 ml
* Indicador púrpura de bromocresol:
Púrpura de bromocresol 1,6 g
Etanol a 95% 100 ml

Mod IV - 49
PROCEDIMENTOS
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtração e reservar;
Pesar o BHI em béquer, acrescentar a água e homogeneizar bem;
Adicionar o indicador e homogeneizar novamente;
Após esfriar a base, adicionar o carboidrato esterilizado por filtração;
Distribuir 3 ml por tubo.
CARBOIDRATOS POSITIVO NEGATIVO
Arabinose Enterococcus faecium Enterococcus faecalis
Rafinose Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis
Sorbitol Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum
Maltose Staphylococcus epidermidis Staphylococcus schleiferi
Trealose Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus epidermidis
Conservar entre 4 a 10 ºC por 3 meses.
INOCULAÇÃO
Dissolver as colônias no caldo;
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: púrpura
Positivo: Crescimento bacteriano (turvação do meio) com viragem do indicador para amarelo;
Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, púrpura e sem
turvação.
RECOMENDAÇÕES
Para provas negativas, incubar um período maior (48 horas);
Não autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato.
PARA A PROVA DE HIDRÓLISE
PRINCÍPIO
A prova de hidrólise PYR é um teste enzimático que consiste na hidrólise do substrato L-
pyrrolidonyl-alfa-naftylamide por uma enzima bacteriana, a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A
hidrólise do substrato libera β-naphtylamide, que é detectada com a adição do reagente, o N,N-
dimetilaminocinamaldeído, que forma uma base de Schiff, de coloração vermelha.
UTILIDADE
Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de
Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp.
Identificação de algumas espécies Staphylococcus coagulase negativa.
Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
FÓRMULA / PRODUTO
Teste comercial : PYR test
Fórmula - Caldo base de PYR (caldo de Todd-Hewitt):

Mod IV - 50
‫ـ‬ BHI caldo 500 g
‫ـ‬ Neopeptona 20 g
‫ـ‬ Dextrose 2 g
‫ـ‬ Cloreto de sódio 2 g
‫ـ‬ Fosfato dissódico 0,4 g
‫ـ‬ Carbonato de sódio 2,5 g
Para cada 100 ml de caldo base, adicionar 0,01 ml de L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide.
Reagente de PYR comercial: N,N-dimetilaminocinamaldeído a 0,01%
PROCEDIMENTOS
Pesar os componentes em béquer;
Adicionar a água e homogeneizar bem até completa dissolução;
Adicionar o L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide e homogeneizar novamente;
Distribuir 0,2 ml por tubo;
Positivo: Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de Lancefield (S. pyogenes ATCC
19615) ou Enterococcus faecalis ATCC 29212 .
Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae.
Comercial: ver instruções do fabricante
INOCULAÇÃO
Dissolver as colônias no caldo OU;
No caso de usar kits comerciais, com auxílio de uma pinça flambada, colocar um disco impregnado
com o substrato de PYR sobre as colônias em estudo recém isoladas;
Incubar à 37ºC por 4 horas;
Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU;
Retirar o disco e colocar sobre uma lâmina e adicionar 1 gota do reagente PYR.
INTERPRETAÇÃO
Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (após adicionar o reagente de
PYR).
Negativo: Sem alteração de cor (permanece amarela ou alaranjada).
RECOMENDAÇÕES
Para identificações presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se
realmente são cocos Gram positivos/ catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus
spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos
Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas
(como bílis esculina) tratar de enterococo ou não;
Não utilizar colônias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado
falso - negativo;
Não exceder o tempo de leitura.
PARA CRESCIMENTO A 42 E 44°C

Mod IV - 51
PRINCÍPIO
Verificar a capacidade do microrganismo crescer em altas temperaturas.
UTILIDADE
Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo BHI (infusão de cérebro e coração).
Indicador púrpura de bromotimol (1,6 g de do indicador em 100 ml de álcool etílico 95%).
PROCEDIMENTOS
Acrescentar o indicador púrpura de bromotimol (1 ml de indicador em 1000 ml de meio);
Temperatura 42°C: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Temperatura 44°C: Acinetobacter baumannii.
INOCULAÇÃO
Com o auxílio de uma alça ou fio bacteriológico, inocular a colônia a ser testada;
Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas;
Incubar em banho Maria na temperatura a ser testada, 42°C ou 44°C.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: púrpura.
Positivo: presença de turvação e viragem do indicador de cor púrpura para amarelo = crescimento
bacteriano.
Negativo: ausência de turvação e permanência da cor púrpura = ausência de crescimento
bacteriano.
Conservar por até 6 meses de 2 a 8°C.
RECOMENDAÇÕES
Não fazer inóculo muito denso, pode resultar em falsa turvação.
Importante o controle da temperatura do banho, com termômetro de máxima e mínima.
PARA TESTE DE MOTILIDADE
PRINCÍPIO
A bactéria é móvel através do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas
formas de cocos são móveis. A bactéria pode conter um ou muitos flagelos e sua localização varia
com a espécie da bactéria e as condições de cultura.
UTILIDADE
Determinar se o microrganismo é o não móvel;
Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade), MILI (Motilidade, Indol,
Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias;

Mod IV - 52
Meio motilidade em caldo utilizado para não fermentadores e Enterobacter cloacae (em
casos de dúvidas).
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Motilidade
Meio comercial: SIM
Meio comercial: MILI
Meio comercial: MIO
Meio Comercial: BHI (brain heart infusion)
Meio Comercial: Triptona
Solução de Vermelho de Tetrazólio.
PROCEDIMENTOS
Meio Motilidade:
Retirar os tubos da autoclave.
Meio Motilidade com adição da solução de Vermelho de Tetrazólio:
Adicionar 0,1 ml para cada 100 ml de base de solução de vermelho de tetrazólio 0,1% e
homogeneizar bem;
Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampa de rosca;
Meio SIM /Meio MILI/Meio MIO
Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampa de rosca;
Retirar os tubos da autoclave.
Caldo BHI (motilidade em caldo)
Deixar esfriar em temperatura ambiente.
Meio Caldo Triptona
Deixar esfriar em temperatura ambiente.
Meio Motilidade:
Meio SIM:

Mod IV - 53
Microrganismo H²S Indol Motilidade
Proteus vulgaris
Shigella sonnei
Escherichia coli
+
neg
neg
+
neg
+
+
neg
+
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922
Meio MIO:
Microrganismo Motilidade Indol Ornitina
Escherichia coli
Enterobacter aerogenes
+
neg
neg
+
neg
+
+
neg
+
Eschericha coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Meio MILI:
Microrganismo Crescimento Lisina Motilidade Indol
E. coli denso + + neg
K. pneum. denso + neg neg
P. alcalifaciens denso neg + neg
S. enteritidis denso + + neg
S. flexneri denso neg neg neg
E.coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Providencia alcalifaciens ATCC 9886, Salmonella enteritidis
ATCC 13076, Shigella flexneri ATCC 12022
Meio BHI/Caldo Triptona:
Negativo: meio sem inocular.
INOCULAÇÃO
Meio Motilidade / Meio SIM / Meio MILI / Meio MIO
Com o auxílio de um fio bacteriológico inocular uma colônia pura de 18 – 24 horas, no meio na
posição vertical, lentamente até a base;
Afastar a agulha seguindo a linha inicial da incubação;
Incubar a 35°C por 18-24 horas.
Meio Caldo BHI / Meio Caldo Triptona
Com o auxílio de uma alça ou fio bacteriológico, inocular colônia pura de 18 a 24 horas;
Incubar a 35±2°C por 24 a 48 horas.
INTERPRETAÇÃO
Meio de Motilidade:
Motilidade positiva: organismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no meio,
causando turbidez.
Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha de inóculo, em
volta continua límpido.
Meio de Motilidade com Tetrazólio:
Motilidade positiva: organismos móveis produzem uma nuvem cor pink e difundem-se
completamente no meio.
Motilidade negativa: há crescimento da bactéria e produção de cor vermelho claro na linha do
inóculo e em volta do meio continua límpido.
Se resultado for negativo incubar a 21-25°C por até 5 dias.
Revelação com reativo de Kovacs no meio SIM:
Realizar a leitura da motilidade e do H2S.

Mod IV - 54
Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o
crescimento bacteriano. Agitar otubo suavemente e proceder a leitura do indol.
‫ـ‬ Motilidade positiva: microrganismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no
meio causando turbidez;
‫ـ‬ Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inóculo, em
volta continua límpido;
‫ـ‬ H²S positivo: ao longo da linha de inoculação aparecerá a cor negra;
‫ـ‬ H²S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada;
‫ـ‬ Indol positivo aparecerá um anel vermelho;
‫ـ‬ Indol negativo permanecerá um anel amarelo (cor original do reativo de Kovacs);
Meio MILI
Interpretar as reações da motilidade e lisina antes da adição do reagente de Kovacs para detecção
do indol.
‫ـ‬ Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inóculo.
‫ـ‬ Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inóculo.
‫ـ‬ Lisina decarboxilase positiva: indicado pela cor púrpura no meio (essa cor pode variar de
intensa ou mais leve, de acordo com a redução do indicador).
‫ـ‬ Lisina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela do meio.
‫ـ‬ Indol positivo: indicado pela formação de cor pink/vermelho, após a adição de 3 a 4 gotas de
reagente de Kovacs na superfície do meio e agitação suave no tubo.
‫ـ‬ Indol negativo: reação negativa é indicada pelo desenvolvimento de cor amarela.
Meio MIO
Interpretar as reações da motilidade e ornitina antes da adição do reagente de Kovacs para
detecção do indol.
‫ـ‬ Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inóculo.
‫ـ‬ Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inóculo.
‫ـ‬ Ornitina decarboxilase positiva: indicado pela cor púrpura no meio.
‫ـ‬ Ornitina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela no meio.
‫ـ‬ Indol positivo: indicado pela formação de cor pink/vermelho, após a adição de 3 a 4 gotas de
reagente de Kovacs na superfície do meio e agitação suave no tubo.
‫ـ‬ Indol negativo: reação negativa é indicada pelo aparecimento da cor amarela.
Meio caldo BHI/ Meio Caldo Triptona
Colocar uma gota do meio entre lâmina e lamínula e observar ao microscópio com objetiva de 40
X. A motilidade verdadeira deve ser diferenciada do movimento “browniano”, verificando que o
microrganismo se desloca em várias direções.
‫ـ‬ Motilidade positiva: bactérias se movendo de um lado para outro.
‫ـ‬ Motilidade negativa: bactéria apresenta somente movimento “browniano”.
Meios motilidade, SIM, MILI, MIO e BHI: conservar de 4 a 8° C por até 6 meses.
RECOMENDAÇÕES
A temperatura de incubação é extremamente crítica, porque muitos microrganismos são móveis a
15-25°C e não móveis a 37°C. Se houver suspeita que o microrganismo pode exibir motilidade em
baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, incubando um a 35°C e outro a
temperatura ambiente 22-25°C.
Uso do sal de tetrazólio no meio de motilidade é desejável, mas pode inibir certos microrganismos
fastidiosos.

Mod IV - 55
Flagelo é o órgão locomotor e é composto de proteína, essa proteína pode se desnaturar com
excesso de calor. Por isso cultura testada em temperaturas acima do indicado para o teste de
motilidade pode fornecer um resultado falso negativo.
Flagelo pode ser destruído também sob agitação violenta do tubo de cultura da bactéria, podendo
produzir um resultado de motilidade fraco positivo ou falso negativo.
Microrganismos mantidos em estoques de cultura em meios artificiais por longos períodos tendem
a perdem sua motilidade.
Os testes de motilidade em aneróbios são difíceis de serem interpretados, sendo significativos
apenas os resultados positivos.
PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5%
PRINCÍPIO
A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns
microrganismos crescerem em presença do sal.
Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo
de muitas bactérias. Este meio normalmente contém 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentração
para 6,5 %, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos.
UTILIDADE
Separa Enterococcus spp., que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são
NaCl 6,5% negativos.
Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
FÓRMULA / PRODUTO
Não há meio pronto para uso.
Fórmula:
BHI caldo 25 g
NaCl 60 g
Indicador * 1 ml
Glicose 1 g
* Indicador púrpura de bromocresol:
Púrpura de bromocresol 1,6 g
Etanol a 95% 100 ml
Observação: o uso de indicador é opcional.
PROCEDIMENTOS
Pesar o BHI, o NaCl e a glicose em um béquer;
Adicionar a água e homogeneizar bem até completa dissolução;
Adicionar o indicador e homogeneizar novamente;
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Enterococcus faecium
Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

Mod IV - 56
INOCULAÇÃO
Dissolver as colônias no caldo;
Incubar.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: amarelo.
Positivo: Crescimento bacteriano (turvação do meio) com ou sem viragem do indicador.
Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, púrpura e sem
turvação.
RECOMENDAÇÕES
Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48
horas);
Verificar a quantidade de NaCl contido na fórmula do meio de BHI, pois a concentração poderá ser
outra, dependendo do fabricante do meio, e a concentração final do meio de NaCl a 6,5 % poderá
ser superior ou inferior à concentração desejada;
Não carregar no inóculo, pois o excesso poderá ser interpretado como crescimento e dar
resultados falso - positivos (para os meios utilizados sem o indicador);
Antes da leitura, agitar delicadamente o tubo, pois pode haver sedimentação das células
bacterianas formadas;
Os Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e
ocasionalmente os Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de Lancefield (S. pyogenes)
podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificação destas
espécies.

Mod IV - 57
6. DISCOS PARA IDENTIFICAÇÃO
BACITRACINA
PRINCÍPIO
Streptococcus beta hemolítico do grupo A são sensíveis a concentrações baixas de bacitracina.
UTILIDADE
Identificação presuntiva de Streptococcus beta hemolítico do grupo A (S. pyogenes).
PRODUTO
Discos de bacitracina de 0,04 unidades/ disco.
Positivo (Sensível): Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
Manter à 4ºC.
INOCULAÇÃO
À partir de caldo BHI ou TSB recém turvado, semear na superfície do meio Mueller hinton sangue,
com auxílio do "swab";
Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente;
Incubar à 35ºC 18 a 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Positivo (Sensível): Presença de qualquer halo ao redor do disco.
Negativo (Resistente): ausência de halo ao redor do disco.
RECOMENDAÇÕES
Streptococcus alfa hemolíticos são sensíveis a baixas concentrações de bacitracina.
Não existem dados disponíveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibição.
O inóculo bacteriano deve ser confluente, inóculo muito diluído pode permitir que os Streptococcus
não pertencentes ao grupo A pareçam sensíveis à bacitracina.
NOVOBIOCINA
PRINCÍPIO
Separa espécies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensíveis ou não a
Novobiocina.
UTILIDADE
Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente) das demais cepas de
Staphylococcus coagulase negativa de importância clínica; Staphylococcus saprophyticcus é a
única espécie isolada em humanos como causadora de infecções urinárias.

Mod IV - 58
FÓRMULA / PRODUTO
Discos de Novobiocina de 5 µg.
Positivo: Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305.
Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
Refrigerado.
INOCULAÇÃO
Preparar uma suspensão do microrganismo em estudo com crescimento recente (até 24 horas)
em caldo BHI, TSA ou solução fisiológica estéril, acertando a turvação na escala 0,5 de
MacFarland;
Com auxílio de um "swab", semear na superfície de uma placa de Ágar Mueller Hinton;
Com uma pinça previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina na superfície do meio e
pressionar delicadamente;
Incubar.
INTERPRETAÇÃO
Resistente: Ausência de halo de inibição ou halos <= 15 mm.
Sensível: Presença de halo de inibição igual ou superior a 16 mm.
RECOMENDAÇÕES
Não usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas) para fazer a suspensão;
Se necessário usar cepas velhas, semear em caldo BHI ou TSA e incubar à 37ºC até turvar,
acertar a turvação na escala 0,5 de MacFarland para fazer o teste;
Cepas isoladas de outros materiais biológicos que não urina, fazer identificação complementar
com fermentação de açúcares para confirmar espécie.
OPTOQUINA
PRINCÍPIO
Cloridrato de etil-hidroxicupreína (optoquina), um derivado da quinina, inibe de forma seletiva o
crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentrações muito baixas (5 µg/ ml ou
menores).
As células do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido à variação da
tensão superficial, e é produzida uma área de inibição.
UTILIDADE
Separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolíticos.
FÓRMULA / PRODUTO
Discos de optoquina de 5 µg
Positivo (Sensível): Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
Negativo(Resistente): Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Mod IV - 59
Manter à 4ºC.
INOCULAÇÃO
À partir de caldo BHI ou TSB recém turvado, semear na superfície do meio Mueller hinton sangue,
com auxílio do "swab";
Colocar um disco de optoquina e pressionar levemente;
Incubar à 35ºC 18 a 24 horas em jarra com vela acesa ou estufa com 5 a 7 de CO2.
INTERPRETAÇÃO
Positivo (Sensível):
Disco de 6 mm: halo de inibição de 14 mm ou mais.
Disco de 10 mm: halo de inibição de 16 mm ou mais.
Negativo (Resistente):
Disco de 6 mm: halo de inibição inferior à 14 mm ou ausência de halo.
Disco de 10 mm: halo de inibição inferior à 16 mm ouausência de halo.
RECOMENDAÇÕES
A optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentrações muito
elevadas.

Mod IV - 60
7. MEIOS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
HTM – HAEMOPHILUS TEST MÉDIUM
PRINCÍPIO
É um meio suplementado que permite o crescimento das espécies mais exigentes de
Haemophilus, pois contém em sua fórmula suplementos à base de NAD e cisteína.
UTILIDADE
Meio padronizado pelo NCCLS para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos de
Haemophilus influenzae.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial HTM
Suplemento VX: NAD (Coenzima I) e cisteína.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante em um balão de fundo chato;
Resfriar o meio a 50°C e adicionar o suplemento previamente reidratado;
Distribuir 50 a 60 ml em placas estéreis de 150 mm (o meio deve ficar com uma espessura
homogênea de 3 a 4 mm);
Deixar esfriar à temperatura ambiente.
Crescimento:
Preparar uma suspensão de Haemophilus influenzae ATCC 10211 na escala 0,5 de Mac Farland;
Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de solução fisiológica);
Semear 0,01 ml da suspensão na placa;
Incubar a placa 35 ±2°C por 24 horas em estufa com 5% de CO².
Se a bactéria crescer em 24 horas, liberar o lote para uso.
Obs: A aprovação final do meio deve ser feita após os testes com antibióticos, uma vez que inúmeras
variáveis como níveis de timina, timidina só podem ser verificadas após o teste com os antibióticos ter
sido realizado.
INOCULAÇÃO
Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac
Farland;
Embeber o “swab” na suspensão, comprimí-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e
semear na placa;
Acrescentar os discos a serem testados;
Incubar a placa de acordo com instruções do NCCLS para a bactéria a ser testada.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: castanho escuro.
A zona do diâmetro é particular para cada droga e organismo, sendo comparado com diâmetros
padronizados pelo NCCLS, que determina cada organismo sendo sensível, intermediário ou
resistente.

Mod IV - 61
ÁGAR MUELLER HINTON
PRINCÍPIO
Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das
principais bactérias.
UTILIDADE
Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos
métodos de difusão em disco e E-test para enterobactérias, não fermentadores, Staphylococcus,
Enterococcus sp.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Ágar Muller Hinton.
PROCEDIMENTOS
Acertar o pH (7,2 – 7,4);
Retirar da autoclave e medir novamente o pH;
Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm;.
Deixar esfriar em temperatura ambiente;
Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira (4 a 8°C).
Obs: É extremamente importante que o meio tenha espessura homogênea de 3 a 4 mm.
Crescimento:
Preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland;
Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de solução fisiológica);
Semear 0,01 ml da suspensão na placa. Incubar a placa 35°C por 24 horas.
variáveis como níveis de timina, timidina, de cálcio e magnésio só podem ser verificadas após o teste
com os antibióticos ter sido realizado.
INOCULAÇÃO
Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala
0,5 Mac Farland;
semear na placa;
INTERPRETAÇÃO
padronizados pelo NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensível, intermediário ou
resistente.
RECOMENDAÇÕES
Principais variáveis que podem interferir no resultado do antibiograma:

Mod IV - 62
Níveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentrações levam a diminuição na atividade de aminoglicosídeos
diante de Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactérias.
Concentrações diminuídas levam a resultados contrários.
Concentração de timidina ou timina: concentrações em excesso levam à falsa resistência para
sulfonamidas e trimetropima.
pH: em pH baixo vamos observar halos de inibição reduzidos para aminoglicosídeos, quinolonas,
macrolídeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibióticos (penicilina e
tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores.
Espessura do meio: < de 3 mm leva à falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva à falsa resistência.
ÁGAR MUELLER HINTON SANGUE
PRINCÍPIO
Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das
principais bactérias.
UTILIDADE
Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos
métodos de difusão em disco e E-test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos
beta-hemolíticos dos grupos A,B,C e G conforme instruções do NCCLS.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Ágar Muller Hinton.
Sangue de carneiro desfibrinado.
PROCEDIMENTOS
Acertar o pH (7,2 – 7,4);
Retirar da autoclave e resfriar a 50°C;
Adicionar 50 ml de sangue de carneiro desfibrinado por litro de meio de cultura de forma
asséptica;
Homogeneizar bem sem formar espuma;
Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm;
Deixar esfriar em temperatura ambiente;
Obs: É extremamente importante que o meio tenha espessura homogênea de 3 a 4 mm.
Crescimento:
Preparar uma suspensão de Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 na escala 0,5 de Mac Farland;
Diluir 1:100 (0,1 ml em 9,9 ml de solução fisiológica);
Semear 0,01 ml da suspensão na placa;
Incubar a placa 35°C por 20 a 24 horas com 5% de CO².
Se a bactéria crescer em 24 horas, o lote está pronto para uso.
variáveis como níveis de timina, timidina, de cálcio e magnésio só podem ser verificadas após o teste
com os antibióticos ter sido realizado.
INOCULAÇÃO
Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac
Farland;
semear na placa;

Mod IV - 63
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: vermelho.
do NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensível, intermediário ou resistente.
RECOMENDAÇÕES
Principais variáveis que podem interferir no resultado do antibiograma:
Níveis de Ca2+
, Mg2+
: altas concentrações levam a diminuição na atividade de tetraciclinas para
todas as bactérias. Concentrações diminuídas levam a resultados contrários.
Concentração de timidina ou timina: concentrações em excesso levam à falsa resistência para
sulfonamidas e trimetropima.
pH: em pH baixo vamos observar halos de inibição reduzidos para quinolonas, macrolídeos e
lincosaminas e halos aumentados para outros antibióticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento
do pH leva a resultados opostos aos anteriores.
Espessura do meio: < de 3 mm leva à falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva à falsa resistência.

Mod IV - 64
1. Balows A., Hausler, W.J. Jr., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D. and Shadomy, H.J. Manual of
clinical microbiology. 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991.
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Ed., United States of America, 1988.
3. Becton Dickinson and Company. Product catalog for microbiology 1996/ 1997, Canada,
1997.
4. Becton Dickinson and Company. DIFCO manual. 10th. Ed. Detroit, 1984.
5. Konemen, E.W. Trad. Cury, A.E. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5a. Ed.,
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6. Larone, D.H. Medically Important Fungi: a guide to identification. 3rd. Ed., Washington,
American Society for Microbiology, 1994.
7. Mc Faddin, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Ed. William & Wilkins
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Microbiologia Clínica, Sarvier, São Paulo, 2000.
12. Oxoid. Manual Oxoid. Espanã, Unipath España, 1995.

Detecção e Identificação
de Bactérias de
Importância Médica
Módulo V

ÍNDICE
1. Estafilococos, estreptococos, enterococos e outros cocos gram positivos ........................................ 1
Introdução..............................................................................................................................................1
Identificação preliminar............................................................................................................................1
Identificação de estafilococos....................................................................................................................3
Identificação dos staphylococcus aureus.....................................................................................................4
Identificação dos estreptococos.................................................................................................................5
2. Neisserias......................................................................................................................................... 9
Introdução..............................................................................................................................................9
Isolamento ...........................................................................................................................................10
Transporte e semeadura do material........................................................................................................11
Bacterioscopia e identificação..................................................................................................................11
3. Enterobactérias .............................................................................................................................. 14
introdução ............................................................................................................................................14
tipos de testes utilizados para identificação...............................................................................................15
etapas da identificação de enterobactérias................................................................................................18
identificação das enterobactérias de importância clínica .............................................................................19
identificação sorológica ..........................................................................................................................27
4. Bastonetes não fermentadores....................................................................................................... 31
Introdução............................................................................................................................................31
Semeadura, leitura e interpretação das provas de identificação...................................................................31
Procedimentos para a identificação ..........................................................................................................33
5. Bacilos curvos ou espiralados......................................................................................................... 41
Introdução............................................................................................................................................41
Campylobacter......................................................................................................................................42
Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas...........................................................................................................43
6. Bacilos gram positivos.................................................................................................................... 45
Introdução............................................................................................................................................45
Corineformes ........................................................................................................................................46
Bacilos gram positivo .............................................................................................................................50
Bacilos esporulados aeróbios e anaeróbios facultativos...............................................................................52
Actinomicetos .......................................................................................................................................54
7. Fastidiosos ..................................................................................................................................... 56
Introdução............................................................................................................................................56
Bartonella.............................................................................................................................................58
Bordetella.............................................................................................................................................59
Brucella................................................................................................................................................60
Francisella tularensis..............................................................................................................................61
Haemophylus........................................................................................................................................62
Legionella.............................................................................................................................................64
Pasteurella ...........................................................................................................................................65
Actinobacillus........................................................................................................................................66
Capnocytophaga....................................................................................................................................68
Eikenella ..............................................................................................................................................68
Kingella................................................................................................................................................68
Cardiobacterium hominis ........................................................................................................................69
Chromobacterium violaceum...................................................................................................................69
Streptobacillus moniliformis....................................................................................................................70
8. Bactérias anaeróbias estritas ......................................................................................................... 71
Introdução............................................................................................................................................71
Coleta de material .................................................................................................................................73
Transporte do material...........................................................................................................................73
Processamento do material.....................................................................................................................73
Identificação bacteriana .........................................................................................................................74
Provas de sensibilidade a antimicrobianos.................................................................................................77
9. Interpretação de Resultados e laudos ............................................................................................ 78
Introdução............................................................................................................................................78
Laudo para o trato respiratório superior ...................................................................................................79
Laudo para escarro................................................................................................................................81
Laudo para secreção endotraqueal, lavado traqueal, e lavado brônquico ......................................................81
Laudo para lavado brocoalveolar ou escovado brônquico ............................................................................82
Laudo para pleural.................................................................................................................................84
Laudo para abscesso pulmonar ...............................................................................................................84
Laudo para ocular..................................................................................................................................84
Laudo para líquido céfalo raquidiano (LCR) ...............................................................................................85
Laudo para fezes ...................................................................................................................................85
Laudo para pele, abscessos e feridas .......................................................................................................86
Laudo para genital.................................................................................................................................88
Laudo para urina ...................................................................................................................................89
Laudo para sangue ................................................................................................................................92
10. Referências Bibliográficas .............................................................................................................. 93

Mod V - 1
1. ESTAFILOCOCOS, ESTREPTOCOCOS, ENTEROCOCOS E OUTROS
COCOS GRAM POSITIVOS
INTRODUÇÃO
Os Estafilococos são as bactérias não esporuladas que mais resistem no meio ambiente. Podem
sobreviver por meses em amostras clínicas secas, são relativamente resistentes ao calor e podem
tolerar uma concentração aumentada de sal. No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da
melhora das condições sanitárias e das medidas de controle de infecção hospitalar, este
microrganismo continua a ser um dos mais importantes patógenos para o homem. Indivíduos sadios
são colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentação, e podem
albergar o microrganismo na nasofaringe, ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir
destes sítios, o S. aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos
inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infecções letais por
conta dos fatores de virulência ou através de resistência aos antimicrobianos atualmente utilizados.
Já foram descritos no Brasil casos de infecções causadas por Staphylococcus aureus parcialmente
resistentes aos antibióticos mais potentes como a Vancomicina, e relatos da capacidade que os
Staphylococcus coagulase negativa tem de desenvolver resistência. Assim há necessidade de uma
identificação rápida e eficiente de todos os casos em que estes microrganismos se apresentam.
Os estreptococos foram os maiores causadores de infecção hospitalar na era pré-antibiótica, causando
surtos de infecção e morte de puérperas. Apesar de não serem atualmente uma importante causa de
infecção hospitalar, provocam, no entanto, doenças muito graves e muitas vezes letais, mesmo em
pacientes imunocompetentes, sendo importante o rápido diagnóstico deste agente.
Já os enterococos apresentam importância crescente como causadores de infecção hospitalar, pelo
aparecimento de resistência quase total aos antibióticos tradicionalmente utilizados para tratamento
destas infecções.
Os Enterococos mais comumente isolados são: Enterococcus faecalis (90% dos casos) e Enterococcus
faecium, com grande capacidade de colonização de pacientes e de contaminarem superfícies ou
equipamentos utilizados em hospitais. Possuem sensibilidade ou resistência variável aos antibióticos
chamados glicopeptídios como a vancomicina e teicoplanina. Existem, atualmente, cepas comensais
naturalmente resistentes a vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porém não
sendo ainda capazes de causarem surtos, mas que devem ser corretamente identificadas.
IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR
A identificação dos estreptococos e estafilococos é baseada na morfologia que apresentam em meios
líquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em
forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados.
A identificação presuntiva começa com a inoculação primária na placa de ágar sangue de carneiro que
deve ser incubada em 5% de tensão de CO² (método da vela ou estufa de CO2). As colônias de
estafilococos são geralmente maiores, convexas, de coloração variando do branco-porcelana a
amarelo podendo apresentar hemólise ou não. Note-se que o desenvolvimento da cor amarelada no S.
aureus ocorre somente após incubação prolongada (72 h), à temperatura ambiente. As colônias de
estreptococos tendem a serem menores (puntiformes), e com halos de hemólise total ou parcial (beta
e alfa hemólise). A diferenciação entre os estreptococos e os estafilococos se dá, seguramente, pela
prova da catalase.
PROVA DA CATALASE
Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se
em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar
a formação de bolhas. Para a família Microccocacea (estafilococos) a prova é geralmente positiva,
enquanto que para a família Streptococcacea (estreptococos) é negativa.

Mod V - 2
Divisão dos cocos Gram positivo pela prova da catalase
Catalase positivos Catalase negativos
Staphylococcus spp. Enterococcus spp.
Micrococcus spp. Streptococcus spp.
Planococcus spp. Aerococcus spp.
Stomatococcus spp. Gemella spp., Leuconostoc spp.
Lactococcus spp., Stomatococcus spp.
Ao coletar a colônia, não carregar meio de cultura (ágar sangue), que pode acarretar resultados falso-
positivos porque o sangue do meio contém catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa
reação positiva (fazer Gram e ver disposição em cadeias curtas ou aos pares).
Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica
Gênero Catalase Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio
estrito
Tétrade
Staphylococcus + neg + neg não variável
Planococcus + + + neg + variável
Micrococcus + neg + + variável variável
Enterococcus neg variável + neg não não
Streptococcus neg neg variável neg não não
Aerococcus neg neg + neg não +
Stomatococcus * variável neg neg neg não variável
* aderente ao meio
Cocos Gram positivo, Catalase negativa, Motilidade Negativa 1
Gênero NaCl 6,5% Vancomicina PYR Bile Esculina Tétrade
Enterococcus + variável + + não
Streptococcus neg sensível neg 2
neg 3
não
Aerococcus + sensível variável variável variável
Leuconostoc variável resistente neg variável não
Pediococcus variável resistente neg + variável
Gemella neg sensível + neg não
Stomatococcus neg sensível + + variável
1
E. casseliflavus e E. gallinarum são positivos
2
S. pyogenes é positivo
3
alguns S. viridans podem ser positivos

Mod V - 3
IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS
O teste mais importante na identificação da família Micrococcaceae é a prova da catalase, e esta
família é composta de quatro gêneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus. O
gênero Staphylococcus apresenta 32 espécies, 14 subnegespécies, sendo que somente 15 espécies
são encontradas em amostras humanas, e de uma maneira prática, os estafilococos são divididos em
duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da
plasmo coagulase.
Provas diferenciais dos generos Catalase positivos
Gênero Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio
estrito
Tétrade
Staphylococcus neg + neg não variável
Planococcus + + neg + variável
Micrococcus neg + + + +
Stomatococcus neg neg neg não variável
Identificação das espécies de Staphylococcus de maior importância clínica
Espécie DNAse PYR Novob. Uréia Polimixina Outras
S. aureus + neg sensível variável resistente pig. amarelo
S. epidermidis neg neg sensível + resistente
S. lugdunensis neg + sensível variável variável omitina +
S. haemolyticus neg + sensível neg sensível omitina neg
S. saprophyticus neg neg resistente + sensível isolado em urina
S. schleiferi neg + sensível neg sensível Sacarose neg
S. intermedius + + sensível + sensível
S. hyicus + neg sensível variável resistente
Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais
freqüentes são:
Staphylococcus epidermidis - causador de infecções de cateteres e próteses e o mais freqüente
microrganismo encontrado em hemoculturas.
Staphylococcus saprophyticus - causador de infecção urinária em mulheres jovens.
Staphylococcus haemolyticus - importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos, e
por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue
de carneiro.
TESTE DA RESISTÊNCIA A NOVOBIOCINA
A cepa é semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de
um disco teste de novobiocina contendo 5 µg. As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6
a 12 mm, enquanto as susceptíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus
saprophyticus são resistentes.

Mod V - 4
Testes da Trealose, Urease e Novobiocina
Espécies Trealose Urease Novobiocina
S. epidermidis Negativa Positiva Sensível
S. haemolyticus Positiva Negativa Sensível
S. saprophyticus Positiva Positiva Resistente
IDENTIFICAÇÃO DOS STAPHYLOCOCCUS AUREUS
A forma mais simples de identifica o Staphylococcus aureus é a prova da coagulase que pode ser
efetuada em tubo ou em lamina.
TESTE DA COAGULASE EM LÂMINA
A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante)
“clumping factor” na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando a
coagulação do mesmo.
Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina;
Emulsionar uma colônia isolada a ser testada;
Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plástico ou madeira;
Observar se há aglutinação em 10 segundos;
Não se pode executar este teste a partir de um ágar com grande concentração de sal como ágar
manitol.
TESTE DA COAGULASE EM TUBO
Este teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático formando um
complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a fibrina. O teste é melhor efetuado se:
Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a um tubo de ensaio
com 0,5 ml de plasma;
Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria;
A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus da
vertical.
Um método alternativo é a emulsificação desta mesma colônia suspeita em um 0,5 plasma e incubado
da mesma forma. Qualquer coágulo indica uma prova positiva, porém não confundir com precipitados
ou floculação. O melhor plasma a ser usado é o de coelho com EDTA, não devendo ser usado o plasma
humano vindo do banco de sangue.
TESTE DA DNASE
Este teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) obtido
comercialmente.
Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%; o meio adquire uma
coloração azul intensa;
Incubar a 35°C por 24 horas;
• Uma coloração rósea característica ao redor das colônias produtoras de DNAse indica a
positividade da prova.

Mod V - 5
O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da
amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne à placa
original onde nem sempre as colônias estão bem isoladas.
TESTE DA ENDONUCLEASE
Teste da endonuclease termoestável é efetuado no mesmo meio de DNA.
Fever o caldo de cultura com a bactéria suspeita por 15 minutos;
Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colônia suspeita;
Fazer pequenos orifícios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante;
A leitura do teste é semelhante ao da DNAse.
Note que este método pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em que foi observado o
crescimento de cocos Gram positivos agrupados.
OUTRAS PROVAS QUE DIFERENCIAM O STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Aglutinação em látex ou em hemácias de carneiro (sorologia). Estes testes geralmente detectam a
coagulase livre e alguns apresentam também uma imunoglobulina antiproteína A presente da parede
do Staphylococcus aureus. Como são disponíveis comercialmente, deve-se seguir as instruções do
fabricante.
TESTE DO CRESCIMENTO EM ÁGAR MANITOL
O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de
cloreto de sódio, denominado ágar manitol salgado ou Meio de Chapman. O indicador de pH é o
vermelho de fenol, que indica uma reação positiva quando o meio ao redor das colônias se torna
amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.
IDENTIFICAÇÃO DE OUTROS GÊNEROS
A diferenciação entre Micrococcus sp e os Staphylococcus sp se dá pela coloração de Gram, em que os
Micrococcus aparecem em tétrades, ou pela pigmentação de suas colônias (amarelas, róseas ou
alaranjadas). Alguns não apresentam pigmentos e podem ser diferenciados pela sensibilidade a
Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificação de Streptococcus pyogenes, mas utilizando-
se a inoculação em ágar Mueller Hinton.
IDENTIFICAÇÃO DOS ESTREPTOCOCOS
Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue após
incubação a 35°C em presença de 5% de CO2, podendo apresentar: hemólise total (beta), parcial
(alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama).
A identificação de espécie de estreptococos beta hemolíticos é feita através de aglutinação com soros
específicos contra os antígenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rápida,
porém não acessível a todos os laboratórios em virtude do elevado custo.
TESTE DA BACITRACINA
É importante notar que as identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 ou os
resultados podem ser conflitantes.
Semear meia placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um
antibiograma;
Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado;
Incubar por uma noite a 35ºC sem CO2;
Observar qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade.
O Streptococcus pyogenes (grupo A) é assim rapidamente identificado.

Mod V - 6
TESTE DO SULFAMETOXAZOL TRIMETOPRIM (SXT)
Adicionar na mesma placa de ágar sangue o disco de SXT;
Incubar por uma noite a 35°C sem CO2.
A sensibilidade a esta droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo não
pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield.
Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI à direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim à
esquerda.
Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme desenho abaixo.
TESTE DE CAMP (NA MESMA PLACA)
Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina
(ATCC 25923) no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de
carneiro. (Esta linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque)
Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de
inoculação da amostra teste de estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando a 1 mm de
distância, e deste modo várias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de ágar
sangue. A maneira de inocular é fundamental para a observação do efeito esperado.
Incubar a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas.
A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada pelo alargamento da
zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na área de intersecção entre
as duas estrias.
TESTE DO PYR
Este teste determina a atividade do PYR também chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima
produzida pelo Streptococcus pyogenes e também pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colônias
puras para o teste, pois podem surgir resultados errôneos. Seguir as instruções do fabricante, uma
vez que se encontra disponível comercialmente.
Esse teste é tecnicamente, equivalente à prova da hidrólise da bile esculina e crescimento em 6,5%
de NaCl, usados na identificação clássica dos enterococos, e mais específico que o teste da Bacitracina
na caracterização presuntiva dos estreptococos beta hemolíticos do grupo “A”, tendo a vantagem de
ser mais rápido.
Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes
duvidosos. Na impossibilidade da realização de testes sorológicos de confirmação, reforçar o valor dos
testes presuntivos clássicos de identificação do Streptococcus pyogenes.
TESTE DA BILE ESCULINA E DO NACL 6,5%
Semear as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5%;
Incubar da mesma forma;
Teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve
mostrar turvação para ser considerado positivo.
1 - Disco de bacitracina
2 - Disco de sulfametoxazol trimetoprim
3 - Camp Test
Linhas verticais –
cepas teste
Linha horizontal –
estria com cepa beta hemolítica de
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

Mod V - 7
Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja
Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D não enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste
da tolerância ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos são positivos.
Identificação de estreptococos beta hemolíticos
Identificação Sensibilidade a
Bacitracina
CAMP /Hidrólise
de hipurato
Sensibilidade
a SXT
Bile Esculina e
Tolerância a
NaCl 6,5%
S. pyogenes sensível negativo negativo negativos
S. agalactiae resistente positivo negativo negativos
Enterococcus sp resistente negativo negativo positivos
Estreptococo
Não A, B ou D.
resistente negativo positivo negativos
TESTE DA HIDRÓLISE DO HIPURATO
Os Streptococcus agalactiae (grupo B) são também capazes de hidrolisar o hipurato em seus
componentes: glicina e ácido benzóico. Identificação presuntiva dos estreptococos beta hemolíticos do
grupo A, B e D.
IDENTIFICAÇÃO DOS ESTREPTOCOCOS NÃO BETA HEMOLÍTICOS
Somente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e D (Enterococcus spp. e
Streptococcus bovis) podem não apresentar nenhuma hemólise, a denominada gama hemólise.
Identificação de estreptococos gama hemolíticos ou sem hemólise
Identificação CAMP /Hidrólise de
hipurato
Bile Esculina Tolerância a NaCl
6,5%
Streptococcus agalactiae positivo negativo negativo
Enterococo negativo positivo positivo
S. bovis negativo positivo negativo
IDENTIFICAÇÃO DOS ESTREPTOCOCOS ALFA HEMOLÍTICOS
A identificação deste grupo não deve ser feita por métodos sorológicos, pois a maioria não possui os
antígenos de Lancefield.
Identificação dos estreptococos alfa hemolíticos
Identificação Optoquina Bile esculina Tolerância 6,5% a
e Bile solubilidade NaCl
Pneumococo positivo negativo negativo
Enterococos negativo positivo positivo
Grupo viridans negativo negativo negativo
Streptococcus bovis negativo positivo negativo

Mod V - 8
TESTE DA OPTOQUINA
Semear um quarto de uma placa de ágar sangue com a cepa alfa hemolítica a ser testada;
Aplicar um disco de optoquina;
Incubar a 35o
C em tensão aumentada de CO2 - método da vela;
Uma zona de inibição de 14 mm ou mais à volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e
identifica o Streptococcus pneumoniae.
TESTE DA BILE SOLUBILIDADE
O teste da bile solubilidade também identifica o Streptococcus pneumoniae. Pode ser executado em
placa ou em caldo.
Placa:
Tomar um caldo turvo após 3 horas de incubação a 35°C;
Inocular uma suspensão de desoxicolato a 10%;
• Clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo à prova.
Caldo:
Inocular gotas de desoxicolato de Sódio a 2% sobre as colônias suspeitas;
Incubar a 35°C por 30 minutos;
As colônias positivas irão desaparecer por lise bacteriana.
Suspeitar da presença de “variante nutricional de Streptococcus” destes microrganismos quando o
Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias
que não crescem no subcultivo em ágar sangue.
Semear o repique em ágar sangue;
Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a
identificação presuntiva de Haemophilus influenzae;
Incubar a 35°C em atmosfera com CO2.
Identificação dos enterococos mais importantes clinicamente
Espécie Arabinos Sorbitol Crescimento
Telurito 0,04%
Motilidade Pigmento Vancomicina
E. faecalis negativo positivo positivo negativa negativo variável (s)
E. faecium positivo variável negativo negativa negativo variável
E. casseliflavus positivo variável negativo positiva positivo resistente
E. gallinarum positivo negativo negativo positiva negativo resistente

Mod V - 9
2. NEISSERIAS
INTRODUÇÃO
As espécies de Neisseria tem como característica morfológica serem diplococos Gram negativos mais
achatadas nas laterais, dando a forma de rins ou dois grãos de feijão unidos por uma ponte. Apenas a
espécie N. elongata difere desta morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo.
Todas neisserias são oxidase positivas e catalase positivas, exceto Neisseria elongata e Kingella
denitrificans. Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e não fermentativa, sendo baixa a acidez,
de modo que podem acontecer reações duvidosas com o meio CTA (Cistyne Tripticase Agar) com
indicador vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina.
As diferentes espécies de neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, são analisadas junto
com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp., Acinetobacter spp., Kingella spp e Alcaligenes spp. pelas
características morfológicas de serem cocos ou cocóides ao Gram e pela possibilidade de haver
confusão na sua identificação.
Quanto a sua importância clínica, a maioria das neisserias é comensal vivendo em mucosas de
humanos e animais.
Diagnóstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gram negativo
Bactéria Morfol. OXI CAT OF Gli CTA
Gli
DNAse AS MOT
Neisseria meningitidis diplococo + + não cresce + neg + neg
Neisseria gonorrhoeae diplococo + + não cresce + neg neg neg
Neisseria spp. diplococo/
bacilo
+ variável variável
(oxidativo)
variável neg + neg
Moraxella catharralis diplococo + + inerte neg + + neg
Kingella spp. cocobacilo + neg fermentador + neg + variável
Moraxella spp. cocobacilo + + inerte neg neg + neg
Acinetobacter spp. cocobacilo neg + variável
(oxidativo)
variável neg + neg
Alcaligenes faecalis Cocobacilo
/ bacilo
+ + inerte neg neg + +
OXI = oxidase CAT=catalase OFGli=OF Glicose CTAGli= utilização da glicose em base ágar cistina tripticase
AS = cescimento em Ágar Sangue MOT = motilidade
CARACTERÍSTICAS DE ALGUMAS ESPÉCIES DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Neisseria
gonorrhoeae
É sempre considerada patogênica, de transmissão sexual ou pelo parto e indicativa de
tratamento. No homem causa uretrite, sendo até 50% assintomática e está relacionada a
complicações como epididimite, prostatite e estenose uretral. Na mulher causa corrimento
vaginal, endocervicite, uretrite, abscesso vestibular, salpingonegooforite e doença inflamatória
pélvica. Pode ser isolada também na mucosa oral e anal, e em récem-nascidos pode causar
uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum. A doença sistêmica disseminada pode
ocorrer em 1 a 3% dos pacientes infectados, principalmente em assintomáticos e caracterizada
por febre, tremores, lesões cutâneas, artrite de extremidades. As lesões cutâneas são do tipo
máculo-pustulares ou hemorrágicas, com centro de necrose. Raramente ocorre artrite séptica
com 50% de positividade de isolamento. Pode ocorrer meningite e endocardite.
Neisseria
meningitidis
Pode causar meningite, infecção sistêmica grave com coagulação intravascular disseminada
(CIVD) e elevada mortalidade, podendo causar em associação outras infecções (conjuntivite,
artrite, sinusite e pneumonia). Em mucosas pode ser isolada em portadores sãos em 5 a 15 %
dos indivíduos e por períodos de semanas a meses. A transmissão se faz por vias aéreas.

Mod V - 10
Moraxella
(Branhamella)
catarrhalis
Potencial patógeno de vias aéreas, principalmente em crianças e adultos jovens. Causa com
maior freqüencia otite, sinusite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite e
meningite. Em idosos, após o Haemophylus influenzae e o Pneumococo, constitui a terceira
causa de pneumonia em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica. Em adultos
raramente é isolada em pacientes assintomáticos. Cerca de 80% das cepas são produtoras de
beta-lactamase, e são detectadas através do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromogênica).
Outras espécies de Neisseria raramente são isoladas em casos de endocardite
ISOLAMENTO
NEISSERIA GONORRHOEAE
Material clínico para isolamento (escolha depende dos sintomas):
Uretral
Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas)
Retal (colher secreção mucosa e não fezes, utilizando meio
seletivo tipo Thayer Martin)
Orofaringe
Conjuntiva
Glândula de Bartholin
Trompas
Endométrio
Líquido sinovial
Lesões de pele
Sangue
Recomenda-se:
Utilizar swab com algodão atóxico ou swab de Rayon ou Dacron.
Semear o mais rápido possível nos meios sólidos, e usar placas aquecidas préviamente em estufa.
Urina pode ser utilizada, após centrifugação rápida e semeadura do sedimento.
Em meio seletivo, deve-se, no entanto, preferir outros materiais com maior chance de isolamento.
Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS que é inibidor para as N. Gonorrhoeae (Ex:
Caldo BHI com 1% de gelatina).
Em lesões de pele preferir a biópsia que o swab.
Incubar em jarra com umidade e vela.
Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram.
NEISSERIA MENINGITIDIS
Materiais clínicos para isolamento, de acordo com aspectos clínicos:
LCR
Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anti-
coagulante)
Aspirado de petéquias
Sufusões hemorrágicas ou biópsias
Liquído sinovial
Swab de conjuntiva
Aspirado traqueal, ou transtraqueal
ou escarro
Swab de nasofaringe (preferível a swab
de orofaringe)
MORAXELLA (BRANHAMELLA) CATARRHALIS
Material clínico adequado para isolamento de acordo com o quadro clínico:
Otite média
Timpanocentese (miringotomia) quando indicado. Secreção colhida com
swab em geral revela flora contaminante, exceto se rompimento
expontâneo muito recente e sem uso prévio de antimicrobianos.
Sinusite Aspirado de seios da face comprometidos, quando indicado.
Infecções do
trato respiratório
inferior/pneumonia
Escarro, aspirado traqueal, transtraqueal podem ser úteis ou BAL, quando
indicado e comparados com bacterioscopia.

Mod V - 11
TRANSPORTE E SEMEADURA DO MATERIAL
O ideal é semear imediatamente após a coleta em meio sólido, levar para a estufa 36o
C em jarra com
vela ou com gerador de CO2 e umidade. O uso de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser
considerada uma alternativa de risco. Para M. catarrhalis, os meios de transporte são adequados.
NEISSERIA GONORRHOEAE
É sensível a variações de temperatura acima de 37o
C ou abaixo de 35o
C, de modo que a amostra
não pode ser refrigerada.
Recomenda-se ágar chocolate enriquecido com suplemento com l-cisteína, NAD e vitaminas
(Isovitalex ou similar), embora seja possível obter crescimento de algumas cepas em ágar sangue.
Incubar em jarra com umidade (bola de algodão e água estéril) e CO2 (jarra com vela ou gerador
de CO2).
Secreção retal, swab de orofaringe, ou outros materiais com maior microbiota contaminante ou
menor expectativa de isolamento, semear, além do meio rico, em meio seletivo como Thayer
Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).
NEISSERIA MENINGITIDIS
É um pouco mais tolerante a variações de temperatura, mas recomenda-se para transporte
ambientes com CO2.
Cresce bem em ágar sangue, mas por precaução, deve-se semear também em ágar chocolate.
Incubar em jarra com umidade (bola de algodão e agua estéril) e CO2 (jarra com vela ou gerador
de CO2).
Materiais com maior flora contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, além do
meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).
Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactérias, a maioria das outras espécies
de Neisserias (7,5 µg/ml de colistina), Gram positivos (Vancomicina 3 µg/ml) e fungos (13,5 µg/ml
de nistatina); e contém suplementos para suportar crescimento das Neisserias meningitidis e N.
gonorrhoeae.
MORAXELLA CATHARRALIS
Tolera temperatura ambiente e cresce bem em ágar sangue.
Material estéril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, biópsia, conjuntiva, nasofaringe).
Pode usar meio não seletivo
BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAÇÃO
A partir das amostras genitais, LCR, biópsia, etc., deve-se sempre reservar material para a
bacterioscopia, fazendo o esfregaço no momento da coleta, ou colhendo dois swabs, ou material
suficiente para a semeadura e bacterioscopia.
Quando o swab é único, no caso das Neisserias dá-se preferência à semeadura imediata e
posteriormente:
- Ressuspender o swab em 1 ml de salina;
- Agitar no Vortex;
- Centrifugar;
- Fazer um esfregaço do sedimento.
Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presença ou ausência de
diplococos Gram negativos com características de neisserias em:
- raros (+)
- poucos (++)
- moderados (+++)
- muitos (++++)
Descrever se os microrganismos são extra-celulares ou intra-celulares e quantidade de neutrófilos
e de células epiteliais.

Mod V - 12
É importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do paciente, como
quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual é fundamental o isolamento e
identificação completa, considerando que neisserias saprófitas ou mesmo Acinetobacter spp.
podem ser diagnosticados erroneamente como N. gonorrhoeae.
IDENTIFICAÇÃO
As N. gonorrhoeae crescem em ágar chocolate formando colônias pequenas, sendo em geral menores
que as de neisserias saprófitas. A cor pode variar de cinza a amarelo. A colônia da M. catarrhalis é de
cor cinza róseo-acinzentado, sendo comumente friável, saindo inteira quando removida com a alça
bacteriológica. As colônias de N. meningitidis A e C capsuladas apresentam mucóides.
Testes imunológicos não substituem a cultura e a bacterioscopia, e para o diagnóstico da gonorréia
existem no comércio recursos do tipo ELISA, sondas genéticas de acido nucléico, PCR e suas
variantes, de elevado custo e indicado em levantamentos epidemiológicos, ou quando não se dispõe
dos recursos tradicionais.
Para LCR e outros fluídos estéreis e mesmo urina, a caracterização de Neisseria meningitidis pode ser
feita pela técnica de aglutinação com partículas de látex que é rápida, com boa sensibilidade,
especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. O teste pode ser
positivo nos casos de cultura negativa por uso prévio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo
elevado. Para o tipo B alguns produtos oferecem testes para afastar reação cruzada com E. coli. A
reação negativa não exclui o diagnóstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a
bacterioscopia e a cultura.
BACTERIOLOGIA
A identificação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser feita em dois níveis: presuntivo e
confirmatório. Em serviços de Saúde Pública (DST) onde a prevalência da gonorréia é significativa,
para fins práticos de tratamento pode-se fazer o diagnóstico utilizando-se aspectos clínicos associados
à bacterioscopia positiva (Diplococos Gram negativos intra-celulares) em pacientes de risco. Deve-se,
no entanto, sempre colher material para cultura, possibilitando a confirmação e monitoramento da
resistência destas bactérias.
Na ocorrência de surtos de meningite meningocócica, o diagnóstico presuntivo para fins de
tratamento, também pode basear-se na clínica e na bacterioscopia do LCR ou de lesões (petéquias e
púrpuras). As culturas devem sempre ser colhidas para confirmação, identificação de sorotipo e
sensibilidade aos antimicrobianos através dos seguintes procedimentos:
Fazer bacterioscopia das colonias isoladas para confirmar a presença de diplococos Gram
negativos com forma de dois feijões.
Fazer o teste de oxidase das colonias sugestivas.
Deve-se procurar afastar outros gêneros de bactérias como Acinetobacter spp., Kingella spp. e
Moraxella spp. que são morfologicamente parecidos. Um recurso prático para evitar erros de
identificação de Acinetobacter spp. e Kingella spp. como Neisserias é:
- Semear o agente suspeito em ágar chocolate.
- Colocar um disco de penicilina de 10 ui.
- Após 24h fazer um gram das colônias que crescerem próximas a zona de inibição.
- Se permanecerem cocóides com aspecto de neisserias confirma-se o isolamento; caso tenham
adquirido a forma de bacilos longos, o isolado não é de Neisseria.
Outro passo importante é verificar a capacidade de crescimento em meios pobres como o ágar
nutriente ou a necessidade de crescimento em meio rico (ágar chocolate suplementado).
A identificação das espécies de neisseria baseia-se na utilização de açúcares: glicose, maltose,
lactose, sacarose e frutose. Como as neisserias utilizam carboidratos por via oxidativa, a base
Ágar Cistina Tripticase (CTA) adicionada de 1% de cada um dos açucares e com indicador
vermelho de fenol tem sido utilizado. No entanto, reações duvidosas podem ocorrer, por falha na
detecção da acidez produzida pela bacteria, dificultando a identificação. Recomenda-se enviar a
cepa isolada rapidamente ao Laboratório de Referência para confirmação.

Mod V - 13
Provas de rotina para diferenciar Neisserias patogênicas
Bactéria AC 22o
C A. Nut.
35o
C
DNAse GLI MAL LAC SAC FRU
N. gonorrhoeae neg neg neg + neg neg neg neg
N. meningitidis neg v neg + + neg neg neg
Outras neisserias + + neg variável variável variável variável variável
M. catharralis + + + neg neg neg neg neg
Kingella spp. v + neg + neg neg neg neg
AC = crescimento em ágar chocolate a 22o
C A. Nut. = crescimento em ágar nutriente a 35o
C
GLI = glicose MAL = maltose LAC = lactose SAC = sacarose FRU = frutose

Mod V - 14
3. ENTEROBACTÉRIAS
INTRODUÇÃO
É a maior e mais heterogênea família de bactérias Gram negativas de importância médica. São
considerados atualmente: 27 gêneros / 102 espécies / 08 grupos indefinidos. Independente da
complexidade, mais de 95% das amostras implicadas em caso clínicos são colocadas em 25 espécies,
sendo possivel o isolamento de enterobactérias de qualquer amostra clínica.
CARACTERIZAÇÃO DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
São bacilos Gram negativos, não esporulados, com motilidade variável, oxidase negativos, e que
crescem em meios básicos (caldo peptona), meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate e CLED), meios
seletivos (Mac Conkey, EMB). São anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose),
fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase positivos, e reduzem nitrato a nitrito.
São divididos através de diferentes provas em 11 principais gêneros, tendo sido descritos nos últimos
anos outros 16 gêneros e algumas espécies, mas ainda consideradas de pouca ou nenhuma
importância clínica.
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
A maioria das enterobactérias é encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal,
na água, solo e vegetais.
Alguns também são considerados enteropatógenos por causarem preferencialmente infecções
gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras salmonellas, Shigella spp., Yersinia enterocolitica
e vários sorotipos de Escherichia coli, embora possam também causar infecção em outros locais.
As enterobactérias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importância clínica
isolados na rotina microbiológica
São responsáveis por de cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias.
INFECÇÕES HOSPITALARES E NA COMUNIDADE
Nas infecções hospitalares:
As enterobactérias que atualmente predominam são: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter
spp.
Principais gêneros das enterobactérias (cerca de 99% dos isolamentos de enterobactérias de
importância clínica): Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia
spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp.
As enterobactérias menos isoladas são: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp.
Baseado em dados de prevalência e importância clínica, considera-se necessário que os
laboratórios de microbiologia utilizem metodologia que permita discriminar com ≥80% de acerto os
gêneros e espécies considerados abaixo:
- Escherichia coli
- Shigella spp.
- Salmonella typhi
- Salmonella spp.
- Citrobacter freundii
- Proteus mirabilis
- Citrobacter koseri
- Klebsiella pneumoniae
- Klebsiella oxytoca
- Providencia spp.
- Serratia spp.
- Proteus vulgaris
- Enterobacter aerogenes
- Enterobacter cloacae
- Enterobacter agglomerans
- Yersinia enterocolitica
- Morganella morganii
Nas infecções da comunidade:
Destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.

Mod V - 15
Principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica
1. Fermentação da glicose
2. Fermentação da lactose
3. Motilidade
4. Utilização de citrato
5. Descarboxilação da lisina
6. Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S)
7. Produção de gás (CO2)
8. Oxidase
9. Produção de indol
10. Produção de urease
11. Produção de fenilalanina desaminase ou opção
triptofanase
12. Produção de gelatinase ou opção DNAse
Provas complementares de Identificação
Fermentação de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc.
Utilização de aminoácidos: arginina e ornitina
Hidrólise da esculina, etc.
ONPG
Utilização de acetato
Provas úteis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila, voges-proskauer, crescimento em KCN,
tartarato de jordan e lipase.
Os esquemas de identificação baseiam-se na determinação dos gêneros e espécies mais isolados na
clínica, e nas provas mais características de cada gênero e espécie, baseado em alguns critérios
como: facilidade de execução, facilidade de interpretação, custo, rapidez para leitura, etc.
TIPOS DE TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO
Podem ser utilizados testes preparados no laboratório, desde que submetidos a controle de
qualidade.
Adquiridos no comércio em testes isolados ou em kits acompanhados dos respectivos esquemas
de identificação.
Métodos automatizados em geral utilizam estas mesmas provas e ampliam o número de testes
podendo caracterizar com maior segurança e melhor poder de discriminação de gêneros e espécies
não comuns.
Métodos rápidos em geral utilizam substratos cromogênicos para detecção de enzimas produzidas
pelas bactérias e que se revelam após 4 a 6 horas de incubação.
Na rotina bacteriológica, existem várias alternativas e, com base em conjuntos ou sistemas
simplificados de provas bioquímicas, é possível realizar a triagem e identificação presuntiva dos
principais gêneros de interesse clínico. Desse modo, das enterobactérias isoladas de amostras clínicas,
cerca de 90%, podem ser perfeitamente identificadas através desses esquemas, podendo o resultado
ser entregue dentro de um espaço de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas.
MEIO IAL (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)
Este meio foi elaborado para triagem de enterobactérias e consiste de 9 provas em apenas um tubo
de ensaio, que consistem em: indol (tampa), fermentação da sacarose e glicose e produção de gás,
fenilalanina, uréia, H2S, Lisina, Motilidade.
Baseado nestas provas é possível identificar as seguintes bactérias:
- E. coli
- Shigella (indol positiva)
- Shigella (indol negativa)
- Enterobacter aerogenes
- Klebsiella pneumoniae
- Klebsiella spp. (sacarose
negativa)
- Providencia spp. (uréia positiva) ou
Morganella morganii
- Providencia spp. (uréia negativa)
- Proteus mirabilis
- Proteus vulgaris
- Salmonella spp.
- Salmonella typhi
- Citrobacter freundii
- Serratia marcescens (provas
complementares)
- Vibrio cholerae
- Vibrio spp.
- bactérias não fermentadoras

Mod V - 16
Vantagens e limitações
O meio IAL tem a vantagem de ser prático para inoculação e de baixo custo. Sua desvantagem é a
dificuldade de interpretação de tantas provas, exigindo muita experiência prévia com o meio. Este
meio identifica os principais gêneros de enterobactérias, indicando a presença de bactérias não
fermentadoras e Vibrios.
Para caracterizar corretamente as espécies de Enterobacter, gênero Serratia, gênero e espécies de
Pseudomonas há necessidade de realizar provas complementares.
Pelas limitações do poder discriminatório de gêneros e espécies de enterobactérias não se recomenda
este meio, como única opção, na identificação de bactérias envolvidas em infecções hospitalares. Uma
alternativa seria utilizar os resultados obtidos do meio IAL como triagem e adicionar os testes
complementares, como Citrato e a fermentação da lactose verificada no crescimento em ágar Mac
Conkey.
Variantes do meio IAL
Tubo 1 – meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentação da glicose, gás, H2S, uréia
Tubo 2 – MIO (Motilidade Indol Ornitina)
Tubo 3 – lisina
Tubo 4 – citrato
Tubo 5 – rhamnose
CONJUNTO EPM / MILI / CITRATO
Trata-se praticamente da mesma combinação de reações do meio IAL ou Rugai & Araújo (modificado
por Pessoa & Silva), separados em 2 tubos, passando a verificação do indol da tampa do IAL, para o
meio MILi após adição do reativo de Kovacs.
Tubo EPM
- inocular picando até o fundo
- semear na superfície
- incubar com a tampa frouxa 24hs/35o
C
Fermentação da glicose, produção de gás, H2S, uréia, fenilalanina.
Tubo MILI
- fazer picada central apenas
- incubar 24hs/35o
C
- adicionar 3 gotas de reativo de Kovacs após a leitura da lisina para o teste de
indol
Motilidade: as imóveis crescem apenas na linha de picada.
Descarboxilação da lisina: lisina positiva o meio torna-se roxo, na prova
negativa o meio permanece amarelado nos 2/3 inferiores.
Indol: a formação de um anel rosa na superfície do meio indica positividade
para o indol.
Citrato
- inocular a superfície
- incubar 24hs/35o
C
A prova positiva é evidenciada pelo aparecimento de coloração azul na
superfície.
Interpretação do Meio EPM
Produção de gás Formação de bolhas ou rachaduras no meio
Produção de H2S Presença de pigmento negro de qualquer
intensidadeBase
Hidrólise da Uréia Coloração azul esverdeada (fraca) na base indica
prova positiva
Superfície Desaminação do Triptofano Reação positiva – verde escuro ou acastanhado
Reação negativa – superfície inalterada

Mod V - 17
MEIO TRÍPLICE AÇUCAR FERRO (TSI)
Considerado o mais clássico dos sistemas de identificação, necessita de provas adicionais, mas tem a
vantagem de ser de mais fácil interpretação. Abaixo será descrito em detalhes e será a base da
identificação de enterobactérias.
Acurácia da identificação - qualquer sistema de testes existentes no comércio, com leitura manual ou
automatizada, tem limitações no número de provas e de discriminação dos diferentes gêneros e
espécies de enterobactérias, de modo que a maioria dos esquemas trabalha com um máximo de 80%
de acerto. Os esquemas de identificação de enterobactérias podem utilizar uma ampla gama de
recursos, variando desde nove reações como meio IAL ou Rugai & Araújo modificado por Pessoa &
Silva, até dez testes propostos neste manual, ou sistemas como API 32E que pode identificar
enterobactérias e alguns não fermentadores, utilizando 32 testes. É importante destacar que nenhum
sistema oferece 100% de acerto para a caracterização das espécies de enterobactérias, mas analisam
o principal comportamento descrito na literatura.
A fonte de informação mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1991) contando com
47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para 28 diferentes gêneros e 121 espécies de
enterobactérias. Os principais gêneros e espécies de importância clínica podem ser caracterizados com
>95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espécies dos gêneros Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminação,
sendo a identificação feita pelo maior percentual de probabilidade.
É necessário destacar que padrões não usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar
atento para analisar cepas que possam ter importância clínica e epidemiológica ou encaminhá-las a
Laboratórios de Referência. Antes, no entanto, deve certificar-se que a análise não esta sendo feita
com cultura mista de bactérias.
O meio de TSI é inclinado em bico de flauta, de cor vermelho-cereja e deve ser inoculado por picada
central até o fundo, seguido de espalhamento na superfície e incubação durante 18-24h a 35o
C.
Provas do Meio de TSI
a) Púrpura/amarelo (ápice
púrpuro e base amarela)
= fermentação apenas da glicose (lactose e
sacarose negativas)
b) Amarelo/amarelo (ápice e
base amarelos)
= fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou
3 açúcares)
c) Presença de gás (CO2) = bolhas ou meio fragmentado
d) H2S positivo = presença de precipitado negro
Interpretação do resultado das reações encontradas no TSI
Ápice Base H2S Gás Interpretação mais provável
Vermelho Vermelho neg neg Sem crescimento = bactéria exigente
Vermelho Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Não Fermentador ou
Gram (+)
Amarelo Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Gram (+)
Vermelho Amarelo neg variável Enterobactéria ou Aeromonas lactose e sacarose
negativas
Amarelo Amarelo neg variável Enterobactéria
Amarelo Amarelo + variável Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e
Citrobacter
Obs. A presença de H2S em bactérias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente, pois a precipitação de
sais de ferro pelo sulfeto de hidrogênio depende de meio acido (Ex: Salmonella typhi)

Mod V - 18
ETAPAS DA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS
ANÁLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOS
A identificação de uma enterobactéria começa com a análise do material semeado. Em geral temos os
seguintes meios para interpretar:
Secreções: ágar sangue e Mac Conkey
Líquidos nobres e biópsias: Ágar Chocolate e Mac Conkey
Fezes: Mac Conkey e Salmonella-Shigella
Urina: CLED ou ágar sangue e Mac Conkey, etc.
Devemos considerar que:
A enterobactéria sempre cresce nos meios ricos (ágar sangue, chocolate e CLED), bem como nos
meios seletivos: ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella.
Os Gram positivos como regra não crescem em ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, exceto os
enterococos que podem crescer.
No ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, além das enterobactérias e dos enterococos, podem
crescer bactérias não fermentadoras e Candida.
Portanto caracteriza-se uma enterobactéria quando ela esta presente em todos os meios semeados,
mas ainda é necessário diferenciar de outros microrganismos não muito exigentes como não
fermentadores, enterococos e Candida spp.
Recomenda-se realizar:
Gram da colônia isolada – sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretação (diferenciar
cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativoe e leveduras).
Prova da oxidase – indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas,
Vibrio que também são fermentadores.
Prova do metabolismo fermentador – triagem utilizando os meios de OF glicose (quando suspeitar
de não fermentador), TSI (Tríplice Açucar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para
enterobactérias.
Série bioquímica complementar – sempre necessária para caracterizar gênero e espécie. O
número de provas vai permitir maior ou menor discriminação (vide a seguir o nível de
complexidade de provas).
As Enterobactérias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos Gram negativos,
fermentadores da glicose, com ou sem produção de gás, oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e
que crescem bem no meio de Mc Conkey ou EMB.
Como modelo de triagem na identificação bacteriana tem sido utilizado o meio de TSI (Triplice Açucar
Ferro), que permite avaliar a fermentação da glicose, produção de gás, fermentação de lactose e/ou
sacarose e produção de H2S.
O TSI constitui o meio de identificação preliminar mais utilizado no mundo, sendo necessário, no
entanto, necessário adicionar algumas provas, para completar a identificação e classificadas em dois
níveis de complexidade:
Nível de complexidade 1 motilidade, indol, lisina, uréia, citrato, lactose (Mac Conkey),
fenilalanina, DNAse e oxidase.
Nível de complexidade 2 provas do nível 1 e ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato,
esculina e PYR.

Mod V - 19
DESCRIÇÃO DAS PRINCIPAIS PROVAS BIOQUÍMICAS
Motilidade, H2S e
Indol
- Semear por picada até o fundo, e incubar 24h/35o
C
- Após 24h de incubação, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfície do
meio
- Meios Motilidade/indol com resazurina (motilidade); SIM (motilidade,
indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina)
crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa
crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva
H2S positivo = meio enegrecido
H2S negativo = cor inalterada do meio Indol
cor púrpura = indol positivo
cor do reagente = indol negativo
Uréia de Christensen
- Inocular apenas na superfície e incubar 24h/35o
C
Urease positivo = cor vermelha (Proteus: reação mais intensa)
Urease negativo = mantém cor amarelada do meio
Citrato de Simmons
- Inocular na superfície e incubar 24h/35o
C
Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio
Citrato negativo = cor verde (inalterado)
Fenilalanina
- Inocular a superfície do meio (inclinado) e incubar 24h/35o
C
- Após crescimento pingar na superfície 5 gotas do reagente cloreto
férrico a 10%
FA positivo = cor verde escuro na superfície
FA negativo = mantém a cor do meio inalterada
IDENTIFICAÇÃO DAS ENTEROBACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
CONSIDERAÇÕES
Valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definição; para saber o real
percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral.
PB (padrão bioquímico) = probabilidade teórica da bactéria em questão; apresentar o padrão
bioquímico analisado (os testes considerados são indicados pelo sinal #).
Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relação às provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%)
(multiplicar os percentuais de ocorrência)= 92%.
PB baixo significa ter outro padrão mais frequente.
Os padrões bioquímicos pouco freqüentes terão menor probabilidade de isolamento.
Não é aplicado quando se considera gênero, pois envolve várias espécies com diferentes padrões
de testes (ex: Salmonella spp.).
Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (neg) significa o percentual de cepas com
resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas são lisina positiva.
V = valores >20% e <80% de reações positivas ou negativas; estas provas podem ser úteis para
diferenciar duas espécies ou dois gêneros quando a reação só ocorre para uma delas. Ex.: uréia
em relação a E. coli e Citrobacter. E. coli é negativa e Citrobacter variável. Se a reação encontrada
for positiva, exclui-se E. coli.
Pela importância clínica e epidemiológica, padrões não comuns de Yersinia e Salmonella spp.
foram considerados, pois na prática a motilidade pode ser duvidosa e o H2S pode ser falso-
negativo.
As provas destacadas com fundo cinza têm a finalidade de facilitar a busca de provas-chave na
diferenciação bacteriana.
Recomenda-se de rotina utilizar as provas do nível 1 que, para a maioria das bactérias da rotina,
permite uma caracterização adequada. Quando houver necessidade usar as de nível 2.

Mod V - 20
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA SIMPLIFICADA DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTÉRIAS -
NÍVEL DE COMPLEXIDADE 1
H2S (gás sulfídrico) positivo, FA (fenilalanina) positivo
Bactérias PB#
Indol + Proteus vulgaris 92%
Indol neg Proteus mirabilis 94%
H2S negativo , FA positivo
Bactérias Citrato Uréia PB#
Indol + Providencia spp. + variável 88%
Morganella morganii neg + 72%
Indol neg P. penneri neg + 69%
Enterobacter spp. variável neg <16%
H2S positivo, FA negativo, Indol positivo
Bactérias Citrato Motilidade Urease Lisina Lac MC PB#
Citrobacter freundii 78%+ 89%+ variável neg + 25%
Edwarsiella tarda neg + neg + neg 99%
Lac MC = lactose em Mac Conkey
H2S positivo, FA negativo, Indol negativo
Bactérias Urease Citrato Lisina Motilidade Gás Sorotipagem PB#
Salmonella spp. neg + + + + +
S. typhi neg neg + + neg + 97%
S. gallinarum/
S. pullorum
neg neg + neg variável + 90%
C. freundii variável + neg + + neg 52%
H2S negativo , FA negativo , Indol positivo, motilidade negativa
Bactérias Citrato Urease Lisina Latose Gás Sorotipagem PB#
Y. enterocolitica 1
neg 75%+ neg neg neg + Yersinia 50%
Shigella spp. neg neg neg neg neg + Shigella 50%
Klebsiella oxytoca + + + + + não 99%
E.coli inativa (rara) neg neg variável 75% neg neg Invasora 2
80%
1
- positivo à temperatura ambiente e negativa à 37o
C
2
- em coprocultura testar p/ E. coli invasora

Mod V - 21
H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade positiva
Bactérias Citrato Urease Lisina Lactose Gás PB#
E. coli neg neg + + + 97%
Citrobacter spp. + variável neg variável +
Aeromonas spp. 1
variável neg + neg 2
variável
1
- oxidase positiva (verificar Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio)
Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas Dnase negativa
2
- Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa
Bactérias Urease Citrato Lisina Gás Lactose Comentário PB#
Shigella spp.
(colônia pequena)
neg neg neg neg neg sorotipagem 50%
Klebsiella pneumoniae 1
+ + + + + Colônia mucóide 100%
Yersinia enterocolitica 2
75%+ neg neg neg neg sorotipagem 50%
E. agglomerans 3
neg variável neg neg variável 15% mot neg 9,6%
1
- cepas isoladas do trato respiratório superior, especialmente nariz podem ser uréia negativas e bioquimicamente
pouco ativas (citrato variável, lisina variável), denominadas K. ozaenae e K. rhinoscleromatis
2
- motilidade positiva à temperatura ambiente
3
- pode ocorrer falsa motilidade negativa em meio semi-solido e positiva em caldo
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo
Bactérias Lisina Lactose Sorotipagem PB#
Hafnia alvei + neg negativa 76%
Salmonella choleraesuis + neg + 37%
Salmonella paratyphi A neg neg + 90%
E. agglomerans neg variável negativa 25%
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, DNAse e
gelatinase negativas
Bactérias Lisina Urease Lactose Gás Sorotipagem PB#
Enterobacter aerogenes + neg + ++ neg 95%
Enterobacter cloacae neg v + ++ neg 95%
Salmonellla typhi + neg neg neg + 12%

Mod V - 22
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, DNAse e
gelatinase positivas, Serratia spp.
Bactérias Lisina Urease Lactose Gás Pigmento
vermelho
PB#
Serratia marcescens + 85% neg neg 55% + variável 95%
Serratia liquefaciens + neg 90% neg 75% pos neg 76%
Serratia rubidae 1
55% + neg + 70% neg variável 85%
1
- raramente isolada
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA SIMPLIFICADA DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTÉRIAS -
NÍVEL DE COMPLEXIDADE 2
H2S positivo, FA positivo
Bactérias Ornitina Sacarose PB#
Indol positivos Proteus vulgaris neg + 92%
Morganella morganii + neg 20%
Bactérias Ornitina Citrato PB#
Indol negativos Proteus mirabilis + variável
(65%+)
94%
Proteus penneri neg neg 30%
H2S negativo, FA positivo
Bactérias Urease Citrato Sacarose Ornitina
Indol negativos Proteus penneri + neg + neg
Morganella morganii + neg neg +
Enterobacter agglomerans neg + 75%+ neg
Enterobacter sakazaki neg + + +
Bactérias Citrato
Indol positivos Morganella morganii neg
Providencia spp. +
H2S positivo, FA negativo, Indol positivo
Bactérias Citrato Urease Lisina Ornitina Lactose Sacarose
Citrobacter freundii 78%+ 44%+ neg neg 78%+ 89%+
Edwarsiella tarda neg neg + + neg neg

Mod V - 23
H2S positivo, FA negativo, Indol negativo
Bactérias Uréia Citrato Lisina Ornitina Motibil. Arabinos Gás Sorotip.
Salmonella spp. neg + + + + + + +
S. typhi neg neg + neg + neg neg +
S. choleraesuis neg 25%+ + + + neg + +
S. paratyphi A neg neg neg + + + + +
S. gallinarum neg neg + neg neg + neg +
S. pullorum neg neg + + neg + + +
Outras
Salmonellas
neg + + + + + + +
C. freundii 44%+ 78%+ neg neg 89%+ + 89%+ neg
Triagem rápida para principais bactérias H2S positivas
Bactérias PYR Fenilalanina
Salmonella spp. neg neg
Citrobacter spp. + neg
Proteus spp. neg +
H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade negativa
Bactérias Citrato Urease Lisina Ornitina Lactose Gás Sorotip. PB#
Y. enterocolitica 1
neg 75%+ neg + neg neg + 50%
Shigella spp. neg neg neg neg neg neg + 50%
Klebsiella oxytoca + + + neg + ++ NI 99%
E. coli inativa (rara) neg neg 40%+ 20%+ 25%+ neg invasora 2
80%
1
- positiva à temperatura ambiente e negativa a 37o
C
2
- em coprocultura testar para E. coli invasora
H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade positiva
Bactérias Citrato Urease Lisina Ornitina Lactose Gás PB#
E. coli neg neg 90%+ 65% + + + 97%
C. diversus (koseri) 1
+ 75% + neg + 50%+ + 97%
Citrobacter amalonaticus 1
+ 85%+ neg + 35%+ + 97%
Yersinia enterocolitica 2
neg 75%+ neg + neg neg
Enterobacter agglomerans 50%+ 20%+ neg neg 40%+ 20%+ 16%
Aeromonas spp. 3
variável neg + 4
+ neg variável
1
- C. koseri = malonato positivo C. amalonaticus = malonato negativo
2
- motilidade negativa a 35o
C e positiva à temperatura ambiente

Mod V - 24
3
- oxidase positiva: Aeromonas é Dnase positiva e Plesiomonas shigelloides é Dnase negativa
4
- Aeromonas caviae é lisina negativa e lactose positiva
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa
Bactérias Urease Citrato Lisina Gás Lactose Comentário PB#
Shigella spp.
(colônia pequena)
neg neg neg neg neg Sorotipagem + >50%
Klebsiella pneumoniae + + + + + Colônia Mucóide 100%
Klebsiella spp. 1
neg variável variável variável variável Mucóide
Citrobacter freundii v 78%+ neg + 78%+ 11% motil. neg 16%
Yersinia enterocolítica 2
75%+ neg neg neg neg Sorotipagem + 50%
E. agglomerans 3
neg variável neg neg variável 15% motil. neg 9,6%
1
- cepas isoladas do trato respiratório superior, especialmente nariz podem ser uréia negativas e bioquimicamente
pouco ativas (citrato v, lisina v), denominadas K. ozaenae e K. rhinoscleromatis
2
- motilidade + à temperatura ambiente
3
- pode ocorrer falsa motilidade (negativa em meio semi-sólido e positiva em caldo)
H2S negativo, FA negativa, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo
Bactérias Lisina Ornitina Lactose Urease Arabinos Sorologia PB#
Hafnia alvei + + neg neg + neg 76%
Salmonella typhi 1
+ neg neg neg neg +
Y. enterocolitica 2
neg + neg 75%+ + +
S. choleraesuis + + neg neg neg +
S. paratyphi A neg + neg neg + +
E. agglomerans neg neg 40%+ 20%+ + neg 25%
1
- H2S pode ser positivo no TSI com 48h
2
- motilidade negativa à 35o
C e positiva a 25o
C
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa, Citrato positivo, DNAse e
gelatina negativas
Bactérias Uréia Fenil. Lisina Argin. Ornit. Malon. Gás Lactose Escul.
C. freundii 44%+ 0 0 67%+ 0 11%+ 89%+ 78%+ 0
E. aerogenes 2%+ 0 98%+ 0 98%+ 95%+ 100%+ 95%+ 98%+
E. cloacae 65%+ 0 0 97%+ 96%+ 75%+ 100%+ 93%+ 30%+
E. agglomerans 20%+ 20%+ 0 0 0 65%+ 20%+ 40%+ 60%+
E. gergoviae 93%+ 0 90%+ 0 100%+ 96%+ 98%+ 55%+ 97%+
E. sakazakii 1%+ 50%+ 0 99%+ 91%+ 18%+ 98%+ 99%+ 100%+

Mod V - 25
Versão simplificada para interpretação das provas da Lisina negativa
Bactérias Gás Esculina Arginina
Ornitina negativa Citrobacter freundii + neg variável
E.agglomerans neg variável neg
Bactérias Urease Fenil. Malonato Esculina Obs.
Ornitina positiva Enterobacter cloacae 65%+ neg 75% + 30% + + comum
Enterobacter sakazaki neg 50%+ 18% + + raro
Versão simplificada para interpretação das provas da Lisina positiva
Bactérias Urease Lactose
E. aerogenes neg +
Enterobacter gergoviae + variável
H2S negativo, FA negativa, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, Dnase e
Gelatina positivas
Bactérias Lisina Ornitina L-arabinose Malonato Motibilidade Lactose
Serratia marcescens 99% + 99% + neg neg + neg
S. marcescens biog 1
55% + 65% + neg neg neg neg
Serratia liquefaciens 95% + 95% + + neg + neg
Serratia rubidae 55% + neg + + + +
CARACTERIZAÇÃO GERAL DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA (%)
Bactérias Indol Citr. H2S Uréia Fenil. Lisina Argin. Ornit. Motil.
Citrobacter freundii 33 78 78 44 0 0 67 0 89
Citrobacter diversus (koseri) 99 99 0 75 0 0 80 99 95
Citrobacter amalonaticus 100 95 5 85 0 0 85 95 95
Edwarsiella tarda 99 1 100 0 0 100 0 100 98
Enterobacter aerogenes 0 95 0 2 0 98 0 98 97
Enterobacter cloacae 0 100 0 65 0 0 97 96 95
Enterobacter agglomerans 20 50 0 20 20 0 0 0 85
Enterobacter gergoviae 0 99 0 93 0 90 0 100 90
Enterobacter sakazakii 11 99 0 1 50 0 99 91 96
Escherichia coli 98 1 1 1 0 90 17 65 95
Escherichia coli inativa 80 1 1 1 0 40 3 20 5

Mod V - 26
Shigella dysenteriae 45 0 0 0 0 0 2 0 0
Shigella flexneri 50 0 0 0 0 0 5 0 0
Shigella boydii 25 0 0 0 0 0 18 2 0
Shigella sonnei 0 0 0 0 0 0 2 98 0
Hafnia alvei 0 10 0 4 0 100 6 98 85
Klebsiella pneumoniae 0 98 0 95 0 98 0 0 0
Klebsiella oxytoca 99 95 0 90 1 99 0 0 0
Klebsiella ozaenae 0 30 0 10 0 40 6 3 0
Klebsiella rhinoscleromatis 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Morganella morganii grupo 95 0 20 95 95 v 0 95 v
Proteus mirabilis 2 65 98 98 98 0 0 99 95
Proteus vulgaris 98 15 95 95 99 0 0 0 95
Proteus penneri 0 0 30 100 99 0 0 0 85
Providencia rettgeri 99 95 0 98 98 0 0 0 94
Providencia stuartii 98 93 0 30 95 0 0 0 85
Providencia alcalifaciens 99 98 0 0 98 0 0 0 96
Salmonella spp. 1 95 95 1 0 98 70 97 95
Salmonell typhi 0 0 97 0 0 98 3 0 97
Salmonella cholerasuis 0 25 50 0 0 95 55 100 95
Salmonella paratyphi A 0 0 10 0 0 0 15 95 95
Salmonella gallinarum 0 0 100 0 0 90 10 1 0
Salmonella pullorum 0 0 90 0 0 100 10 95 0
Salmonella outras 1 90 100 0 0 99 70 99 99
Serratia marcescens 1 98 0 15 0 99 0 99 97
Serratia marcescens bio 0 30 0 0 0 55 4 65 17
Serratia liquefaciens 1 90 0 3 0 95 0 95 95
Serratia rubidae 0 95 0 2 0 55 0 0 85
Yersinia enterocolitica 50 0 0 75 0 0 0 95 2
CARACTERIZAÇÃO GERAL DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA (%)
Bactérias Gelatina Malon. Gás
glicose
Lactose Sacarose Escul. DNAase
Citrobacter freundii 0 11 89 78 89 0 0
Citrobacter diversus (koseri) 0 95 98 50 40 1 0
Citrobacter amalonaticus 0 1 97 35 9 5 0
Edwarsiella tarda 0 0 100 0 0 0 0
Enterobacter aerogenes 0 95 100 95 100 98 0
Enterobacter cloacae 0 75 100 93 97 30 0
Enterobacter agglomerans 2 65 20 40 75 60 0

Mod V - 27
Enterobacter gergoviae 0 96 98 55 98 97 0
Enterobacter sakazakii 0 18 98 99 100 100 0
Escherichia coli 0 0 95 95 50 35 0
Escherichia coli inativa 0 0 5 25 15 5 0
Shigella dysenteriae 0 0 0 0 0 0 0
Shigella flexneri 0 0 3 1 1 0 0
Shigella boydii 0 0 0 1 0 0 0
Shigella sonnei 0 0 0 2 1 0 0
Hafnia alvei 0 50 98 5 10 7 0
Klebsiella pneumoniae 0 93 97 98 99 99 0
Klebsiella oxytoca 0 98 97 100 100 100 0
Klebsiella ozaenae 0 3 50 30 20 80 0
Klebsiella rhinoscleromatis 0 95 0 0 75 30 0
Morganella morganii grupo 0 1 90 1 0 0 0
Proteus mirabilis 90 2 96 2 15 0 50
Proteus vulgaris 91 0 85 2 97 50 80
Proteus penneri 50 0 45 1 100 0 40
Providencia rettgeri 0 0 10 5 15 35 0
Providencia stuartii 0 0 0 2 50 0 10
Providencia alcalifaciens 0 0 85 0 15 0 0
Salmonella spp. 0 0 96 1 1 5 2
Salmonell typhi 0 0 0 1 0 0 0
Salmonella cholerasuis 0 0 95 0 0 0 0
Salmonella paratyphi A 0 0 99 0 0 0 0
Salmonella gallinarum 0 0 0 0 0 0 10
Salmonella pullorum 0 0 90 0 0 0 0
Salmonella outras 1 V 100 V 1 0 ou 15 1
Serratia marcescens 90 3 55 2 99 95 98
Serratia marcescens bio 30 0 0 4 100 96 82
Serratia liquefaciens 90 2 75 10 98 97 85
Serratia rubidae 90 94 30 100 99 94 99
Yersinia enterocolitica 0 0 5 5 95 25 5
IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA
Dentro da família Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de amostras bacterianas
bioquimicamente homogêneas e, sorologicamente relacionadas, que constituem os gêneros e,
segundo alguns critérios, podem se dividir em espécies.
As amostras relacionadas bioquimicamente são divididas em subgrupos ou tipos, por critério
sorológico, de acordo com a presença dos antígenos: somático (O), flagelar (H) e de envoltório ou

Mod V - 28
cápsula (K). Desse modo, os sorotipos são divisões baseadas no relacionamento antigênico, enquanto
os biotipos são amostras do mesmo sorotipo que diferem em características bioquímicas.
Em atividades de rotina de Bacteriologia Clínica, a identificação ou confirmação sorológica é feita
apenas com germes comprovadamente patogênicos e de importância epidemiológica como Salmonella
spp., Shigella spp., Escherichia coli Yersina enterocolitica e mesmo assim utilizando-se esquemas
simplificados, através do seguinte procedimento técnico:
Preparar uma suspensão bastante densa (aspecto leitoso), da bactéria a ser testada, utilizando
solução salina a 0,85%. A massa bacteriana é proveniente do Ágar TSI usado na identificação
bioquímica ou, de preferência, em ágar nutriente inclinado após repique para obtenção de massa
de germes.
‫ـ‬ Colocar a salina sobre o crescimento bacteriano ocorrido na superfície inclinada do meio;
‫ـ‬ Agitar o tubo após alguns minutos de modo a obter a suspensão bacteriana;
‫ـ‬ Bactérias em fase rugosa tendem a se auto-aglutinar, e não devem ser utilizadas na
classificação sorológica.
Sobre uma lâmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspensão bacteriana a
ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura bastante homogênea continuando o
movimento durante um ou no máximo dois minutos. O aparecimento de aglutinação, nesse
intervalo de tempo, indica positividade da reação.
Algumas vezes, é necessário o aquecimento da suspensão bacteriana em banho-maria fervente,
durante 15 minutos, com finalidade de eliminar estruturas mais externas da célula que têm ação
interferente na reação. Após o resfriamento da suspensão, repetir o teste. Caso ocorra a
aglutinação, confirmar a prova.
IDENTIFICAÇÃO DE SALMONELLA
No gênero Salmonella existe uma grande quantidade de sorotipos, que não são mais considerados
como espécies, e sua identificação sorológica completa e detalhada é uma tarefa restrita aos
denominados Laboratórios de Referência. Para identificação rotineira no laboratório clínico utilizam-se
basicamente três antisoros:
a) Anti-Salmonella polivalente somático (Grupos A,B,C,D,E)
b) Anti-Salmonella somático, Grupo D (S. typhi)
c) Anti-Salmonella, anti Vi
Quando o denominado antígeno de virulência (Vi) está presente, poderá bloquear a aglutinação do
antígeno somático do grupo D (Salmonella typhi). Desse modo, a suspensão deverá ser aquecida em
banho-maria fervente e testada novamente com os três anti-soros citados, dando o resultado abaixo
no caso de Salmonella typhi. A partir de uma reação positiva feita apenas com o antígeno somático
polivalente, existe condição de confirmar a amostra como sendo do gênero Salmonella, sem
especificar o sorotipo ou sorovar.
Antisoros Antígeno vivo Antígeno aquecido
Anti-soro poli somático + +
Grupo D somático neg +
Anti Vi + neg
Após a identificação bioquímica e aglutinação com soro polivalente, as amostras poderão ser testadas
com os soros A,B,C,D,E monovalentes. A bactéria pertencerá ao sorogrupo em cujo soro houver
aglutinação. Se a reação for negativa deve-se aquecer a metade da suspensão em banho-maria
fervente e repetir o teste. A metade não aquecida deverá ser utilizada para determinação de
antígenos flagelares. A identificação até sorotipos poderá ser feita com auxílio dos soros flagelares
(a,b,c,d,i,1,2,5), e através de sua utilização é possível identificar as seguintes amostras:

Mod V - 29
Grupo Sorológico Espécie Bacteriana
Grupo O2 (A)
Grupo O4 (B)
Grupo O7 (C1)
Grupo O5 (D1)
Salmonella paratyphi A
Salmonella paratyphi B e S. typhimurium
Salmonella paratyphi C e S. cholerae suis
Salmonella typhi
IDENTIFICAÇÃO DE SHIGELLA
O gênero Shigella está constituído de apenas quatro sorogrupos, que são identificados
sorologicamente, de maneira simplificada, com a utilização de anti-soros polivalentes.
Excepcionalmente, utiliza-se apenas o antisoro monovalente de Shigella dysenteriae tipo 1 (bacilo de
Shiga), por ser o mais patogênico.
Grupo Sorológico Espécie Bacteriana Sorotipos
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
Shigella dysenteriae
Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
13 sorotipos
06 sorotipos
18 sorotipos
01 sorotipo
As culturas suspeitas deverão ser testadas primeiramente com os soros contra Shigella flexneri e
Shigella sonnei, que representam mais de 95% das amostras de Shigella isoladas em nosso meio.
Caso não haja aglutinação, prosseguir com os outros soros.
Não ocorrendo aglutinação, é possível que a cultura seja rica em antígenos de superfície que
geralmente impedem o contato do soro com o antígeno somático O. Estes antígenos devem ser
destruídos pelo aquecimento da suspensão bacteriana por 15 minutos em banho-maria fervente,
procedimento que pode ser adotado como de rotina na sorologia desse gênero.
IDENTIFICAÇÃO DE ESCHERICHIA COLI
As amostras de Escherichia coli que causam diarréia pertencem a três grupos principais:
Enteropatogênicas (EPEC)
Enterotoxigênicas (ETEC)
Enteroinvasoras (EIEC)
Não existe nenhuma prova bioquímica que possa, seguramente, distinguí-las entre si ou de outros
tipos de E. coli pertencentes à flora normal do intestino. As amostras EPEC e EIEC são identificadas
por provas de sorotipificação rotineira, enquanto as amostras ETEC são identificadas apenas mediante
provas especiais de produção de toxinas, realizadas somente em laboratórios de referência ou de
pesquisa.
Soro Anti E. coli Enteropatogênica Clássica (EPEC)
Polivalente A anti 026, 055, 0111, 0119
Polivalente B anti 0114, 0125, 0142,0158
Polivalente C anti 086, 0126, 0127, 0128
A sorotipificação pode ser feita, utilizando-se a mesma técnica descrita para outras enterobactérias.
Um melhor resultado é obtido, repicando cerca de cinco colônias características a partir do Ágar BEM
ou Mac Conkey, para um tubo contendo Ágar Nutriente Inclinado, com finalidade de obter massa de

Mod V - 30
germes. É feita então uma suspensão bacteriana em solução salina, a qual será testada utilizando
anti-soros polivalentes, abrangendo os sorotipos mais prevalentes na população.
Soro Anti E. coli Enteroinvasora (EIEC)
Polivalente A anti 028ac, 029, 0136, 0144, 0152
Polivalente B anti 0112ac, 0124, 0143, 0164, 0167
Soro Anti E. coli O 157 (EHEC)
Utilizar o soro para O157:H7
Observações importantes:
Bactérias isoladas com o mesmo padrão de provas de materiais nobres em surtos de infecção
hospitalar, ou isoladas de infecções da comunidade que possam suspeitar de um surto, ou pela
gravidade da doença, ou por um padrão não esperado de resistência, devem ser remetidas ao
Laboratório de Referência (LACEN/Adolfo Lutz) para melhor caracterização.
Bactérias que não se enquadram nos padrões definidos acima, recorrer a testes suplementares ou
usar kits com maior número de provas ou em caso de importância clínica (descritos acima) enviar
ao Laboratório de Referência.

Mod V - 31
4. BASTONETES NÃO FERMENTADORES
INTRODUÇÃO
Os bacilos Gram negativos classificados como não fermentadores (BNFs) são microrganismos
aeróbios, não esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem incapazes de utilizar carboidratos
como fonte de energia através de fermentação, degradando-os pela via oxidativa.
A identificação dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratórios de rotina em microbiologia,
considerando que a maioria deles não realiza este tipo de identificação, ou o faz de maneira elementar
em virtude da pouca incidência em amostras ambulatoriais, assim como pela complexidade e elevado
custo dos esquemas completos de identificação.
A caracterização deste grupo de bactérias é de grande importância nos casos de infecção hospitalar.
Embora a sua incidência, mesmo em hospitais, seja pequena quando comparada a outros agentes
etiológicos, geralmente eles apresentam resistência elevada a vários antibióticos e são capazes de
causar infecções graves. Estas bactérias colonizam e causam infecções, em especial, em pacientes
graves oriundos de CTI e submetidos à procedimentos invasivos, sendo importante classificá-los até o
nível de gênero e espécie.
O número de bactérias não fermentadoras conhecidas é muito grande. Foram selecionadas aquelas
consideradas na atualidade de maior importância clínica (*) e as demais para diagnóstico diferencial
entre si.
BNFs de importância clínica consideradas neste capítulo*:
Acinetobacter spp.* Alcaligenes spp.*
Achromobacter spp. Bordetella bronchyseptica
Burkholderia cepacia * Chryseobacterium (Flavobacterium) spp.*
Methylobacterium spp. Moraxella spp.*
Pseudomonas aeruginosa * Pseudomanas fluorescens
Pseudomonas luteola Pseudomanas oryzihabitans
Pseudomanas putida Pseudomonas stutzeri
Pseudomanas pseudomallei * Roseomonas spp.
Stenotrophomonas spp.* Shewanella spp.
Sphingobacterium spp. Sphingomonas paucimobilis
Testes necessários para a identificação de rotina dos BNFs
Tubo de OFglicose (com vaselina) Disco de oxidase
Tubo de OFglicose (sem vaselina) Disco de PYR
Tubo com lisina Tubo com arginina
Tubo controle de aminoácidos Caldo TSB para motilidade em lâmina
Tubo ágar citrato Caldo TSB crescimento 42o
c
Tubo ágar uréia Tubo de caldo indol
Tubo com ágar esculina Disco de polimixina
Tubo com TSI Placa de Mac Conkey
Tubo com gelatina Placa de DNAse
Tubo com caldo NaCl 6,5%
SEMEADURA, LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
A partir de colônias isoladas em cultura pura com 24 horas de crescimento, nos meios de inoculação
primária, deve-se proceder a realização das técnicas de identificação e diferenciação dos BNFs:
PROVAS SEMEADURAS LEITURA E INTERPRETAÇÃO
Disco de oxidase
- Retirar 2-3 colônias com alça.
- Esfregar sobre a fita ou disco
teste; pode umedecer o papel
com 1 gota de salina estéril.
- A leitura é feita em 15 a 20 segundos.
- A cor violeta forte aparece rapidamente. Após este
intervalo, cores violeta-pálido são falso positivos. A
Burkholderia cepacia pode dar reação fraca.

Mod V - 32
Tubo de OF
glicose (com e
sem vaselina)
- Picar com agulha até o fundo
do tubo.
- Fermentador: dois tubos ficam amarelos (ácido)
- Oxidativo: tubo sem vaselina amarelo
tubo com vaselina verde
- Inerte ou alcalino: dois tubos não mudam de cor
(inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado
(alcalino). Aguardar, no mínimo, 72h para definir
como inerte, pois pode ocorre a oxidação tardia ou
lenta.
Tubo com pedaço
de filme e
gelatina
- Inocular 2-3 colônias na salina.
- Deixar o fragmento imerso.
- Incubar 30o
C, se negativo, aguardar no mínimo
72h. Se positivo, ocorre precipitado cinza no fundo
do tubo.
Placa de DNAse
- Semear 2 a 3 colônias em
“spot” (círculo de 1 cm de
diâmetro).
- Adicionar ácido clorídrico e aguardar 5 minutos.
- Observar a presença de halo transparente em
volta do inoculo positivo enquanto o restante do
meio fica leitoso.
- Se negativo, repetir o teste com leitura em 72h.
Tubo com lisina,
arginina, controle
de aminoácidos
- Usar inóculo denso; pode
adicionar 2 ml de vaselina
líquida no tubo com lisina.
- Comparar os tubos testes dos aminoácidos com o
controle negativo.
- tubo controle negativo deve ficar azul esverdeado
pálido e as provas positivas ficam de cor púrpura.
- Se negativo, aguardar até 5 dias.
Uréia
- Semear com agulha inóculo
denso na superfície do meio.
- A cor rosa forte aparece em todo o meio após 24 a
72 h de incubação; uma ligeira mudança de cor
rósea no ápice, que não progride com maior tempo
de incubação, é considerado negativo.
- Bordetella bronchiseptica: reação positiva em 4 h.
Citrato - Semear com agulha na
superfície do meio.
- A cor azul forte aparece no pico, e com maior
incubação estende-se a todo o meio.
Caldo TSB
crescimento 42o
C
- Semear 2 colônias no caldo. - Ocorre turbidez no meio ou é nítido o aumento da
densidade bacteriana.
- Ideal comparar com controle mantido a
Caldo TSB
motilidade
- Semear 2 colônias no caldo. - Agitar o tubo e com uma pipeta com ponteira
estéril ou alça bacteriológica estéril.
- retirar uma gota e depositar sobre uma lâmina.
- Cobrir a gota com uma lamínula e levar ao
microscópio. Observar com aumento de 400 vezes
(ocular 10x e objetiva 40).
- A presença de bactérias cruzando o campo em
diferentes direções é significativo de motilidade
positiva; movimentos vibratórios fracos = negativo
(movimento browniano). Quando o movimento de
todas as bactérias é numa mesma direção,
provavelmente é o movimento do líquido entre a
lâmina e a lamínula.
- Verificar a motilidade em temperaturas de 37o
C e
20o
C (ambiente).
Tubo com caldo
NaCl 6,5%
- Semear 2 a 3 colônias no caldo. - A presença de turbidez e mudança de cor indicam
crescimento
Tubo com ágar
esculina
- Semear 2 a 3 colônias na
superfície do meio.
- Ocorre precipitado negro intenso nas provas
positivas a partir de 6 horas de incubação até 48 h
- Cor castanho escuro é prova negativa.
Tubo de caldo
indol
- Inocular 2 colônias no caldo. - Colocar 5 gotas de xilol e agitar bem o tubo.
- Adicionar 5 gotas do reagente de Erlich ou Kovacs.
- Observar a presença de anel púrpura-pálido ou
intenso que revelam prova positiva.
Disco de
polimixina
- Fazer antibiograma em Mueller
Hinton.
- Colocar o disco.
- Qualquer halo em torno do disco significa
sensibilidade.

Mod V - 33
Disco de PYR
- Colocar o disco sobre colônias
de crescimento recente ou fazer
suspensão densa.
- Depositar 3 a 4 gotas sobre o
disco de PYR.
- Incubar durante 4 horas numa
placa vazia com umidade.
- Colocar o disco teste em contato com o
- Colocá-lo sobre uma lâmina.
- Depositar uma gota do reagente que acompanha o
teste.
- A presença de cor alaranjada é prova positiva;
mantendo a cor amarela é prova negativa.
- Recomenda-se testar controles positivo e negativo.
Placa de Mac
Conkey
- Semear com alça 1 colônia
isolada.
- Crescimento deve ocorrer entre 1 a 3 dias.
TSI
- Semear com agulha picando
até o fundo do tubo e na
superfície do ágar inclinado.
- Fermentador: presença de cor amarela apenas na
base ou no ápice e na base
- Com ou sem H2S e gás: precipitado preto e bolhas.
- Não fermentador: permanece vermelho (alcalino)
no ápice e na base.
PROCEDIMENTOS PARA A IDENTIFICAÇÃO
No caso de isolar uma bactéria que não foi ainda comprovada como não fermentadora da glicose,
seguir as seguintes etapas com a colônia isolada:
Gram e Oxidase: observar se há pigmento da colônia crescida (amarelo, róseo, cor metálica).
RESULTADO DO GRAM E OXIDASE
Gram Positivo:
Procurar a identificação de cocos e bacilos Gram positivos
Gram negativo:
Coco Gram negativo, oxidase positivo, identificar como Neisseria spp. ou seguir para a Tabela 2
Coco Gram negativo, oxidase negativo, seguir para Tabela 1
Bacilo Gram negativo, oxidase negativo:
Semear Fenilalanina, Citrato, Uréia (ou EPM MILI ou IAL)
Semear OF glicose e Caldo motilidade – seguir Resultado OF 1
Bacilo Gram negativo, oxidase positivo:
Semear OF Glicose e Caldo motilidade – seguir Resultado OF 2
RESULTADO DO OF
1. Bacilo (cocobacilo) Gram negativo oxidase negativo
OF Glicose fermentador:
Fazer a identificação com as provas realizadas, visto ser uma enterobactéria.
Vide capítulo enterobactérias para interpretação dos resultados.
OF não fermentador:
motilidade negativa: Tabela 1
motilidade positiva: Tabela 3
2. Bacilo Gram negativo oxidase positiva:
OF Glicose fermentador: pesquisar Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio
OF Glicose não fermentador:
‫ـ‬ se pigmento rosa, seguir Tabela 7
‫ـ‬ motilidade negativa e pigmento amarelo, seguir Tabela 4
‫ـ‬ motilidade positiva: se TSI com H2S segue Tabela 5a e 5b; se OF glicose Oxidativo segue
Tabela 5; se OF glicose Inerte, seguir Tabela 6

Mod V - 34
TABELAS DE IDENTIFICAÇÃO DOS BNFS
Tabela 1. Coco-bacilos ou cocos Gram negativo, Oxidase negativa e Motilidade negativa
Microrganismos OF-glicose Cresc. 42ºC Citrato Gelatina
A. baumannii O + + neg
A. calcoaceticus O neg + neg
A. haemolyticus Inerte/oxidativo neg + +
A. lwoffii inerte neg neg neg
Prova opcional
Microrganismos Hemólise *
A. baumannii neg
A. calcoaceticus neg
A. haemolyticus +
A. lwoffii neg
* hemólise em ágar sangue
Tabela 2. Cocos Gram negativo, Oxidase positivo, Motilidade negativa, OF-Gli inerte
Microrganismos Urease Gelatina DNAse Mac Conkey
Moraxella(B) catarrhalis neg neg + neg
Moraxella canis neg neg + +
M. fenilpiruvica/ureolytica + neg neg +
Moraxella lacunata neg + neg neg
Moraxella spp. * neg neg neg variável
* Moraxella spp.: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis
Tabela 3. Bacilos Gram negativo, Oxidase negativa, Motilidade positiva, OF-Gli oxidativo ou
inerte
Microrganismos Arginina DNAse Lisina Polimixina *
Pseudomonas luteola + neg neg sensível
Pseudomonas oryzihabitans neg (14+) neg neg sensível
B. cepacia neg neg 80%+ resistente
S. maltophilia neg + 93%+ resistente
* Fazer antibiograma com polimixina

Mod V - 35
Provas opcionais
Microrganismos Esculina PYR Imipenem *
Pseudomonas luteola + + sensível
Pseudomonas oryzihabitans neg + sensível
B. cepacia variável neg variável
S. maltophilia variável neg resistente
* Fazer antibiograma com Imipenem
Tabela 4. Oxidase positiva, Motilidade negativa e OFG Oxidativo, Bacilos com
pigmento amarelo e Crescimento em MC variável
Microrganismos Indol DNAse Polimixina Uréia
Chryseobacterium meningosepticum + + resistente neg
C. indologenes + neg resistente neg
Sphingomonas paucimobilis neg neg sensível neg
Sphingobacterium spp. * neg variável resistente +
* S. multivorum, S. spiritivorum
Tabela 5a. Bacilos Gram negativo, Oxidase positiva, Motilidade positiva, OF GLI oxidativo -
vide fluxograma para facilitar interpretação
Microrganismos Polimixina Lisina Arginina NaCl
6,5%
Gelatina 42ºC Característica
A. xilosoxidans sensível neg neg neg neg + 86
P. aeruginosa sensível neg + 82 + pigmento
P. fluorescens sensível neg + + neg
P. putida sensível neg + neg neg
P. stutzeri sensível neg neg + neg variável seca
B. pseudomallei resitente neg + +79% +
B. cepacia resistente 80%+ neg 20%+ 83%+
S. paucimobilis * sensível neg neg + neg pigm. amarelo
Shewanella spp. sensível neg neg variável variável variável
* Mot positiva = Temperatura ambiente
Provas complementares 1, 2
Microrganismos Esculina * PYR * Microrganismos Esculina * PYR *
A. xilosoxidans neg + B. pseudomallei variável neg
P. aeruginosa neg variável B. cepacia variável neg
P. fluorescens neg variável S. paucimobilis* + 25+
P. putida neg neg Shewanella spp. neg +
P. stutzeri neg neg
* provas da esculina e PYR úteis apenas para diferenciar as bactérias lisina e arginina negativas

Mod V - 36
Tabela 5b. Bacilos Gram negativos não fermentadores, Oxidase positiva,
Motilidade positiva, com H2S no TSI, OF Glicose variável, DNAse positiva
Bactéria Cresc. 42o
C NaCl 6,5%
Shewanella putrefaciens neg neg
Shewanella alga + +
Fluxograma Auxiliar para Tabela 5
Lisina positiva Burkholderia cepacia
Polimixina R
negativa
negativa
arginina positiva
polimixina polimixina
R S
B. pseudomallei crescimento a 42o
C
R S
B. cepacia esculina
positivo negativo
P. aeruginosa gelatina
positiva negativa
S. paucimobilis NaCl 6,5%
positiva negativa
P. putida P. fluorescens
positivo negativo
DNAse P.stutzeri
S. putrefaciens A. Xylosoxidans
positivo negativo

Mod V - 37
Tabela 6. Bacilos Oxidase positiva, Motilidade positivo, OF-Gli alcalino - incubar 72 h.
Microrganismos Uréia NaCl 6,5% DNAse
A. denitrificans variável neg neg
Alcaligenes faecalis neg + neg
B. bronchiseptica ++ neg neg
S. malthophilia * neg 78% neg +
*raramente pode ser oxidase positiva
Prova complementar 2
Microrganismos PYR
A. denitrificans +
Alcaligenes faecalis neg
B. bronchiseptica neg
S. malthophilia neg
Tabela 7. Bacilos e coco-bacilos Gram negativos não fermentadores, Oxidase positiva, OF
Glicose variável, com pigmento róseo (1)
Microrganismos Motilidade Morfologia Urease Mac
Conkey
Cresc.
42o
C
Obs.
Methylobacterium spp. + bacilos + neg neg colônia seca
coral
Roseomonas spp. variável Coco-bacilos + + + colônias mucóides
rosadas
TABELAS DE CONSULTA PARA IDENTIFICAÇÃO DE NÃO FERMENTADORES
Oxidase e motilidade negativos
Microrganismos OXI MOT Morf. OF-G Cresc.
a 42ºC
CIT MAL GEL HEM
A. baumannii neg neg coco O + + + neg neg
A. calcoaceticus neg neg coco O neg + + neg neg
A. haemolyticus neg neg coco Inerte/
oxidativo
neg + neg + +
A. lwoffii neg neg coco inerte neg neg neg neg neg
Acinetobacter spp. neg neg coco Inerte/
oxidativo
neg + variável variável variável
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia CIT = citrato MALO = malonato GEL = gelatina
OFG = meio de oxidação fermentação da glicose de Leifson HEM = hemólise em ágar sangue

Mod V - 38
Oxidase negativo e Motilidade positiva
Microrganismos Oxidase Motilidade Morfologia OF-Glicose Imipenem
P. luteola neg + bacilo oxidativo sensível
P.oryzihabitans neg + bacilo oxidativo sensível
S. maltophilia neg + bacilo 85% oxid. resistente
B. cepacia 14% neg + bacilo oxidativo resistente
Microrganismos Esculina Dnase Lisina Argina Mac Conkey 42o
C
P. luteola + neg neg + + 94%+
P.oryzihabitans neg neg neg 14%+ + 33%+
S. maltophilia 39%+ + + neg + 48%+
B. cepacia 63%+ neg 80%+ neg + 83%+
Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-Glicose oxidativo
Microrganismos OXI MOT Morf OF-G Uréia Indol DNAse MC Poli
C. meningosepticum + neg bacilo oxidativo
lento
neg + + variável resistente
C. indologenes + neg bacilo oxidativo
lento
neg + neg variável resistente
S. paucimobilis 1
+ Neg 2
bacilo oxidativo neg neg neg variável sensível
Sphingobacterium spp. + neg bacilo oxidativo var neg variável variável resistente
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia MC = Mac Conkey Poli = polimixina
OFG = meio de oxidação fermentação da glicose de Leifson
1
pode ser motilidade positiva a 20o
C
2
a 37o
C
Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-Glicose inerte e cocóide
Microrganismos OXI MOT Morf OF-G Uréia GEL DNAse MC
M. catarrhalis + neg coco inerte neg neg + neg
M. canis + neg coco inerte neg neg + +
M. fenilpiruvica / ureolytica + neg coco inerte + neg neg +
M. lacunata + neg coco inerte neg + neg neg
Moraxella spp. * raras + neg coco inerte neg neg neg variável
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia MC = Mac Conkey GEL = gelatina
* Moraxella spp.: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis

Mod V - 39
Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-Glicose inerte ou alcalino
Microrganismos OXI MOT Morf OF-G MC Uréia CIT Nat
ito
Nit
gás
Cresc.
42o
C
A. denitrificans + + bacilo alcalina + nt + +
A. piechaudii + + bacilo alcalina + neg + neg
Alcaligenes faecalis + + bacilo alcalina + neg neg +
B. bronchiseptica + + coco-
bacilo
alcalina + ++ + neg
Comamonas spp. + + bacilo inerte + neg + + neg variável
P.pseudoalcaligenes + + bacilo inerte + neg variável + neg +
P. alcaligenes + + bacilo inerte + neg variável 54+ neg neg
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia MC = Mac Conkey CIT = citrato
nt= não testado (não citado na literatura)
Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-Glicose oxidativo
Microrganismos Oxidase Motilidade Morfologia OF-Gli Cresc. 42o
C
A. xilosoxidans + + bacilo oxidativo nt
P. aeruginosa + + bacilo oxidativo +
P. fluorescens + + bacilo oxidativo neg
P. mendocina (rara) + + bacilo oxidativo +
P. putida + + bacilo oxidativo neg
P. stutzeri + + bacilo oxidativo 69
S. paucimobilis + + bacilo oxidativo nt
B. cepacia 86% + + bacilo oxidativo 83% +
B pseudomallei + + bacilo oxidativo +
S. putrefaciens + + bacilo oxidativo V
Microrganismos Gelatina Esculina Polimixina Mac Conkey Lisina Arginina
A. xilosoxidans nt neg sensível + nt variável
P. aeruginosa 82% + neg sensível + neg +
P. fluorescens + neg sensível + neg +
P. mendocina (rara) neg neg sensível + neg +
P. putida neg neg sensível + neg +
P. stutzeri neg neg sensível + neg neg
S. paucimobilis nt + sensível variável nt neg
B. cepacia 20% + 63% + resistente + 80% + neg
B pseudomallei 79% + 59% + resistente + neg +
S. putrefaciens variável neg sensível + neg neg

Mod V - 40
Bactérias não fermentadoras com pigmento rosa
Microrganismos OXI MOT Morf OF-Gli Uréia Mac
Conkey
Cresc.
42o
C
Obs.
Methylobacterium spp. + + bacilo variável + neg neg Colônia seca
coral, bacilos
com
vacúolos
Roseomonas spp. + variável coco-
bacilo
variável + + + Colônias
mucóides
rosadas
cocobacilos
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia

Mod V - 41
5. BACILOS CURVOS OU ESPIRALADOS
INTRODUÇÃO
Este capítulo apresenta os principais bacilos curvos ou espiralados de importância clínica, relacionados
às principais patologias, fontes de infecção e recursos diagnósticos para sua caracterização. Por se
tratar de agentes raros, com exceção dos Campylobacter spp., não serão abordados em profundidade,
devendo o microbiologista encaminhar a cepa isolada para Laboratório de Referência ou consultá-lo
sobre recursos disponíveis para tentativa de isolamento.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS CURVAS OU ESPIRALADAS
Agente Doença Reservatório Transmissão
Arcobacter spp. Bacteremia gastroenterite Gado, humanos Alimentos 1
Borrelia burgdoferi Doença de Lime Roedores Carrapatos
Borrelia recurrentis Febre recorrente
epidêmica
Humanos Sarna (P.humanus)
Campylobacter coli/
jejuni
Gastroenterite Alimentos contaminados Alimentos 1
Campylobacter fetus Bacteremia, infecção
extranegintestinal
Humanos Fecal-oral
Helicobacter pylori Gastrite, úlcera péptica Humanos, macacos, gatos Fecal-oral
Helicobacter spp. Gastroenterite,
bacteremia, etc.
Animais domésticos Fecal-oral, alimentos
Leptospira spp. Leptospirose Cães, gatos, porcos, ratos Alimentos-água 2
Treponema pallidum Sífilis Humanos Sexual
Vibrio spp. Gastroenterite Alimentos, água Alimentos 1
1
- Ingestão de alimentos e água contaminados
2
- Alimentos ou água contaminados com urina de animal infectado
RECURSOS DIAGNÓSTICOS
Agente Testes *
Arcobacter spp. - Microscopia: bacilos Gram negativos curvos ou helicoidais
- Cultura: cresce entre 15 a 30o
C em ambiente específico de combinação de gases
em CAMPY-CVA.
- Sorologia: Não disponível
Borrelia burgdorferi
(doença de Lyme)
- Microscopia: espiroquetas coradas por coloração de prata de Warthinneg Starry
ou anticorpos marcados por fluoresceína em tecidos
- Cultura: meio BSK II em microaerofilia entre 30-37o
C por 6 semanas
- Sorologia; Imunofluorescência e ELISA
Borrelia spp. - Microscopia: espiroquetas coradas pelo Giemsa, Wright de amostras de sangue
- Cultura igual de B. burgdorferi
Campylobacter coli - Microscopia: bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram.
e C. jejuni - Cultura: cresce a 37 e 42o
C em em ambiente específico de cambinação de gases
em Campy-CVA
Campylobacter fetus - Microscopia:bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram
- Cultura: cresce em ágar sangue a 37o
C, mas não a 42o
C em ambiente específico
de cambinação de gases

Mod V - 42
Helicobacter pylori - Microscopia: biópsia gástrica corada por H&E, Giemsa ou coloração pela prata de
Warthin-Starry.
- Recurso rápido; teste da urease em biópsia gástrica (sensibilidade>90%)
- Cultura: cresce em meios seletivos ou não em microaerofilia a 37o
C por 5-7dias
- Sorologia: útil para determinar doença ativa por Enzima-Imunoensaio
Leptospira spp. - Pesquisa no sangue, LCR e urina:microscopia em campo escuro (baixa
sensibilidade) ou por imunofluorescência direta
- Cultura: primeiros 10 dias de doença - LCR e sangue colhido com heparina em
meio de Fletcher incubado à temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura
do sedimento urinário alcalinizado após a 1ª semana da doença.
- Sorologia: aglutinação ou ELISA são sensíveis e específicos
Treponema pallidum - Linfa de lesões observadas em campo escuro ou coloração pela prata (Fontana);
presença de espiroquetas. Imunofluorescência direta mais sensível
- Sorologia: VDRL ou FTA-abs são muito úteis para diagnóstico
* Recursos não citados: não úteis ou não disponíveis
BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly
Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina.
CAMPYLOBACTER
MATERIAL
Em caso de gastroenterite colher fezes e enviar rapidamente ao laboratório ou em meio de transporte
de Cary-Blair semi-sólido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais, estas podem
suportar o crescimento do C. fetus que é a espécie que causa com maior freqüência infecções extra-
intestinais.
MICROSCOPIA
A coloração de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina básica a 0,1%
durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presença de leucócitos, mas a ausência não
contra-indica a cultura ou a suspeita diagnóstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90%
e elevada especificidade.
Principais espécies de Campylobacter e Arcobacter
Bactéria Catalase H2S-TSI Cresc.
15o
C
Cresc.
25o
C
Cresc.
42o
C
Mac
Conkey
Ácido
Nalidixico
Cefalotina
C. jejuni + neg neg neg + + sensível ou
resistente
resistente
C. coli + neg neg neg + + sensível resistente
C. fetus + neg neg + neg + sensível ou
resistente
sensível
Campylobacter
spp.
variável + neg neg + variável sensível ou
resistente
sensível *
Arcobacter + neg + + variável variável sensível variável
* C. lari = resistente
ISOLAMENTO
A maioria das espécies de Campilobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de CO2, 10% de
CO2 e 85% de N2 (microaerofilia), obtidos com geradores específicos e não apenas com vela. Para
aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtração das fezes em filtro de acetato de
celulose >0,45 mµ. Vários são os meios de cultura específicos para coprocultura por serem seletivos,
sendo na atualidade os mais recomendados o ágar carvão desoxicolato cefoperazona, o meio Campy
CVA (Cefoperazona , Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia ágar, carvão
ativado e suplemento de antibióticos).

Mod V - 43
Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios não seletivos com geradores para
microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42o
C (todos crescem a 37o
C). No exame direto
em gota direto no microscópio entre lâmina e lamínula pode-se observar a motilidade tipo hélice em
movimento.
As provas de crescimento devem ser feitas em ágar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em
microaerofilia. O teste de sensibilidade ao ácido nalidíxico e cefalotina pode ser feito em qualquer
meio não seletivo e será considerado sensível a presença de qualquer tamanho de halo.
VIBRIOS, AEROMONAS E PLESIOMONAS
A suspeita da presença de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas é evidenciada pelo:
Isolamento de bactéria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase
positiva.
Materiais clínicos que podem, eventualmente, ser associados com maior frequência de isolamentos
de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas.
Principais bactérias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associação com
diferentes quadros clínicos:
Bactéria Diarréia Infecções partes
moles
Sepse Outros
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
freqüente pouco comum raro raro
Plesiomonas shigeloides freqüente raro freqüente * raro
Aeromonas hydrophila freqüente frequente freqüente freqüente
Aeromaonas caviae freqüente raro freqüente freqüente
Aeromonas veronii freqüente raro freqüente freqüente
* associado à meningite em recém-nascidos
VIBRIO
As espécies do Gênero Vibrio são bacilos curvos ou às vezes retos, longos, anaeróbios facultativos,
móveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gás, e oxidase positivas. Além do Vibrio
cholerae, existem mais de 10 espécies patogênicas para o ser humano. Algumas espécies podem
causar gastroenterite, outras infecções cutâneas e bacteremias.
A cólera, é causada pelo V. cholerae produtor de toxina (dois biotipos: clássica e El Tor), responsável
por diarréia secretória disseminada por via fecal-oral (água e alimentos contaminados) em surtos e
epidemias associadas à falta de condições sanitárias adequadas. O quadro clínico pode variar de
assintomático a diarréia aguda com morte em 5 horas por desidratação e distúrbio eletrolítico. Casos
esporádicos podem ocorrer por ingestão de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos.
A coleta do material quando for fecal deverá ser feita utilizando o meio de transporte de Cary & Blair,
e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio deverão ser encaminhadas a Laboratório de Referência,
para registro epidemiológico.
Algumas outras espécies de Vibrios além do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. Ágar
sangue e Mac Conkey permitem o crescimento da maioria das espécies, e neste último meio as
colônias são semelhantes a de bastonetes não fermentadores. A diferença é que no TSI, EPM ou IAL
há fermentação da glicose, como ocorre também com Aeromonas e Plesiomonas. São oxidase
positivas, a maioria é esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl
6%.

Mod V - 44
AEROMONAS E PLESIOMONAS
Vivem em ambientes aquáticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em água de
fonte, água de lagos, águas poluídas, etc. Plesiomonas preferem águas tropicais e não marinhas,
sendo a Aeromonas mais tolerante às diferentes condições. Aeromonas têm sido isoladas em carnes,
meio ambiente aquático e produtos do mar, e suas diferentes espécies causam doenças não só no
homem como em animais, peixes, répteis, cobras e pássaros.
Em nossa experiência é comum o isolamento de Aeromonas em abscesso pós-picada de cobra, líquido
biliar em pacientes com colicistite, diarréia, sepse (em pacientes com doença hepática crônica) e
abscessos cutâneos pós-acidentes (corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar
Aeromonas e Plesiomonas depende da adoção do procedimento em se fazer o teste da oxidase em
bactérias com características de Escherichia coli lactose negativa.
As principais características das Aeromonas são: lactose negativa, H2S negativo, fenilalanina negativa,
indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos (Mac Conkey e
Salmonella-Shigella).
Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp., E.coli e Citrobacter spp.
Bactérias Citrato Uréia Lisina H2S Lactose Gás
E. coli neg neg + neg + +
Citrobacter spp. + variável neg variável variável +
Aeromonas spp. variável neg + neg neg 1
variável
1
- Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva
Provas diferenciais para bactérias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas,
Plesiomonas e Vibrio
Provas V. cholerae Outros
vibrios
Aeromonas spp. Plesiomonas spp.
Cresce sem NaCl 1
+ neg 2
+ +
Cresce com 6% NaCl 1
+ + neg neg
Oxidase + + + +
DNAse + + + neg
1
- crescimento em caldo nutriente
2
- exceto V. mimicus
Provas para diferenciar as principais espécies de Aeromonas e Plesiomonas
Bactérias Indol LIS ARG ORN ARA LAC SAC ESC HEM *
A. hydrophila + + + neg + neg + + +
A. caviae + neg + neg + + + + neg
A. sobria + + + neg neg neg + neg +
A. veronii + + neg + neg neg + + +
A. jandaei + + + neg neg neg neg neg +
A. schubertii neg + + neg neg neg neg neg Variável
Plesiomonas
shigelloides
+ + + + neg neg neg neg neg
LIS = lisina ARG = arginina ORN = orninina ARA = arabinose LAC = lactose SAC = sacarose
ESC = esculina HEM * = hemólise / sangue carneiro

Mod V - 45
6. BACILOS GRAM POSITIVOS
INTRODUÇÃO
Este capítulo aborda os aspectos práticos para identificação dos principais bacilos Gram positivos de
importância clínica.
Bactérias consideradas:
Corineformes Arcanobacterium spp., Corynebacterium spp., G. vaginalis, Oerskovia
spp., Rhotia spp.
Bacilos Gram
positivos regulares
Erisipelotrix spp., Listeria spp., Kurthia spp.
Esporulados Bacillus spp.
Bacilos ramificados
(Actinomycetos)
Nocardia spp., Rhodococcus spp., Streptomyces spp.
Bactérias Gram positivas que são citadas no texto para fins de diagnóstico diferencial, mas que foram
abordadas em outros capítulos são:
Actinomyces spp. (anaeróbios)
Clostridium spp. (anaeróbios)
Lactobacillus spp. (anaeróbios)
Mycobacterium spp. (micobactérias)
Outros anaeróbios:
Mobiluncus spp.
Propionibacterium spp.
Eubacterium
Bifidobacterium spp.
Os Actinomyces spp. e alguns Propionibacterium spp. embora anaeróbios, podem ser aerotolerantes, e
crescer em aerobiose.
ORIENTAÇÃO GERAL NA IDENTIFICAÇÃO DE BGPS
Para triagem inicial dos Bacilos/cocobacilos Gram positivos, algumas observações e provas são
fundamentais:
Colher material com antissepsia rigorosa para evitar contaminação.
Mesmo em líquidos estéreis há risco de contaminação, por isso pede-se a coleta de no mínimo
duas hemoculturas. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presença de neutrofilia
reforçam a hipótese de ser agente infeccioso.
Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos.
Procurar sempre ter bacterioscopia do material clínico onde foi isolado o Bacilo Gram Positivo
(BGP) e verificar se há predomínio do agente em questão; é relevante o achado dentro de
macrófagos / neutrófilos.
Valorizar materiais nobres (sangue, LCR, pericárdico, etc.), biópsias, aspirados de abscessos, LBA,
etc., desde que a bacterioscopia e o quadro clínico sejam compatíveis.
Cuidado com contaminação por bactérias da flora de mucosas.
Em caso de abscessos é interessante fazer semeadura quantitativa (com alça calibrada), sendo
sugestivo o isolamento de >104
UFC/ml.
Em urina é sugestivo quando isolado como único agente, bacterioscopia concordante, leucocitúria,
sintomas de infecção urinária e contagem >105
UFC/ml.
Observar características da colônia: cor, tamanho, cheiro, consistência, hemólise, etc.
Testar em quais meios cresce o BGP e suas condições de incubação.
Para observar esporos e hifas aéreas algumas vezes é necessário deixar a colônia envelhecer ou
crescer em meios pobres.

Mod V - 46
É sempre interessante semear em meio sólido e em caldo para observar variação morfológica;
observar ramificações em diferentes condições e meios de cultivo.
Fazer coloração de Ziehl ou de Kinyoum para pesquisa de álcool-ácido resistente.
Lembrar que este grupo de bactérias pode variar muito nas características morfológicas quando
observado no material clínico culturas jovens, culturas velhas, meios sólido ou líquido, meio rico
ou pobre, etc., sem que represente contaminação ou cultura mista. No entanto, algumas destas
bactérias são habitantes de mucosas e podem causar infecção mista associada ou não com
anaeróbios estritos.
CORINEFORMES
São classificados como corineformes as seguintes bactérias:
Arthrobacter spp.
Brevibacterium spp.
Curtobacterium spp.
Exiguobacterium spp.
Arcanobacterium spp.
Microbacterium spp.
Aureobacterium spp.
Turicella spp.
Dermabacter spp.
Gardnerella spp.
Rothia spp.
Cellulomonas spp.
Entre os corineformes foram selecionados aqueles de maior importância clínica, sendo recomendável a
caracterização e provas diferenciais apenas dos gêneros:
Arcanobacterium spp.
Gardnerella spp.
Rothia spp.
PRINCIPAIS DOENÇAS ASSOCIADAS AOS BACILOS GRAM POSITIVOS
Bactéria Quadro clínico
Actinomyces spp., A. israelii, A. naeslundii,
A. viscosus, A. odontolyticus e outros
Actinomicose, doença granulomatosa predominante
cervico-facial
Arcanobacterium spp., A. nhaemolyticum faringite, infecção de partes moles, endocardite, etc
Bacillus sp, B. anthracis, B. cereus Antraz, intoxição alimentar, sepse e pneumonia em
imunossuprimidos e neutropênicos
C. diphtheriae, C. ulcerans difteria
C. jeikeium endocardite, bacteremia
C. pseudotuberculosis Zoonose, linfadenite e abscessos
Erysipelotrix sp celulite em veterinários e zona rural
Gardnerella spp. vaginose, endometrite, pós-parto
Lactobacillus spp. flora oro-intestinal e vaginal, raríssimo patógeno
Listeria spp. meningite, sepses, aborto
Nocardia spp. abscesso cerebral, abscesso pulmonar, etc. em
imunocomprometidos
Oerskovia spp. bacteremia, infecção associada a corpo estranho
Rhodococcus spp. pneumonia, abscessos, etc. em imunocomprometidos
Rothia spp., R. dentocariosa endocardite, bacteremia, infecções respiratórias
Streptomyces spp. Oportunista, infecções de partes moles, etc.

Mod V - 47
Triagem inicial para Bacilos e Cocobacilos Gram positivos
Bactéria Esporo Anaer. AAR * Ramif. Hemólise Catalase Obs.
Actinomyces spp. neg + neg neg neg V
Arcanobacterium spp. neg neg neg raro /curto beta neg Pleomórfico
Bacillus spp. + neg neg neg variável +
Clostridium spp. + + neg neg variável neg
Corinebacterium spp. neg neg neg neg neg variável paliçada
Erisipelotrix
rhustiopathie
neg neg neg neg alfa neg H2S +
Gardnerella vaginalis neg neg neg neg beta /coelho neg Gram lábil
Lactobacillus spp. neg + neg neg neg variável
Mobiluncus spp. neg + neg neg neg neg móvel
Listeria spp. neg neg neg neg beta + móvel
Mycobacterium spp. neg neg + variável neg + cresc. lento
Nocardia spp. neg neg + + neg + col. laranja
Oerskovia spp. neg neg neg variável neg + col. amarela
Ppropionibacterium
spp.
neg + neg + neg variável
Rhodococcus spp. neg neg variável variável neg + col. coral
Rhotia dentocariosa neg neg neg + neg + Pleomórfico
Streptomyces spp. neg neg neg + neg + raro, hifas
* AAR = alcool-ácido resistente
É importante destacar que os corineformes correspondem a um grupo não homogêneo de bactérias
com poucas características em comum sendo também morfologicamente muito distintos:
CORYNEBACTERIUM SPP
O gênero Corynebacterium compreende cerca de 50 espécies, sendo cerca de 30 de algum interesse
médico.
Estas espécies podem ser diferenciadas por
provas como:
Principais características:
OF glicose
redução de nitrato
urease
utilização de diferentes carboidratos
reação de CAMP
não se ramificam
não são alcool-ácido resistentes
catalase positivas
imóveis
esculina e gelatina negativas
MORFOLOGIA
Variam muito na morfologia das diferentes espécies, e mesmo mesmas culturas em diferentes
condições de cultivo. São bacilos Gram positivos, retos ou ligeiramente curvos, com extremidades em
geral arredondadas, com a forma de clava, podendo apresentar arranjos característicos em paliçada
ou letras chinesas, podendo ou não apresentar grânulos metacromáticos, que são melhores
visualizados através da coloração de Albert-Laybourn, e que caracterizam as bactérias conhecidas
como difteróides. As corinebactérias de maior importância clínica são catalase positivas, imóveis
podendo ser fermentadoras ou não.
São muitas as corinebactérias que se pode isolar em material clínico, entretanto, é de pouco interesse
aprofundar na caracterização destas espécies, exceto para fins de pesquisa ou epidemiológicos.

Mod V - 48
CORINEBACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Considera-se fundamental o laboratório de microbiologia poder caracterizar ou afastar a possibilidade
de isolamento das espécies de C. diphtheriae e C. ulcerans que podem pproduzir a toxina diftérica.
Outra espécie de importância em infecções hospitalares e frequentemente isolada em material clínico
é a C. jeikeium.
Difteria
Em virtude da vainação compulsória, a difteria na atualidade é uma doença rara em pacientes
imunizados, mas de importância epidemiológica quando detectada. A infecção caracteriza-se por
processo infeccioso localizado no trato respiratório e manifestações tóxicas no coração e nervos
periféricos.
Quadro clínico Coleta de material Processamento do
material
Bacterioscopia
Ocorre dor de garganta,
dificuldade de deglutição,
presença de
pseudomembrana
purulenta, dor no corpo,
cefaléia, náuseas e febre.
A morte pode ocorrer por
obstrução respiratória ou
por miocardite. Pode
ocorrer difteria cutânea
com lesões necróticas e,
eventualmente, presença
de pseudomembrana.
O material de orofaringe
ou nasofaringe deve ser
colhido das bordas, abaixo
da pseudomembrana
purulenta.
Semear em meios não
específicos como ágar
sangue e ágar chocolate
para pesquisa do
Streptococcus pyogenes e
outros patógenos
eventuais, e encaminhar
outro swab em meio de
transporte para o
laboratório de referência.
Os meios específicos para
a pesquisa de bacilo
diftérico são os meios de
enriquecimento de
Loeffler e o meio seletivo
e diferencial ágar sangue-
cistina-telurito.
A bacterioscopia do
esfregado do material,
bem como do
crescimento no meio de
Loeffler, após coloração
de Gram pode ser
sugestiva caso sejam
visualizados bacilos
difteróides, melhor
caracterizados pela
coloração de Albert-
Laybourn.
A identificação
bioquímica das
Corynebactérias
potencialmente
produtoras de toxina é
difícil em laboratório não
especializado.
Recomenda-se, nestes
casos, encaminhar o
material ou contactar o
Laboratório de
Referência para
orientação.
PROVAS DIFERENCIAIS PARA OS CORINEFORMES
Bactéria Catalase O/F 1
Motilidade Uréia Esculina CAMP
Reverso
Hemólise
Arcanobacterium spp. neg F neg neg neg + beta
C. diphteriae + F neg neg neg neg neg
C. jeikeium + O neg neg neg neg neg
C.ulcerans
/Pseudotuberculosis
+ F neg + neg + neg
Corinebacterium spp. + F variável variável neg neg neg
Gardnerella vaginalis neg F neg neg neg neg beta 2
Oerskovia spp. + F variável neg + neg neg
Rhotia spp. variável F neg neg + neg neg
1
Base CTA (cystine tripticase ágar) O = oxidativo e F = fermentador
2
ágar sangue de coelho

Mod V - 49
C. PSEUDOTUBERCULOSIS
Importância
clínica
Deve ser lembrado nos casos de veterinários ou trabalhadores de zona rural com quadro de
linfadenite, linfangite ulcerativa ou abscesso relacionado a manuseio de aborto de gado. Esta
espécie pode ser produtora de toxina diftérica.
Isolamento e
Identificação
As colônias são pequenas, branco-amareladas, urease positiva, CAMP reverso positivo (inibe
a beta-hemólise do S. aureus em ágar sangue com hemácias de carneiro).
C. JEIKEIUM
Características
gerais
Colônia pequena cinza ou translúcida, a bacterioscopia é um pequeno coco-bacilo gram
positivo, resistente a vários antibióticos (beta-lactâmicos, gentamicina, etc).
Importância
clínica
Associada a septicemia, endocardite, infecções de pele e tecido subcutâneo. Infecções mais
severas podem ocorrer em imunossuprimidos, como meningite, pneumonia e peritonite ou
associada a próteses e procedimentos invasivos.
Isolamento e
Identificação
Cresce em BHI com 1% de Tween 80, sendo lipofílica e não em caldo BHI sem Tween 80.
Apresenta metabolismo oxidativo na base CTA, enquanto a maioria das Corynebacterium
spp. de importância clínica são fermentadoras. Oxida a glicose, é uréia negativa, esculina
negativa, PYR positiva.
ROTHIA * DENTICARIOSA
Características
gerais
São bacilos Gram positivo retos, sendo alguns ramificados.
Importância
clínica
Pertence à microbiota da cavidade oral, e está raramente associada à endocardite.
Isolamento e
Identificação
As colônias são brancas salientes e às vezes rugosas. São fermentadores da glicose e
esculina positiva.
* Rhotia spp.: São pleomórficos podendo apresentar-se tanto na forma cocóide como de bacilos. São catalase
positiva, imóvel e fermentador.
ARCANOBACTERIUM SPP.
Características
gerais
São bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatação terminal e ramificações
rudimentares.
Importância
clínica
Arcanobacterium haemolyticum tem sido considerado juntamente com S. pyogenes como
agentes patogênicos em orofaringe, identificados e relatados com a finalidade de tratamento.
Está associado com infecções de partes moles, faringite em jovens e raros casos de
septicemia, endocardite e osteomielite.
Isolamento e
Identificação
Crescem em 24-48h como colônias pequenas e hemolíticas. Colônias mais velhas tendem a
adquirir a forma de coco-bacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo
tendem a formar ramificações e em anaerobiose filamentos.
São bacilos Gram positivos irregulares, catalase negativa, imóveis e fermentadores.
Espécies A. haemolyticum, A. pyogenes e A. bernardiae são hemolíticas, têm a hemólise
melhor visualizada em sangue de coelho, e crescem melhores em CO2. Pode se apresentar
como dois tipos de colônias no mesmo cultivo: lisas, mucóides e brancas ou secas e cinza.
Produz a prova de CAMP reverso (inibição da hemólise).
GARDNERELLA SPP.

Mod V - 50
Características
gerais
São pequenos bacilos ou coco-bacilos irregulares, que se coram irregularmente pela violeta.
A principal espécie é a Gardnerella vaginalis, que tem uma classificação taxonômica incerta,
e portanto para fins didáticos, estudada com os coryneformes.
Importância
clínica
Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas
está associada à vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituição ao
Lactobacillus de Doderlein. A vaginose bacteriana e a presença de Gardnerella estão
associadas também ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite.
Esta bactéria é comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e
pós-aborto. Pode causar sepse em recém-nascidos e raramente infecção urinária em adultos.
Isolamento e
Identificação
Crescem no ágar sangue humano e de coelho produzindo hemólise beta, mas sem hemólise
no ágar sangue de carneiro.
São visualizadas e caracterizadas no exame citológico e/ou no Gram pela presença das “clue
cells”, que são células epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lábeis, de modo a
perder sua definição morfológica.
É pleomórfica, Gram variável (ora Gram negativa ora parcialmente e fracamente Gram
positiva), imóvel, sem cápsula. É um anaeróbio facultativo, fermentador lento, catalase e
oxidase negativas.
OERSKOVIA SPP.
Características
gerais
São microrganismos cocóides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de micélios,
apresentam ramificação, hifas vegetativas, sem hifas aéreas e penetração no ágar.
Oerskovia turbata e O. xanthineolytica são bactérias do meio ambiente ou solo, com pouca
importância clinica, com raros casos de bacteremia e infecções em implantes de próteses.
Isolamento e
Identificação
Cresce bem em ágar sangue de carneiro e no ágar chocolate. Cresce mal no meio de
Sabouraud dextrose. O crescimento, quando ocorre, é visível após 24-48h em anaerobiose
ou 5% CO2
.
Apresentam colônias amareladas, catalase positiva em aerobiose, oxidase negativa.
Fermentador da glicose, sacarose e lactose, hidrolisa gelatina, amido e esculina; motilidade
variável.
BACILOS GRAM POSITIVO
LISTERIA
Características
gerais
São bacilos uniformes, não ramificados, apresentando-se só ou em pequenas cadeias. A
única espécie importante para o homem entre as sete espécies conhecidas é a L.
monocytogenes. Móvel a temperatura ambiente (25 a 28o
C) e imóvel a 37o
C. Encontrada na
natureza no solo, em matéria orgânica em decomposição, água, leite e derivados, carne, etc.
Sendo encontrada como microbiota de diversos mamíferos, aves, peixes, e insetos.
Importância
clínica
Tem importância clínica particularmente para idosos e imunocomprometidos causando
meningite, encefalite ou septicemia. Na grávida a infecção pode causar amnionite, infecção
do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Pode ocorrer em
surtos, em geral relacionados a contaminação de alimentos.
Isolamento e
Identificação
Crescem em ágar sangue, ágar Chocolate, CLED, ágar nutriente, TSA e ágar Mueller Hinton,
mas não em Mac Conkey. As colônias são pequenas, crescendo melhor entre 30 a 37o
C, e
crescem também à temperatura ambiente e a 4o
C em três a quatro dias.
A partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos, água, etc., semear em ágar sangue de
carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresça também com outras bases (Mueller
Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigações
epidemiológicas.
Bacilo Gram positivo anaeróbio facultativo, catalase positiva, oxidase negativa, que produz
ácido de glicose. Hemólise beta em ágar sangue de carneiro, CAMP positivo, motilidade
positiva à temperatura ambiente, hidrólise da esculina positiva e NaCl 6,5% positiva. É Além
disso, é verificada prova da esculina rapidamente positiva, assim como uréia, gelatina, indol
e H2S negativas.

Mod V - 51
ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATHIAE
Características
gerais
Bacilo Gram positivo curto, de extremidades arredondadas, anaeróbio facultativo, não
esporulado, não alcool-ácido resistente, ocorre só em cadeias curtas ou longas, sem
ramificar. Existe na natureza, em matéria orgânica, urina, fezes e carcaça de animais. Vive
em animais, peixes e pássaros e causa erisipela em porcos. No homem causa uma zoonose
(doença ocupacional de veterinários e manuseadores de carne e animais) caracterizada por
celulite que aparece no local da inoculação após 2 a 7 dias.
Importância
clínica
A lesão costuma ser violácea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem
supuração e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente.
Disseminação da doença e endocardite podem ocorrer, particularmente em
imunossuprimidos, cujo prognóstico é grave. Cicatrização pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou
mêses, com possibilidade de recaída.
Coleta do
material
Material ideal para isolamento é a biópsia colhida de maneira asséptica. Swab da lesão em
geral é negativa, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida.
Isolamento e
Identificação
Cresce em ágar sangue, ágar chocolate, caldo tripticase soja, a 35o
C aerobiose ou 5% de
CO2. Cresce entre 5 a 42o
C e em caldo NaCL 6,5%. No ágar sangue cresce em 24 a 72h,
como colônias minúsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colônia, maior, rugosa e
chata pode aparecer, bem como uma hemólise esverdeada em baixo da colônia no ágar
sangue. As colônias lisas são bacilos ou coco-bacilos Gram positivos, às vezes corando-se
mal pelo Gram
Catalase negativa, imóvel, esculina negativa, fermenta lentamente a glicose sem produzir
gás, uréia e indol negativos, mas caracteriza-se por crescer no TSI produzindo H2S; é lactose
positiva e sacarose negativa.
KURTHIA
Características
gerais
São bacilos Gram positivos grandes em cadeias ou em paralelo, ou filamentos não
ramificados e em culturas velhas tendem a ficar cocóides ou bacilos curtos. Vivem no meio
ambiente, na água, solo, animais, sua carne e seus derivados.
Importância
clínica
Seu papel clínico é questionado, pois não há relatos recentes de isolamento em casos
significativos.
Isolamento e
Identificação
Crescem em ágar sangue como colônias de cor creme não hemolíticas, podendo ser
confundidas com Bacillus spp.
São aeróbios estritos, não esporulados, não álcool-ácido resistentes; são móveis, catalase
positiva e não fermentadores.
Principais diferenças entre bacilos e coco-bacilos Gram positivos
Bactéria Gram Catalase Motil.
25o
C
Hemólise CAMP
test
NaCl 6,5%
Esculina
Listeria
monocytogenes
bacilo curto ou coco-bacilo
regular e largo
+ + beta + + / +
Enterococcus spp. cocos ou coco-bacilos em
cadeias
neg neg Alfa, beta
gama
neg + / +
Streptococcus
beta hemolíticos
cocos em cadeias neg neg beta neg 1
neg / neg
Lactobacillus spp. coco-bacilos e cadeias
longas
neg neg não neg neg / neg
Kurthia spp. 2
bacilo grande, cadeias,
cocóide em cultura velha
+ + não neg neg / neg
Corynebacterium
spp.
bacilos e coco-bacilos
pleomórficos
+ neg variável neg variável /
neg
Erysipelotrix
rhusiopathiae 3
coco-bacilo ou filamentos
longos
neg neg alfa neg neg / neg
1
- Só S. agalactiae (beta do grupo B) é positiva 2
- Não usa glicose 3
- H2S positivo

Mod V - 52
Bacilos Gram positivos anaeróbios que devem ser diferenciados:
Lactobacillus spp. - flora da boca, intestino e flora vaginal (Bacilo de Doderlein). São aneróbios
estritos mas crescem em ágar sangue e ágar chocolate como colônias muito pequenas. São
imóveis e catalase negativa. Sem valor patogênico.
Mobilluncus - bacilos Gram positivos anaeróbios estritos, curvos, móveis que vivem na trato
genital humano e reto. Encontra-se aumentado nos casos de vaginose, juntamente com a
Gardnerella.
Propionibacterium spp., Eubacterium spp. e Bifidobacterium spp. – anaeróbios estritos que
são analisados juntamente com os demais anaeróbios.
BACILOS ESPORULADOS AERÓBIOS E ANAERÓBIOS FACULTATIVOS
Gênero Bacillus compreende cerca de 50 espécies de bacilos anaeróbios facultativos que podem
exibir a forma esporulada, corando-se mal pela violeta, quando em colônia mais velhas. As formas
vegetativas são retas largas, podendo ser grandes, isolados ou em cadeias. A forma e localização dos
endosporos são úteis para sua classificação:
podem ser cilíndricos, ovais, redondos, e eventualmente com forma de feijão
posição central, sub-terminal, terminal
dilatando ou não a célula mãe
Todos são móveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides e a maioria é catalase positiva. Na presença de
íon bicarbonato (HCO3 -) e em anaerobiose ou CO2 os B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B.
megaterium apresentam cápsula polipeptídica.
Habitat e importância clínica - Os Bacillus spp. encontram-se basicamente no solo, água, matéria
orgânica animal e vegetal nas condições mais variadas de temperatura, umidade, pH, etc. As duas
espécies mais importantes e que devem ser reconhecidas pelo laboratório de microbiologia são o B.
antrhacis e B. cereus.
Principais espécies de Bacillus relacionadas à infecção
Espécie de Bacillus Quadro clínico Frequência de relatos
Antrhacis
‫ـ‬ Antrhax cutâneo
‫ـ‬ Anthrax intestinal
‫ـ‬ Anthrax pulmonar
‫ـ‬ Bastante frequente
‫ـ‬ Raro
‫ـ‬ Raro
Cereus
‫ـ‬ Necrose ou gangrena em partes moles
‫ـ‬ Bacteremia e sepse
‫ـ‬ Intoxicação alimentar
‫ـ‬ Infecções pulmonares, endocardite, meningite,
osteomielite e endoftalmite
‫ـ‬ Bastante frequente
‫ـ‬ Frequente
‫ـ‬ Muito frequente
‫ـ‬ Frequente
Circulans
‫ـ‬ Infecções de partes moles, abscessos,
bacteremia e sepse
‫ـ‬ Frequente
Licheniformis
‫ـ‬ Bacteremia e sepse
‫ـ‬ Pouco frequente
‫ـ‬ Frequente
Subtilis
‫ـ‬ Bacteremia, sepse, endocardite e infecções
respiratórias
‫ـ‬ Muito frequente
‫ـ‬ Raro
Bacillus cereus
Pode apresentar dois tipos de intoxicação:

Mod V - 53
Caracterizado por diarréia, dor abdominal, que aparecem 8 a 16 h após a ingestão do alimento
contaminado (carnes, vegetais, leite, molhos, massas, doces, bolos).
Caracterizado por náuseas e vômitos que aparecem 1 a 5 horas após a ingestão do alimento
contaminado, principalmente arroz, mas pode ser os mesmos alimentos acima.
Bacillus anthracis
Características
gerais
No passado era causa importante de mortalidade no gado, sendo os herbívoros altamente
suscetíveis, sendo reduzida pela vacinação e melhores condições de higiene. O homem pode
adquirir a doença em contato com animais doentes (trabalhadores área rural e veterinários),
no manuseio industrial de ossos, lã, crina, e outros produtos animais e de forma eventual,
sendo a forma cutânea quase a totalidade dos casos, com raros episódios intestinais pela
ingestão de carne contaminada. Potencial risco elevado na comunidade quando usado como
arma biológica.
Quadro clínico A forma cutânea não tratada pode ser fatal (menos de 20% dos casos), principalmente
quando a lesão é próxima a cabeça ou pescoço. As formas pulmonares e intestinais são mais
graves pela dificuldade de diagnóstico. No local de inoculação da forma cutânea aparece após
2 a 3 dias uma pequena mancha ou pápula, seguida no dia seguinte de um anel de vesículas
em torno da pápula, que ulcera, seca, escurece formando uma escara característica que
cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante,
mas tem a característica de ser indolor e sem pus.
A forma intestinal é semelhante à forma cutânea atingindo a mucosa com lesões e
eventualmente gastroenterite.
No antraz pulmonar o esporo inalado é transportado pelos macrófagos do pulmão para o
sistema linfático onde os esporos germinam e causam septicemia que é fatal. Atenção ao fato
de que evolução nos casos fatais é inicialmente caracterizada por sintomas leves como
fadiga, mal-estar e febre baixa, ou às vezes até sem sintomas, quando repentinamente se
instala dispnéia, cianose, febre elevada, desorientação, falência circulatória, choque, coma e
morte em poucas horas. Em geral a bacteremia é importante.
Coleta de
material
Swab do exudato de lesões podem ser úteis; na escara, remover a crosta e colher material
com swab ou com tubo capilar, usando luvas. Na forma intestinal, fezes podem ser colhidas.
Pós-mortem, sangue venoso ou de sangramento de mucosas (sangue não coagula) pode
evidenciar o bacilo na bacterioscopia. No antraz pulmonar a hemocultura é útil nos casos
graves, mas o material pulmonar oferece menor chance de isolamento.
Isolamento e
Identificação
Em casos clínicos os Bacillus estão na forma vegetativa, mas em alimentos, produtos secos
de animais (ossos, crina, pelo) o Bacillus deverá estar em forma esporulada e haverá
necessidade de ativá-los a 62,5o
C por 15 minutos (choque térmico).
Os Bacillus crescem com facilidade em meios pobres ou ricos. Dependendo do material (ex:
fezes) poderá haver necessidade de usar meio seletivo com adição de polimixina
(100.000U/L). Colônias grandes de cor creme crescem no ágar sangue.
Diferenças entre Bacillus spp. e Clostridium spp.
Bacillus spp. Clostridium spp.
‫ـ‬ Endosporos em aerobiose
‫ـ‬ Catalase positivos
‫ـ‬ Endosporos em anaerobiose
‫ـ‬ Catalase negativos
Diferenças entre B. cereus, B. anthracis e espécies relacionadas
Espécies Colônia no AS * Motilidade Hemólise Penicilina Citrato Lecitinase
B. cereus esverdeado claro + + resistente + +
B. anthracis branco acinzentado neg neg sem variável fraco +
B. thurigiensis esverdeado claro + + resistente variável +
B. cereus subsp.
mycoides
rizóides / espalhando neg fraco + resistente + +
* ágar sangue de carneiro

Mod V - 54
O B. antrhacis virulento pode ser testado para produção de cápsula semeando-se em ágar nutriente
com 0,7% de bicarbonato de sódio em jarra com vela. O crescimento será mucóide e a cápsula poderá
ser evidenciada com a tinta da china.
ACTINOMICETOS
Grupo de bactérias Gram positivo que apresentam como características em comum a produção de
filamentos ou hifas vegetativas, sendo que alguns também apresentam hifas aéreas, semelhanças de
composição de parede e padrão de ácidos graxos celulares.
Neste grupo serão abordados os seguintes gêneros:
Nocardia spp.
Rhodococcus spp.
Streptomyces spp.
O gênero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas, é analisado juntamente com os
corineformes. Outros actinomicetos raros ou de menor importância clínica não considerados são:
Gordona spp., Tsukamurella spp., Actinomadura spp., Nocardiopsis spp.
Informações importantes sobre Actinomicetos
Para a adequada caracterização dos Actinomicetos, que apresentam alguma semelhança morfológica
com os fungos, é importante considerar:
A origem do material, valorizando os abscessos.
A quantidade de microrganismos isolados e correlação com a bacterioscopia do material.
Possibilidade de contaminação com bactérias da mucosa oral.
Pigmento da colônia.
Análise morfológica da bactéria pelo microcultivo em lâmina idêntico ao utilizado na secção de
Micologia, empregando ágar fubá sem dextrose a 25o
C.
Identificação presuntiva de actinomicetos
Gênero Micélio aéreo Conídio Metabolismo glicose
Nocardia + oxidativo
Rhodococcus neg neg oxidativo
Oerskovia neg neg fermentativo
Rhotia neg neg fermentativo
NOCARDIA SPP.
Características
gerais
São bacilos Gram positivo ramificados e filamentosos, aeróbios estritos, catalase positivo,
imóveis, que se fragmenta em bacilos e cocos irregulares.
Produz hifas aéreas à medida que o cultivo envelhece. Existem 12 espécies sendo as mais
importantes N. asteroides e N. brasiliensis.
Importância
clínica
Está associada ao solo e vegetais. As formas clínicas podem ser bem distintas: pulmonar
(abscessos), extra-pulmonar localizada, sistêmica, sistema nervoso central (abscessos),
partes moles e micetoma. É considerada uma bactéria oportunista, pois a maioria dos casos
não cutâneos e micetomas ocorrem em pacientes imunocomprometidos.
Coleta de
material
Quando colhido o material por punção, biópsia ou mesmo swab da lesão profunda, deve ser
processado rapidamente; existe uma característica do material descrita como grânulos de
enxofre, especialmente nos micetomas.

Mod V - 55
Isolamento e
Identificação
Não é bactéria exigente, crescendo em ágar sangue, ágar chocolate, ágar Sabouraud
dextrose, ágar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen. Cresce entre 72h a 14 dias.
Com exceção da N. asteroides, a maioria das nocardias apresentam beta-hemólise em ágar
sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte única de carbono),
juntamente com Rhodococcus e algumas micobactérias.
Em microcultivo é possível visualizar as hifas ramificando-se em angulo reto, podendo
apresentar ramificações secundárias, bem como hifas aéreas. Em cultura mais velhas em
ágar tornam-se visíveis as hifas aéreas nas colônias rugosas. As micobactérias de
crescimento rápido podem apresentar ramificações bem curtas em ângulo agudo e sem
ramificações secundárias.
Uma característica importante é a cor das colônias em Sabourad dextrose ágar ou mesmo
em outros meios:
- salmão ou laranja claro – N. asteroides
- laranja escuro – N. brasiliensis
A Nocardia brasiliensis é uréia positivo, citrato positivo e gelatina positiva.
A Nocardia asteroides é uréia positivo, citrato variável e gelatina negativa.
Bacterioscopia
e Histologia
A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificações e parcialmente ou
fracamente álcool-ácido resistentes pelo Ziehl ou coloração de Kinyoun. Cortes histológicos
corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grânulos, mas não os filamentos da
bactéria. O Gram ou a coloração de metenamina prata de Gomori são úteis.
RHODOCOCCUS SPP.
Características
gerais
O R. equi é uma bactéria oportunista, causando pneumonia em imunocomprometidos,
apresentando uma evolução lenta e granulomatosa, com infiltrados que evoluem para
cavitação. Pode causar também abscessos no sistema nervoso central, tecido subcutâneo,
linfadenite, etc.
Diagnóstico clínico diferencial deve ser feito com micobactérias, fungos, nocardia e
actinomyces. Hemoculturas com elevada frequência podem ser positivas.
Coleta de
Material
Lavado bronco-alveolar (LBA), biópsias, hemocultura e mesmo escarro. Em material clínico o
Rhodococcus pode ser visualizado no interior de macrófagos e extra-celular, na forma de
cocos ou coco-bacilos. Em hemoculturas, LBA e escarro eventualmente pode ser observado
na forma filamentosa.
Isolamento e
Identificação
Em microcultivo o R. equi cresce de forma típica como coco-bacilo ou bacilo em zig-zag. Em
Heart Infusion ágar (HIA) cresce em 6 horas a 35o
C como bacilo Gram positivo e em 24
horas apresenta-se cocóide. A forma de ramificações rudimentares a partir dos filamentos
pode ocorrer em culturas jovens em meio líquido.
Em HIA cresce entre 28 e 35o
C, entre 2 a 4 dias, mas não a 45o
C. Pode crescer na forma de
colônias rugosas (com hifas aéreas) ou lisas ou mucóides. Pode apresentar a cor coral ou
rosa pálido que são mais freqüentes, mas pode ser amarela ou incolor.
A coloração pelo Ziehl ou Kinyoun pode revelar a fraca alcool-ácido resistência.
STREPTOMYCES SPP.
Características
gerais
Alguns milhares de espécies de Streptomyces já foram caracterizados, sendo na quase
totalidade saprófitas. O Streptomyces somaliensis é responsável pelo micetoma de cabeça e
pescoço. Outras espécies foram identificadas em casos de pericardite crônica e infecções de
partes moles pós-traumáticas (S. griseus).
Isolamento e
Identificação
O abscesso pode revelar a presença de grânulos duros. O Gram vai revelar uma massa de
bacilos Gram positivo finos.
Não é fastidioso, cresce em Sabouraud dextrose melhor incubado a temperatura ambiente
entre 4 a 10 dias. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificações,
hifas aéreas e conídios (via assexuada de propagação com forma arredondada).
Não é alcool-ácido resistente, e apenas os conídios podem apresentar esta propriedade;
metaboliza a glicose por oxidação e cresce a 50o
C. As colônias são mais secas com, diferentes
pigmentos (creme, marron, preto, etc) e presença ou não de hifas aéreas. Uma característica
importante das colônias é o cheiro de terra molhada.

Mod V - 56
7. FASTIDIOSOS
INTRODUÇÃO
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FASTIDIOSOS
Este grupo heterogêneo de bactérias apresenta como característica comum exigências especiais de
condições de cultivo, em relação as enterobactérias e a maioria dos não fermentadores. Estas
condições variam para cada microrganismo, podendo ser a necessidade de CO2, crescimento lento
com a necessidade de até 30 dias de incubação (Brucella), adição de fatores especiais de crescimento,
etc.
Pontos-chave para classificação
São bactérias Gram negativas ou Gram lábeis (coram-se de forma tênue pela safranina).
Muitos, mas não todos são coco-bacilos e oxidase positivos; não crescem em Mac Conkey.
Para teste de fermentação de carboidratos exigem uma base mais rica como o CTA (vide capítulo
meios de cultura). O inóculo deve ser bem denso e muitas vezes é necessário a adição de 2 ou 3
gotas de soro de coelho ou cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas
bioquímicos.
Exceto as Capnocytophaga spp. que crescem formando colônias grandes e com aparência de véu
em torno da colônia, os demais fastidiosos crescem lentamente e exigem 48 a 72 horas para as
colônias ficarem bem visíveis, embora diminutas.
Alguns destes potenciais patógenos estão associados a síndromes clínicas bem definidas, embora
não frequentes como a brucelose, tularemia, etc. É importante nestes casos obter informações
adicionais com o médico assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de
identificação microbiológica.
Sempre valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrer em mais de uma amostra, ou
materiais de bom valor preditivo de infecção como o LCR, líquido pleural, pericárdico, sinovial,
BAL, etc.
Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemoculturas e
a bacterioscopia pode ser aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactéria como
pela má coloração pela safranina.
A topografia da fonte de isolamento é uma pista importante, pois diferentes espécies de Neisseria,
Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium
podem ser encontrados em pele e mucosas, a Gardnerella e Cardiobacterium no trato genital, etc.
Como a alguns exigem tratamento com drogas não habituais, é extremamente importante chegar
a definição de gênero ou encaminhar a Laboratório de Referência. Outro motivo relevante para a
correta identificação é a importância epidemiológica que o agente possa ter em surtos ou mesmo
em casos isolados, como é o caso da brucelose, legionelose e Bordetella pertussis.
A Pasteurella spp. embora incluída neste grupo, cresce com facilidade em Ágar Sangue, Ágar
Chocolate, comportando-se no TSI como fermentador, mas não cresce em Mac Conkey . É oxidase
positiva.
Alguns dos fastidiosos estão relacionados a contato com saliva, sangue, fezes, através de acidente
perfuro-cortante ou mordida de animais domésticos ou silvestres (Pasteurella, Bartonella,
Francisella e Brucella).
Destaca-se ainda a necessidade de precauções especiais no manuseio de alguns destes agentes
pelo potencial patogênico (Brucella e Francisella).
Com base na importância clínica e epidemiológica, este grupo de bactérias será dividido em dois
grupos:
Grupo A: maior interesse clínico e epidemiológico
Grupo B: casos clínicos esporádicos / microbiota oral humana

Mod V - 57
GRUPO A - MAIOR INTERESSE CLÍNICO E EPIDEMIOLÓGICO
Bactéria Hospedeiro principal Via de transmissão
Bordetella pertussis
/parapertussis
Homem Secreções de vias aéreas
Bartonella spp. Gatos, humanos infectados,
outros desconhecidos
Mordida ou arranhão de gato;
picada de piolho infectado
Brucella spp. Mamíferos domésticos Leite e derivados, carne, sangue,
secreções de animais doentes
Francisella spp. Animais silvestres Picada de carrapato ou mosquito
infectado em zona endêmica
Haemophilus spp. Homem Secreções de vias aéreas
Legionella spp. Meio ambiente/água Inalação de água contaminada
Pasteurella spp. Animais domésticos/silvestres Mordida e secreções de animais
domésticos e silvestres
GRUPO B - CASOS CLÍNICOS ESPORÁDICOS
Bactéria Fonte
Actinobacillus actinomycetemcomitans Cavidade Oral humana
Cardiobacterium hominis Cavidade oral humana
Capnocytophaga spp. Cavidade oral humana
Chromobacterium violaceum Água e solo
Eikenella corrodens Cavidade oral humana
Kingella spp. Cavidade oral humana
Streptobacillus spp. Boca de roedores
As características deste grupo heterogeneo são:
Dificuldade ou ausência de crescimento em meios ricos como Ágar Sangue e Ágar Chocolate.
Exigência de incubação em diferentes tensões de CO2.
Dificuldade em caracterizá-los, pois exigem meios enriquecidos.
Crescimento lento e pouca importância clínica, talvez pela dificuldade do seu isolamento e
caracterização.
Os gêneros Actinobacillus, Capnocytophaga e Eikenella tem em comum o fato de pertencerem à
microbiota da cavidade oral humana e estarem relacionados à doenças gengivais e, a partir deste
foco, doenças sistêmicas.
Kingella e Cardiobacterium estão associadas ao trato respiratório humano.
Diferem deste grupo a Chromobacterium que é encontrada na natureza em água e solo e
Streptobacillus na orofaringe e nasofaringe de camundongos selvagens e de laboratório.

Mod V - 58
PRINCIPAIS FASTIDIOSOS E DIAGNÓSTICO
Bactéria Material clínico Meio específico Incubação
Bordetella pertussis Swab nasofaringe Meio de Bordet & Gengou 7 dias
Bartonella spp. Sangue, gânglios, biópsias Ágar chocolate, Ágar sangue
carneiro
5 a 15 dias
Brucella spp. Sangue, aspirado de
medula
Rotina de hemocultura ou
meio de Castañeda
Até 30 dias
Francisella spp. Gânglios, biópsias Ágar chocolate enriquecido 7 dias
Haemophilus spp. Sangue, LCR, etc. Ágar chocolate de cavalo 48-72 h até 7 dias
Legionella spp. Secreções ou aspirados de
trato respiratório inferior
Meio específico BCYE * 7 a 14 dias
Pasteurella spp. Sangue, LCR, lesões Ágar sangue, Ágar chocolate 24 a 72 h
* ágar extrato de levedura, carvão, com pirofosfato férrico e alfa-cetoglutarato.
PRINCIPAIS PROVAS DIFERENCIAIS ENTRE OS FASTIDIOSOS
Bactérias Oxidase Catalase Motilidade Ágar Sangue Ágar Chocolate
Actinobacillus
actinomycetemcomitans
neg /+ fraco + neg + +
Bartonella spp. neg neg variável + +
Bordetella pertussis + variável neg neg neg
Brucella spp. + + neg + +
Capnocytophaga spp. neg neg neg + +
Cardiobacterium hominis + neg neg + +
Chromobacterium spp. V + + + +
Eikenella corrodens + neg neg + +
Francisella tularensis neg + fraco neg neg +
Haemophylus influenzae + fraco + neg neg +
Kingella spp. + neg neg + +
Legionella spp. + fraco + fraco + fraco neg neg
Pasteurella spp. + + neg + +
Streptobacillus spp. neg neg neg
BARTONELLA
A classificação taxonômica dos membros do gênero Bartonella ainda não é definitiva e agrupa as
espécies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis.

Mod V - 59
B. bacilliformis - é o agente etiológico da verruga peruana (febre de Oroya), doença restrita aos
Andes, caracterizada por profunda anemia, trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delírio, coma e alta
mortalidade.
B quintana - é causa de doença febril que atacou soldados na I Guerra Mundial, conhecida como
febre das trincheiras e relacionado a picada de piolhos e baixa higiene. Caracterizada por febre e
bacteremia com duração variável e ainda não bem conhecida. Casos associados à infecção por HIV
foram relatados.
B. henselea - pode apresentar quadro de bacteremia principalmente em imunossuprimidos bem
como relacionada à doença da arranhadura do gato. O quadro de bacteremia caracteriza-se de forma
insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de peso e com febre progressiva. A doença da arranhadura
do gato manifesta-se inicialmente com uma pápula ou pústula cerca de uma semana no local de
contato com animal (gato ou cão novo que arranha ou morde). Após 1 a 7 semanas aparece
adenopatia regional e 1/3 dos pacientes apresentam febre e em 1/6 ocorre supuração do gânglio,
sendo que a maioria evolui sem outros sintomas. A cura espontânea ocorre entre 2 a 4 meses. B.
quintanae e B. henselae podem causar quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferação
neovascular envolvendo pele, gânglios e fígado. B. elizabethae ainda é pouco conhecida.
Afipia felis - foi considerada há alguns anos como o agente etiológico da doença da arranhadura do
gato, que é hoje atribuida à B. henselae. Seu papel patogênico não está bem esclarecido.
Isolamento As bartonellas podem ser isoladas de hemoculturas, lesões cutâneas biópsias e gânglios.
O SPS (polianetol sulfonato) que é o anticoagulante usado nas hemoculturas é inibidor
das bartonellas, por sso deve-se usar outro anticoagulante.
Quando há suspeita clinica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, até 40 dias. Vários
meios enriquecidos podem permitir o crescimento das bartonellas. O caldo infusão
coração de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo são
adequados, como também o ágar chocolate.
No Bactec pode crescer, mas não aciona o alarme de CO2. Exigem umidade a 35-37o
C por
3 a 4 semanas. B. bacilliformis e Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30o
C.
Identificação Colônias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material. São bacilos Gram
negativos pequenos, às vezes curvos.
As espécies quintana e henselae, que são mais isoladas, são caracterizados pelas
seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lâmina presente e que não
é devida a flagelos (não tem), mas a fímbrias, percebendo-se a agitação da célula. O
período de incubação é longo (> que sete dias) e a B. henselae é bem aderente ao meio.
Provas para diferenciação de espécies de Bartonella e de A. felis
Espécies Catalase Oxidase Uréia Flagelo Motilidade
B. baciliformis + neg neg + +
B. quitanae neg neg neg + *
B. henselae neg neg neg + *
B. elizabetae neg neg neg neg neg
A. felis + + + +
* Motilidade por fímbrias
BORDETELLA
Características
gerais
O gênero Bordetella compreende as espécies B. pertussis, responsável pela coqueluche ou
tosse comprida, e B. parapertussis, com quadro clínico semelhante a coqueluche, mas em
geral menos severo. Ambas são patógenos exclusivos dos humanos. A B. bronchiseptica e B.
avium são bactérias comensais de mamíferos e aves, causando infecções em cães (tosse dos

Mod V - 60
canis) e a B. avium rinotraqueíte em perus. São patógenos oportunistas para humanos que
entram em contato com estes animais. Foram classificadas mais recentemente para o gênero
bordetella as espécies holmesii e hinzii.
Importância
clínica
A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianças não vacinadas, com clínica bastante
característica: Período prodrômico, que inicia 5 a 10 dias após a aquisição do agente, com
sintomas semelhantes a um resfriado ou gripe. Fase altamente contagiosa e com sintomas
inespecíficos. Segue-se o período paroxístico com quadro de tosse convulsiva, persistente e
característica seguida de inspiração ruidosa. Podem ser acompanhadas de cianose e vômito e
várias complicações como convulsões, insuficiência respiratória, encefalopatia, infecções
secundárias, etc. A convalescença ocorre cerca de quatro semanas após inicio dos primeiros
sintomas.
Material
clínico e
Semeadura
São adequados o swab ou aspirado de nasofaringe e semeadura imediata em meios
específicos e em ágar sangue para afastar B. pertussis. Na atualidade não se justifica dispor
de meio de Bordet & Gengou ou outro, mas em caso de suspeita solicitar auxílio de
Laboratório de Referência. Para fórmula de meios de cultura vide manuais de fabricantes de
meios de cultura. A prova de imunofluorescência deve ser utilizada em material de
nasofaringe juntamente com a cultura que é mais específica.
Isolamento e
Identificação
São, cocobacilos Gram negativos pequenos e aeróbios estritos. A safranina deve ser corada
pelo Gram durante 2 minutos para melhorar a coloração. Para B. pertussis e parapertussis os
Laboratórios de Referência devem dispor de identificação sorológica para acelerar a
identificação.
Provas diferenciais para espécies de Bordetella
Espécies Oxidase Motilidade Uréia Ágar Sangue
e Chocolate
B & G ou
Regan-Lowe
Salmonella
-Shigella
B. pertussis 1
+ neg neg neg + 3-6 dias neg
B. para pertussis neg neg + em 24h + + 2-3 dias neg
B. bronchiseptica + + + em 4h + + 1-2 dias +
B. avium + + 2
neg + + 1-2 dias +
B. holmesii neg neg neg + + 1-2 dias +
B. hinzii + + variável + + 1-2 dias +
1
- necessita de meio específico: Bordet & Gengou (infusão de batata + glicerol + sangue de carneiro) ou Regan
Lowe.
2
- mais evidente a 25o
C
BRUCELLA
A brucelose é uma doença de sintomas vagos, que cursa de forma insidiosa com febre baixa, calafrios,
sudorese noturna, cefaléia, mialgia e artralgia. Pode ser acompanhada na forma crônica de alterações
hematológicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia, anemia hemolítica, etc.
Importância
clínica
Está associado à ingestão de leite e derivados e carne de mamíferos, à veterinários,
açougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue destes animais e à
acidentes em laboratórios. A hemocultura exige tempo superior de 5-7 dias de incubação. É
importante a informação médica de suspeita clínica para orientar o laboratório na pesquisa e
caracterização do agente.
Material
clínico e
Semeadura
Sangue, aspirado de medula, aspirado e biópsia de gânglios, fígado, baço, LCR, etc. A partir
do segundo dia de febre as hemoculturas podem ser positivas, ocorrendo também
hemoculturas positivas em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o
isolamento é o método de lise-centrifugação:
- Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de sódio a 4%
- Adicionar cerca de 40mL de água destilada estéril
- Centrifugar 2.000g por 30 minutos
- Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de ágar sangue e semear. Pode-se fazer o
mesmo com LCR e aspirado de medula.
- Incubar 35o
C em estufa entre 5 a 10% de CO2 (com gerador de CO2 ou estufa apropriada).
Isolamento e
Identificação
As brucellas crescem bem em ágar sangue, ágar chocolate, Tripticase Soy Ágar e Brucella
ágar. O crescimento é visível com 48 a 72 horas. Colônias são pequenas, brancas a creme, e
ao Gram visualizam-se coco-bacilos bem finos e pequenos. São aeróbios OF oxidativos,
crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, ágar sangue, ágar chocolate,

Mod V - 61
mas não no Mc Conkey.
Espécies mais importantes são:
- melitensis, abortus, suis e canis.
- Uréia positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h)
no meio uréia de Christensen.
- H2S com tira de acetato positivo: B.abortus e de B.suis (biotipo 1).
- CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis.
Provas diferenciais entre coco-bacilos Gram negativos
Bactéria Oxidase Motilidade Uréia Ágar Sangue Mac Conkey
Brucella spp. + neg + + neg
Bordetella bronchiseptica + + + + neg
Acinetobacter spp. neg neg variável + +
Moraxella phenylpyruvica + neg + + +
Pasteurella spp. * + neg variável + neg
Haemophilus influenzae + neg variável neg neg
* cresce no TSI como fermentador acidificando ápice e base sem gás.
Considerando que a Brucella é de dificil caracterização em laboratório não especializado, encaminhar a
laboratório de referência para confirmação. Suspeitar quando houver quadro clínico sugestivo,
obtendo-se isolado de sangue ou medula, crescimento de coco-bacilos finos pouco corados, oxidase e
catalase positivas, que crescem lentamente em ágar sangue ou chocolate. Soroaglutinação é útil como
elemento da caracterização.
FRANCISELLA TULARENSIS
É um coco-bacilo pequeno, Gram negativo, imóvel e pleomórfico, aeróbio estrito e capsulado.
Apresenta grande resistência no meio ambiente, sobrevivendo semanas em meios úmidos, carcaças
de animais, água, lama, etc. Constitui o agente da tularemia, uma doença de animais selvagens e com
vários vetores hematófagos. É transmitida principalmente por carrapatos, mas também por
mosquitos.
Nos Estados Unidos prevalece o biovar A, mais grave, enquanto que no hemisfério sul prevalece o
biovar B que apresenta a forma clínica mais leve, sendo pouco diagnosticada principalmente por
desconhecimento do agente.
Fontes de
transmissão
Centenas de animais silvestres, incluindo alguns domésticos (incluindo cães, gatos e
pássaros), podem ser portadores deste agente. Cerca de uma dezena de diferentes insetos
servem de vetores. A transmissão pode ocorrer também em contato direto com animais pela
mordida, sangue, carne contaminada e eventualmente água e inalação de aerossóis.
Quadro clínico É extremamente infectante, devendo ser manipulado em cabine de segurança nivel 2 para
material clínico e nível 3 para culturas positivas. Bastam 10 microrganismos injetados por via
subcutânea ou 25 inaladas para causar a doença.
Logo após a penetração do agente, em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes da
gripe: febre, tremores, cefaléia e dor generalizada. Após período de incubação de 2 a 10 dias
forma-se uma úlcera no local de penetração, que pode durar meses. Os gânglios regionais
aumentam e ocorre necrose. Se ocorrer invasão sanguínea, o quadro de endotoxemia típico
se manifesta. Estes casos são pouco frequentes e ocorrem quando há grande inoculação ou
paciente é imunocomprometido. A mortalidade alcança 60%, ocorrendo toxemia, cefaléia
intensa, febre elevada e contínua, com delírios, prostração e choque.
A forma úlcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A úlcera é endurada,
eritematosa, que não cicatriza. Outras formas relatadas são oculo-ganglionar, em orofaringe,
ganglionar sem úlcera, pleuropulmonar e gastrointestinal.

Mod V - 62
Material
clínico e
Semeadura
Os materiais que oferecem maior chance de positividade são a partir de raspados de úlceras,
biopsias e escarro. A Francisella cresce em ágar chocolate suplementado com Isovitalex ®.
Laboratório de Referência deve ser consultado sobre recursos disponíveis ou
encaminhamento de cepas suspeitas.
Isolamento e
Identificação
A bacterioscopia de material clínico de lesões ou biópsias raramente ajuda, pois o
microrganismo é muito pequeno e cora mal pelo método de Gram. Este agente deve ser
lembrado sempre que houver doença associada a picada de carrapato e formação de úlcera
com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diagnóstico microbiológico é difícil, sendo
na maioria das vezes feito com base em testes de aglutinação em amostras pareadas
colhidas com intervalo de 2 a 3 semanas e congeladas a - 20o
C.
HAEMOPHYLUS
Diferentes espécies pertencentes ao gênero Haemophilus podem ser encontradas como flora normal
da nasofaringe e orofaringe, chegando a 50% da população, geralmente cepas não capsuladas,
embora também cepas do H. influenzae b possam apenas representar colonização (rara nos adultos e
cerca de 5% nas crianças).
Para considerar o isolamento de Haemophilus é fundamental associar o papel patogênico ao da clínica.
Várias são as infecções causadas por H. influenzae, sendo H. influenzae do tipo b as cepas mais
virulentas. Entretanto a partir da década passada, com a disponibilidade de vacinação, houve uma
drástica redução na importância desta bactéria nas populações vacinadas.
Doenças causadas pelo H. influenzae b principalmente na infância: Meningite, Epiglotite,
Pericardite, Pneumonia, Artrite séptica, Osteomielite, Celulite facial.
Mais raramente: peritonite e infecção urinária em crianças menores que cinco anos.
Doenças causadas por cepas não b e não tipáveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a
doença de base predisponente como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC, etc.): Traqueobronquite e
pneumonia, Bacteremia, Conjuntivite, Ootite (segunda causa depois do pneumococo), Sinusite.
HAEMOPHILUS APHROPHILUS
Microbiota do trato respiratório superior, especialmente em placas dentárias e sulco gengival;
endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia estão
associados a este agente, particularmente em pacientes com comprometimento imunológico. A
endocardite não está necessariamente relacionada à lesão valvular prévia, mas a associação com
embolia arterial é freqüente nestes casos. Existem relatos também de isolamento em otites, sinusites
e epiglotites, etc.
Crescem bem em ágar chocolate no isolamento primário e em ágar sangue de carneiro nos subcultivos
sem exigência de fatores X e V, mas as colônias são muito pequenas de cor amarelada, cheiro de cola
e necessitam de 48 a 72h para boa visualização. Em caldo tem a característica de aderir as paredes
do tubo, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. Não crescem em Mac Conkey. Para todos os
hemófilos fazer o teste da beta-lactamase para verificar a resistência à penicilina
HAEMOPHILUS DUCREY
É o agente do cancro mole, sendo na atualidade raramente isolado, pela menor incidência da doença,
da contaminação das lesões com flora genital e pelo frequente uso prévio de antibióticos.
Colhido de úlceras genitais removendo-se previamente a secreção superficial ou lavando com salina
estéril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer esfregaço a ser corado
pelo Gram. Em geral é de difícil cultivo.
Emprega-se ágar chocolate de cavalo com base GC ou Mueller Hinton. A colocação de um disco de
vancomicina pode ajudar a inibir bactérias Gram positivas. Na bacterioscopia aparecem coco-bacilos
Gram lábeis agrupados e em cadeias como cardumes.
ISOLAMENTO

Mod V - 63
No isolamento primário no ágar chocolate as colônias costumam ser pequenas de cor beje claro, com
odor característico. No ágar sangue ocasionalmente pode-se detectar o crescimento em torno de
colônias de Staphylococcus aureus , que produz o fator V e é utilizada como prova alternativa à
utilização dos discos e denominada prova do satelitismo.
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE HAEMOPHILUS
Anaeróbio facultativo.
Não crescem no TSI e no OF-glicose.
Melhor meio de cultura para haemophilus influenzae é o ágar chocolate com sangue de cavalo. A
base GC usada para Neisserias é indicada, embora os hemófilos cresçam com outras bases como
Columbia e Mueller Hinton. Há necessidade de umidade e CO2 entre 3 a 5% para o H. influenzae e
H. aphrophilus. O ágar chocolate suporta muito bem o crescimento dos haemophilus, mas para
outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de crescimento (vitox®, isovitalex ®).
As diferentes espécies de haemófilos podem dar reação de oxidase positiva fraca e demorada
(cerca de 25 a 20 segundos).
Em amostras de LCR pode ser útil a aglutinação com partículas de látex, mas a confirmação
bioquímica e sorológica em laboratório de referência é necessária.
Antibiograma é realizado em meio padronizado HTM (vide cap. meios de cultura).
PRINCIPAIS PROVAS PARA DIFERENCIAR ALGUMAS ESPÉCIES DE HAEMOPHILUS
Espécies Fator
X
Fator
V
Hemólise * Uréia Indol GLI SAC LAC Catalase
H. influenzae + + neg variável variável neg neg neg +
H. haemolyticus + + + + variável + neg neg +
H. parainfluenzae neg + neg variável variável + + neg variável
H. ducrey + neg fraca neg neg neg neg neg neg
H. aphrophilus neg neg neg neg neg + + + neg
* Verificar hemólise em ágar sangue de cavalo GLI = glicose SAC = sacarose LAC = lactose
Obs.: Fermentação de açucares com base CTA e 1% de açúcar adicionado de fator X e V (vide cap. meios de
cultura); vide leitura de fatores X e V
Técnica para testar fatores X e V:
Usar meio ágar tripticase soja ou BHI ágar.
Discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e V=NAD ou coenzima I.
Semear a bactéria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pinça a uma
distância de 1,5 cm um disco do outro. Flambar a pinça antes e após a retirada de cada disco.
Após 24h de incubação em jarra com vela e umidade a 35o
C, verificar crescimento próximo aos
discos:
Haemophilus influenzae: Crescimento entre os discos (exige X e V)

Mod V - 64
Prova do satelitismo
Semear com swab uma suspensão em salina cerca de 1 a 2 da escala Mac Farland no centro de
uma placa de ágar sangue de carneiro.
Semear em uma única estria um repique de S. aureus hemolítico (ATCC 23922).
Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2.
Verificar crescimento de colônias pequenas próximas a zona de hemólise do estafilococo.
Encaminhar cepas isoladas de líquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericárdico) a Laboratórios de
Referência para confirmação e sorotipagem.
LEGIONELLA
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Pneumonia com ou sem sepsis é a manifestação clinica mais importante, podendo ocorrer infecções de
partes moles e sinusite. Está em geral associada a surtos cuja fonte é a água contaminada com este
agente. Largamente distribuída na natureza em ambiente úmido e água potável e ocasionalmente em
chuveiros. Está associada a presença de outras bactérias e amebas de vida livre na água. A presença
de bactérias do gênero Legionella em material clínico humano está invariavelmente associada à
doença clínica.
ESPÉCIES E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Existem algumas dezenas de espécies de Legionella sendo a espécie mais importante a L.
pneumophila, sorogrupos 1 e 6. A doença pode ser sub-clínica, forma não pulmonar, pneumonia e
doença extra-pulmonar. A forma não pulmonar tem período de incubação curto (horas a dias), sendo
auto-limitada e sem evidências radiológicas de comprometimento pulmonar.
Os sintomas são febre, mal-estar, mialgia e tosse. A pneumonia é a forma mais frequente de
manifestação da doença, acompanhada dos mesmos sintomas acima descritos para a forma não
pulmonar e em geral com tosse não produtiva. A doença apresenta rápida progressão e nos casos
graves, a formação de abscessos são sugestivos da legionelose. Bacteremia é comum e o
comprometimento dos mais variados orgãos e tecidos já foi descrito.
MATERIAIS RECOMENDADOS
Escarro
Aspirado traqueal e outros que neste caso específico estão indicados como úteis
Lavado/escovado bronco-alveolar.
Biópsia pulmonar ou outros tecidos e aqueles obtidos em autópsia.
LCR e outros líquidos de derrame.
Urina (pesquisa de antígenos) – conservar a - 20o
C.
Para transporte: usar frasco estéril com água destilada estéril, mas não salina que pode inibir o
cultivo. Sempre que possível concentrar os materiais por centrifugação, evitando formar aerossóis.
RECURSOS DIAGNÓSTICOS MAIS UTILIZADOS
Sensibilidade e especificidade de recursos diagnósticos para legionelose
Teste Sensibilidade Especificidade Observação
Cultura 70% 100% Método de escolha
Aglutinação pelo látex 55-90% 85-99%
Imunofluorescência indireta 70-80% >95% Útil com cultura ou fins
epidemiológicos

Mod V - 65
Cultura em meio
enriquecido
Cresce em meio suplementado com extrato de levedura, l-cisteina, sais de ferro e alfa-
cetoglutarato em meio denominado BCYEa ou BCYE, e seu crescimento é favorecido pela
incubação em 5% de CO2. Para materiais com microbiota, como para secreção traqueal e
escarro, acidificar o meio por 15 minutos a pH 2,0 com tampão ácido (0,2M HCl e 0,2M KCl)
e em seguida neutralização a pH 7,0 com KOH 0,1N.
Cultura em meio
seletivo
Recomenda-se uso de meio seletivo, adicionando ao meio BCYE os antibióticos: polimixina B,
cefamandol e anisomicina ou vancomicina, polimixina B e anfotericina B. Colônias azuladas
ou esverdeadas
Cultura em meio
diferencial BCYE
Adicionado de glicina, vancomicina, púrpura de bromocresol e azul de bromotimol apresenta
as seguintes características: L. pneumophila (branco esverdeado), L. micdadei (colônias azul
claro ou acinzentadas), outras legionelas (colônias verde bem claro). Crescem bem no frasco
utilizado pelo BACTEC®.
IDENTIFICAÇÃO
São bacilos Gram negativos finos que se coram fracamente pela fucsina e safranina do Gram. Em
repiques tornam-se filamentosos.
PROVAS
Aeróbio estrito
No primo isolamento a l-cysteína é imprescindível.
No meio BCYEa o crescimento pode ser observado a partir do 3 ao 5º dia a 35o
C.
Semear o material em ágar sangue como controle, pois a Legionella não deverá crescer.
Aguardar 14 dias para descartar as culturas quando negativas.
CARACTERÍSTICAS DA L. PNEUMOPHILA
oxidase positiva fraca
catalase positiva
não sacarolítico (não oxida nem fermenta
os açúcares)
motilidade positiva
gelatinase positiva
hidrólise do hipurato positivo
sensível a macrolídeos, rifampicina, sulfatrim e
quinolonas
A identificação com base em testes é difícil. O suspeita deve ser baseada na clínica, no aspecto da
colônia, crescimento em meio BCYEa, dependência da l-cysteina, ausência de crescimento em ágar
sangue e ágar chocolate não suplementados.
A imunofluorescência direta, com amostras clínicas utilizadas para cultura, é um método
complementar para diagnóstico da legionelose. Encaminhar cepas suspeitas a Laboratório de
referência para confirmação.
PASTEURELLA
A infecção pela Pasteurella constitui uma zoonose, pois se trata de bactéria microbiota de boca e trato
respiratório superior de mamíferos e aves. As diferentes espécies estão associadas a infecções
humanas relacionadas a mordida dos animais descritos abaixo ou outros tipos de contato com sangue,
carne, carcaça, etc.
A P. multocida é a espécie mais comumente isolada em material clínico humano, em geral associada a
mordida ou arranhadura de cães e gatos. Caracteriza-se pela formação de abscessos ou celulite e
eventualmente osteomielite. Infecções respiratórias podem ocorrer, incluindo pneumonia lobar, com
ou sem derrame e empiema. Em pacientes imunocomprometidos, com cirrose, neoplasias, podem
apresentar bacteremia e septicemia.

Mod V - 66
Principais espécies de Pasteurella e doenças relacionadas
Bactéria Doenças Relacionadas
P. multocida Microbiota do trato respiratório de mamíferos e aves (domésticos e silvestres,
encontrado na boca de cerca de 50% dos cães e gatos).
Pode causar infecções em mamíferos e diarréia em aves.
P. pneumotropica Trato respiratório de roedores, cães, gatos, etc
P. haemolytica Infecções pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos.
P. aerogenes Microbiota do trato intestinal de suínos
P. dagmatis (n. sp1) Trato respiratório de cães e gatos
DIAGNÓSTICO DE ZOONOSES
Para facilitar o isolamento e identificação da Pasteurella é muito importante a descrição clínica, pois na
suspeita de zoonoses é importante lembrar de: brucelose, pasteurella, micobacterioses, tularemia,
leptospirose, yersiniose, etc.
Caracterização microbiológica
Coco-bacilo Gram negativo ou bacilos – podem ser capsulados
Anaeróbio facultativo (fermentador) – TSI ácido/ácido
Oxidase positiva em colônias isoladas em ágar sangue ou ágar chocolate
Catalase positiva
Motilidade negativa
Indol positivo
Sacarose positiva
Muitas espécies são ornitina positivas
Provas diferenciais das espécies de Pasteurella spp. de importância clínica
Espécie * Hemólise Mac Conkey Indol Uréia Ornitina OF Glicose
P. multocida neg neg + neg + F sem gás
P. pneumotropica neg variável + + + F gás
variável
P. haemolitica + 72% variável neg neg variável F sem gás
P. aerogenes neg + neg + variável F sem gás
P. dagmatis neg neg + + + F com gás
* Todas são oxidase positiva, catalase positiva e fermentadoras da glicose
Obs.: a P. multocida cresce bem em ágar sangue de carneiro e ágar chocolate, formando pequenas
colônias acinzentadas. Não cresce em ágar Mac Conkey. Tem odor forte característico e podem ser
diferenciadas entre si por poucas provas (vide tabela acima), mas dependendo do animal-fonte,
outras espécies menos frequentes podem estar envolvidas.
ACTINOBACILLUS
São habitantes das mucosas do trato respiratório e urinário de humanos e animais. As três espécies
mais importantes são: A. actinomycetemcomitans, A. urea e A. hominis.

Mod V - 67
O primeiro está relacionado doença periodontal e particularmente à periodontite juvenil localizada,
bem como com endocardite e abscesso cerebral, oriundos da boca. A doença periodontal está
associada à endocardite pelos seguintes agentes:
A. actinomycetemcomitans
Cardiobacterium hominis
E. corrodens
Kingella spp.
As outras espécies de Actinobacillus são patógenos oportunistas e causam raramente infecções do
trato respiratório e bacteremia.
PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS PARA DIAGNÓSTICO
São coco-bacilos Gram negativos ou pequenos bacilos que crescem em aerobiose, umidade e 5 a 10%
de CO2 ou anaerobiose em ágar sangue e ágar chocolate. Recomenda-se adicionar suplementos com
vitaminas e sangue lisado de carneiro ou cavalo ao ágar chocolate. As colônias ficam bem visíveis com
48 a 72 h de incubação, são brancas acinzentadas, com um pregueamento no centro, fortemente
aderentes ao meio e pegajosas no primo isolamento.
Principais características das bactérias fastidiosas analisadas
Bactérias Características Principais
Actinobacilus Cocobacilus a bacilos longos, anaeróbios facultativos, colônias cinza,
aderentes ao meio, com centro da colônia enrugado
Cardiobacterium Bacilos que podem apresentar formas semelhantes à gota d´água
Eikenella Cocobacilos com extremidades arredondadas, cheiro de água clorada,
colônias podem corroer o meio
Kingella Pequenos cocobacilos
Capnocytophaga Fusiforme e curvo, colônias crescem espalhadas
Streptobacillus Filamentos longos
Chromobacterium Pode ter forte pigmento violeta, cresce em Mac Conkey
Provas diferenciais entre os principais fastidiosos
Bactérias Oxidase Catalase CO2 Mac
Conkey
Uréia Indol Glic. TSI Motil.
Actinobacilus 1
neg ou
+ fraco
+ + variável neg neg + ac / ac neg
Cardiobacterium + neg + neg neg + + ac / ac neg
Eikenella + neg + neg neg neg neg alcalino neg
Kingella + neg + neg neg neg + alcalino neg
Capnocytophaga neg 2
neg 2
+ neg neg neg + n cresc. 3
neg
Streptobacillus neg neg + neg neg neg + n cresce neg
Chromobacterium variável + neg + neg neg + alc / ac +
positivo ou neg = 80% ou mais das provas positivas ou negativas ac= ácido alc = alcalino
1
- A. actinomycetemcomitans
2
- origem humana. As de origem animal são oxidade e catalase positivas.
3
- pode acidificar lentamente

Mod V - 68
CAPNOCYTOPHAGA
As espécies de Capnocytophaga gingivalis, granulosa, haemolitica, ochracea e sputigena fazem parte
da microbiota da cavidade oral humana, enquanto outras espécies podem ser encontradas na boca de
animais domésticos. O isolamento de Capnocytophaga ocorre com maior freqüência em bacteremias
nos pacientes neutropênicos com mucosite, mas estão também implicadas na doença periodontal
juvenil (gengivalis e ochracea), periodontite em adultos (sputigena) e isoladas em placas dentais
supragengivais em adultos (granulosa e haemolytica). As doenças localizadas (ceratites, abscessos e
endoftalmites), bem como doenças sistêmicas (septicemia, endocardite, osteomielite, etc.) ocorrem
em pacientes imunocomprometidos ou não.
MORFOLOGIA E CULTIVO
A morfologia da Capnocytophaga é bem característica, facilitando a sua suspeita, pois lembra um
Fusobacterium aerotolerante. Tem as extremidades afiladas e o centro mais largo, podendo ser
encurvada e eventualmente cocóide.
Para cultivo, crescem melhores com 5 a 10% de CO2 e em anaerobiose, o que pode confundir com o
anaeróbio estrito, se não for feita a prova de crescimento em aerobiose com CO2. Chama a atenção o
fato de crescer melhor em ágar sangue de carneiro que no ágar chocolate sem suplemento de
vitaminas. Não crescem em Mac Conkey. O crescimento pode ocorrer com 24 a 72 h. A colônia é chata
e sua borda é irregular; com maior incubação nota-se o espalhamento em torno da colônia,
semelhante ao Proteus, mas em escala muito reduzida, cerca de 2 a 4 mm de diâmetro. A espécie
haemolytica apresenta hemólise discreta, e a espécie ochracea tem cheiro de amêndoas.
IDENTIFICAÇÃO
Capnocytophaga de origem humana são oxidase e catalase negativas, produzem ácido a partir da
glicose em caldo enriquecido com soro de coelho e inóculo denso. Motilidade negativa; indol negativo;
lisina, ornitina e arginina negativas. A maioria é esculina positiva (gengivalis é variável e granulosa
negativa). A diferenciação das espécies é dificil. As amostras de origem animal (C. canimorsus e
cynodegmi) são oxidase, catalase e arginina positivas.
EIKENELLA
Também é bactéria da microbiota da cavidade oral humana e atribuinegse participação em infecções
periodontais, sendo encontrada na placa bacteriana subgengival em adultos com periodontite. Isolada
em material de trato respiratório inferior, abscessos de partes moles, sangue e fluídos estéreis
infectados em casos de infecções pleuronegpulmonares, infecções pósnegcirúrgicas de parede, artrite,
meningite, endocardite e septicemia.
CULTIVO, BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAÇÃO
É anaeróbio facultativo, mas cresce melhor com 5% de CO2, em ágar sangue e chocolate, mas não em
Mac Conkey. O crescimento é lento, necessitando de 2 a 4 dias para boa visualização das colônias. Em
cerca da metade das cepas pode-se observar a corrosão do ágar, que é sua característica marcante.
Produz um pigmento amarelo claro e tem odor de hipoclorito no ágar sangue e ágar chocolate.
Na bacterioscopia são observados bacilos delgados ou coco-bacilos gram negativos com extremidades
arredondadas. E, bioquimicamente, caracteriza-se por ser oxidase positiva, catalase negativa,
motilidade negativa e ornitina positiva; provas negativas de utilização de carboidratos, uréia, indol e
esculina.
KINGELLA
Espécies de Kingella fazem parte do trato respiratório e genito-urinário humanos. K. kingae é a
espécie mais importante e é um patógeno oportunista responsável por casos graves de endocardite,
osteomielite, septicemia, com provável porta de entrada em lesões da mucosa da orofaringe. A
doença valvular pode estar ou não associada a doença cardíaca prévia. A osteomielite ocorre com

Mod V - 69
maior frequência em crianças menores de 5 anos. Os quadros sépticos podem ser semelhantes à
doença meningocócica.
A K. kingae cresce em ágar sangue e ágar chocolate com 5% de CO2, após pelo menos 48 h de
incubação, mas não em Mac Conkey. Tem como característica ser beta-hemolítica no ágar sangue de
carneiro, mas sem hemólise intensa. Pode crescer numa mesma placa de isolamento como colônias
lisas e convexas ou fazendo corrosão, ou colônias espalhadas como se fossem móveis.
São coco-bacilos que ocorrem aos pares ou cadeias curtas, podendo ser confundida com Neisseria
spp. e, bioquimicamente, são oxidase positiva, motilidade e catalase negativas, e acidificam a glicose
lentamente.
Provas diferenciais entre os fastidiosos oxidase positivas e catalase negativas:
Fastidiosos oxidase positivas e catalase, uréia e esculina negativas
Bactérias Hemólise Indol Ornitina Glicose
C. hominis neg + neg +
E. corrodens neg neg + neg
K. kingae + neg neg +
CARDIOBACTERIUM HOMINIS
Cardiobacterium é flora do trato respiratório humano e ocasionalmente do trato urogenital. Está
associado quase exclusivamente a quadros de endocardite, precedidos de manipulação dentária.
Cresce em 3 a 5 dias em hemoculturas, mas não causa alterações no meio (turvação, hemólise,
película, grumos, etc.). Cresce em 3 a 5 dias em 5 a 7% de CO2, em ágar sangue e ágar chocolate,
mas não em Mac Conkey. As colônias são branco-amareladas e podem manifestar um pequeno
espraiamento da colônia simulando motilidade no ágar como o Proteus e eventualmente a corrosão do
ágar.
São bacilos Gram negativos, podendo apresentar pleomorfismo com extremidades dilatadas como
bulbos que podem reter corante violeta e com arranjos característicos em agrupamentos de rosetas e
formas isoladas como gota d’água ou alteres. Deve-se observar estas características para não
confundir com bacilos Gram positivos.
Uma prova fundamental é a produção de indol, que deve ser feita em caldo triptona, com inóculo
denso, incubação de 48 h, e extração com xilol e uso do reagente de Ehrlich.
CHROMOBACTERIUM VIOLACEUM
Encontrada na natureza no solo e na água, a infecção em geral está relacionada a lesões cutâneas
com estes elementos. Lesões localizadas ou formas septicêmicas graves com múltiplos abscessos têm
sido esporadicamente relatadas. Mais raramente diarréia e infecção urinária.
CULTIVO E BACTERIOSCOPIA
Bacilo Gram negativo anaeróbio facultativo, reto ou ligeiramente curvo, com extremidades
arredondadas, isolados ou em arranjos aos pares ou em cadeias curtas.
Diferente da maioria dos fastidiosos, cresce além do ágar sangue e chocolate, também em Mac
Conkey. Característica de colônia convexa, lisa e de cor violeta forte, embora algumas variantes sem
cor possam ocorrer. Algumas cepas podem ser levemente hemolíticas no ágar sangue.

Mod V - 70
STREPTOBACILLUS MONILIFORMIS
Encontrado na nasofaringe e orofaringe de ratos, camundongos e outros roedores domésticos como a
cobaia. As infecções estão relacionadas a mordida destes roedores ou ingestão de leite ou alimentos
contaminados. A febre por mordedura do rato apresenta quadro clínico bem definido com período de
incubação de cerca de 10 dias, início abrupto com febre elevada, tremores, cefaléia intensa, vômitos e
artralgia migratória.
Rash semelhante ao sarampo com erupções maculopapulares podendo ser pustulosa, com petéquias
ou púrpuras nas extremidades, incluindo região palmar e plantar. Complicações graves podem ocorrer
como endocardite, pericardite, septicemia, abscesso cerebral, etc. Sem tratamento pode evoluir
favoravelmente em 2 semanas ou pode se tornar crônica; a mortalidade chega a 10%.
É um bacilo Gram negativo muito pleomórfico, podendo ter em culturas mais velhas de 1 a 150 µm de
comprimento (habitualmente bactérias tem de 1 a 3 µm), com eventuais dilatações como um colar de
pérolas, sem apresentar ramificações, quebrando em formas coco-bacilares. Em culturas jovens pode
ter morfologia mais uniforme. O isolamento é feito de hemocultura, aspirado de derrames (devem ser
centrifugados para concentrá-los) e abscessos.
Meios de cultivo
Colher sangue para hemocultura com citrato. Não se deve usar hemoculturas com SPS que é
inibidor do S. moniliformis.
Cultivar em meio bifásico TSA/TSB ou ágar infusão coração ou caldo infusão coração,
suplementados com 10% de soro de cavalo ou 15% de soro de coelho, e 0,5% de extrato de
levedura.
Incubar em jarra de anaerobiose ou 10% CO2 a 35-36o
C e umidade.
Após cerca de três dias crescem colônias cinzas de 1-2 mm de diâmetro, consistência butirosa
podendo surgir colônias variantes com aparência de ovo frito como micoplasmas. Em caldo de cultura
crescem em 2 a 3 dias com aparência de bolas de pêlo.
As provas bioquímicas exigem a adição de soro de cavalo ou coelho para suportar o crescimento. São
oxidase, catalase, indol e uréia negativos; e positivos para esculina, H2S com a prova da tira de
acetato de chumbo e hidrólise da arginina. Acidificam lentamente a glicose em base CTA com 0,5% de
soro de cavalo.

Mod V - 71
8. BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ESTRITAS
INTRODUÇÃO
Existe um grupo de bactérias, que produz patologia no ser humano, e que não tem capacidade de
multiplicar-se em presença do oxigênio atmosférico. E mais, para muitas espécies destas bactérias o
oxigênio é deletério. Estas bactérias são chamadas de anaeróbios estritos, para diferenciar dos
chamados anaeróbios facultativos, que têm a capacidade de desenvolver seus processos metabólicos,
tanto em presença como na ausência do oxigênio. A maior parte das bactérias patogênicas do ser
humano são anaeróbios facultativos e as famílias Micrococaceae, Streptococaceae,
Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, são exemplos destes microrganismos.
Os anaeróbios estritos estão constituídos por numerosas famílias, gêneros e espécies com caracteres
morfológicos como H2O2 que se formam em presença de oxigênio e que podem ser tóxicos,
bioquímicos e antigênicos muito diferentes. São estudados em capítulo separado porque a
metodologia para seu isolamento e identificação laboratorial é própria deste grupo, e porque
produzem alguns tipos especiais de processos patológicos no ser humano.
Existem várias teorias que tentam explicar esta susceptibilidade dos anaeróbios estritos ao oxigênio.
Entre elas, as seguintes:
Oxigênio seria um tóxico direto para a bactéria anaeróbia.
As bactérias anaeróbias estritas não têm a enzima catalase que impede a formação de grandes
quantidades de peróxidos.
Oxigênio altera enzimas bacterianas importantes no metabolismo (oxida, por exemplo, enzimas
que contém sh).
As bactérias anaeróbias estritas não possuem a enzima superóxido dismutase, capaz de
transformar o radical, o que é altamente tóxico para a bactéria.
Existem vários argumentos a favor ou contra estas teorias. Provavelmente mais de um destes fatores
seja importante para explicar a ação deletéria do oxigênio nestas bactérias.
Esta labilidade dos anaeróbios estritos ao oxigênio explica a dificuldade existente nos laboratórios para
seu isolamento e estudo. Por este motivo também, boa parte das infecções provocadas por estes
microrganismos não eram diagnosticadas até a década de 1970, quando foram desenvolvidos
procedimentos práticos de laboratórios para criar atmosferas de anaerobiose. Assim, as infecções
provocadas pelos microrganismos mais resistentes dentro deste grupo, os esporulados do gênero
Clostridium, eram diagnosticadas com maior freqüência. Hoje sabemos que as infecções por
Clostridium são menos freqüentes que as infecções provocadas por outros gêneros de bactérias
anaeróbias.
Um fato que também merece ser destacado, para explicar a freqüência com que estas bactérias
provocam infecção, é que os anaeróbios estritos são habitantes normais do organismo humano,
ultrapassando em número os aeróbios e anaeróbios facultativos. Assim, os anaeróbios estritos estão
em proporções 5 a 1000 vezes maiores que os anaeróbios facultativos na microbiota normal do tubo
digestivo, pele, trato respiratório superior e genital feminino.
Quando existem fatores predisponentes estas bactérias provocam processos patológicos em diferentes
órgãos e sistemas. Por este motivo, a maior parte das infecções provocadas pelas bactérias
anaeróbias estritas são infecções chamadas endógenas. É a própria microbiota bacteriana do doente
que em determinado momento provoca o processo infeccioso, sendo este tipo de infecção pouco ou
não contagioso. As infecções provocadas pelo gênero Clostridium são fundamentalmente adquiridas a
partir do meio ambiente externo e por este motivo são chamadas de infecções exógenas.
Nas mucosas, onde os anaeróbios estritos formam parte da flora normal, existem condições locais de
anaerobiose. Estas condições são provocadas por compostos orgânicos, enzimas, restos celulares e
bactérias anaeróbias facultativas que baixam o potencial redox nestes locais. Neste sentido devemos
assinalar que estas bactérias toleram pequenas quantidades de oxigênio. As mais estritas crescem em
atmosferas com 0,5% de oxigênio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas podem
crescer ainda em concentrações de até 8% de oxigênio.

Mod V - 72
Como as bactérias anaeróbias facultativas e aeróbias favorecem a mutiplicação dos anaeróbios, por
consumirem o oxigênio existente no local e talvez por produzirem alguns fatores de crescimento como
substâncias secundárias do seu metabolismo, a maior parte das infecções por bactérias anaeróbias
estritas são infecções mistas. Assim, são freqüentes as infecções conjuntas com Enterobactérias,
Pseudomonas e Staphylococcus aureus.
Alguns aspectos clínicos fazem suspeitar uma infecção com envolvimento de bactérias anaeróbias,
sendo os principais estes abaixo relacionados:
Secreção fétida
Infecção nas proximidades de superfície mucosa
Tecido necrótico
Presença de gás em tecidos ou secreções
Tromboflebite séptica
Coloração negra em secreção com sangue
Infecção decorrente de mordida humana ou de animal
Presença de grânulos de enxofre nas secreções
Terapêutica prévia com aminoglicosídeos
Gangrena gasosa
Uma lesão com aspecto de um micetoma e a observação de grânulos de enxofre no pus obtido são
característica de uma infecção por Actinomyces. A infecção por anaeróbios secundária a uma mordida
de animal ou do ser humano é explicada pela existência de um grande número destas bactérias na
cavidade oral destes hospedeiros. Associados a estes elementos clínicos, existem alguns outros,
laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma infecção por anaeróbios estritos:
Ocorrência de formas pleomórficas na coloração de Gram (como regra geral, os anaeróbios são
mais pleomórficos que os aeróbios e anaeróbios facultativos).
Observação no material, de bacilos gram positivos esporulados que fazem pensar em Clostridium.
Presença de bactérias no Gram direto, que não crescem nos meios mantidos em atmosferas de
aerobiose.
Crescimento de bactérias somente na parte inferior de tubos com meios de cultura líquido ou
semi-sólido.
FATORES PREDISPONENTES
Uma variedade de condições predispõe um indivíduo a desenvolver infecção por anaeróbios. Podemos
generalizar dizendo que todos os fatores que fazem diminuir a quantidade de oxigênio nos tecidos, e,
portanto, o potencial de oxi-redução dos mesmos, favorecem a infecção por anaeróbios estritos. Entre
estes fatores podemos assinalar como mais frequentes os seguintes:
Diminuição do fluxo sangüíneo.
Presença de áreas necróticas.
Corpos estranhos.
Acúmulo de sais endógenos (por exemplo, pontos de calcificação).
Infecção por bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas.
Manipulações cirúrgicas.
Esterilização intestinal pré-operatória.
Tumores, processos orgânicos ou caseosos.
Um baixo potencial de oxi-redução facilita o crescimento de bactérias anaeróbias e a causa clínica
mais comum de diminuição do potencial redox é a anóxia dos tecidos resultante de lesão vascular,
compressão, hipotermia, choque, edema e outras condições levando à má perfusão.
Quanto às doenças sistêmicas ou condições gerais como corticoterapia, terapêutica de tumores,
leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses, diabetes, esplenectomias, embora relacionadas

Mod V - 73
como predisponentes, não há evidência concreta de que realmente estejam associadas à maior
incidência de infecção por anaeróbios.
COLETA DE MATERIAL
As amostras devem ser colhidas de forma que não entrem em contato com oxigênio e não se
contaminem com bactérias anaeróbias da flora normal. Por este motivo devem ser aspiradas com
seringa, da qual é eliminado o ar imediatamente após a obtenção da amostra.
O material não pode ser colhido com zaragatoa (swab). Para evitar a contaminação pelos anaeróbios
da flora normal, não devem ser semeados escarro, secreção faríngea ou nasal, secreções vaginais,
fezes ou material de colostomia, pois estes materiais sempre têm bactérias anaeróbias. Idealmente,
as bactérias anaeróbias estritas são pesquisadas em líquidos aspirados de cavidades fechadas,
material obtido por aspiração profunda de feridas, punção de traquéia ou pulmonar e sangue para
hemocultura.
Em resumo, serve qualquer material que não esteja normalmente contaminado com as bactérias
anaeróbias da flora normal.
TRANSPORTE DO MATERIAL
O transporte pode ser feito com a mesma seringa com que foi colhido o material. Obviamente que
este transporte deve ser o mais rápido possível. O melhor é que a mesmo profissional que colheu leve
imediatamente a seringa ao laboratório.
Também pode ser empregado, com este fim, um vidro do tipo de penicilina, que contém meio de
tioglicolato de sódio (± 7 ml). O tioglicolato é um sal redutor, de forma que no interior do meio
existem condições de anaerobiose. A este meio líquido pode acrescentar uma pequena quantidade de
ágar (0,5%) para transformá-lo em um meio mais espesso, o que dificulta a difusão de oxigênio. O
meio tem um indicador de oxigenação que é a rezarsurina, de modo que se por algum motivo existe
oxigenação do mesmo, o indicador adquire cor rosa.
O material aspirado é inoculado no interior do meio de cultura, através da tampa de borracha.
Especial cuidado deve ter-se para não agitar o meio, antes e depois da inoculação, para evitar sua
oxigenação.
As amostras colhidas neste meio podem ser encaminhadas ao laboratório várias horas após sua
inoculação (até 24 horas).
PROCESSAMENTO DO MATERIAL
Sempre é feita uma coloração de Gram e de esporos, quando necessário, da amostra recebida, o que
pode orientar o clínico para o diagnóstico e a terapêutica precoce. Por exemplo, a observação num
processo com aspecto de gangrena gasosa de bacilos gram positivos, grandes esporulados, é quase
confirmação do diagnóstico de Clostridium e de gangrena gasosa.
A existência de poucas ou muitas bactérias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve
enriquecer previamente a amostra em um caldo ou fazer diretamente a semeadura em placa. Quando
o material vem numa seringa, a semeadura é feita em tioglicolato e em placa. Quando o material já
vem no meio de tioglicolato, é feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os
meios.
PRODUÇÃO DE ANAEROBIOSE
Existem vários procedimentos para conseguir no laboratório uma atmosfera de anaerobiose adequada
à multiplicação das bactérias anaeróbias produtoras de patologia no ser humano. Por exemplo:
Uso de tubos com meios sólidos pré-reduzidos.

Mod V - 74
Câmaras anaeróbias (glove box), nas quais o manipulador introduz somente as mãos, sendo o ar
eliminado, colocando-se uma mistura de gazes (H2, CO2, N2); nestas câmaras existem todos os
elementos necessários para o trabalho bacteriológico, incluindo estufas de incubação.
Sistema mais empregado é o sistema das jarras de anaerobiose com geradores químicos que
permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicação destas bactérias. Existem diversos
tipos de geradores. Os mais utilizados são os que provocam um consumo do oxigênio com
substâncias redutoras como ferro reduzido ou ácido ascórbico.
Os métodos citados acima dão resultados semelhantes quanto à eficácia do isolamento de bactérias
anaeróbias em amostras clínicas, porém, o sistema das jarras é o mais prático e menos complicado.
SEMEADURA EM PLACA
As amostras são semeadas em três placas de ágar sangue preparadas com ágar Brucella, adicionadas
com 10% de sangue de carneiro. Uma das placas é incubada a 37ºC em atmosfera aeróbia, e uma
segunda é incubada a 37ºC em uma atmosfera com 5% de CO2 para bactérias microaerófilas. Para
este fim colocamos a placa em uma jarra com um gerador de CO2, produzindo aproximadamente 5%
de CO2. A terceira placa é a que se inocula em atmosfera de anaerobiose. O meio de cultura desta
terceira placa é enriquecido com hemina (5mg/ml), vitamina K (10 mg/ml) e extrato de levedura
(0,5%). Neste meio acrescenta-se também um antibiótico aminoglicosídeo (geralmente amicacina,
100 mcg/ml).
A adição do antibiótico cria um meio seletivo porque os anaeróbios estritos são resistentes a estes
antimicrobianos e a maior parte das cepas de aeróbios e anaeróbios facultativos é sensível. Como a
maior parte das infecções provocadas pelos anaeróbios estritos são infecções mistas, este meio
seletivo ajuda o isolamento bacteriano. Não se justifica o uso de mais uma placa sem antibiótico
porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaeróbios.
Estas placas são incubadas dentro da jarra a 37ºC de temperatura durante 48 horas. Quando se
suspeita, pelo quadro clínico ou pela coloração de Gram da amostra, que estamos em presença de
uma infecção por Clostridium, que são de crescimento mais rápido, as jarras podem ser abertas após
18 a 24 horas de incubação.
Por outro lado, bactérias de crescimento mais lento, como os actinomices, podem demorar sete dias
ou mais para formar colônias visíveis.
IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
COMPROVAÇÃO DE ANAEROBIOSE ESTRITA
Após a incubação, as placas são examinadas e agora o passo mais importante é a comprovação de
que as bactérias desenvolvidas nas placas de anaerobiose são anaeróbios estritos.
Para este fim, são feitas colorações de Gram, de todos os diferentes tipos de colônias observadas nas
três placas e comparada a morfologia bacteriana. Ao mesmo tempo, semea-se as diversas bactérias
obtidas, novamente em anaerobiose e aerobiose.
Dentro da jarra é colocado, além dos geradores químicos, uma fita de papel filtro
impregnada de azul de metileno, que é um indicador de anaerobiose. Quando a atmosfera
do interior da jarra tem condições adequadas de anaerobiose, o azul de metileno altera
para uma cor branca.
Numa jarra de tamanho médio 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10 placas e muitos
tubos. Com estes sistemas o conteúdo de O2 da jarra cai a 0.4%, em aproximadamente 1
hora e meia, de forma que as condições anaeróbias estão presentes bem antes da
transformação do azul de metileno, que acontece por volta de 4-6 horas.
Observar uma jarra com placas semeadas, um gerador de anaerobiose sobre a última
placa, e o indicador de anaerobiose reduzido de cor branca. Comparar esta cor com a cor
azul do indicador nos geradores localizados fora da jarra em sua parte inferior.

Mod V - 75
Só é feito o diagnóstico de anaeróbio estrito quando, após 24 a 48 horas da nova incubação, a
bactéria apenas crescer na placa de anaerobiose. O Gram das colônias já orienta para uma
identificação preliminar do grupo de anaeróbio isolado.
Agrupamento das bactérias anaeróbias estritas, de importância em patologia humana de
acordo com sua morfologia na coloração de Gram
Cocos Gram Staphylococcus Cocos Gram Veillonella
positivos Peptostreptococcus negativos Acidaminococcus
Streptococcus Megasphaera
Bacilos Gram Propionibacterium Bacilos Gram Clostridium
positivos Bifidobacterium positivos
não esporulados Actinomyces esporulados
Eubacterium
Lactobacillus
Bacilos Gram Bacteróides
negativos Fusobacterium
Prevotella
Porphyromonas
IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA PRESUNTIVA
Das colônias de anaeróbios estritos, deve ser feita coloração de Gram. Já nesta etapa o laboratório
presta uma grande ajuda ao clínico, informando que o paciente tem uma infecção por uma bactéria
anaeróbia estrita que pertence a determinado grupo morfológico.
O diagnóstico de gênero e espécie é feito utilizando:
Provas bioquímicas: utilização de açúcares, produção de indol, redução de nitratos, urease,
crescimento em presença de bile, liquefação da gelatina, hidrólise de esculina etc.
Produção de pigmentos
Hemólise
Aprofundamento no ágar
Susceptibilidade a antimicrobianos
Formação de ácidos detectados por cromatografia líquida
Inoculação experimental
Sorologia
As seguintes considerações práticas são úteis para a orientação do clínico para uma conduta
adequada, sem a necessidade de aparelhos ou metodologias caras por parte do laboratório:
Na presença de cocos Gram positivos, o laboratório deve fazer o diagnóstico presuntivo de
Peptostreptococcus que são os mais freqüentemente isolados neste grupo morfológico.
Diagnóstico diferencial com Streptococcus e Staphylococcus anaeróbios como das espécies de
Peptostreptococcus deve ser feita com ajuda da cromatografia para detectar a produção de
diferentes ácidos graxos.
Na presença de cocos Gram negativos, o laboratório deve fazer o diagnóstico presuntivo de
Veillonella, gênero mais freqüente neste grupo. Para o diagnóstico diferencial com os outros
gêneros de cocos Gram negativos também é recomendada a cromatografia líquida, para pesquisar
ácidos graxos.
Na presença de bacilos Gram positivos esporulados, o laboratório deve fazer o diagnóstico de
Clostridium.
Na dúvida no diagnóstico de bacilo esporulado, recomenda-se o tratamento com álcool etílico a
95%, durante 1 hora à temperatura ambiente e ressemeadura posterior. Além disso, a suspensão
bacteriana pode ser aquecida a 80ºC durante 10 minutos, esfriada e feita resemeadura. Após um
ou outro destes procedimentos, só sobrevivem bactérias esporuladas.
Se o Clostridium produzir um duplo halo de hemólise pode ser feito o diagnóstico presuntivo de
Clostridium perfringens. Esta espécie é a mais freqüentemente isolada dentro deste grupo
bacteriano.

Mod V - 76
Para o diagnóstico diferencial das outras espécies de Clostridium devem ser feitas provas
bioquímicas como hidrólise da gelatina, fermentação da glicose, lecitinase, lipase, produção de
indol, uréia, nitratos, e motilidade.
Na presença de bacilos Gram positivos não esporulados recomendamos fazer a prova de catalase,
redução de nitratos, hidrólise de esculina, urease, e produção de pigmento. Para o diagnóstico
definitivo, deve ser feita a pesquisa da produção de ácidos graxos.
Se a coloração de Gram mostrar bacilos Gram negativos, recomendamos semear a colônia em
ágar sangue (Brucella ágar), colocando um disco de Rifampicina (15 mcg) e um disco de
Kanamicina (1.000 mcg); a bactéria deve também ser semeada num meio que contém bile a 20%,
e num meio rico em triptofano para determinar a produção de indol, com as placas incubadas por
48 horas a 37ºC.
Estas provas junto com a produção de pigmento permitem fazer o diagnóstico presuntivo de
Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium.
Frente aos discos de antibióticos, a bactéria é considerada sensível se o halo de inibição é de 12
mm ou maior; considerada resistente com halos menores de 12 mm.
Como inóculo para a semeadura utiliza-se uma suspensão com turvação semelhante ao número 3
de escala de MC Farland ou uma turvação semelhante após incubação em meio de tioglicolato.
A prova da bile é considerada positiva, se existir crescimento bacteriano no quadrante respectivo.
Para a produção de pigmento, recomendamos a observação direta das colônias, e, em caso de não
existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta (± 360 nm de comprimento de
onda). Colônias de Prevotella melaninogenicus aparecem de cor tijolo avermelhado.
Para a prova de indol, recomendamos passar uma colônia, a partir do meio com triptofano, com
ajuda de uma alça de platina num papel filtro impregnado em 1% de
paradimetilaminocinamaldeido (em ácido clorídrico 10%). Uma reação positiva produz
imediatamente uma cor azul.
O diagnóstico presuntivo é feito de acordo à seguinte tabela:
Bacilos Gram negativos anaeróbios estritos
Bactérias Rifampicin
a 15 mcg
Kanamicin
a 1.000 mcg
Bile 20% Indol Pigmento
Bacteroides grupo fragilis sensível resistente + +/neg neg
Prevotella sp sensível resistente neg +/neg +
Porphyromonas sp sensível resistente neg + +
Bacteróides sp sensível sensível-
resistente
neg neg neg
F.mortiferum resistente sensível + neg neg
F.varium resistente sensível + + neg
Fusobacterium spp. sensível sensível neg + neg
Para Rifampicina e Kanamicina:
Sensível = halo de inibição com 12 mm ou mais de diâmetro
Resistente = ausência de halo ou menor que 12 mm de diâmetro.
A diferenciação dos gêneros Prevotella e Porphyromonas é realizada através da capacidade de
fermentar glicose que é positiva para o primeiro gênero e negativa para o segundo.
Alguns sistemas comerciais manuais ou automatizados permitem fazer o diagnóstico das
diferentes espécies de anaeróbios utilizando numerosas provas bioquímicas.
Algúns utilizando a ação de enzimas bacterianas pré-formadas podem fazer este diagnóstico após
4 horas de incubaçâo. Destes os mais freqüentemente utilizados são:
‫ـ‬ API®, Vitek® e Microscan®. Estes sistemas mais caros não são fundamentais para o
diagnóstico dos grupos bacterianos e para uma orientaçâo terapêutica adequada.

Mod V - 77
Em algumas infecções é importante, para o diagnóstico, determinar a presença de toxinas como
acontece nas infecções intestinais por Clostridium difficile. Esta determinação é feita com provas
sorológicas disponíveis comercialmente.
PROVAS DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
O estudo da sensibilidade destas bactérias é importante pelo aumento permanente de sua resistência
frente aos diferentes antimicrobianos. Esta resistência é mais comum nos gêneros Bacteroides e
Prevotella, mas pode estar presente também nos gêneros Clostridium, Porphyromonas e
Fusobacterium.
Método do Disco
O método do disco difusão não é adequado para estudar a sensibilidade das bactérias anaeróbias
estritas. O NCCLS (National Committee for Clinical Laboratories Standards) dos EUA recomenda um
método de diluição em ágar: as concentrações de antimicrobianos são incorporadas no meio de
Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentração de um antimicrobiano. As bactérias são
semeadas utilizando o inoculador múltiplo de “Steers” e as placas colocadas em jarras com gerador de
anaerobiose. A leitura é feita após 48 horas de incubação na estufa, determinando-se a CIM
(concentração inibitória mínima).
Método da Fita
Um método alternativo mais prático é a determinaçâo da sensibilidade utilizando fitas de plástico
impregnadas com um gradiente de concentração de antimicrobianos como no método do E test®. As
bactérias são semeadas em forma similar à empregada no método do disco para aeróbios. São
colocados duas fitas cada uma com um antibiótico diferente em cada placa de 9 cm de diâmetro. Em
geral é necessário testar 6 antibióticos (3 placas). Os antimicrobianos com maior atividade in vitro e in
vivo frente aos anaeróbios estritos são: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, metronidazol, penicilina
e amoxicilinanegácido clavulânico. As placas são incubadas dentro de jarra com gerador a 37 graus de
temperatura. A leitura é feita após 48 horas de incubação, e a sensibilidade é interpretada nos dois
métodos seguindo as tabelas publicadas pelo NCCLS.
Salientamos que existe uma boa correlação nos resultados obtidos com as duas metodologias
descritas.

Mod V - 78
9. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS E LAUDOS
INTRODUÇÃO
O microbiologista ao elaborar os relatórios de exames microbiológicos deve ter em mente a
possibilidade do clínico não saber interpretá-lo adequadamente, tanto por desconhecer um
determinado nome de bactéria, como seu potencial patogênico e porque muitas vezes estas dúvidas
associadas à disponibilidade do antibiograma possam ser um fator determinante do uso inadequado
de antimicrobianos.
Cabe ao microbiologista elaborar um laudo claro e objetivo, facilitando a comunicação:
Diretamente (telefone ou pessoalmente), indo ao encontro do clínico ou encorajando-o a procurar
o laboratório para discutir casos ou participar de reuniões, visitas de enfermaria, etc.
Elaborando manuais de coleta, informes sobre perfil de bactérias mais isoladas e padrões de
sensibilidade (por exemplo em hemoculturas, em urina, ferida cirúrgica por especialidade, etc.).
Esclarecendo novos padrões de relatórios, novos agentes, seu potencial patogênico, mudanças de
padrões (p. Ex. de antibiograma), disponibilidade de recursos diagnóstico e orientação terapêutica
(ex. E-test, testes rápidos com látex para pesquisa de antígenos, etc.).
Microbiologista deve ter em mente os principais agentes etiológicos correspondentes a cada material
enviado, bem como da respectiva flora normal, para adequada interpretação do resultado.
Cabe ao microbiologista como membro nato da Comissão de controle de infecção hospitalar:
Tomar iniciativa de procurar o médico ou o paciente para esclarecer dúvidas sobre exames e
materiais.
Estimular e envolver a enfermeira e o infectologista da CCIH ou clínico para a comunicação rápida
dos resultados de bactérias resistentes, dos exames relacionados com diagnóstico de infecção
hospitalar, dos exames de urgência como de LCR, hemocultura, etc., do diagnóstico de doenças de
notificação compulsória ou que exijam isolamento, etc.
Em resumo, mais do que um retrato do crescimento nas placas de Petri, o laudo microbiológico deve
ser o resultado de uma leitura interpretativa e crítica utilizado como um instrumento de comunicação
e interação entre o laboratório de microbiologia e o médico.
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
O microbiologista na sua rotina diária para decidir a importância das bactérias ou fungos isolados deve
considerar o potencial patogênico do agente, a bacterioscopia e o pedido médico.
Bactérias como S. pyogenes, Neisseria gonorrhoeae e Mycobacterium tuberculosis, independente do
material que foram isoladas são de importância clinica e epidemiológica. Bactérias como Neisseria
meningitidis e Haemophilus influenzae, se forem isolado no LCR ou sangue são de importância
indiscutível, mas quando isolados em mucosas costumam representar flora e seu relato é discutível.
ALGUMAS SUGESTÕES IMPORTANTES
Como norma, não se deve identificar e fazer antibiograma de bactérias da microbiota de pele e
mucosas. No entanto, é sempre conveniente entender as sugestões que se seguem como sujeitas a
revisões conceituais e atualizações:
Conversar com o médico do paciente ou com o médico da CCIH ou mesmo com o paciente se
indicado.
Quando não for possível a comunicação, relatar os achados da bacterioscopia, se realizada, com
identificação sumária (bacilos ou coco-bacilos não fermentadores), ou ao nível de gênero
(enterobactérias e alguns Gram positivos), se o estafilococo é aureus ou coagulase negativo, etc.
Conservar a bactéria por um prazo de 7 a 10 dias deixando a possibilidade de prosseguir nos
testes caso necessário.

Mod V - 79
Estudos quantitativos são sempre que possível mais úteis que exames qualitativos, usando ou
diluição do material ou semeando com alça calibrada
Relatório quantitativo de bacterioscopia: número médio de bactérias anotadas no mínimo em 10
campos observados.
Relatório qualitativo de bacterioscopia do esfregaço corado pelo Gram, descrevendo e
quantificando a presença de:
‫ـ‬ grupos morfológicos de bactérias (cocos/bacilos/ Gram positivos ou negativos) e predomínio;
quando o microbiologista for experiente recomenda-se adicionar o comentário “sugestivo de
pneumococo ou haemophilus”, etc.
‫ـ‬ bactérias intracelulares (neutrófilos ou fagócitos)
‫ـ‬ fungos leveduriformes em brotamento e hifas, etc.
Finalmente a discussão sobre os materiais provenientes de tecido cutâneo-mucosos, o que
devemos relatar com antibiograma e o que entender como flora são muito relativos, não havendo
unânimidade para padrões definitivos de relatórios.
É sempre conveniente entender que as sugestões que se seguem estão sujeitas a revisões
conceituais, atualizações e pequenas adaptações locais.
Como microbiologia é uma soma de evidências (microbiológicas, clínicas, epidemiológicas), torna-se
impossível esgotar todas as possibilidades. O que pode e deve ser feito é buscar traçar linhas mestras
para a orientação do raciocínio, deixando que cada caso seja analisado como um exercício constante
do bom senso e cientificamente embasado.
Relatório quantitativo de exame microscópico pela coloração de Gram
Descritivo Classificação
númerica
Nr. médio de bactérias, células epiteliais,
leveduras, neutrófilos /campo 1.000x
Ausente 0 0
Raros + 1-5
Frequentes ++ 6-15
Numerosos +++ 16-30
Incontáveis ++++ >30
LAUDO PARA O TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR
OROFARINGE
É importante relatar os achados de bacterioscopia do esfregaço corado pelo Gram, descrevendo e
quantificando a presença de:
Células epiteliais
Polimorfonucleares (neutrófilos) e/ou mononucleares (linfócitos)
Principais grupos morfológicos de bactérias
Presença de bactérias intracelulares (neutrófilos ou fagócitos)
Presença de fungos leveduriformes / hifas
Associação fuso-espirilar, quando presente
Patógenos a serem relatados em isolados de cultura:
Streptococcus pyogenes (beta hemolítico do grupo A)
Arcanobacterium haemolyticum
Bordetella pertussis
Corynebacterium diphtheriae

Mod V - 80
No caso da Corynebacterium diphtheriae quando solicitado, realizar ou encaminhar para Laboratório
de Referência:
‫ـ‬ Resultado sem patógenos: “Presença de bactérias da microbiota da orofaringe”
‫ـ‬ No caso de paciente imunossuprimido, quando solicitado, cultura de vigilância e se houver
predominância de bactéria ou fungo, relatar predomínio de: P. aerginosa, Candida spp., S. aureus,
Enterococcus spp., etc.; nestes casos o antibiograma será feito apenas quando solicitado pela
CCIH.
Obs: Embora seja um tema polêmico na literatura e na prática microbiológica, relatar o isolamento de
pneumococo, Haemophilus, N. meningitidis, Moraxella catarrhalis em orofaringe, nos casos em que:
‫ـ‬ a bacterioscopia revelar predomínio de neutrófilos (ressalva em imunossuprimidos), presença do
agente em neutrófilos/macrófagos e crescimento abundante (nítido predomínio) em relação ao
restante da microbiota.
‫ـ‬ a pedido médico, colocar a seguinte observação: “A(s) bactéria(s) isolada(s) fazem parte da
microbióta da orofaringe, não sendo recomendável uso de antimicrobianos. Consultar
infectologista para orientação.”
SWAB NASAL
O swab nasal ou de nasofaringe não tem valor diagnóstico para sinusite, otite ou infecções do trato
respiratório inferior, não devendo ser processada para estes fins. Pode ser útil apenas para pesquisar
portadores de S. aureus e Streptococcus pyogenes (beta hemolitico do grupo A).
EPIGLOTE/NASOFARINGE
No caso de epiglotite, no material de nasofaringe ou do local, podem ser isolados o Haemophilus
influenzae, o pneumococo e o Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus como agente
etiológico. No caso de coqueluche deve-se pesquisar a Bordetella pertussis.
Relatar o resultado positivo ou negativo para Haemophilus influenzae, pneumococo, Streptococcus
pyogenes, S. aureus e Bordetella pertussis quando pesquisados.
SEIOS DA FACE
Culturas de aspirados intra-operatórios ou obtidas por punção devem ser relatadas:
Bacterioscopia - relato quantitativo de bactérias, fungos, neutrófilos e células epiteliais.
Cultura dos agentes isolados e se houver predomínio de algum (são esperados o pneumococo, H.
influenzae, M. catarrhalis, Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus).
Caso seja sugestivo de contaminação com secreção de nasofaringe (muitas células epiteliais,
poucos neutrófilos) relatar: “sugestivo de contaminação com microbiota de nasofaringe“.
É aconselhavel em sinusite subaguda e crônica a cultura para anaeróbios. Quando realizada relatar
o resultado. Quando não realizada, comparar a bacterioscopia com o resultado da cultura e relatar
sobre a possibilidade de participação de bactérias anaeróbias (observadas no Gram, mas que não
crescem em aerobiose).
A rino-sinusite infecciosa aguda e não complicada na maioria das vezes é de etiologia viral.
Ressaltando-se os seguintes casos:
‫ـ‬ Em imunossuprimidos e diabéticos valorizar o achado de fungos filamentosos do tipo Aspergillus
spp.
‫ـ‬ Em pacientes com entubação nasotraqueal ou nasogástrica > que 48h, o material pode revelar
presença de enterobactérias, bactérias não fermentadoras, S. aureus, leveduras e polimicrobiana.
Devem ser relatados, mas para serem valorizados deve haver clínica ou evidência radiológica e
material representativo.
OUVIDO
Otite externa:
- relatar o resultado da bacterioscopia e fazer identificação e antibiograma caso a bacterioscopia de
respaldo (abundantes neutrófilos e predomínio do tipo morfológico isolado na cultura de potencial
patógeno) ao isolamento de uma enterobactéria ou Pseudomonas ou eventualmente fungo.

Mod V - 81
Otite média:
‫ـ‬ Culturas de materiais obtidos por timpanocentese (miringotomia) são ideais, mas raros e devem
ser relatados os achados de bacterioscopia e cultura.
‫ـ‬ Swabs, ou aspirados de conduto auditivo em membranas previamente rompidas tem pouco ou
nenhum valor diagnóstico. Sugerir não coletar este tipo de material.
‫ـ‬ Quando realizada a cultura, havendo crescimento de bactérias da microbiota (Gram positivos,
Neisserias, enterobactérias, etc.) relatar: “presença de bactérias da flora do conduto externo”.
‫ـ‬ No caso da bacterioscopia revelar predomínio de um tipo morfológico, com abundantes neutrófilos
e predomínio na cultura de um agente, relatar: microscopia do esfregaço corado pelo Gram com
relatório quantitativo dos elementos celulares (células, bactérias e neutrófilos) e qualitativa.
‫ـ‬ Resultado da cultura, quando o agente isolado for Haemophilus, Pneumococo ou M. catarrhalis,
relatar o agente isolado e o antibiograma
‫ـ‬ Quando o agente for uma enterobacteria ou Pseudomonas relatar que a bactéria isolada é
sugestiva de contaminação, exceto se for em paciente com entubação nasotraqueal há mais de
48h. A pedido médico fazer antibiograma.
‫ـ‬ No caso de mastoidite a indicação é obtenção cirúrgica de fragmentos ósseos para cultivo e não
cultura de secreção de ouvido externo/médio. Poderá se relatado o cultivo deste material quando
a bacterioscopia for concordante e a bactéria isolada for:
Aguda: Haemophilus, pneumococo, S. pyogenes e S. aureus – fazer antibiograma
Crônica: Enterobactérias, Pseudomonas, S. aureus.
‫ـ‬ Quando isolar Staphylococus coagulase negativa, S. viridans, Corynebactérias, etc, em flora
mista, relatar: “presença de bactérias da flora do conduto auditivo externo” e não fazer
antibiograma.
LAUDO PARA ESCARRO
O escarro é útil para diagnóstico de tuberculose e para os agentes de algumas micoses pulmonares
(blastomicose sul-americana, histoplasmose, criptococose). Pode ser valorizado o agente isolado
quando houver correspondência na bacterioscopia e quando houver poucas células epiteliais e
numerosos leucócitos.
Quando a bacterioscopia revelar mais de 10 células epiteliais por campo de pequeno aumento
(objetiva de 10x), havendo predomínio sobre leucócitos e sem um tipo morfológico predominante,
relatar: “material com sugestiva contaminação de flora de orofaringe. Exame de valor diagnóstico
prejudicado”. Não processar o material e solicitar nova amostra.
Processar o material que revele menos de 10 células epiteliais, quando houver predomínio de
leucócitos e predomínio de um tipo morfológico de bactéria. Este critério é mais rigoroso, pois o
anterior, para mais de 25 células epiteliais, revelou ser mais fidedigno.
Os agentes bacterianos esperados em pneumonia aguda da comunidade são: S. pneumoniae, M.
catarrhalis, H. influenzae e S. aureus.
LAUDO PARA SECREÇÃO ENDOTRAQUEAL, LAVADO TRAQUEAL, E LAVADO BRÔNQUICO
ROTINA PARA LAVADO BRÔNQUICO, ESCARRO E SECREÇÃO TRAQUEAL
Homogeneizar muito bem a amostra, por pelo menos 1 minuto.
Fluidificar as secreções traqueais muito espessas com 1,0 ml de solução salina estéril ou com N-
acetil-cisteína.
Pode-se também utilizar pérolas de vidro estéreis na homogeneização do material.
Confeccionar lâmina para coloração de Gram.
Centrifugar 7 ml e corar o sedimento, quando processar lavado brônquico.
Corar o material direto, sem centrifugar, quando processar escarro e secreção traqueal.
Fixar cuidadosamente o esfregaço seco sobre a chama.

Mod V - 82
Observar ao Gram (imersão) a presença de bactérias intracelulares que devem ser reportadas
caso ultrapassem 7%.
Verificar a presença de células estratificadas epiteliais. Mais de 1 célula para cada 10 leucócitos ou
mais de 10 células em campo de pequeno aumento contra indicam a realização de cultura, e
portanto reportar como Material Inadequado.
Confeccionar também lâminas para coloração de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessário.
Plaquear volume de 1 µl (alça calibrada) em meios de Mac Conkey, MN, Ágar Sangue e Ágar
Chocolate (atmosfera CO2).
Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1º C e realizar a primeira leitura quantitativa.
Reincubar por mais 24 horas nos casos de difícil diferenciação macroscópica entre colônias.
Multiplicar o número de cada tipo de colônia identificada pelo fator 103
.
Interpretar como significativo as contagens > 105
UFC do lavado brônquico, escarro ou secreção
traqueal.
Realizar antibiograma somente para as colônias com contagens significativas.
Liberar apenas a identificação, sem TSA, para microrganismos em contagens inferiores a 105
UFC.
RELATÓRIO
Quando usar técnica qualitativa:
Quando o material for adequado, mas mais de três bactérias isoladas, sem predomínio, relatar
microbiota mista, presença de (número) Gram positivos e (número) de Gram negativos. Não fazer
antibiograma e guardar a placa por sete dias.
Quando houver predomínio de uma bactéria relatar: predomínio do agente e antibiograma.
Presença de outros microrganismos: Gram positivos e/ou Gram negativos, no máximo
identificados a nível de gênero, sem antibiograma.
Quando usar técnica quantitativa:
Se houver contagem significativa, com predomínio de um microrganismo e eventualmente 2,
relatar o(s) agente(s) isolado(s) e fazer antibiograma.
Se a contagem não for significativa ou várias bactérias da microbiota do trato respiratório superior
foram isoladas relatar: “presença de bactérias da flora do trato respiratório superior sem valor
diagnóstico”. Não identificar nem fazer antibiograma.
LAUDO PARA LAVADO BROCOALVEOLAR OU ESCOVADO BRÔNQUICO
São considerados junto com a biópsia pulmonar os materiais de melhor valor preditivo de isolamento
do agente patogênico. É imprescindível a semeadura quantitativa para posterior contagem do número
de colônias.
ROTINA DE SEMEADURA E INTERPRETAÇÃO PARA ESCOVADO PROTEGIDO E BAL
Passar assepticamente a escova para um tubo contendo 1,0ml de solução salina estéril.
Homogeneizar muito bem em vórtex por pelo menos 1 minuto.
Confeccionar lâmina para Gram com pipetor de 10 µl ou alça calibrada de mesmo volume.
Deixar a lâmina secar por 30 minutos dentro da estufa.
Completar a fixação do esfregaço cuidadosamente sobre a chama.
Confeccionar também lâminas para coloração de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessário.
Plaquear 10 µl (alça calibrada ou pipetor) em Mac Conkey, MN, Ágar Sangue e Ágar Chocolate
(CO2).
Plaquear 1 µl (alça calibrada) em Mac Conkey, MN, Ágar Sangue e Ágar Chocolate (CO2)
Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1º C e realizar a primeira leitura quantitativa.

Mod V - 83
Reincubar por mais 24 horas nos casos de difícil diferenciação macroscópica entre colônias.
Multiplicar a contagem dos tipos de colônias identificadas pelo fator, de acordo com o volume
plaqueado.
‫ـ‬ Multiplicar pelo fator 102
quando o volume plaqueado foi 10 µl.
‫ـ‬ Multiplicar pelo fator 103
quando o volume plaqueado foi 1µl.
Quando for conhecido o valor de solução fisiológica utilizado na técnica do BAL, deve-se considera-
lo como mais um fator de correção. Por exemplo: se forem utilizados 10, 20 ou 100 ml; multiplicar
por 10, 20 ou 100, respectivamente.
Interpretar como significativo para o diagnóstico de pneumonia contagens:
‫ـ‬ 103
UFC para Escovado Brônquico Protegido
‫ـ‬ 104
UFC para BAL
Realizar antibiograma somente para as colônias com contagens significativas.
Liberar apenas a identificação, sem TSA, para os microrganismos em contagens inferiores à
significativa.
Exemplo de cálculo:
Cultura quantitativa de BAL, colhido com 10 ml de solução fisiológica estéril, apresentou crescimento
de 80 colonias de Pseudomonas aeruginosa com a alça de 10 µL e 8 com a alça de 1 µL, além de 5
colonias de Streptococcus viridans apenas na semeadura com 10 µL.
Cálculo:
Pseudomonas aeruginosa –
‫ـ‬ 10 (sol. Fisiológica) x 80 (no de colônias) x 100 (alça de 10µL) = 80.000 (ou 8.104
UFC/ml)
‫ـ‬ 10 (sol. Fisiológica) x 8 (no de col.) x 1000 (alça de 1µL)= 80.000 (ou 8.104
UFC/ml)
Streptococcus viridans –
‫ـ‬ 10 (sol. Fisiológica) x 5 (no de col.) x 100 (alça de 10 µL) = 5.000 (ou 5.103
UFC/ml)
Relatar:
Pseudomonas aeruginosa - 8.104
UFC/ml / com antibiograma
Streptococcus viridans - 5.103
UFC/ml / sem antibiograma
RELATÓRIO DA BACTERIOSCOPIA
Descrever os achados da bacterioscopia do centrifugado, lembrando que será melhor quando feita em
citocentrífuga.
Relatar:
Relação células epiteliais/neutrófilos.
Descrever presença de bactérias e, particularmente, se houver presença de microrganismos
fagocitados, quanto ao seu padrão morfo-tintorial (forma e reação ao gram) e se há predomínio de
algum tipo.
RELATÓRIO DA CULTURA
Culturas quantitativas de amostras do trato respiratório inferior, relatar:
Contagem final do(s) microrganismo(s) isolado(s)
Quando isolar um ou até dois microrganismos em contagens significativas (vide parâmetros), fazer
antibiograma
Comentar: contagem bacteriana significativa – bom valor preditivo de infecção se a clínica for
concordante.

Mod V - 84
Quando as contagens não forem significativas ou mais de dois microrganismos isolados e
bacterioscopia com predomínio de células epiteliais sobre os leucócitos, relatar: “Presença de bactérias
do trato respiratório superior” - sem valor diagnóstico.
Contagens bacterianas consideradas significativas
Escarro, aspirado endotraqueal, lavado brônquico = 105
– 106
Ufc/ml
Escovado brônquico protegido = 103
Ufc/ml
Lavado broncoalveolar (BAL) = 104
Ufc/ml
CANDIDA EM SECREÇÕES RESPIRATÓRIAS
A Pneumonia causada por Candida spp. é considerada uma raridade e o diagnóstico só pode ser
definido por biópsia pulmonar que revele invasão tecidual e não por cultura. É muito freqüente a
presença qualitativa de Candida spp. em todos os materiais obtidos de pacientes com cânula oro-
traqueal ou traqueostomia.
O relato de isolamento de Candida costuma induzir a terapêutica desnecessária, com custo elevado,
com efeitos colaterais e seleção de cepas resistentes. Mesmo contagens significativas de leveduras
devem ser consideradas com cautela, pois pode apenas representar colonização. Exceção deve ser
feita aos recém-natos pré-termo e de baixo peso. Nestes, a mortalidade por candida apresenta níveis
bastante elevados e a possibilidade de infecção invasiva deve ser considerada. Outros fungos como
Histoplasma, Cryptococcus spp. e mesmo Aspergillus spp. (particularmente em imunossuprimidos)
devem ser identificados e relatados.
LAUDO PARA PLEURAL
Todo o cuidado deve ser tomado para evitar contaminação deste material. A bacterioscopia do
sedimento centrifugado é muito útil para avaliar a presença de bactérias, micobactéria e
eventualmente fungos, bem como as características da celularidade.
Alguns patógenos encontram-se em pequena concentração (Haemophilus, pneumococo, Streptococcus
pyogenes, S. aureus) ou mais raramente podem ser Anaeróbios , fastidiosos ou fungos. Relatar o
isolamento de bactérias potencialmente patogênicas (acima relacionadas). No caso de Staphylococcus
coagulase negativo, Corynebacterium spp., Streptococcus viridans e outras bactérias da flora cutâneo-
mucosa, é conveniente comparar com os achados da bacterioscopia e na dúvida contatar o clínico e
solicitar nova coleta com anti-sepsia rigorosa.
LAUDO PARA ABSCESSO PULMONAR
Os mesmos potenciais patógenos do derrame pleural podem estar presentes, incluindo os anaeróbios
e fungos e somados às Nocardias, Micobactérias, Bacillus anthracis, etc.
O exame microscópico da amostra do material deve ser processado pela microbiologia e pelas técnicas
histológicas. As colorações de Gram e Ziehl, exame direto com azul de algodão e se possível o Giemsa
serão muito úteis na busca do agente etiológico e na sugestão de meios de cultura para semeadura,
para orientar tempo de incubação, etc. Relatar o isolado se potencialmente patogênico.
Cautela na liberação de resultados de cultura se exames microscópicos forem negativos e a cultura
revelar bactérias potenciais contaminantes de pele. Outras causas de abscesso devem ser
consideradas (neoplasia, infarto, etc.).
LAUDO PARA OCULAR
Os potenciais patógenos devem ser distinguidos dos potenciais contaminantes de mucosas, sendo
o recurso mais simples a bacterioscopia do material, quando necessário concentrado fazendo-se

Mod V - 85
uma suspensão do swab em salina e centrifugado em cito-centrífuga. No entanto é comum a
bacterioscopia ser inconclusiva, tanto pela dificuldade de caracterizar a bactéria como pelas outras
etiologias (viral, Chlamydia trachomatis, alérgica, química, uso prévio de colírios com antibióticos,
etc.).
Infecções de glândula lacrimal, ordéolo e blefarite podem involver amostras de S. aureus.
Conjuntivite bacteriana pode ser atribuída à N. gonorrhoeae em recém-nascidos. A presença de S.
pneumoniae, H. influenzae, S. aureus são outras possibilidades etiológicas.
• Isolamento de bactérias como S. aureus ou os outros agentes relacionados, concordantes ou não
com a bacterioscopia, desde que não descrito como raríssimas colônias, deve ser relatado e
realizado o antibiograma.
Úlcera de córnea pode envolver P. aeruginosa e outros oportunistas inclusive protozoários
(Acanthamoeba). Cautela no caso de isolamento de Neisserias saprofitas, Staphylococcus
coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. e outros potenciais habitantes
de mucosas. Comparar sempre o resultado da bacterioscopia, com a quantidade de bactérias
isoladas, se houve crescimento puro ou quase puro.
Relatar: cultura positiva para bactéria da microbiota de mucosas – sem valor diagnóstico. Sugerir
nova coleta.
Endoftalmite envolve bactérias potencialmente patogênicas como S. aureus, P. aeruginosa,
pneumococo, Haemophilus spp., N. meningitidis, e outros agentes relacionados a fatores
predisponentes como imunossupressão, diabetes, trauma, cirurgia, endocardite, bacteremia, etc.
O material deverá ser obtido por punção e evitar contaminação. Eventualmente anaeróbios e
fungos podem estar presentes. O exame microscópico poderá ajudar a evidenciar o agente e
orientar o meio de cultura mais adequado ou apenas o resultado da cultura poderá revelar o
agente, que poderá ser um dos listados acima.
No caso de potenciais contaminantes que crescem em pequena quantidade, sem respaldo da
bacterioscopia, identificar o agente e relatar: “bacteria da flora de mucosas, papel patogênico
duvidoso”. Guardar a bactéria por sete dias para eventual teste de sensibilidade.
LAUDO PARA LÍQUIDO CÉFALO RAQUIDIANO (LCR)
Os agentes clássicos das meningites devem ser relatados bem o antibiograma.
A bacterioscopia pode ser relatada sem resultado positivo de cultura quando o microbiologista
sentir confiança no diagnóstico.
No caso de isolamento na cultura de potenciais contaminantes de pele, em caso de meningite
bacteriana sem fator predisponente (imunossupressão, cirurgia, etc) e bacterioscopia discordante
ou negativa, relatar: “O agente isolado com o comentário: potencial contaminante de coleta”. O
antibiograma será realizado apenas a pedido médico.
Não cultivar LCR em caldo de cultura, pois aumenta muito a chance de isolamento de
contaminantes.
LCR obtido pelo “shunt”: a maioria das infecções em pacientes com shunts, ou derivações são
bactérias da flora cutânea como Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans,
Corynebacterium spp. , Neisserias saprofitas e Acinetobacter spp. Neste caso devem ser
considerados e relatados. Eventualmente Propionibacterium spp. podem estar envolvidos. Na
dúvida solicitar novo material para confirmação. Bactéria que cresce no caldo e não cresce no
ágar, se não for fastidioso ou anaeróbio em geral é contaminante.
LAUDO PARA FEZES
Os potenciais agentes de diarréia são muitos.
laboratório deve listar apenas os agentes pesquisados na sua rotina ou quando especificado pelo
clínico relatar o resultado sobre os agentes solicitados.
Relatar: “Cultura negativa para os seguintes enteropatógenos pesquisados: E. coli clássica, E. coli
invasora, E. coli O 147 EHEC, Shigella spp., Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Aeromonas
spp. (opcional), Plesiomonas shigelloides (opcional).

Mod V - 86
Relatar pesquisa de leucócitos quando realizada pois dá suporte a infecções por Salmonella,
Shigella e Campylobacter.
No caso de realizar cultura para Campylobacter de rotina, incluí-lo no relatório. Lembrar que
diarréia/enterocolite em pacientes com mais de 3 dias de hospitalização e fazendo uso de
antimicrobianos pode ser Clostridium difficile, devendo pesquisar a toxina com kits específicos.
Diarréia com mais de 7 dias de duração em imunocomprometidos pode ser por parasitas (Giardia,
Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora belli e em paciente com HIV, complexo do Mycobacterium
avium.
LAUDO PARA PELE, ABSCESSOS E FERIDAS
Abscesso tecido subcutâneo
Abscesso cerebral
Abscesso intranegabdominal
Embora sejam os três materiais abscesso, o microbiologista deve ter em mente expectativa de
isolamento de diferentes agentes.
Os abscessos fechado e puncionados com técnica asséptica são considerados materiais de bom
valor preditivo diagnóstico quando revelam bactérias ou fungos.
Deve-se, portanto, orientar o médico para obter material nas melhores condições de assepsia
possível.
Encaminhar rapidamente o material para o laboratório.
Para abscessos considerar a possível participação de anaeróbios estritos ou microaerófilos. Quando
disponível fornecer meio de transporte adequado ou orientar para enviar o material na seringa
sem agulha.
Fazer lâmina para bacterioscopia, e, se indicado, exame direto com KOH 10% para pesquisa de
fungos, asssim como pesquisa de BAAR para micobactérias.
Nos abscessos de tecido subcutâneo e cerebral a bacterioscopia pode dar orientação útil para
escolha dos meios de semeadura ou ajudar no resultado. S. aureus é a causa mais importante em
abcesso subcutâneo, mas em caso de associação com mordida, os fastidiosos devem ser
lembrados.
No caso de abscesso cerebral, o diagnóstico correto e rápido é de extrema valia. O exame
microscópico pode ser muito útil se revelar algum agente. Pode haver participação dos mais
variados agentes como bactérias comuns, fastidiosos, fungos, nocardia, micobactérias, etc. Deve-
se procurar semear no maior número de meios diferentes, inclusive em caldo tioglicolato.
No caso de abscesso abdominal a associação de enterobactérias com anaeróbios é esperada.
Dependendo da história clínica lembrar de Salmonella e Yersinia.
No caso de abscesso de tecido subcutâneo o resultado ideal é quando concordante com a
bacterioscopia e revelando agente potencialmente patogênico. O S. aureus e Streptococcus beta
hemolíticos causam mais celulite, mas podem ser isolados em abscessos, sendo as enterobactérias
raras.
No caso da cultura revelar bactérias da microbiota, mas concordante com a bacterioscopia (S.
viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc,); liberar o resultado com o
antibiograma.
No caso de bacterioscopia negativa ou discordante e, principalmente em abscesso drenando há
alguns dias, liberar o resultado fazendo restrições sobre a possibilidade de contaminação; a
bactéria isolada possivelmente representa contaminação pela microbiota da pele, assim, guardar a
bactéria por sete dias e não fazer o antibiograma.
No caso de abscesso cerebral se o exame microscópico revelar possível agente, o clínico deve ser
imediatamente comunicado e informado do andamento dos exames de cultura.
Tanto bactérias potencialmente patogênicas como possíveis contaminantes de pele ou mucosas
podem ser isoladas, mas o clínico deve estar informado e o teste de sensibilidade poderá ser feito
de qualquer destas bactérias.

Mod V - 87
Os abscessos abdominais polimicrobianos da comunidade em geral respondem à terapêutica
empírica e não exigem a identificação de todas as bactérias aneróbias facultativas e anaeróbias
estritas. Importante relatar quando isolar enterococcus ou enteropatógenos ou bactérias não
comuns ou nos casos de insucesso terapêutico; indica-se identificar os agentes isolados e fazer o
antibiograma.
FERIDA / LESÃO CUTÂNEA
Em geral estes materiais são feridas de origem na comunidade. O relatório de cultura de ferida aberta
ou lesão depende muito de saber se a coleta foi adequada removendo secreções superficiais ou não.
Relatar quando isolar S. pyogenes, S. aureus e fastidiosos em condições clínicas concordantes
(mordida, acidente com água, terra, etc).
Enterobactérias e Pseudomonas podem ser contaminantes ou patogênicos. Deve-se relatar o
achado, mas colocar como ressalva a possibilidade de contaminação.
Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc., sugerem
contaminação
Dá respaldo a possibilidade de isolamento de agente patogênico quando são atendidos os seguintes
requisitos:
‫ـ‬ Coleta bem feita.
‫ـ‬ Bacterioscopia concordante com a cultura e
‫ـ‬ Ocorrem muitas colônias de uma mesma bactéria, isoladas em cultura pura ou em nítido
predomínio.
FERIDA CIRÚRGICA
São esperadas bactérias endógenas ou tipicamente de origem hospitalar (Enterobacterias, S. aureus,
Pseudomonas, etc). Para o relatório de cultura e indicação de antibiograma deve-se contar com coleta
bem feita, e os resultados devem ser comunicados a CCIH.
Neste caso infecções polimicrobianas são comuns, devendo-se considerar os gêneros predominantes.
Deve-se guardar as cepas isoladas por período maior (mínimo 30 dias) para eventual investigação de
surto e fazer antibiograma com atenção para pesquisa de bactérias multiresistentes.
DRENO / FÍSTULA
São materiais que não deveriam ser coletados, pois na maioria das vezes representam colonização
dos drenos. Mesmo fístulas de osteomielite não são adequadas.
Nos casos em que a bactéria encontrada já tenha sido isolada de procedimento com menor risco de
contaminação (biópsia, punção, etc.) e persiste, relatar o achado e fazer antibiograma. Para os
demais casos relatar os gêneros que predominaram na cultura, sem antibiograma e que representam
possível contaminação. Guardar as bactérias por sete dias. Considerar que fístulas expontâneas
podem revelar presença de micobacteriose, micoses, actinomicose, etc.
BIÓPSIA
As biópsias devem seguir critérios cirúrgicos de antissepsia. Assim representam material de bom valor
preditivo diagnóstico. O material deverá em condições assépticas ser triturado em gral e semeado
qualitativa e quantitativamente para posterior cálculo aproximado do conteúdo bacteriano por grama
de material. Utilizam-se as seguintes amostras: tecido, material de queimadura, material ósseo.
Condições que dão segurança para liberação do resultado e antibiograma:
‫ـ‬ Condições adequadas de coleta, transporte e processamento preliminar.
‫ـ‬ Bacterioscopia concordante com achados de cultura.
‫ـ‬ Cultura pura ou predomínio de algum germe em particular.
‫ـ‬ Contagens >104 UFC/g tecido
Para os demais casos:
‫ـ‬ Bacterioscopia negativa ou discordante

Mod V - 88
‫ـ‬ Culturas polimicrobianas
‫ـ‬ Isolamento de bactérias da flora cutâneo-mucosa (Streptococcus viridans, Staphylococcus
coagulase negativo, corineformes, Neisseria spp., etc)
‫ـ‬ Baixas contagens < 104
UFC/g de tecido; relatar o(s) agente(s) isolado(s), sua contagem sem
antibiograma e guardar a(s) bactéria(s) por sete dias.
GÂNGLIO
O gânglio quando infectado pode revelar agentes importantes de doenças localizadas ou sistêmicas,
de origem: bacteriana (incluindo os fastidiosos), raramente anaeróbios; e micobacteriose, fungos,
protozoários e vírus.
Cabe ao laboratório aproveitar ao máximo. Uma parte será enviada para estudo histológico e o
restante do material deverá ser triturado e realizado exame microscópico (Gram, direto com KOH
10%, Giemsa) e culturas para bactérias (em meios ricos), fungos e micobactérias; caldo BHI com
suplemento (pode ser o balão de hemocultura) e tioglicolato com suplemento.
Procurar identificar o gênero e espécie com segurança e na dúvida encaminhar a laboratório de
referência. No caso de isolamento de bactérias da flora cutâneo-mucosa e sem correlação com a
bacterioscopia relatar o achado sem antibiograma e guardar a bactéria por sete dias.
Contactar o clínico e o patologista, e se persistir a suspeita de etiologia bacteriana, quando possível,
solicitar nova amostra.
LAUDO PARA GENITAL
URETRAL
Os principais agentes etiológicos das uretrites estão bem estabelecidos:
Chlamydia trachomatis
Mycoplasma spp.
Ureaplasma spp.
Herpes simplex (vírus)
Mais raramente:
Trichomonas vaginalis
Haemophilus spp.
outros
Colher sempre lâmina para bacterioscopia:
Trichomonas: colher urina e centrifugar para fazer pesquisa no sedimento imediatamente após a
coleta.
Chlamydia: o diagnóstico melhor é imunológico (Imunofluorescência)
Mycoplasma e Ureaplasma: existem meios específicos e kits muito práticos com cultura semi-
quantitativa por avaliação visual de mudança de cor.
No resultado da cultura é importante comparar com a bacterioscopia e estar alerta para não dar falsos
resultados de N. gonorrhoeae confundindo com Neisserias saprófitas e Acinetobacter.
Quando isolar Staphylococcus coagulase negativo ou outras bactérias da flora genital relatar:
“Presença de bactérias da flora genital”, não fazer antibiograma. Sugerir, quando não realizado, a
pesquisa de Chlamydia e Micoplasma.
Quando isolar enterobactérias, Enterococcus em cultura pura ou em grande quantidade e for
concordante com a bacterioscopia, relatar o isolamento com antibiograma e concluir: “Bacteria
raramente isolada como agente de uretrite; sugerimos investigar outras causas como Chlamydia,
Micoplasmas, Trichomonas etc.”
VAGINAL
As principais causas de vaginite são: vaginose, Candida spp. e Trichomonas vaginalis. Em meninas e
pacientes na menopausa ou deficientes hormonais, enterobactérias, S. aureus e mesmo bactérias da
flora podem eventualmente estar relacionadas com a sintomatologia.
A bacterioscopia é sempre útil para observar:

Mod V - 89
presença de leveduras
presença e quantidade de neutrófilos
presença e predomínio de bactérias
presença de Gardnerella spp. e Mobiluncus spp., e outros anaeróbios que caracterizam a vaginose,
associados às “clue cells” (células características do epitélio vaginal abarrotadas de bactérias).
A bacterioscopia também é útil:
Quando isolar Candida spp. e for caso de doença recidivante é interessante (quando disponível) a
identificação de espécie, podendo ser necessário também o teste de sensibilidade (mais fidedigno
e prático)
Quando isolar Streptococcus beta hemolítico do grupo A, Streptococcus agalactiae , enterococos,
Listeria spp.
Quando a bacterioscopia for normal, com raros neutrófilos, presença de células epitelias e bacilos de
Doderlein, e houver crescimento de raros Gram positivos e/ou raras enterobactéria, relatar: “Presença
de bactérias da flora vaginal normal”
Se isolar numerosas colônias de enterobactérias ou S. aureus e a bacteriocopia sugerir alteração de
flora, relatar: “Presença de bactérias da flora vaginal com predomínio de: por exemplo, E. coli,
Enterococcus spp, S. aureus, etc.”
ENDOCERVICAL
A cultura de secreção endocervical pode ser útil para isolamento de N. gonorrhoeae quando houver
suspeita. Deve-se recomendar a pesquisa de Chlamydia trachomatis nos casos de cervicite.
O isolamento de enterobactérias, enterococcus, etc. pode significar alteração de microbiota por
diferentes causas, mas o achado deve ser relatado, para consideração do médico. No caso da
bacterioscopia revelar presença de freqüentes, numerosos ou incontáveis neutrófilos (++ a ++++) e
presença de bactérias com a morfologia e Gram concordantes com as bactérias encontradas na
cultura, relatar: “Alteração da flora endocervical/vaginal com a presença das bactérias isoladas com
antibiograma” - lembrando que outras causas devem ser investigadas e/ou afastadas antes de iniciar
o tratamento específico
No caso de material endometrial e amniótico, fazer cultura para anaeróbios e bacterioscopia. No caso
de não realizar cultura para anaeróbios, relatar a bacterioscopia e o resultado da cultura. Destacar a
possibilidade de anaeróbios se visualizar bactérias no Gram sem correspondente crescimento.
ESPERMA E/OU FLUÍDO PROSTÁTICO
É aconselhavel para elaborar um laudo adequado :
Fazer bacterioscopia do esperma e da secreção prostática
Verificar contagem de leucócitos
Semear com alça calibrada de 10 µL e fazer contagem de colônias
Relatar os achados de bacterioscopia, contagem de leucócitos e bactéria isolada em contagens =
103
Ufc/ml. No caso de enterobactérias, enterococos e Pseudomonas fazer antibiograma.
No caso de isolamento de estafilococos, Streptococcus spp., Corynebacterium spp. e outras bactérias
da flora uretral, principalmente em prostatite crônica, sugerir a pesquisa de outros agentes
(Chlamydia, Micoplasma, Trichomonas, virus, etc.), sem liberar antibiograma.
LAUDO PARA URINA
Para a interpretação da urocultura, algumas informações são consideradas úteis:
Se o paciente apresenta sintomas de infecção urinaria, Leucocitúria
Gestante, Idade/sexo
Tipo de coleta: jato médio, coletor, punção de sonda vesical em sistema fechado, punção
supranegpúbica, etc.
Uso prévio de antibióticos à coleta da presente amostra, etc.

Mod V - 90
URINAS COLETADAS POR JATO MÉDIO
Quando estas urinas são submetidas a cultura sem informação clínica específica sugere-se que
contagens de colônias < 105
UFC/ml possam também causar infecção, somente se um único
microrganismo e potencial patógeno for isolado. Prováveis contaminantes são: difteróides,
Streptococcus viridans, Lactobacilos, estafilococos coagulase negativa e outros que não sejam
classificados como Staphylococcus saprophyticus.
Contagem de colônias ≥105
UFC/ml:
Um provável patógeno Definitivamente identificar ao nível de espécie e realizar o teste de
sensibilidade (antibiograma).
No caso de paciente assintomático solicitar nova amostra, pois se trata
de provável bacteriúria assintomática.
No caso da presença de outras espécies em contagens < 104
UFC/ml,
relatar número de microrganismo(s) presente.
Um provável contaminante
(difteróides, S. viridans,
lactobacilos, estafilococos
coagulase negativa e outros que
não sejam Staphylococcus
saprophyticus.)
Realizar uma identificação limitada: por exemplo distinguir entre S.
saprophyticus de outros estafilococos coagulase negativa, ou
Streptococcus agalactiae (grupo B) de Streptococcus viridans . Não fazer
antibiograma e sugerir nova coleta.
É raro, mas não impossível, ocorrer infecção urinária por bactérias da
microbiota da uretra ou vagina. Para caracterizar ITU há necessidade de
confirmar o achado com nova urocultura, e que esteja associada a
sintomas. Sintomas e leucocitúria podem tornar muito provável o
diagnóstico. Sem sintomas pode ser bacteriúria assintomática ou falha
grosseira na coleta.
Enumerar outras espécies eventualmente presentes em < 104
UFC/ml.
Dois prováveis patógenos
(com um diagnóstico deinfecção
do trato urinário crônica ou
recorrente)
Definitivamente identificar ao nível de espécie.
Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma).
Dois prováveis patógenos
(com sintomas de ITU)
Identificar ao nível de espécie.
Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma).
Solicitar nova amostra para confirmação.
Mais que dois microrganismos Reportar: “Múltiplos microrganismos presentes; provável contaminação,
repetir a cultura.”
Contagem de colônias ≤ 105
UFC/ml:
Um provável
patógeno
Para pacientes sob antibioticoterapia, grávidas, recém-nascidos, com infecção urinária de
repetição, realizar identificação e teste de sensibilidade.
Um potencial patógeno presente em > 102
UFC/ml em mulheres sintomáticas e >103
UFC/ml em homens sintomáticos, fazer identificação e antibiograma.
Um provável
contaminante
Leucócitos normais: descritivamente identifique o isolado.
Leucócitos aumentados: solicite nova amostra.
Mais que dois
microrganismos
Relatar: “Múltiplos microrganismos presentes; provável contaminação, repetir a cultura.”
Sem informação
clínica
Descreva o microrganismo presente entre 104
e 105
UFC/ml, com base na morfologia.
Entre em contato com o paciente e/ou médico. Solicite informações e/ou a coleta de nova
amostra.
Caso o contato não seja possível, mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias
para possível retomada de identificação, se requerido pelo médico do paciente.

Mod V - 91
URINAS COLETADAS POR CATETERIZAÇÃO
Contagem de colônias ≥104
UFC/ml:
Dois ou mais
prováveis
patógenos
Realize a identificação e teste de sensibilidade de ambos os isolados.
Descritivamente identifique as espécies presentes em <104
UFC/ml.
Um ou dois
prováveis
contaminantes
Reportar o(s) microrganismo(s) presente(s) com descrição do tipo(s) morfológico(s),
exemplo, difteróides, Streptococcus do grupo viridans.
Reportar: “Múltiplos microrganismos presentes; provável contaminação, repetir a
cultura.”
Um provável
patógeno e um
provável
contaminante
Identificar o provável patógeno e fazer antibiograma.
Fornecer o tipo morfológico do provável contaminante.
Três ou mais
microrganismos
Fornecer uma descrição dos tipos morfológicos.
Reportar: “Múltiplos microrganismos presentes; provável contaminação, repetir a
cultura.”
Contagem de colônias <104
UFC/ml:
Para pacientes sob antibioticoterapia, mulheres sintomáticas, homens sintomáticos, realizar
identificação e teste de sensibilidade.
Para todos os outros pacientes, forneça uma descrição do(s) tipo(s) morfológico(s) presente(s) e
requeira nova amostra.
Mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para se necessário retomar o
processamento de identificação se requerido pelo médico do paciente.
Obs.: Uroculturas com candida provenientes de pacientes sondados são utilizadas como critério para
a troca da sonda. Sugere-se nova coleta de urocultura após 24 horas. Caso o isolamento de Candida
seja mantido, deve-se relatar, pois poderá haver necessidade de instituir terapia específica.
URINAS COLETADAS POR PUNÇÃO SUPRAPÚBICA
Um ou dois
patógenos
presentes
Identifique ao nível de espécie.
Realize o teste de sensibilidade do provável agente patogênico.
Três ou mais
patógenos
presentes
Identifique.
Mantenha a cultura por três dias para possível consulta.
Sem
crescimento
Examine em até 48 horas de incubação.
Reporte “Sem crescimento, teste com sensibilidade de > 102
UFC/ml em 48 h” - (para
semeadura de 10µl).
OBSERVAÇÕES
Não realizar cultura de ponta de sonda vesical.
Critério de positividade pode ser aplicado sempre que isolar ≥ 105
UFC/ml de um só agente,
devendo a presença de sintomas caracterizar a infecção do trato urinário e a ausência como
bacteriúria assintomática.
Realize pesquisa para anaeróbios somente em punções supra-púbicas, quando solicitado.
Não realize de rotina o teste de sensibilidade diretamente da amostra de urina, embora em
situações de urgência da disponibilidade do antibiograma isto possa ser feito.
Em caso de dúvida na interpretação da urocultura, se possível, entre em contato com o paciente
e/ou médico para maiores informações, conferindo as condições de coleta. Isto não sendo
possível, relate o numero de diferentes microrganismos encontrados e sua contagem e solicite
nova amostra.

Mod V - 92
LAUDO PARA SANGUE
Em caso de bacteremia, septicemia, ou febre a esclarecer, deve-se sempre que possível colher duas
amostras de sangue venoso (periférico) de locais diferentes. Se o paciente tiver cateter, colher mais
uma amostra obtida do cateter.
Bactérias isoladas no sangue periférico do tipo S. aureus, Streptococcus pneumoniae, enterobactérias,
P. aeruginosa e Candida albicans, tem elevado valor preditivo de infecção.
Enterococos tem significância clínica em 80% dos casos
Streptococcus viridans entre 40 a 60%:
‫ـ‬ 1 cultura positiva em duas obtidas – é muito provável uma contaminação
‫ـ‬ 2 ou mais culturas positivas – é muito provável a infecção
‫ـ‬ 1 colhida e positiva. Colher nova amostra
Staphylococcus coagulase negativa entre 20 a 40%:
‫ـ‬ 2 amostras colhidas e positivas – verificar se são da mesma espécie ou se tem mesmo
antibiograma. Se diferirem na espécie e/ou nitidamente no antibiograma é provável que houve
contaminação de coleta. Não liberar antibiograma.
‫ـ‬ 2 amostras colhidas e 1 positiva – solicitar nova amostra – provável contaminação. Não fazer
antibiograma.
‫ـ‬ 2 amostras colhidas e identificadas como da mesma espécie e com mesmo antibiograma –
Liberar resultado da cultura e antibiograma e destacar: “Bactéria da flora cutânea. Instituir
tratamento específico se evidências clínicas de infecção. Se o paciente estiver com cateter,
possível colonização.”
Outras bactérias isoladas de em uma única amostra e sugestivas de contaminação: Micrococcus
spp., corineformes, Propionibacterium spp., Bacillus spp.
Hemoculturas positivas e repetidas para bactérias potencialmente contaminantes podem ser
consideradas patogênicas quando afastada a contaminação por cateter. Considerar a hipótese de
endocardite. Quando houver suspeita de fastidiosos ou fungos ou micobactérias conservar as
hemoculturas por 30 a 40 dias.
Relação entre idade e volume ideal de sangue a ser coletado
Idade volume
< 1 mês 1-2 ml
1 mês a 2 anos 2-3 ml
> 2 anos a 10 anos 3-5 ml
Adolescente 10-20 ml
Adulto 40 ml
PONTA DE CATETER
Fazer cultura qualitativa não se justifica para diagnóstico de bacteremia. Deve-se relatar o número
de colônias isoladas e a(s) bactérias isolada(s) pela técnica semi-quantitativa de Maki.
Quando maior que 15 colônias, identificar, mas não fazer antibiograma. Se a hemocultura for
positiva fazer antibiograma da hemocultura.
No caso de bacteremia, a remoção do cateter e envio da ponta para cultura se justifica quando a
amostra de hemocultura for colhida no prazo de 24 h.
Considerando que a colonização de cateter é muito comum, se não houver bacteremia não se se
justifica identificar bactérias do cateter e fazer antibiograma, exceto se houver indicação de
monitoramento dos cateteres pela CCIH. Caso a hemocultura seja negativa, não se justifica
trabalhar com bactérias do cateter. As técnicas de investigação de contaminação da luz do cateter
justificam-se quando se deseja descobrir fonte de bacteremia, fungemia, abscessos em múltiplos
orgãos, etc.

Mod V - 93
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11. Koneman, E.W., Allen, D.S., Janda, M.W., Schreckenberger C.P. and Winn Jr., C.W. Color atlas
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Gram-negative bacilii: a guide to identification. 2nd. Ed., University of Illinois, College of
Medicine at Chicago, CACMLE, 1996.
22. Thayer, J.D. and Martin Jr., J.E. A seletive medium for the cultivation of Neisseria
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para a realização simultânea dos testes de produção de gás a partir da glicose, H2S,
urease e triptofano desaminase. Rev Microbiol, 13(04): 309-315, 1982.
24. Toledo. M.R.F., Fontes, C.F. and Trabulsi, L.R. MILi: um meio para a realização dos testes de
motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev Microbiol, 13(04):230-235, 1982.

de Micobactérias de
Módulo VI

ÍNDICE
1. Introdução............................................................................................................................1
2. Coleta de amostras ...............................................................................................................2
Amostras respiratórias .............................................................................................................. 2
Sangue ................................................................................................................................... 2
Urina ...................................................................................................................................... 3
Fezes...................................................................................................................................... 3
Biópsias ou amostras de tecido................................................................................................... 3
Lavado gástrico........................................................................................................................ 3
Outros materiais: medula óssea, líquor, líquido pleural .................................................................. 4
3. Processamento de amostras .................................................................................................5
Exame microscópico e coloração.................................................................................................5
Métodos para tratamento das amostras para cultura...................................................................... 7
4. Cultura para isolamento de micobactérias ..........................................................................10
Meios sólidos ......................................................................................................................... 10
Meios Líquidos ....................................................................................................................... 10
Controle de Qualidade............................................................................................................. 12
5. Identificação das diferentes espécies de micobactérias......................................................14
Testes bioquímicos tradicionais................................................................................................. 14
Testes automatizados e moleculares para identificação ................................................................ 20
6. Anexos................................................................................................................................24
7. Referências Bibliográficas...................................................................................................27

mod VI - 1
1. INTRODUÇÃO
Com a crescente preocupação mundial com a tuberculose, os laboratórios de Microbiologia têm sido cada
vez mas exigidos em relação à rapidez do diagnóstico. Um número maior de amostras é processado no
laboratório para realizar este diagnóstico, exigindo que medidas de segurança sejam tomadas e que os
técnicos tenham um treinamento adequado nessas técnicas.
Uma variedade de técnicas está sendo implantada nos laboratórios para acelerar o diagnóstico, mas as
técnicas convencionais ainda ocupam um espaço importante na rotina laboratorial.
Um importante evento mudou um pouco a visão do que era necessário para o diagnóstico em termos
laboratoriais, que foi o aparecimento da AIDS. O perfil de sensibilidade das cepas de M. tuberculosis
passou a ter um papel extremamente importante para o clínico já que a sensibilidade às drogas
tradicionais tinha sofrido algumas mudanças o que ocasionava sérias dificuldades no tratamento. Além do
aparecimento de cepas multi-resistentes de M. tuberculosis, aparecerem as infecções por outras espécies
de micobactérias nestes pacientes, levando a quadros graves (como por exemplo M. avium).
Diante deste fato os laboratórios necessitam estar sempre atualizados. Nos capítulos adiante citamos
alguns dos procedimentos mais utilizados para o diagnóstico das infecções por micobactérias.
Manipulação do material clínico
Uma parte importante que deve ser considerada pelo laboratório quando trabalhando com micobactérias,
é a segurança empregada na manipulação do material clínico destas cepas. É grande o número de casos
de técnicos infectados devido ao descaso dos laboratórios com a manipulação deste tipo de patógeno.
Algumas medidas mínimas devem ser tomadas quando o laboratório vai no intuito de diagnosticar este
agente.
Se o laboratório for realizar apenas a pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes no material clínico, sem
tratamento (laboratório Nível-1), as seguintes medidas devem ser observadas:
Colocar na amostra clínica a mesma quantidade de hipoclorito de sódio a 5% e deixar 15 minutos a
fim de inviabilizar os eventuais bacilos presentes na amostra. Centrifugar a amostra e do sedimento
preparar as lâminas.
Treinar os técnicos e orientar para os riscos da manipulação inadequada do material clínico.
Utilizar luvas e aventais descartáveis.
Se o laboratório for realizar também a cultura, além da pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes no
material clínico direto e após tratamento (Laboratório Nível 2), além das medidas já citadas, o laboratório
deve :
Processar todas as amostras em uma capela biológica classe I ou II que possuem filtros HEPA.
Utilizar respiradores descartáveis (tipo N95).
Limitar a entrada de pessoas na área reservada para a manipulação dos materiais.
Treinamento dos técnicos nas técnicas de cultura e identificação de M. tuberculosis.
Se o laboratório for realizar todas as técnicas descritas acima e, além disso, for trabalhar com testes de
avaliação da sensibilidade (Laboratório nível 3), deve possuir:
uma área com ante-sala e uma sala separada onde as amostras são processadas e os testes de
sensibilidade são realizados.
um sistema de exaustão próprio que crie uma pressão negativa nas duas salas.
uma autoclave deve ser instalada dentro desta área para que todo material seja autoclavado antes de
deixar esta área.
treinamento específico dos técnicos nas técnicas de cultura, identificação e testes de avaliação da
sensibilidade das diferentes espécies de micobactérias.

mod VI - 2
2. COLETA DE AMOSTRAS
AMOSTRAS RESPIRATÓRIAS
COLETA ARMAZENAMENTO AMOSTRAS REJEITADAS TRATAMENTO
‫ـ‬ Usar um frasco estéril de
boca larga com tampa de
rosca.
‫ـ‬ De preferência, colher as
amostras antes da
administração de
antibióticos, mas não
excluir a coleta por causa
do uso de antibióticos já
que na maioria dos casos
o paciente em tratamento
para tuberculose não vai
suspender a terapia para
realizar o exame.
‫ـ‬ Orientar a coleta do
primeiro escarro da
manhã. Coletar a amostra
após expectoração
profunda e evitar colher
saliva.
‫ـ‬ É recomendado um
mínimo de 3 amostras de
escarro em dias
consecutivos.
‫ـ‬ Entregar instruções por
escrito para uma coleta
adequada da amostra.
‫ـ‬ Identificar (nome do
paciente, data da coleta)
as amostras após a coleta
‫ـ‬ Se a amostra não for
processada dentro de 1
hora após a coleta,
armazenar em geladeira
(2 a 8°C) por até 24
horas.
‫ـ‬ Manter as amostras em
geladeira até ter sido
examinada por algum
método de coloração.
‫ـ‬ Manter as amostras com
exame direto positivo em
geladeira para eventuais
exame posteriores (no
máximo 30 dias)
‫ـ‬ Amostras de escarro
colhidas durante um
período de 24 horas.
Estas amostras possuem
alta possibilidade de
contaminação por outras
bactérias e fungos o que
prejudica o
processamento correto da
amostra.
‫ـ‬ Amostras que não
estiverem devidamente
identificadas
‫ـ‬ Amostras coletadas em
frascos não estéreis e
com conservantes.
‫ـ‬ Amostras enviadas em
“swabs” de coleta
‫ـ‬ NALC-NaOH (NALC=N-
Acetil-cisteína)
‫ـ‬ NaOH 4%
‫ـ‬ ácido oxálico - usado
para materiais
contaminados com P.
aeruginosa.
SANGUE
‫ـ‬ Seguir as orientações
utilizadas no seu
laboratório para a
assepsia antes da coleta
das amostras de sangue
para cultura.
‫ـ‬ Coletar uma amostra de
sangue e inocular
diretamente meios de
cultura apropriados ou no
tubo isolator.
‫ـ‬ Não refrigerar as
amostras.
‫ـ‬ Se utilizado o meio bactec
13ª, manter a amostra
em estufa a 37°C.
‫ـ‬ Se forem utilizados os
meios que serão lidos em
aparelhos automatizados
(bactec myco/f lytic,
mb/bact), manter os
frascos em temperatura
ambiente após a coleta.
‫ـ‬ Se for utilizado o tubo
isolator manter em
‫ـ‬ Amostras colhidas com
EDTA.
‫ـ‬ Amostras coaguladas.
- As amostras não devem
ser previamente tratadas,
e sim inoculadas
diretamente conforme
especificações dos
fabricantes de cada
frasco.
- Meios utilizados para
detecção de
micobactérias em
amostras de sangue:
Bactec 13A (BD) 1
Bactec Myco/Lytic (BD) 1
MB/BacT (Organon T.) 1
Isolator (Wampole) 2
1
Utilizar 5 ml de amostra de sangue 2
Utilizar 10 ml de amostra de sangue

mod VI - 3
URINA
- Coletar a 1a
urina da
manhã (mínimo 40 ml)
após assepsia genital
adequada com água e
sabão
- Coletar em um frasco
estéril de boca larga com
tampa de rosca.
- É recomendado a coleta
de 3 amostras em dias
consecutivos
- Se a amostra não for
hora após a coleta,
armazenar em geladeira
(2 a 8°C) por até 24
horas.
- Urina colhida durante um
período de 24 horas. O
elevado número de
microrganismos
contaminantes presentes
nestas amostras prejudica
a descontaminação da
amostra.
- Amostras colhidas em
frascos não estéreis.
- As 3 amostras colhidas no
mesmo dia em horários
diferentes.
- Colocar a urina em um
tubo cônico estéril com
tampa de rosca e
centrifugar a 3000 xg por
15 min.
- Desprezar o sobrenadante
e tratar a amostra com
NALC-NaOH ou NaOH 4%,
conforme descrito no
anexo A.
FEZES *
- Coletar em frascos de
boca larga sem
conservantes.
- Manter as amostras em
geladeira até o
processamento.
- Amostras congeladas. - Suspender 1 g de fezes
em 5 ml de middlebrook
7h9.
- Agitar vigorosamente e
tratar pelo método de
NaOH 4%.
* Apenas as amostras com pesquisa positiva deveriam ser processadas para cultura.
BIÓPSIAS OU AMOSTRAS DE TECIDO *
- Enviar a amostra em tubo
estéril sem conservante
ou fixador, com um pouco
de solução salina estéril.
- Processar a amostra
assim que for recebida no
laboratório.
- Manter o material depois
de processado na
geladeira.
“swabs”.
formol.
- Macerar o material com
pistilo estéril dentro do
próprio tubo cônico ou em
um cadinho estéril
adicionando caldo 7H9.
- Tratar a amostra pelo
método NALC-NaOH ou
NaOH 4% e proceder
conforme descrito no
anexo A.
* Temperaturas diferentes devem ser usadas para incubar os meios inoculados com amostras de pele.
LAVADO GÁSTRICO
- Colher de 5 a 10 ml da
amostra em um tubo
estéril contendo 100 mg
de carbonato de sódio.
- Realizar a coleta de
manhã em jejum.
- Usar salina estéril para a
coleta.
- Manter as amostras em
geladeira até serem
processadas.
- Se na amostra não for
adicionado carbonato de
sódio esta deve ser
horas após a coleta.
- Amostras colhidas sem
carbonato de sódio.
- Se a amostra for muito
mucóide, adicionar 50 a
100 mg de NALC
- Centrifugar a 3000 xg por
15 min.
- Suspender o sedimento
em água destilada estéril
e processar pelo método
de NALC ou NaOH 4%.

mod VI - 4
OUTROS MATERIAIS: MEDULA ÓSSEA, LÍQUOR, LÍQUIDO PLEURAL
- Coletar em tubos estéreis.
- Os frascos utilizados para
a cultura de sangue
também podem ser
usados.
- Quanto maior o volume
processado maior a
possibilidade de se ter
uma amostra positiva.
- Manter a amostra na
geladeira se não for
horas.
- Manter as amostras na
geladeira após o
processamento, por
vários dias em caso de
haver contaminação da
cultura.
- Amostras enviadas em
tubos não estéreis.
- No caso de medula óssea,
amostras colhidas sem
anticoagulante.
- Normalmente estas
amostras não têm
bactérias contaminantes,
portanto não são tratadas
previamente; são
inoculadas diretamente
nos meios de cultura.
- Meios que podem ser
usados para a coleta de
amostras:
Bactec 13 A
Bactec Myco/F Lytic
MB/BacT *
ESP Myco *
* Estes meios não podem ser utilizados para amostras de medula óssea

mod VI - 5
3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS
EXAME MICROSCÓPICO E COLORAÇÃO
Todos as amostras clínicas, exceto sangue e medula óssea, devem ser examinadas por algum método
de coloração, para a presença ou não de bacilos álcool-ácido resistentes.
Preparar o esfregaço com no máximo 1 a 2 cm de diâmetro.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
Ziehl-Neelsen
Corantes Procedimento Resultado
- Fucsina
dissolver 3 g de fucsina básica em
10 ml de etanol 90%-95%
adicionar 90 ml de uma solução
aquosa de fenol a 5%
- Álcool-ácido
adicionar 3 ml de HCl concentrado
em 97 ml de etanol a 90%-95%.
- Azul de Metileno
dissolver 0,3 g de cloreto de azul
de metileno em 100 ml de água
destilada
‫ـ‬ Fixar o esfregaço na lâmina, na
chama do bico de bunsen.
‫ـ‬ Cobrir o esfregaço com a fucsina
‫ـ‬ Aquecer, sem deixar ferver , 3 a 4
vezes em um período de 5 min.
‫ـ‬ Lavar com água.
‫ـ‬ Descorar com o álcool-ácido até
remover todo o corante - 2 min.
‫ـ‬ Cobrir o esfregaço com azul de
metileno - 2 min.
‫ـ‬ Deixar a lâmina secar ao ar (se for
usado papel de filtro para secar a
lâmina, desprezar em lixo
apropriado e usar um papel para
cada lâmina).
‫ـ‬ Ler em microscópio óptico comum
em objetiva de imersão de 100x.
‫ـ‬ Positivo: bacilos coram em rosa
forte, outras bactérias e células
coram em azul.
‫ـ‬ Negativo: não são observados
bacilos em 300 campos
examinados
A interpretação segue descrita na
Tabela 1.
Auramina
Corantes Procedimento Resultado
‫ـ‬ Auramina fenólica
dissolver 0,1 g de auramina O em
adicionar em uma solução de 3g de
fenol em 87 ml de água destilada
estéril (estocar a solução em frasco
escuro)
‫ـ‬ Álcool-ácido
adicionar 0,5 ml de HCl
concentrado em 100 ml de álcool
70%
‫ـ‬ Permanganato de potássio
dissolver 0,5g de permanganato de
potássio em 100 ml de água
destilada
‫ـ‬ Fixar a lâmina.
‫ـ‬ Cobrir o esfregaço com auramina e
deixar por 15 min.
‫ـ‬ Descorar com álcool-ácido - 2 min.
‫ـ‬ Cobrir o esfregaço com
permanganato de potássio - 2 min.
e não mais que 4 min.
‫ـ‬ Lavar com águ
‫ـ‬ Ler em microscópio de
fluorescência com objetiva de 40x.
‫ـ‬ Positivo: bacilos coram em amarelo
alaranjado em fundo escuro.
‫ـ‬ Negativo: não há presença de
bacilos em 100 campos
observados.
Tabela 1.

mod VI - 6
Kinyoun
Indicado para micobactérias, Nocardia spp. e outros bacilos Gram positivos ramificados que se coram
fracamente pela coloração de Ziehl-Neelsen.
Corantes Procedimento Resultado *
- Fucsina
dissolver 4 g de fucsina básica em
adicionar 100 ml de uma solução
aquosa de fenol a 5%
- Álcool-ácido
adicionar 3 ml de HCl concentrado
em 97 ml de etanol a 90%-95%.
- Azul de Metileno
dissolver 0,3 g de cloreto de azul
de metileno em 100 ml de água
destilada
‫ـ‬ Fixar o esfregaço na lâmina.
‫ـ‬ Cobrir o esfregaço com a fucsina
- 5 min.
‫ـ‬ Descorar com álcool-ácido até
remover todo o corante - 2 min.
‫ـ‬ Cobrir o esfregaço com azul de
metileno - 2 min.
‫ـ‬ Deixar a lâmina secar no ar (se
for usado papel de filtro para
secar a lâmina, desprezar em
lixo apropriado e usar um papel
para cada lâmina).
‫ـ‬ Ler em microscópio óptico
comum em objetiva de imersão
de 100x.
‫ـ‬ Positivo: Bacilos coram em rosa
forte, outras bactérias e células
coram em azul.
‫ـ‬ Negativo: não são observados
bacilos após a observação de 300
campos.
Tabela 1.
* Um resultado negativo no exame direto do material clínico não exclui a possibilidade de infecção por M. tuberculosis.
A cultura é necessária para confirmação do diagnóstico.
Interpretação de resultados de pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes
Número de microrganismos
Resultado
Auramina objetiva 25x Ziehl-Neelsen (Kinyoun) objetiva 100x
Negativo 0 0
Duvidoso, repetir a coloração 1-2/30 campos 1-2/300 campos
+ (raros) 1-9/10 campos 1-9/100 campos
++ (alguns) 1-9/campo 1-9 /10 campos
+++ (frequentes) 10-90/ campo 1-9/ campo
++++ (numerosos) > 90/campo > 9/campo
A sensibilidade dos métodos está em torno de 22 a 81%. Os métodos não possuem boa especificidade já
que outros microrganismos que não micobactérias podem aparecer corados (ex: Nocardia, Rodococcus,
entre outros).
Se apenas 1 a 2 bacilos são observados em toda a lâmina este resultado não deve ser reportado antes de
ser realizado uma outra lâmina. Se o resultado persistir ligar para o médico responsável pelo paciente
para discutir o caso.
Lâminas positivas e negativas devem ser incluídas toda vez que se fizer a coloração e quando novos lotes
de corantes são preparados.
Controle negativo: Escherichia coli
Controle positivo: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177

mod VI - 7
MÉTODOS PARA TRATAMENTO DAS AMOSTRAS PARA CULTURA.
Algumas amostras podem apresentar flora mista de bactérias e devem ser tratadas para minimizar o
crescimento destes microrganismos contaminantes, que crescem mais rápido, impossibilitando o
crescimento das micobactérias.
Materiais que devem ou não ser tratados antes de serem semeados nos meios apropriados
Material Processado Não processado
Escarro x
Lavado bronco-alveolar x
Líquor x
Sangue x
Pele x
Biópsias x
Lavado gástrico x
Urina x
Fezes x
Medula óssea x
N-ACETIL-L-CISTEINA/NAOH 2% (NALC-NAOH)
O NALC é um potente agente mucolítico e favorece a utilização de concentrações baixas do
descontaminante sem prejudicar a recuperação de micobactérias. A desvantagem é que a solução deve
ser preparada diariamente por que ela perde a atividade após 24 horas.
Reagentes Procedimento
‫ـ‬ N-acetil-L-cisteina
‫ـ‬ Solução de NaOH/ citrato de sódio: volume 1/1
(autoclavar e estocar em frascos com tampa de rosca)
‫ـ‬ NaOH 4% (40 g pastilhas de NaOH em 1000mL de
água destilada)
‫ـ‬ Citrato de sódio 0,1M (26 g de citrato de sódio
(anidro) em 1000 ml de água destilada).
‫ـ‬ Tampão fosfato 0,067M, pH 6,8 (pode ser substituído
por água)
‫ـ‬ Preparar a quantidade necessária da solução de
NALC de acordo com a tabela 3.
‫ـ‬ Colocar 5 ml da amostra em um tubo cônico estéril
com tampa de rosca de 50 ml.
‫ـ‬ Homogeneizar vigorosamente.
‫ـ‬ Deixar 15 - 20 minutos à temperatura ambiente.
‫ـ‬ Adicionar o mesmo volume de tampão fosfato.
‫ـ‬ Centrifugar a 3.000 xg por 15 minutos.
‫ـ‬ Desprezar o sobrenadante em frasco apropriado
evitando ao máximo espirros do material. Limpar a
borda do tubo com hipoclorito.
‫ـ‬ Ressuspender o sedimento com tampão fosfato;
ressuspender com um volume suficiente para
inocular os meios que serão utilizados.
‫ـ‬ Preparar lâminas para coloração.
‫ـ‬ Desprezar todo o material utilizado em lixo
apropriado ou em frascos próprios contendo
hipoclorito.

mod VI - 8
Preparação da solução para tratamento das amostras com N-acetil-L-cisteina
Volume (ml) NaOH 4% / citrato de sódio NALC
25 ml 12,5 ml / 12,5 ml 125 mg
50 ml 25 ml / 25 ml 250 mg
100 ml 50 ml/ 50 ml 500 mg
200 ml 100 ml/ 100 ml 1g
500 ml 250 ml/ 250 ml 2,5g
1000 ml 500mL/ 500 ml 5 g
NAOH 4% (PETROFF)
Esta solução tem atividade descontaminante e para ter atividade mucolítica deve ser usada em
concentrações altas (4%). Nessa concentração o NaOH é tóxico para algumas micobactérias o que torna o
tempo de exposição do material a esta substância crucial para se obter um bom resultado.
‫ـ‬ Solução de 2% ou 4% de NaOH (1N)
‫ـ‬ Tampão fosfato de 0,067 M , pH 6,8
‫ـ‬ Solução de HCl
‫ـ‬ Indicador vermelho de fenol
‫ـ‬ Água destilada estéril
‫ـ‬ Colocar 5 ml da amostra em um tubo cônico estéril
com tampa de rosca de 50 ml.
‫ـ‬ Colocar o mesmo volume da solução de NaOH.
‫ـ‬ Homogeneizar vigorosamente.
‫ـ‬ Deixar 15 - 20 minutos à temperatura ambiente
‫ـ‬ Adicionar o mesmo volume de tampão fosfato (ou
água).
‫ـ‬ Centrifugar a 3.000 xg por 15 minutos.
‫ـ‬ Desprezar o sobrenadante em frasco apropriado
evitando a formação de aerosóis. Limpar o tubo com
uma solução de hipoclorito.
‫ـ‬ Adicionar uma gota de vermelho de fenol no
sedimento e adicionar aos poucos a solução de hcl até
o indicador mudar de vermelho para amarelo.
‫ـ‬ Homogeneizar o sedimento.
‫ـ‬ Inocular a amostra no meio apropriado.
‫ـ‬ Preparar lâminas para coloração.
‫ـ‬ Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado
ou em frascos próprios contendo hipoclorito.
ÁCIDO OXÁLICO
É o método de escolha para processar amostras contaminadas com Pseudomonas aeruginosa.
5% ácido oxálico
ácido oxálico 50g
água destilada 1000 ml
‫ـ‬ Dissolver o ácido em um pouco da água destilada
‫ـ‬ Completar para 1000 ml
‫ـ‬ Esterilizar a 121°C por 15 minutos
‫ـ‬ Estocar a temperatura ambiente
‫ـ‬ Adicionar um volume de 5% de ácido oxálico.
equivalente ao da amostra em um tubo cônico de 50
ml.
‫ـ‬ Homogeneizar vigorosamente por 30 segundos.
‫ـ‬ Deixar a temperatura ambiente por 30 minutos
agitando o tubo ocasionalmente.
‫ـ‬ Adicionar nacl 0,85% até a marca de 50 ml do frasco.
‫ـ‬ Inverter o tubo várias vezes para mistura.
‫ـ‬ Centrifugar por 15 a 20 minutos a 3000xg.

mod VI - 9
Vermelho de fenol
vermelho de fenol 8 mg
4% NaOH 20 m L
‫ـ‬ Dissolver o vermelho de fenol em 4% NaOH utilizando
um agitador magnético; se necessário aquecer
levemente
‫ـ‬ Completar com 1000 ml de água destilada
‫ـ‬ Estocar a temperatura ambiente
4% NaOH
NaOH 40g
‫ـ‬ Dissolver o NaOH em um pouco de água
‫ـ‬ Manter o frasco resfriado para evitar aquecimento
‫ـ‬ Completar para 1000 ml com água destilada. Esterilizar
a 121°C por 15 min. Estocar a temperatura ambiente
NaCl 0.85% estéril
‫ـ‬ Desprezar o sobrenadante.
‫ـ‬ Adicionar ao sedimento algumas gotas de vermelho de
fenol.
‫ـ‬ Neutralizar o sedimento com 4% naoh até obter uma
cor rosa claro.
‫ـ‬ Preparar as lâminas e semear nos meios apropriados.

mod VI - 10
4. CULTURA PARA ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS
MEIOS SÓLIDOS
LOWENSTEIN-JENSEN
a) Composição: ovos coagulados, verde malaquita, sais, glicerol, farinha de batata
b) Inoculação: 0,5 a 1,0 ml do material clínico
c) Incubação: 37°C em estufa com 5% a 10% de CO2, na ausência de luz, com exceção de amostras de
pele em que o meio deve ser incubado a 30°C, por até 8 semanas. Nas 2 primeiras semanas manter os
tubos na posição horizontal com as tampas um pouco desrosqueadas, depois colocar na vertical e apertar
as tampas.
d) Leituras: ler duas vezes durante as duas primeiras semanas (fazer a segunda leitura da primeira
semana sempre com 7 dias exatos, já que é um parâmetro importante para a identificação posterior) e
depois uma vez por semana até completar 8 semanas. Observar o pigmento da colônia.
Se o meio estiver contaminado com outros microrganismos, desprezar o meio e preparar outra
cultura se o material estiver ainda estocado.
Descontaminar novamente o material antes de inocular no meio.
MIDDLEBROOK 7H10, 7H11
a) Composição: sais, vitaminas, cofatores, ácido oléico, albumina, catalase, glicerol, glicose (7H10),
acrescido de hidrolizado de caseína (7H11)
b) Inoculação: semear 0,5 a 1,0mL do sedimento tratado na placa. Utilizar uma alça descartável para
espalhar bem todo o material sobre a superfície da placa. Não utilizar a técnica normal de semeadura em
placas, semear em todas as direções.
c) Incubação: a 37°C em estufa com 5% a 10% de CO2 no escuro por até 8 semanas.
d) Leituras: ler duas vezes durante as duas primeiras semanas (fazer a segunda leitura da primeira
semana sempre com 7 dias exatos, já que é um parâmetro importante para a identificação posterior) e
depois uma vez por semana até completar 8 semanas.
Os meios sólidos são importantes para observar amostras que possuem mais de um tipo de
micobactéria.
MEIOS LÍQUIDOS
MIDDLEBROOK 7H9
a) Composição:
sais, vitaminas, cofatores, albumina, catalase, glicerol
b) Inoculação: inocular a amostra de biópsia ou fragmento de pele diretamente no meio
c) Incubação: incubar a 37°C em estufa contendo 5 a 10% de CO2. Se forem inoculados fragmentos de
pele no meio incubar um tubo a 37°C e outro a 30°C.
d) Leitura: examinar os tubos duas vezes durante as duas primeiras semanas e uma vez nas semanas

mod VI - 11
seguintes até completar 8 semanas.
BACTEC 12B
Antes de serem inoculados com amostras clínicas ou cepas bacterianas os frascos devem ser colocados no
equipamento Bactec 460TB para que sejam inoculados com uma quantidade determinada de C02.
a) Composição (Middlebrook 7H12): caldo 7H9, albumina bovina, hidrolizado de caseína, catalase,
substrato marcado com 14
C(1µCi/ml).
b) Inoculação: inocular 0,5 ml do sedimento tratado pelo método de NALC, com uma seringa tipo
insulina. Adicionar 0,1 ml de uma solução de antibióticos (PANTA, Becton Dickinson) nas amostras que
podem apresentam alguma contaminação bacteriana.
c) Incubação: 37°C; amostras de tecidos ou fragmentos de pele devem ser incubados também a 30°C
(preparar 2 frascos). Não é necessário incubar no escuro.
d) Leituras: ler 2 vezes nas duas primeiras semanas de incubação e uma vez nas semanas seguintes até
completar 6 semanas. Frascos com índices de crescimento (GI) maior que 10 devem ser separadas e
testadas diariamente.
Frascos que apresentarem GI superiores a 10 devem ser considerados como suspeitos de serem
positivos, quando o GI chegar a 50 preparar uma lâmina e corar pelo método de Ziehl-Neelsen.
Algumas vezes pode ser difícil visualizar as micobactérias com um GI tão baixo; aguardar para fazer
outra lâmina quando o frasco apresentar um GI maior.
Algumas vezes o meio 12B não adere bem à lâmina e solta do esfregaço, adicionar uma gota de
albumina na lâmina antes de colocar a gota do 12B para fixar o esfregaço.
Se o frasco apresenta além de bacilos álcool-ácido outras bactérias, descontaminar a amostra
diretamente do 12B removendo todo o conteúdo e processando pelo método de 4% de NaOH. Inocular
o sedimento tratado novamente em um novo 12B.
BACTEC 13A
a) Composição (Middlebrook 7H13): caldo 7H9, albumina bovina, hidrolizado de caseína, catalase,
substrato marcado com 14
C(1µCi/ml), Tween 80, polianetolsulfonato de sódio (SPS).
b) Inoculação: colocar até 5 ml de sangue diretamente no frasco. Adicionar no laboratório 0,5 ml da
solução de enriquecimento que vem junto com os frascos Bactec 13A.
c) Incubação: 37°C por até 6 semanas.
d) Leituras: ler os frascos duas vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes até
completar 6 semanas.
Os frascos 13A não necessitam ser passados no Bactec 460 para colocar C02, pois estes já vem
preparados com a quantidade certa de C02.
MGIT
a) Composição: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente embebido em silicone sensível ao oxigênio.
b) Inoculação: 0,5 ml do material tratado, adicionar 0,5 ml de OADC (acompanha o kit) e PANTA
(solução de antibióticos, Becton Dickinson).
c) Incubação: 37°C.
d) Leituras: realizar a primeira leitura após 48 horas de incubação. Ler duas vezes nas duas primeiras

mod VI - 12
semanas e uma vez nas semanas seguintes até completar 8 semanas. A leitura é feita com uma luz
ultravioleta e a fluorescência emitida é comparada com um controle positivo e negativo.
Amostras de sangue não devem ser colocadas neste meio.
Existe disponível um equipamento automatizado (MGIT 960) que realiza as leituras automaticamente.
ESP MYCO
a) Composição: caldo Middlebrook 7H9 e esponjas de celulose.
b) Inoculação: 0,5 ml da amostra clínica. São adicionados OADC e uma mistura de antibióticos
(MycoPVNA).
c) Incubação: Os frascos são incubados no aparelho ESP Difco por um período de 6 semanas.
d) Leituras: O equipamento automatizado vai realizar as leituras continuamente e medir o consumo e
produção de gases.
Este sistema permite o processamento de qualquer amostra clínica inclusive sangue.
MB/BACT
a) Composição: Middlebrook 7H9, caseína pancreática digerida, catalase, albumina bovina.
b) Inoculação: 0,5 ml do material clínico tratado. Uma mistura de antibióticos é adicionada.
c) Incubação: 37°C no equipamento automatizado MB BacT/Alert por 6 semanas.
d) Leituras: os frascos são lidos automaticamente e constantemente pelo equipamento.
BACTEC MYCO LYTIC
a) Composição: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente sensível ao oxigênio.
b) Inoculação: 5 ml da amostra.
c) Incubação: 37°C no equipamento Bactec 9420 durante 42 dias
d) Leituras: o equipamento realiza as leituras e o monitoramento contínuo dos frascos.
Estes frascos são apenas para processamento de amostras de sangue. Para amostras respiratórias o
equipamento usado é o Bactec 9000MB e o frasco é o Myco/F.
Controle positivo: apresenta crescimento abundante no meio
- Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC 25177
- Mycobacterium kansasii ATCC 12478
- Mycobacterium scrofulaceum ATCC 19981
- Mycobacterium intracellulare ATCC 13950
- Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.
Controle negativo: não apresenta crescimento no meio
- Escherichia coli ATCC 25922

mod VI - 13
Sugestão de meios de cultura, temperatura de incubação e método de processamento de
diferentes amostras para isolamento de micobactérias.
Meio para isolamento Temperatura de
incubação
Amostra Inoculação
direta
Tratamento
da amostra
Lowen
Jensen
7H10/
7H11
Outro 25 a
30°C
37°C
Sangue
Medula óssea
X Bactec 13A, Isolator,
Bactec Myco/F Lytic,
MB/BacT
X
Amostras
respiratórias
X X X Bactec 12B, ESP Myco/F
Lytic, MGIT, MB/BacT
X
Líquidos X X X Bactec 12B , ESP
Myco/F Lytic, MGIT,
MBBacT
X
Líquor X X X Bactec 12B, ESP Myco/F
X
Tecidos
Feridas/Úlceras de
pele
X X X Bactec 12B, MGIT, 7H9 X X
Lavado gástrico X X X Bactec 12B, MGIT, ESP
Myco/F Lytic, MB/BacT
X
Urina X X X Bactec 12B, ESP Myco/F
X
Fezes X X X 7H11 X
Linfonodos X X X Meio suplementado com
hemina
X

mod VI - 14
5. IDENTIFICAÇÃO DAS DIFERENTES ESPÉCIES DE MICOBACTÉRIAS
TESTES BIOQUÍMICOS TRADICIONAIS
CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE PIGMENTO
As micobactérias podem ser separadas em grupos de acordo com, o tempo de crescimento, a
temperatura ótima para que esse crescimento ocorra e a produção de pigmento quando exposta à
luz.
Estas características podem ser observadas com uma cultura nova em Lowenstein Jensen (LJ), meio
usado preferencialmente porque o contraste de cor é mais facilmente observado.
Crescimento
Definido como sendo o tempo necessário para colônias serem visualizadas a olho nú, em meio sólido.
Micobactérias de crescimento rápido: < 7 dias
Micobactérias de crescimento lento : > 7 dias
Estudos de crescimento devem ser feitos sempre com uma subcultura diluída para se obter um
crescimento de colônias isoladas, nunca em culturas primárias, já que o processo de digestão e
descontaminação pode ser muito acentuado levando micobactérias de crescimento rápido a crescerem em
até 3 semanas.
a) Meios:
Tubos ou Middlebrook 7H9 (caldo).
Lowenstein Jensen preparado em tubos com
tampa de rosca.
b) Materiais e Equipamentos:
Alças descartáveis estéreis
Pipeta Pasteur descartável
Papel de alumínio
Estufa de CO2 37°C
Estufa a 30°C e 45°C
Homogeneizador
Lâmpada 60W
c) Procedimento:
Inocular uma alçada cheia de crescimento em
um tubo com caldo 7H9.
Homogeneizar vigorosamente por 10 seg.
Fazer uma diluição 1:100 deste inóculo.
Com uma pipeta Pasteur estéril transferir 6
gotas do inóculo diluído para 5 tubos de LJ
(Lowenstein-Jensen). Distribuir o inóculo por
todo o meio.
Cobrir 2 tubos com papel de alumínio.
Incubar, um tubo fechado e um aberto a 25°C
(temperatura ambiente), um fechado e um
aberto a 37°C. Um tubo deixar aberto a 45°C.
Se o material processado for tecido ou material
de pele incubar também a 30°C.
Manter todos os tubos com as tampas
desrosqueadas.
d) Leituras:
Examinar os tubos após 5 e 7 dias de
incubação. Verificar se tem crescimento e
classificar conforme descrito na Tabela 5.
Considerar crescimento quando existem colônias bem formadas ou um crescimento confluente. É
importante fazer uma diluição do inóculo, para visualizar colônias isoladas.

mod VI - 15
Quantidade de crescimento no meio de LJ
Quantidade de crescimentoCrescimento a 37°C
1 semana 2 semanas 3 semanas
Rápido + a ++
Intermediário ± a + ++
Lento 0 a ± + ++
0 - nenhuma colônia visível no meio
± - algumas poucas colônias muito pequenas ou uma pequena mancha de pigmento visível no meio
+ - várias colônias bem desenvolvidas ou uma fina camada confluente visível de crescimento no meio, podendo ser
visto o meio de LJ embaixo ou entre as colônias
++ - muitas colônias bem desenvolvidas formando uma camada grossa e confluente de crescimento ( colônias tocando
umas nas outras ou próximas) sem que se possa ver o meio de LJ embaixo ou entre as colônias.
Pigmento
Variações na produção de pigmento levam a classificar as micobactérias em 3 grupos:
fotocromogênicas - micobactérias que produzem pigmento somente após a exposição à luz.
scotocromogênicas - micobactérias que produzem pigmento tanto no escuro quanto no claro.
não fotocromogênicas - micobactérias que não produzem pigmento em qualquer situação.
a) Procedimento:
Quando houver crescimento no tubo
descoberto retirar o papel de alumínio do tubo
coberto e verificar se as colônias são
pigmentadas.
Se não for observado pigmento expor à luz
(lâmpada de 60W) por 3 horas (distância do
tubo para a lâmpada deve ser de 20 a 25 cm)
com a tampa desrosqueada
Incubar por mais 3 dias. Manter as tampas
desrosqueadas.
b) Resultado:
Não pigmentada - cor creme
Pigmentada – cor amarelo, laranja claro,
laranja
(não deve ser observada a intensidade da cor
produzida e sim apenas se produz ou não
pigmento).
TEMPERATURA
A temperatura de incubação geral é de 37°C.
Incubar em diferentes temperaturas quando o material clínico for amostras de pele (25°C a 30°C).
Algumas micobactérias (M. xenopi) crescem melhor quando incubadas 42°C.
TESTE DA CATALASE
A enzima catalase separa o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, e o oxigênio aparece na forma de
bolhas.
Quase todas as micobactérias produzem catalase, o que vai mudar é a quantidade de catalase produzida
ou a perda ou não da capacidade de produzir catalase a 68°C.

mod VI - 16
Reagentes:
10% Tween 80
Aquecer o Tween 80 e 90 ml de água destilada
estéril em banho 50°C.
Pipetar 10 ml de Tween 80 aquecido nos 90 ml
de água destilada estéril aquecida (lavar a
pipeta várias vezes para retirar todo o Tween).
Deixar o frasco no banho até dissolver todo o
Tween 80.
Estocar de 2 a 8°C.
10% Tween 80 / 30% H2O2 (solução de uso)
Misturar partes iguais dos dois reagentes.
Preparar no momento do uso (1,0 ml/teste).
Não deixar este reagente cair na pele. Em caso de
acidente lavar com água corrente.
TESTE SEMI-QUANTITATIVO
a) Meios:
7H9
Lowenstein Jensen sem inclinação (tubos de
150 mm)
b) Materias e Equipamentos:
alça descartável
estufa 37°C
régua
c) Procedimento:
Inocular um caldo 7H9 com uma alçada cheia
de micobactérias.
Incubar por 7 dias a 37°C
Homogeneizar vigorosamente por 10 segundos
Inocular 0,1 ml do caldo com crescimento em
um tubo de LJ preparado sem inclinação.
Incubar a 37°C por 14 dias com as tampas
desrosqueadas.
Adicionar 1 ml do reagente preparado (Tween
80/H2O2) .
Deixar a temperatura ambiente por 5 minutos
e medir a altura das bolhas a partir da
superfície do meio de cultura com uma régua.
d) Resultado:
>45 mm - alta catalase ( Ex: M. fortuitum, M.
kansasii, M.simiae, etc.)
< 45mm - baixa catalase (Ex: M. tuberculosis,
M.marinum, M.avium, etc.)
e) Controles de Qualidade:
Controle negativo: tubo de LJ não inoculado
Controle Positivo:
‫ـ‬ catalase alta - M. fortuitum ATCC 6841
‫ـ‬ catalase baixa - M. tuberculosis ATCC
25177
TESTE A 68°C
a) Reagentes:
tampão fosfato (0,067M)
2 tubos com tampa de rosca
alça descartável
banho maria 68°C
c) Procedimento:
Inocular um tubo de tampa de rosca com 1,0
ml de tampão fosfato (0,067M) com uma
alçada cheia de crescimento de micobactérias.
Transferir 0,5 ml do inóculo para um segundo
tubo de tampa de rosca.
Incubar um tubo em banho maria a 68°C por
20 min e o outro a temperatura ambiente.
Adicionar 0,5 ml da solução de Tween 80/H2O2
nos dois tubos.
Deixar a temperatura ambiente por 20 minutos
antes de ler. (Não agitar os tubos)
d) Controle de Qualidade:
M.tuberculosis ATCC 25177 - forma bolhas a
temperatura ambiente mas não a 68°C.
M. fortuitum ATCC 6841- forma bolhas a
temperatura ambiente e a 68°C.

mod VI - 17
TESTE DA URÉIA
Método Wayne
Teste utilizado para identificar as micobactérias que têm a capacidade de hidrolisar a uréia.
a) Reagentes:
Caldo Uréia
Adicionar 10 g de Bacto Uréia ágar base
concentrado (Difco) em 90 ml de H20 destilada
estéril.
Homogeneizar bem.
Colocar assepticamente 3 ml em tubos com
tampa de rosca.
Estocar de 2 a 8°C. (validade 1 mês)
b) Materias e Equipamentos:
alça descartável
estufa 37°C
c) Procedimento:
Inocular o caldo uréia com uma alçada cheia
de um crescimento de micobactérias.
Homogeneizar.
Incubar por 3 a 5 dias a 37°C (não passar de 5
dias para fazer a leitura).
d) Resultado:
Positivo: rosa forte ou vermelho
Negativo: sem mudança de cor. Se ficar
levemente rosado repetir o teste, se o
resultado persistir, reportar como negativo.
Método Murphy-Hawkins
a) Materiais e Equipamentos:
água estéril
alça descartável
disco de uréia
vermelho de fenol
estufa 37°C
vermelho de fenol
b) Procedimento:
Colocar um disco de uréia em um tubo
contendo 0,5 ml de H2O estéril.
Inocular uma alçada cheia de micobactérias
com 2 a 4 semanas de incubação no tubo
contendo o disco de uréia.
Incubar a 37°C por 3 dias.
Pingar 1 gota de vermelho de fenol.
c) Resultados:
Positivo: rosa forte
Negativo: laranja
d) Controle de Qualidade:
Positivo: M. kansasii ATCC 12478
Negativo: M. intracellulare ATCC 13950 ou um
tubo apenas com meio
CRESCIMENTO EM ÁGAR MACCONKEY SEM CRISTAL VIOLETA
É um teste utilizado para diferenciar as diferentes espécies de micobactérias de crescimento rápido.

mod VI - 18
a) Meios:
placa com meio de Mac Conkey sem cristal
violeta
caldo 7H9
alça descartável
pipeta Pastuer descartável
estufa 37°C
estufa 30°C
c) Procedimento:
Inocular em um tubo com 7H9 uma alçada do
Incubar a 37°C por 1 semana.
Inocular 3 a 4 gotas do inóculo do caldo 7H9
no ágar MC.
Estriar a placa.
Incubar a 28°- 30°C por 11 dias.
d) Resultado:
Positivo: colônias nas estrias
Negativo: sem crescimento
e) Controle de Qualidade:
Controle Positivo: M. fortuitum
Controle Negativo: M. chelonae
TESTE DA ARILSULFATASE
Verificar as micobactérias que em diferentes condições produzem a enzima arilsulfatase.
Teste de 3 dias
a) Meios:
caldo de arilsulfatase (3 dias)
b) Reagentes:
Na2CO3 2N
padrões de leitura
c) Materiais e Equipamentos:
alça descartável
vortex
estufa 35°C
estufa 45°C
pipeta Pasteur descartável
d) Procedimento:
Inocular um caldo de 3 dias de Arilsulfatase
com uma alçada cheia de micobactérias de
uma cultura de 2 a 4 semanas de crescimento.
Homogeneizar.
Incubar por 3 dias a 35 - 37°C para
micobactérias de crescimento rápido (sem CO2)
e a 45°C quando a suspeita for de M. xenopi.
Após 3 dias colocar 6 gotas de Na2CO3 2N (não
mais) com uma pipeta Pasteur.
Ler comparando com os padrões.
e) Resultado:
Positivo: produção imediata da cor pink ou
vermelha. (Leitura equivalente a +++ do
padrão)
Negativo : incolor
f) Controle de qualidade:
Positivo: M. fortuitum
Negativo: caldo sem inocular
Teste de 2 semanas

mod VI - 19
a) Meios:
caldo de arilsulfatase (2 semanas)
b) Reagentes:
Na2CO3 2N
padrões de leitura
alça descartável
vortex
estufa 35°C
estufa 45°C
pipeta Pasteur descartável
d) Procedimento:
Inocular o tubo de arilsulfatase de 2 semanas
com uma alçada cheia de micobactérias de
uma cultura de 2 a 4 semanas de crescimento.
Homogeneizar.
Incubar por 2 semanas a 37°C.
Colocar 6 gotas de Na2CO3 2N com uma pipeta
Pasteur.
Ler comparando com os padrões.
e) Resultado:
Positivo: produção imediata de cor rosa forte
ou vermelha. (Leitura equivalente a ++++ do
padrão)
Se o resultado for de +++ (borderline) repetir
o teste.
f) Controle de qualidade:
Positivo: M. triviale
Negativo: caldo não inoculado ou caldo
inoculado com M. tuberculosis.
TESTE DA REDUÇÃO DO TELURITO
Teste utilizado para verificar se a micobactéria reduz o telurito.
a) Reagentes:
telurito de potássio 0,2%
b) Meios:
caldo 7H9 (preparado em tubo de fundo
arredondado)
alça descartável
estufa 37°C
escala de McFarland (4)
vortex
d) Procedimento:
Utilizar uma cultura com 3 a 4 semanas de
crescimento.
Inocular densamente um tubo de fundo
arredondado com caldo 7H9.
Homogeneizar bem.
Incubar por 1 semana a 37°C.
Verificar se tem crescimento suficiente
(equivalente à escala 4 de McFarland). Se não
cresceu bem, não incubar novamente e fazer
um novo tubo.
Com uma pipeta Pasteur colocar 2 gotas de
telurito de potássio 0,2% .
Agitar no Vortex 30 segundos.
Incubar 3 dias a 37°C.
Ler após 3 dias (não passar o prazo).
e) Resultado:
Positivo: formação de um precipitado preto no
fundo do tubo
Negativo: não forma precipitado
f) Controle de Qualidade:
Positivo: M. intracellulare
Negativo: caldo sem inóculo
UTILIZAÇÃO DE FERRO
Verificar se a micobactéria é capaz de converter citrato de ferro amoniacal em óxido de ferro.

mod VI - 20
a) Reagentes:
citrato férrico amoniacal (solução estéril)
c) Procedimento:
Inocular 2 LJ com uma suspensão de
micobactérias.
Incubar até obter crescimento visível (2
semanas).
Colocar tantas gotas de citrato férrico
amoniacal quantos forem os mililitros de meio
em um dos LJ. Ex: para 8 ml de meio LJ,
colocar 8 gotas da solução.
O outro tubo será o controle negativo.
Reincubar o LJ a temperatura ambiente de 28°
- 30°C por até 3 semanas.
d) Resultado:
Positivo: colônias se tornam escuras-oxidadas
Negativo: as colônias permanecem com a
mesma cor que as do LJ em que não foi
colocada a solução.
Positivo: M.fortuitum
Negativo: M. chelonae
HIDRÓLISE DO TWEEN 80
Esta prova é utilizada verificar a hidrólise enzimática do Tween 80 pelas micobactérias.
a) Reagentes:
reagente de hidrólise do Tween 80
alça descartável
estufa 37°C
c) Procedimento:
Inocular uma alçada cheia de micobactérias
com 2 a 4 semanas de crescimento, em um
tubo com o reagente de hidrólise do Tween 80.
Homogeneizar.
Incubar a 37°C no escuro com as tampas bem
fechadas.
Ler após 5 e 10 dias de incubação.
Não agitar os tubos.
Examinar o líquido e não o sedimento.
d) Resultado:
Positivo: mudança de cor do meio, de âmbar
para pink ou vermelho
Positivo: M. kansasii
Negativo: M. avium
Se o líquido ficar sem cor repetir o teste, se
persistir o resultado reportar como negativo.
TESTES AUTOMATIZADOS E MOLECULARES PARA IDENTIFICAÇÃO

mod VI - 21
IDENTIFICAÇÃO PELO BACTEC 460 - NAP
Princípio
NAP (ρ-nitro-α- acetylamino-β-hydroxypropiophenone) é uma substância que inibe o crescimento de
micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis. Outras micobactérias que não estão incluídas
neste complexo crescem na presença desta substância.
Na presença de M. tuberculosis não há produção de CO2, derivado do crescimento da micobactéria, o que
resulta em uma redução na quantidade de 14
CO2 produzido, originando um resultado negativo quando o
frasco é lido no aparelho Bactec 460TB.
Somente culturas em fase de crescimento devem ser usadas para realizar o teste.
a) Meios:
1 frasco de Bactec 12B
1 frasco NAP
Bactec 460TB
seringas tipo tuberculina
estufa 37°C
c) Procedimento:
Se for utilizado um crescimento de
micobactérias no frasco 12B, seguir conforme
descrito no anexo C.
Se for utilizado um crescimento de
micobactérias de um outro meio líquido ou de
um meio sólido, colocar um pouco do
crescimento da micobactéria em um frasco
12B. Ler diariamente até atingir um GI de 50 -
100 e proceder conforme descrito no anexo C.
IDENTIFICAÇÃO POR SONDAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Princípio
As sondas de DNA utilizam uma fita simples de DNA marcada com um éter de acridina complementar ao
rRNA do microrganismo alvo. Após a lise das células da micobactéria, o rRNA é liberado e a sonda
marcada se combina com esse rRNA formando um complexo sonda + rRNA.
Uma solução hidrolítica é utilizada para inativar o éster que não ligado ao rRNA. O complexo formado é
detectado por quimioluminescência com um luminômetro. A quantidade de luz produzida é proporcional a
quantidade de complexos sonda + rRNA presentes na amostra.
As sondas comercialmente disponíveis identificam o complexo Mycobacterium tuberculosis, complexo
Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium gordonae e Mycobacterium intracellulare
(GenProbe Inc. San Diego, CA).
a) Materiais e Equipamentos: 2. Se for utilizado crescimento de
micobactérias em meio sólido:

mod VI - 22
Luminômetro
sonicador de banho maria
banho seco 95°C
seringa de tuberculina
pipetas automáticas de 100 µL e 300 µL
banho 60°C
b) Procedimento
1. Se for utilizado crescimento de
micobactérias em frasco 12B:
Utilizar a cultura quando o crescimento atingir
um GI de 999.
Adicionar 100 µL do reagente 1 e 100 µL do
reagente 2 em um tubo de lise.
Ligar todos os banhos para que possam atingir
a temperatura adequada antes de começar o
teste.
Retirar 1 ml do crescimento bacteriano e
colocar no tubo de lise.
Votexar o tubo vigorosamente por 5 minutos
Sonicar o tubo por 15 minutos a temperatura
ambiente.
Colocar o tubo no banho a 95°C por 15
minutos.
Deixar o tubo esfriar a temperatura ambiente
Retirar 100µL do lisado e transferir para um
tubo com a sonda.
Incubar 15 minutos a 60°C.
Pipetar 300 µL do reagente 3 (que vem no kit)
no tubo.
Tampar e vortexar.
Colocar no banho a 60°C * por 5 minutos.
Retirar do banho, deixar chegar a temperatura
ambiente e colocar no luminômetro para fazer
a leitura.
* A temperatura do banho de 60°C é crucial para
ocorrer o anelamento da sonda com o rRNA da
amostra.
colocar 100µL do reagente 1 e 100µL do
reagente 2 no tubo de lise
inocular uma alçada cheia do crescimento no
tubo de lise.
proceder como descrito acima no item 1.
3. Se for utilizado crescimento de
micobactérias em meio líquido:
somente fazer o teste quando o caldo
apresentar uma boa turvação.
colocar 100 µL do reagente 1 e 100 µL do
reagente 2 no tubo de lise
colocar 1 ml da amostra no tubo de lise
proceder como descrito acima no item 1.
Nota: O passo mais importante no processo é a
lise das células. Após colocar a amostra no tubo de
lise, agitar no vortex vigorosamente por
aproximadamente 5 minutos para que o processo
seja adequando.
d) Resultado:
Positivo: > 30,000 RLU (Relative Light Units)
Negativo: < 30,000 RLU
A sonda para o complexo M. tuberculosis não
identifica as diferentes espécies de micobactérias
pertencentes ao complexo.
IDENTIFICAÇÃO POR MÉTODOS DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA
O termo amplificação significa fazer várias cópias a partir de poucas. Por muito tempo a única técnica em
que isso era possível de ser realizado era a cultura, de onde se multiplicava o número de microrganismos
presentes na amostra. Esta técnica é muito demorada quando se fala de micobactérias por isso foram
desenvolvidas técnicas que amplificam o DNA do microrganismo de forma rápida e específica.
Vários são os métodos para amplificação do DNA de micobactérias que existem no mercado, dentre eles
podemos citar; PCR (Polimerase Chain Reaction) e TMA (Transcription-mediated amplification), NASBA
(nucleic acid sequence-based amplification) e SDA (Strand Displacement Amplification).
PCR
(Amplicor, Roche Diag. Systems)
TMA

mod VI - 23
Princípio
É um sistema semi-automático de
amplificação do DNA “in vitro” por uma
série de incubações sucessivas em
diferentes temperaturas usando uma
enzima estável a temperatura e
dependente de DNA (Taq polimerase).
É um sistema semi-automático de
amplificação de RNA que utiliza uma única
temperatura de amplificação e duas
enzimas uma que converte o rRNA em
DNA e outra que transcreve o DNA em
RNA.
Materiais
e
Equipamentos
termociclador
pipetas automáticas
kit Amplicor
pipetas automáticas
sonicador
banho 42°C
banho seco 95°C
banho 60°C
luminômetro
Procedimento
A amostra deve ser digerida e
descontaminada utilizando o método
de NALC-naoh
As células devem ser lisadas e o DNA
extraído
O DNA deve ser purificado e
concentrado
A técnica de amplificação é aplicada
nesse concentrado
O kit possui as soluções e instruções
para realizar os passos de extração e
amplificação
A detecção do produto amplificado é
feita com sondas específicas para o
fragmento do DNA amplificado,
marcadas com digoxigenina e biotina
no formato de uma reação
imunoenzimática colorimétrica.
As amostras devem ser digeridas e
descontaminadas pelo método de
NALC-NaOH
As células devem ser lisadas e o DNA
extraído
A técnica de amplificação é aplicada no
DNA extraído
Kit possui as soluções e instruções
para realizar os passos de lise,
extração e amplificação do DNA
A detecção do produto amplificado é
feita com sondas específicas para o
fragmento do DNA amplificado,
marcadas com um éster de acridina e
a leitura é feita em um luminômetro.

mod VI - 24
6. ANEXOS
ANEXO A. ESQUEMA DE ISOLAMENTO PRIMÁRIO
Material
Material sem flora
contaminant
Material com
contaminant
Lâmina Ziehl (2)
Repouso 15
3000xg 15
Resuspender o sedimento com
0,5 ml de ágau estéril
Lâmina Ziehl (2) Colocar todo material em
tubo cônico de 50
Dobrar o volume com
Completar com água estéril até
50 ml
0,5 0,1

mod VI - 25
ANEXO B. ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS
Crescimento das Micobactéria
L J 350
C
Não
pigmentado
Pigmento amarelo
ou laranja
M. gordonae
Expor à Luz
Hidrólise do
Tween
M. scrofulaceum
M. xenopi
Crescimento lento
> 7 dias
Nitrato
M. szulgai
M. flavesnens
M. thermoresistibile
Não
fotocromogênico
Fotocromogênico
M. Kansasii
M. marinum
M. simiae
M. asiaticum
+
+
-
-

mod VI - 26
ANEXO C. ESQUEMA DO TESTE DE NAP
12B
GI > 10
Ziehl
positivo
Ziehl
negativo
Micobactéria não
do complexo
Incubar 370
C
Ler diariamente 2 a 7 dias
12B Controle GI ↑
NAP GI ↓
Ler frasco
diariamente até
atingir GI de 50-100
Diluições:
Transferir os seguintes
volumes para um novo 12B
50-100 nenhum
101-200 0,8 mL
201-400 0,6 mL
401-600 0,4 mL
601-800 0,3 mL
801-999 0,2 mL
999 por mais de 1 dia 0,1 mL
Ler normalmente
1x por semana
Complexo
M. tuberculosis
Homogeneizar bem a cultura
com a seringa e transferir 1
mL para o frasco NAP
O frasco 12B
original -
controle do
teste
12B Controle GI ↓
NAP GI ↑

mod VI - 27
1. Della-Latta, P., Weitzman, I. Mycobacteriology. In: Isenberg, H. D. Essential Procedures for
Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 169-203, 1998.
2. Heifits, L.B. Clinical Mycobacteriology. In: Clinical in Laboratory Medicine.W.B. Saunders,
Philadelphia, vol 16, no. 3, 1996.
3. Koneman, E.W. Allen, A.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C., Winn Jr., W.C. Mycobacteria. In:
Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott, Philadelphia, 5a
ed, 1997.
4. Master, R.N. Mycobacteriology. In: Isenberg, H.D. Procedures in Clinical Microbiology. American
Society for Microbiology, Washington, D.C. 1996.

dos Fungos de
Módulo VII

ÍNDICE
1. Introdução ......................................................................................................................1
Fungos e infecção hospitalar .................................................................................................1
2. Coleta e transporte de amostras ....................................................................................4
Procedimentos para coleta de amostras..................................................................................4
3. Processamento de amostras ..........................................................................................6
Exame microscópico de amostras ..........................................................................................6
Cultura de amostras biológicas para isolamento de fungos ........................................................8
4. Identificação de fungos.................................................................................................12
Identificação de leveduras .................................................................................................. 12
Identificação de fungos filamentosos.................................................................................... 16
Identificação de fungos dimórficos ....................................................................................... 18
5. Descrição das principais micoses ..................................................................................20
6. Referências bibliográficas .............................................................................................24

GLOSSÁRIO
Artrósporo ou artroconídio = esporo formado pela desarticulação da hifa de fungos filamentosos ou
leveduras.
Blastosporo ou blastoconídio = esporos formados por brotamento ou gemulação.
Bolor = fungo filamentoso, multicelular, constituído de hifas.
Brotamento ou gemulação = reprodução com divisão de citoplasma através de estrangulamento.
Cenocítica = hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa contínua.
Clamidósporo = estruturas de resistência, constituídas de reserva nutritiva e membrana bastante
espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhante aos esporos.
Conídio = esporo assexuado externo.
Dimórfico = que apresenta duas formas: leveduriforme e filamentosa.
Esporângio = órgão de reprodução assexuada interna, geralmente em forma de vesícula e contêm
inúmeros esporos denominados de esporangiosporos.
Hialino = que não tem cor, translúcido, assumindo a cor do corante utilizado.
Hifa = reunião de células justapostas, formando estrutura tubular, filamentosa, que compõe o corpo
vegetativo dos bolores e de alguns gêneros de leveduras (por ex, Candida spp.).
Demácio ou demaciáceo = fungos negros que têm pigmento melanóide (acastanhado), na parede
celular.
Levedura = fungo em regra, unicelular que se reproduz geralmente por brotamento.
Tuberculado = com granulações ou nodosidades.

Mod VII - 1
1. INTRODUÇÃO
FUNGOS E INFECÇÃO HOSPITALAR
Fungos são seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosférico, solo e água e, embora
sejam estimados em 250 mil espécies, menos de 150 foram descritos como patógenos aos seres
humanos. Leveduras são fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente à perda do
equilíbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas clínicas
localizadas ou disseminadas. De modo contrário, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, não
fazem parte da microbiota animal e portanto o homem não é um reservatório importante para esse
grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro são as vias aéreas superiores ou quebra na
barreira epidérmica após traumatismos com objetos perfuro-cortantes.
Dentre as centenas de espécies descritas, leveduras do gênero Candida são os maiores agentes de
infecção hospitalar e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenças graves e
aqueles em período pós-operatório. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilância operante,
notificaram Candida como 6o
patógeno nosocomial e a 4a
causa mais comum de infecções de corrente
sanguínea, adquiridas em hospitais.
A manifestação clínica mais comum nas candidíases hospitalares é febre. Candidemia pode ser
definida como a ocorrência de 2, ou mais,culturas positivas para a mesma espécie de Candida,
provenientes de amostras diferentes, coletadas após 72 h da admissão. Infecção invasiva por Candida
pode ser também considerada quando há isolamento de Candida a partir de sítio normalmente, estéril
associado a pelo menos, um outro sinal de infecção. A sensibilidade de hemocultura para Candida é
baixa; aproximadamente, 50% dos pacientes com infecção invasiva por Candida podem ter culturas
negativas. Além disso, se houver infecção bacteriana concomitante, pode diminuir a chance do
isolamento de Candida.
Os fatores reconhecidos de risco para infecção invasiva por Candida são:
Permanência > 4 dias em UTI
Antibioticoterapia de largo espectro
Cirurgia abdominal
Cateterização venosa central
Nutrição parenteral total
Imunodepressão
Índice APACHE II > 10
Ventilação mecânica > 48h
Neutropenia
Quimioterapia citotóxica
Frente a estas condições recomenda-se monitoração com exames micológicos sangue de amostras
biológicas dos pacientes, tais como, sangue, escarro, pontas de catéteres intravasculares, líquido
peritoneal e urina. Culturas positivas para leveduras podem significar apenas colonização mas, podem
conduzir à doença invasiva subsequente. Estudo prospectivo, em pacientes cirúrgicos de UTI, mostrou
que 38% de 29 pacientes desenvolveram infecção após colonização. A colonização pode ser
demonstrada por análise de 3 ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de sítios diferentes, do
mesmo paciente, em dias consecutivos.
Diferentes espécies de Candida podem causar quadros de fungemia, a saber: Candida glabrata
(Torulopsis glabrata), Candida tropicalis; Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii,
Candida lusitaniae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e
Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na década de 90 um estudo multicêntrico e, por
análise univariada, concluiram ser C. glabrata, a espécie associada à maior taxa de mortalidade e que
óbito estava relacionado com maior idade e severidade da doença de base do paciente.

Mod VII - 2
O gênero Candida é, sem dúvida o mais importante mas, existem outras leveduras no ambiente
hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosférico e água, quanto na pele e no trato gastrointestinal dos
pacientes e funcionários, que podem causar quadros infecciosos. Os principais gêneros são Pichia sp
(Hansenula sp), Rhodotorula sp e Trichosporon sp.
Fungos filamentosos presentes no meio ambiente hospitalar, também podem causar infecção em
pacientes suscetíveis. O gênero Aspergillus sp (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger)
é o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes transplantados de
medula óssea e neutropênicos. A inalação de esporos é a via mais comum de transmissão e os surtos
de aspergilose são associados a reformas e construções, dentro e ao redor de hospitais. Doença
pulmonar e, mais raramente, sinusite, são as manifestações de aspergilose. Outros gêneros, tais
como Fusarium sp, Acremonium sp e Penicillium sp são capazes de causar formas localizadas ou
disseminadas de infecção hospitalar. Estes gêneros que são dispersos pelo ar atmosférico, pertencem
ao grupo dos hialohifomicetos, pois têm hifas hialinas e septadas. Outros grupos de fungos
filamentosos, como zigomicetos (Rhizopus sp, Mucor sp), caracterizados por hifas não-septadas
(cenocíticas) e alguns feo-hifomicetos (“fungos negros” ou demácios) que têm hifas amarronzadas,
podem também ser agentes de infecção hospitalar.
GENERALIDADES SOBRE FUNGOS
Os fungos de interesse médico, agentes de micoses, são de dois tipos morfológicos: leveduras, que
são unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, que são multicelulares (Fig.1). Existe um subgrupo
dentro dos filamentosos, chamados fungos dimórficos, que se apresentam sob ambas as formas,
dependendo principalmente da temperatura, mas sob influência também do teor de CO2 e condições
nutricionais.
As leveduras têm como estrutura primária, células que se reproduzem por brotamento, único ou
múltiplo, em geral, de forma arredondada. Estas células são esporos de origem assexual e se
denominam blastoconídios. Alguns gêneros de leveduras menos importantes em micologia médica,
reproduzem-se por fissão.
Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte básico a hifa, que pode ser septada ou
não septada (cenocítica). A partir da hifa formam-se esporos, para propagação das espécies. Na
grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de conídios, pois nascem diretamente
delas ou sobre estruturas ligas a elas.
Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificação de um fungo, pois a
classificação de filamentosos é feita, em regra, pelas características morfológicas, tanto macroscópicas
(cor, aspecto, textura da colônia, etc.), quanto microscópicas (forma e cor da hifa, presença ou não de
septos, tipo e arranjo de esporos, etc.), além da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou
rápida). A identificação de leveduras, ao contrário, é feita, principalmente, por características
fisiológicas, desde que, a morfologia destes fungos não é muito variada e não permite distinção entre
espécies e, em regra, entre gêneros.
Com o advento da terapia com antibióticos de largo espectro e o tratamento de pacientes com
doenças metabólicas crônicas, neoplásicos e transplantados, em uso de agentes citotóxicos e
imunossupressores, além da AIDS, a diferença entre fungos contaminantes e patogênicos
(classicamente os agentes de micoses superficiais, subcutâneas e profundas), tornou-se pouco clara.
Agentes como Aspergillus, Candida, Cryptococcus e espécies de zigomicetos, considerados
antigamente, como contaminantes de laboratório e, portanto, de pouca importância clínica, são agora
conhecidos como causadores de enfermidades disseminadas, endocardites, infecções pulmonares,
ceratites entre outras, em pacientes imunodeprimidos. Portanto, estes fungos devem ser
considerados, além dos patógenos clássicos, como por ex., Paracoccidiodes brasiliensis e Histoplasma
capsulatum, como possíveis agentes de quadros infecciosos.
Neste módulo, será apresentada uma visão geral das principais infecções fúngicas, de modo que, os
microbiologistas possam adquirir certa habilidade para identificar fungos isolados de amostras
biológicas. Para um estudo mais completo sobre diagnóstico de infecções fúngicas, recomenda-se as
referências citadas ao final do capítulo.

Mod VII - 3
Estruturas microscópicas básicas de fungos: a, b, c - filamentosos, d - leveduras
a – Filamentosos
b – Filamentosos
c – Filamentosos
d – Leveduras

Mod VII - 4
2. COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS
O tipo e a qualidade da amostra biológica, submetida ao laboratório de micologia, são fatores
importantes no sucesso do isolamento e identificação do verdadeiro agente etiológico de infecções
fúngicas.
A amostra deve ser submetida ao exame microscópico direto e cultura em meios para isolamento e
identificação acurada do agente etiológico. Por isso, a assepsia na coleta e o volume da amostra são
fatores básicos para o sucesso do diagnóstico da infecção.
RECOMENDAÇÕES GERAIS DE COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS
Coletar a amostra biológica com assepsia e colocá-la em recipiente estéril e vedado, sempre em
quantidade suficiente (>2 ml ou 0,5 cm3
) para permitir todos os procedimentos laboratoriais
necessários.
Os “swabs” usados para coleta de material de ouvido, nasofaringe e orofaringe, secreção vaginal e
lesões abertas, devem ser colocados em tubos contendo salina estéril para o transporte, de modo
a evitar a dessecação da amostra.
Sempre que possível, coletar amostras antes do início da terapia específica e, particularmente,
para lesões cutâneas de pele e unhas, orientar o paciente para evitar uso de medicação tópica por
4 a 5 dias antes da coleta de escamas.
A amostra deve ser identificada com nome do paciente , número de registro hospitalar (quando
for o caso), tipo de amostra e data da coleta.
A requisição médica que acompanha a amostra, deve conter, sempre que possível, as hipóteses
diagnósticas que auxiliarão o micologista na escolha da coloração e do meio de cultura mais
adequado para o isolamento do agente etiológico.
Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um mesmo tipo de amostra
biológica, coletada em 2 ou 3 dias consecutivos, é importante para a interpretação correta de
resultados positivos para fungos considerados como saprófitas, ou seja, contaminantes do meio
ambiente, ou mesmo, constituinte da microbiota normal do paciente. Nestes pacientes, os fungos
saprófitas podem se tornar oportunistas e comportarem-se como patógenos.
Os materiais ditos contaminados, tais como urina, fezes, pús, secreções de feridas ou trato
respiratório, devem ser enviados, sob gelo, ao laboratório, o mais rápido possível (<2 h).
Liquor e líquidos cavitários devem ser mantidos à temperatura ambiente e encaminhados com
urgência ao laboratório para processamento imediato.
Sangue e material de punção de medula óssea são os únicos materiais biológicos que devem ser
semeados diretamente, em frascos contendo meio de cultura líquido ou bifásico (líquido sobre
sólido), de modo a evitar coagulação e consequente diminuição da sensibilidade do exame.
PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE AMOSTRAS
Escarro
Recolher, de preferência, a primeira expectoração da manhã, após gargarejo
com água limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. Não deve
conter saliva.
Aspirado gástrico
Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gástrico, através de sonda nasogástrica,
pela manhã, em jejum.
Aspirado traqueal
e secreção obtida
por broncoscopia
Procedimento realizado por médico treinado. O material colhido deve ser
colocado em recipiente estéril.
Sangue e aspirado
de medula óssea
Fazer assepsia rigorosa no local da punção e coletar cerca de 5 a 6 ml de
sangue venoso, que deverá ser injetado diretamente, em frasco contendo meio
de cultura (ver detalhes no próximo ítem). A última gota de material deve ser
distendida em uma lâmina de microscopia, para coloração de Giemsa.

Mod VII - 5
Líquor
Fazer assepsia rigorosa no local da punção. Coletar 2 ml ou mais, para exame
microscópico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar, devem ser
usados na seguinte sequência: 1º exame bioquímico, 2º exame de
celularidade, 3º microbiológico, reduzindo assim a possibilidade de isolamento
de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em tubos
específicos para cada um desses exames, aumenta a sensibilidade do exame
micológico e, por isso, deve ser recomendada.
Tecido obtido por
biópsia, necrópsia
e peças
operatórias
Colher assepticamente, utilizando instrumentos estéreis e colocar o material
em recipiente estéril, com salina. Não adicionar nenhum liquido fixador.
Urina
A amostra biológica mais apropriada para o diagnóstico de micose do trato
urinário é obtida por sondagem ou citoscopia. Quando não for possível, e para
evitar contaminação com microrganismos presentes nas áreas vizinhas, fazer
limpeza prévia da região perineal com água e sabão, desprezar o primeiro jato
de urina da manhã, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio estéril.
Coleções de 24 horas, não têm valor para diagnóstico micológico.
Fezes
Fazer lavagem prévia da região anal com água e sabão, coletar porções de
fezes em recipiente estéril com tampa ou “swab” anal, mergulhar o “swab” em
salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
Secreção ou pele
de conduto
auditivo externo
Colher material por curetagem da lesão ou com “swab” estéril. Mergulhar o
“swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
Material de micose
ocular
O melhor método para recuperação de fungos, requer raspado de córnea,
aspiração de líquido intra-ocular ou biópsia. A coleta com auxílio de “swab” não
é indicada em local de drenagem.
Lesão de nariz
e
seios paranasais
Coletar secreção, material necrótico ou tecido obtido por biópsia em recipiente
estéril.
Mucosa oral e
orofaringe
Coletar com “swab” estéril o material de lesão de mucosa jugal, papilas linguais
ou região tonsilar. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o
tubo ao laboratório.
Secreção vaginal
Com auxílio de espéculo, coletar material da lesão ou do fundo de saco vaginal
com “swab” estéril. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o
tubo ao laboratório.
Liquídos corporais
(pleural, ascítico,
pericárdico, sinovial)
Fazer assepsia rigorosa no local da punção. Coletar cerca de 5 a 10mL de
líquido em tubo de ensaio estéril.
Pus e material de
abscesso
Devem ser colhidos de preferência, por aspiração de abscessos fechados, com
seringa e agulha estéril. Se a lesão for aberta, limpar o local, com gaze
esterilizada embebida em salina estéril, para eliminar os exsudatos superfíciais
que são altamente, contaminados com bactérias. A seguir, colher o material
com “swab”. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo
ao laboratório.
Pele e pelos
Se possível, descontaminar a pele com álcool 70% antes da coleta. Raspar com
lâmina de bisturi as escamas cutâneas da borda das lesões . Pode-se utilizar
também, uma lâmina de microscopia. Colocar o material entre duas lâminas
limpas, de preferência esterilizadas, vedando-se as bordas das lâminas com fita
adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados, devem ser
retirados com pinça estéril e acondicionados entre lâminas ou em potes, de
preferência esterilizados.
Unhas
Fazer limpeza prévia das unhas, escovando com água e sabão. Cortar com
tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lâmina de bisturi, raspar
as áreas mais profundas e pulverulentas. Colocar este material entre lâminas e
vedá-las com fita adesiva.

Mod VII - 6
3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS
O sucesso na visualização e isolamento do agente etiológico depende, além da coleta e transporte
adequados e volume suficiente da amostra, de seu processamento correto antes do exame micológico.
As seguintes recomendações devem ser cuidadosamente, seguidas para boa resolução diagnóstica:
Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame microscópico e
cultura pois, para exame são clarificadas com solução aquosa de KOH a 20% e, para cultura, não
podem sofrer nenhum tratamento prévio, sendo por isso, inoculadas diretamente na superfície do
meio de cultura.
Líquor, secreções e fluídos corporais (líquido pleural, ascítico, sinovial, pericárdico, aspirado
transtraqueal, lavado gástrico e broncoalveolar [BAL]) devem ser concentrados por centrifugação
(1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com “swabs” devem ser eluidos em
solução salina e também devem ser centrifugados. O sedimento obtido é o material adequado
para o exame microscópico e semeadura em meios de cultura.
Para urina, é recomendável que uma alíquota (alça calibrada) seja semeada, por esgotamento,
sobre o meio de cultura distribuído em placa de Petri, para exame quantitativo, pela contagem de
unidades formadoras de colônias (UFC). A outra alíquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm
por 10 minutos) e o sedimento será utilizado para exame microscópico e nova semeadura em tubo
(cultura qualitativa).
Escarro pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzima dissolvidas
em 1 L de solução-tampão citrato ou solução fisiológica), que fluidifica e facilita a manipulação da
amostra e formação de sedimento após centrifugação. Porém, não foi comprovado que esse
tratamento melhore a recuperação de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se
utilizar, como alternativa, para digestão da amostra, solução de KOH 20%. A porção purulenta da
amostra é preferível e porções liqüefeitas não são adequadas para isolamento do agente. A porção
da amostra tratada com KOH, porém, só pode ser usada para exame microscópico, pois a potassa
destrói, após algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando seu isolamento em meio de
cultura. Neste caso, outra porção da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para
cultura.
Tecidos obtidos por biópsia requerem fragmentação, com o auxílio de um bisturi estéril ou
maceração (gânglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de uma placa de Petri estéril.
Esse procedimento visa aumentar a área de superfície e expor o microrganismo ligado ao tecido,
ao maior contato com o meio de cultura.
Sangue e aspirado de medula óssea não necessitam preparação, sendo que o exame
microscópico tem baixa sensibilidade e, portanto a cultura é importante para identificação do
agente. Para cultura, as amostras são semeadas imediatamente, após a coleta, em frascos
contendo meio de cultura. O meio pode ser bifásico (15 ml de ágar inclinado sob 50 ml de caldo)
composto de infusão de cérebro-coração (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para
lise e posterior centrifugação da amostra são indicados. Na prática, frascos para hemocultura
bacteriológica (simples ou automatizada), proporcionam isolamento adequado de fungos, desde
que respeitado os períodos necessários ao seu desenvolvimento. Para fungos dimórficos, de
crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram o método de lise-centrifugação o mais
sensível. O sangue e medula óssea não devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois
esta substância se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do
exame. Um dos procedimentos recomendados para é a inoculação de 5 a 6 ml da amostra no
frasco com meio bifásico sendo, uma parte para 10 partes do meio liquído, que deve ser então,
incubado à temperatura de 30°C.
EXAME MICROSCÓPICO DE AMOSTRAS
A observação de um fungo na amostra biológica tem grande valor diagnóstico pois demonstra a
invasão do fungo no tecido e permite uma informação imediata ao médico, a qual pode ser crucial
para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biológica
for insuficiente para o exame microscópico e cultura do material, a cultura, na maioria das amostras,
tem prioridade sobre o exame microscópico, desde que é método mais específico e em muitos casos,
mais sensível. O exame microscópico da amostra é realizado por várias técnicas, dependendo do tipo
da amostra e suspeita clínica.

Mod VII - 7
EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO (KOH) A 20%
É usado para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por biópsia, exsudatos espessos e outros
materiais densos. Colocar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em uma lâmina de microscopia e sobre
esta, uma porção da amostra a ser examinada. Cobrir a preparação com uma lamínula e, para
intensificar a clarificação, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar
ferver a mistura. Examinar a preparação após 20 minutos, em microscópio óptico comum,
inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x.
EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA)
Utilizada em amostras de líquor, urina, secreções ou exsudatos, para visualização de leveduras
capsuladas do gênero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro
proporcionado pela tinta.
Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada, sobre uma
lâmina. Cobrir a preparação com lamínula e observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x).
Nesta técnica, um erro bastante frequente é confundir linfócitos com células de leveduras. A
diferenciação é feita pela refringência da parede celular e das inclusões no citoplasma das leveduras,
além da presença de brotamentos.
Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cápsula
polissacarídica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim
EXAME MICROSCÓPICO COM COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM
Todos os fungos são Gram- positivos, assim a utilização da coloração não visa a diferenciação dos
microrganismos, mas possibilita discriminar elementos fúngicos de artefatos existentes em urina,
secreções e fezes. A amostra é espalhada de modo homogêneo, em movimentos circulares, em uma
lâmina de microscopia, fixada com calor e submetida à coloração.
EXAME MICROSCÓPICO COM COLORAÇÃO PANÓTICA (GIEMSA, LEISHMAN OU WRIGHT)
Estas colorações são usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diversas amostras
biológicas: medula óssea, sangue, aspirados e secreção cutânea. Nestes casos, faz-se um esfregaço
semelhante ao usado para coloração de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o método
escolhido. Podem ser usadas ainda, para corar “imprints” de tecidos obtidos por biópsia.
Abaixo estão esquematizados os principais aspectos morfológicos observados ao exame microscópico
e os possíveis agentes etiológicos de acordo com a amostra biológica.
Cápsula
Polissacarídica
Inclusões
citoplasmáticas
Células em
brotamento
Tinta da China

Mod VII - 8
Interpretação de aspectos morfológicos encontrados em exames microscópicos de
amostras biológicas
Amostra biológica Aspecto Morfológico Interpretação
Pelos a. Hifas hialinas e/ou artrosporos (1) a. Dermatófitos
Unhas,
escamas de pele
a. Hifas regulares, septadas, ramificadas, hialinas,
artrosporadas (1)
b. Leveduras e pseudohifas
c. Grupo de leveduras e/ou pequenas hifas
tortuosas, hialinas (1)
a. Dermatófitos
b. Candida spp
c. Malassezia sp
Líquor a. Levedura capsulada (2) a. CRYPTOCOCCUS SP
Secreções
(trato respiratório,
vaginal, nasal, oral,
naso-faringe)
a. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (3)
b. Levedura capsulada (2)
c. Levedura e pseudohifa (1,3)
d. Leveduras globosas ou multiformes, de parede
espessa, inclusões citoplasmáticas, com
múltiplos brotamentos (1)
a. Fungos filamentosos hialinos (5)
b. CRYPTOCOCCUS SP
c. Candida spp
d. Paracoccidioides brasiliensis
Tecidos, pus e
aspirados
(subcutâneo,
ganglionar,
cerebral, pulmonar,
mucosa ou outro)
a. Hifas irregulares, largas, cenocíticas (1,3)
b. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (1,3)
c. Hifas septadas de cor castanha ou marrom (1,3)
d. Estruturas ovaladas, com ou sem septos, de cor
castanha (estruturas muriformes) (1)
e. Levedura e pseudohifa (1,2)
f. Levedura capsulada (2)
g. Levedura globosa ou ovóide, de parede espessa,
inclusões citoplasmáticas, com brotamento
único ou múltiplos (1)
h. Leveduras pequenas, tipo charuto (achado
muito raro) (3)
i. Leveduras pequenas em macrófagos (4)
a. Zigomicetos
b. Fungos filamentosos hialinos(5)
c. Feohifomicetos (fungos demácios)
d. Cromomicetos (agentes de
cromomicose)
e. Candida spp
f. CRYPTOCOCCUS SP
g. Paracoccidioides brasiliensis
h. Sporothrix schenckii
i. Histoplasma capsulatum
Fluídos oculares a. Fragmentos de hifas, hialinas, septadas (1,3)
b. Leveduras e pseudohifas (1,3)
a. Fungos filamentosos hialinos (5)
b. Candida spp
Sangue e
medula óssea
a. Fragmentos de hifas ramificadas, hialinas,
septadas (3,4)
b. Levedura capsulada (2)
c. Leveduras em brotamento (3,4)
d. Leveduras pequenas em macrófagos (4)
a. Fungos filamentosos (5)
b. CRYPTOCOCCUS SP
c. Leveduras (6)
d. Histoplasma capsulatum
(1) Exame microscópico com KOH
(2) Exame microscópico com tinta nanquim
(3) Exame microscópico com coloração de Gram
(4) Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica
(5) São fungos saprófitas que podem se tornar oportunistas, por ex. Aspergillus, Fusarium, Acremonium, cuja
identificação só é possível pela cultura.
(6) No sangue, leveduras do genero Candida não formam pseudohifas e a identificação de gênero e espécie é
possível somente, após isolamento em meio de cultura.
CULTURA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS PARA ISOLAMENTO DE FUNGOS
A amostra, após o processamento, poderá ser usada para isolamento do agente etiológico. Para tanto,
deverá ser semeada em movimentos de estrias (zig-zag) sobre a superfície de meios sólidos de
cultura, distribuídos em alíquotas de 12 a 20 ml, dentro de tubos de ensaio tamponados com tampão
hidrófilo.

Mod VII - 9
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura utilizados para o isolamento primário de fungos, a partir de amostras biológicas,
podem ser adquiridos no comércio, sob a forma desidratada, não precisando ser formulados no
laboratório. Após a hidratação, conforme instruções do fabricante, o meio deve ser distribuído, de
preferência, em tubos e esterilizados por autoclavação.
Para ágar, recomenda-se a solidificação com tubo inclinado, deixando espaço de 3 cm do final do meio
até o tampão, para evitar contaminação via meio externo. Todos estes meios de cultura são
distribuídos e esterilizados, de preferência em tubos de ensaio pois, desta forma, há maior resistência
à desidratação e contaminação, além de oferecer menor bio-risco na manipulação da cultura.
O armazenamento dos tubos, contendo meios de cultura, deve ser em saco plástico fechado, dentro
de armários, à temperatura ambiente. Desse modo, se houver uma contaminação durante o tempo de
armazenamento, as colônias de fungos contaminantes serão facilmente observadas, ao contrário do
que ocorre, quando se armazena sob refrigeração. O controle de esterilidade deve ser feito por 7 dias,
à temperatura ambiente, antes do uso de qualquer meio de cultura.
Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser utilizados meios não
seletivos, que permitam crescimento de fungos patogênicos e bolores de crescimento rápido (< de
7dias). Estes fungos, apesar de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de
micoses em pacientes suscetíveis, ou seja, são potencialmente, oportunistas. O isolamento desses
fungos, em meio de cultura está sendo, cada vez mais, importante para diagnóstico laboratorial das
infecções ditas oportunísticas.
O meio básico em laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose (ASD), chamado
simplesmente, ágar Sabouraud. Em regra, usa-se um antibiótico para impedir o crescimento de
bactérias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. O cloranfenicol é o mais indicado, pois
resiste à autoclavação. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos.
Meios ditos seletivos para fungos patogênicos, contém cicloheximida que inibe parcialmente, ou
totalmente, fungos anemófilos. Estes meios são indicados para cultivo de materiais coletados de
lesões com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatófitos.
Mas, deve-se ressaltar que esta substância poderá inibir o isolamento de fungos oportunistas, como
Aspergillus sp, além de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras
patogênicas dos gêneros Candida e Cryptococcus.
Existem meios presuntivos que indicam presença de certos grupos de fungos ou determinados
gêneros, como por ex., ágar contendo compostos fenólicos para Cryptococcus sp (ágar contendo
sementes de niger ou Guizzotia abssinica), ou ágar especial para dermatófitos (Dermatophyte Test
Medium). Existem ainda, meios presuntivos, por reação enzimática e colorimétrica, de espécies de
Candida spp (Candida Medium, ChromAgar, Biggy Agar, etc). São meios mais caros que ASD e além
disso, sua maior aplicação é no isolamento primário de leveduras, a partir de amostras biológicas
muito contaminadas, tais como: secreção vaginal, fezes e urina. A identificação, no entanto, é feita
somente, após análise morfológica e fisiológica.
Para isolamento ou subcultivo de dermatófitos recomenda-se o ágar batata, encontrado no comércio,
sob forma desidratada, para aumentar a esporulação e facilitar a identificação do gênero e espécie do
fungo. Para fungos dimórficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o uso de meios
enriquecidos como o ágar infusão de cerebro-coração (BHI) para obtenção, em menor tempo, de
culturas melhor desenvolvidas. Pode ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibióticos
(de preferência, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina).
O meio de cultura pode ser selecionado segundo: tipo de amostra e agente etiológico, conforme a
suspeita clínica. De acordo com os aspectos observados ao exame microscópico da amostra, pode-se
ainda, redirecionar o procedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de
meio para semeadura da amostra biológica, os quais deverão ser incubados à temperatura de 30°C,
usada atualmente, para todos os tipos de amostras.
ÁGAR SABOURAUD-DEXTROSE (ASD)
Dextrose ........................................................40 g
Peptona .........................................................10 g
Ágar ..............................................................15 g
água destilada ..............................................1000 ml

Mod VII - 10
Dissolver os componentes na água destilada.
Acertar o ph em 5,6 .
Aquecer até a completa dissolução.
Distribuir cerca de 10 ml por tubo.
Esterilizar em autoclave a 120ºC por 15 minutos.
ÁGAR SABOURAUD-DEXTROSE COM CLORANFENICOL
Dissolver 100 mg de cloranfenicol em 10 ml de álcool 95ºC.
Adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilização.
ÁGAR-SABOURAUD-DEXTROSE COM CLORANFENICOL E CICLOHEXIMIDA
(MEIOS COMERCIAIS MYCOSEL, MICOBIOTIC AGAR OU MEIO SELETIVO PARA FUNGOS)
Diluir separadamente 400 mg de cicloheximida (Actidione) em 10 ml de acetona.
Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de álcool 95ºC.
Misturar as soluções e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilização.
pH= 7,0
BRAIN HEART INFUSION AGAR COM CLORANFENICOL (BHI)
Dissolver 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de álcool 95ºC.
Adicionar em 1 litro de BHI desidratado antes da esterilização.
PROCEDIMENTOS PARA CULTURA
Os materiais devidamente, processados devem ser semeados na superfície dos meios de cultura, com
alça de níquel-cromo ou pipeta Pasteur, com movimentos em estrias em zig-zag, para permitir
separação de eventuais contaminantes da amostra. O material não deve ser colocado em
profundidade no ágar, mas apenas aderido à superfície do meio.O ASD é o meio mais utilizado, por
ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fungos, com raríssimas exceções.
A temperatura de incubação recomendada, para todas as amostras é 30°C, devido a possibilidade de
o agente etiológico ser oportunista, e desse modo, crescer melhor a 30°C do que a 37°C, no primo
isolamento. Além disso, pensando em Brasil, em que, as temperaturas são muito altas na região norte
e nordeste, dificilmente alcançam 25°C, a menos que se utiliza estufa BOD (“body oxigen demand”). A
temperatura de 30°C é verificada, mais facilmente, durante muitas horas do dia.
Hemoculturas fazem parte da rotina diagnóstica para casos de infecção hospitalar e merecem
algumas recomendações à parte, para isolamento de fungos. Os frascos contendo meio bifásico e
sangue ou aspirado de medula óssea, devem ser submetidas à agitação manual periódica, para
maior homogeneização do oxigênio na fase líquida do frasco. Exames macroscópicos diários da
superfície da fase sólida são indicados para verificar aparecimento de colônias de: leveduras dos
gêneros Candida sp, Cryptococcus sp e outros (24 h-7 dias), fungos filamentosos e Sporothrix
schenckii (2 a 15 d) e fungos dimórficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma
capsulatum (15 a 30d). Qualquer colônia de fungo deve ser repicada em ASD, para posterior
identificação.
O crescimento de fungos, ao contrário de bactérias, não resulta em turvação imediata do meio
líquido, de modo que, a análise microscópica de uma gota do meio, abrevia o prazo de resultados
positivos. Recomenda-se a pesquisa microscópica do crescimento de fungos corando por Gram,
duas gotas do meio liquido, periodicamente, em cada um dos períodos acima citados. Além do
exame microscópico da fase líquida, um procedimento que resulta em maior sensibilidade da
cultura, é a realização de repiques de 1 ml da fase líquida, para tubos contendo ASD ou BHI, em
dias alternados: 2º
, 10º
e 30º
dia.
Visto que a maioria dos laboratórios brasileiros não trabalha com o meio bifásico, pode-se inocular
a amostra, na mesma proporção de 10%, em frascos de hemocultura bacteriológica e fazer a
leitura como anteriormente, descrito. Entretanto, sistemas automatizados para hemoculturas, que
acusam o crescimento de qualquer microrganismo em até 7 dias, não permitem identificar a
presença de fungos de crescimento mais lento. Nesses casos, a incubação por periodo de até 30
dias, com repiques do caldo em ASD. O procedimento para sangue e aspirado de medula óssea,
denominado lise-centrifugação, não é muito difundido no Brasil, pelo custo de importação do
sistema. O material biológico é inoculado diretamente no frasco do sistema, que contem

Mod VII - 11
saponina, que lisa as células liberando assim os microrganismos intracelulares. A seguir, deve-se
realizar centrifugação que direcionará os elementos fúngicos para o fundo do tubo que já contem
o meio de cultura. O sobrenadante é desprezado e, desta forma, a cultura foi realizada, evitando-
se subcultivos, que são necessários quando se inocula o material em meios bifásicos ou líquidos. A
incubação é feita a 37ºC por período de até 30 dias.
Abaixo estão os procedimentos recomendados para exame direto e cultura, visando obter melhor
rendimento no isolamento primário de fungos, de acordo com tipo de amostra biológica.
Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segundo amostra
biológica
AMOSTRA BIOLÓGICA PROCESSAMENTO EXAME MICROSCÓPICO MEIO DE CULTURA*
Secreção respiratória
- Fluidificação (recomendada)
- Centrifugação
- Uso do sedimento
- “a fresco”
- KOH a 20%
- Giemsa
- Tinta nanquim
- ASD
- BHI
Líquor - Centrifugação
- Uso de sedimento
- Tinta nanquim
- Gram
- ASD
Urina** - Centrifugação
- Uso de sedimento
- “a fresco”
- Gram
- ASD
Fluídos corporais
(pleural, ascítico, sinovial,
pericárdico, gástrico,
brônquico)
- Centrifugação
- Uso de sedimento
- KOH a 20%
- Giemsa
- ASD
- BHI
Pus e secreções de
abscessos
- Nenhum - KOH a 20%
- Giemsa
- ASD
- BHI
“swab” embebido em salina
(mucosa oral, nasal,
vaginal, anal, olhos,
conduto auditivo)
- Centrifugação
- Uso de sedimento
- Gram - ASD
Pele, pelos e escamas - Nenhum - KOH a 20% - ASD
Tecidos e peças - Fragmentação ou
maceração
- “Imprint” em lâmina
- KOH a 20%
- Giemsa
- Tinta naquim
- ASD e BHI
Sangue e medula óssea
- Semeadura em meio de
cultura
- Esfregaço ou distensão em
lâmina
- Giemsa - BHI bifásico ou líquido
- ASD bifásico ou líquido
* Todos os meios sólidos, para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol.
** Para contagem de colônias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribuído em placa de Petri, antes de
centrifugar.

Mod VII - 12
4. IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS
O profissional de laboratório deve tentar identificar todas as culturas positivas e emitir o resultado
mais acurado possível. Muitas vezes, o exame microscópico da amostra é suficiente para medidas de
controle da infecção, outras vezes somente o isolamento e identificação do fungo pode orientar a
conduta clínica. A identificação dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gênero e a espécie;
porém, muitas vezes, isso não é possível, pelo grau de dificuldade e complexidade do exame. Nestes
casos a identificação do grupo de fungos, suficiente para o diagnóstico de micose, por ex.,
zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatófitos, leveduras, etc.
O isolamento de um fungo em meio de cultura não significa, necessariamente, que ele é o agente
etiológico da infecção. A presença de fungos na microbiota (flora) de pacientes, por ex. Candida sp e
no meio ambiente, por ex. Aspergillus sp, pode resultar em cultura positiva. Isto explica o grande
número de culturas positivas para fungos, a partir de uma amostra biológica. A relação entre o fungo
isolado em meio de cultura e sinais e sintomas, é critério clínico-epidemiológico. No entanto, deve-se
sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de:
Qualquer amostra biológica que mostrou resultado positivo ao exame microscópico
Micose cutânea
Fluídos corporais normalmente estéreis
Tecidos obtidos por biópsias ou peças operatórias
Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independente da contagem de colônias
Raspado de córnea
Paciente imunodeprimido (transplantado ou com Aids)
Paciente em uso de antibióticos por longo tempo, internado em unidade de terapia intensiva ou
submetido a ventilação, cateterismo ou outras manipulação
Paciente de hemodiálise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doença infecciosa
independente do tipo de amostra clínica
Além desses casos, têm importância as culturas de fungos:
Dimórficos
Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra biológica, coletada em diferentes dias e
procedentes do mesmo paciente
Isolados de ponta de cateter (alimentação parenteral, infusões venosas, etc.)
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS (Morfológica e Bioquímica)
A morfologia das leveduras, ao contrário do que ocorre com os bolores, não apresenta muita
diversidade e, portanto, nem sempre é um parâmetro suficiente para sua identificação. Em
determinadas situações, no entanto, a identificação rápida, simples e presuntiva pode ser feita,
contribuindo para o diagnóstico do quadro infeccioso. Desse modo, se a levedura apresenta hifas
hialinas e ramificadas, é sugestivo do gênero Candida sps e se, além disso, desenvolver clamidósporos
-células de reserva- ou tubos germinativos, em determinadas condições “in vitro”, é identificada como
Candida albicans. Outros gêneros, tais como, Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporon,
também podem, na grande maioria das vezes, ser identificados apenas, por sua morfologia
característica. O restante dos gêneros e espécies, porém, necessita de provas bioquímicas para sua
identificação. No entanto, do ponto de vista clínico, nem sempre é importante a identificação acurada
da levedura. Por outro lado, a identificação, pode ter interesse epidemiológico. Para leveduras
relacionadas a episódios de infecção hospitalar, por ex., há grande preocupação no estudo das
espécies dos agentes, como marcador epidemiológico temporal e espacial de infecções, como no caso
de espécies de Candida que têm menor sensibilidade a antifúngicos azólicos.
Colônias de levedura obtidas de amostra biológica, só devem ser identificadas, quando estiverem
puras, ou seja, sem contaminação bacteriana ou em mistura de espécies. Para tanto, deve ser
realizado o plaqueamento de cada colônia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza, por
microscopia. De cada colônia deve ser feito um repique em ASD para sua identificação.

Mod VII - 13
As provas fisiológicas mais comuns e mais simples para identificação de Candida albicans e Candida sp
são: tubo germinativo e filamentação em cultivo em lâmina. No cultivo em lâmina, avalia-se a
capacidade de produção de hifas hialinas ramificadas que podem se fragmentar em esporos,
denominados artroconídios. Estas hifas ocorrem nos gêneros Geotrichum e Trichosporon. Caso a
levedura forme hifas hialinas ramificadas sem fragmentação, provavelmente pertence ao gênero
Candida e se houver formação de clamidósporos caracteristicos, é Candida albicans.
A pesquisa de cápsula, característica marcante do gênero Cryptococcus é feita com uma gota de tinta
nanquim e uma alçada da cultura. A cápsula, constituída de material polissacarídico, aparece como um
halo claro ao redor dos blastoconídios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lâmina.
A prova de urease, disponível em todo laboratório de microbiologia é muito utilizada em micologia. A
reação positiva para urease, junto com análise morfológica permite identificação presuntiva de
Cryptococcus sp. Leveduras do gênero Rhodotorula são também urease positiva mas, como em
regra, apresentam colônias com pigmento avermelhado ou salmão, são facilmente distinguidas de
Cryptococcus sp. Outros gêneros incluindo Candida sp, produzem urease, mas tem outras
características para sua identificação.
O esquema abaixo propõe um fluxo para identificação das principais leveduras de interesse médico.
Se as provas não conduzirem à identificação presuntiva do gênero, provas de assimilação de fontes de
carbono e nitrogênio (auxanograma) e fermentação de carboidratos (zimograma) devem ser
realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste
capítulo. Um exemplo simplificado é a Tabela 1.
Esquema simplificado para identificação de alguns gêneros de leveduras
Auxanograma e
Zimograma
Tubo Germinativo
Positivo Negativo
Candida albicans
Cultivo em lâmina
Hifas Somente blastoconídios
Prova da Urease
Positiva Negativa
Associar à cor da colônia
Laranja, Avermelhada, Salmão Branca Bege
Rhodotorula sp Associar à pesquisa de cápsula
Artrosporadas não-artrosporadas
+ blastoconídios
com
blastoconídios
sem
blastoconídios
Trichosporon sp Geotrichum sp
Positiva Negativa
Cryptococcus sp
Candida albicans

Mod VII - 14
PROVA DO TUBO GERMINATIVO
A partir de uma alçada da colônia isolada, fazer uma suspensão em tubo de ensaio contendo 0,5 ml de
soro humano (pode-se usar também soro estéril de bovino, cavalo ou coelho). Incubar a 37ºC durante
período máximo de 3 horas. Este prazo é importante porque, após esse período, outras espécies de
Candida e de outros gêneros, formam também tubo germinativo. Depositar então, uma gota da
suspensão sobre lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio óptico. A presença de tubo
germinativo, na forma de pequeno filamento que brota do blastoconídio, sem formar constricção com
a célula-mãe, permite a identificação presuntiva de Candida albicans.
Prova do tubo germinativo com blastoconídios, tubo germinativo e pseudo-hifas de
Candida albicans
CULTIVO EM LÂMINA PARA PROVA DE FILAMENTAÇÃO E CLAMIDÓSPORO
Depositar 3 ml de ágar-fubá fundido, sobre uma lâmina contida sobre um suporte dentro de uma
placa de Petri. O suporte para a lâmina pode ser um bastão de vidro, outra lâmina ou apenas dois
palitos de madeira Após solidificação do meio, semear a levedura, com auxílio de uma agulha em “L”,
fazendo 2 estrias paralelas. Recobrir as estrias com lamínula esterilizada. Fazer uma câmara úmida,
acrescentando 2 ml de água destilada estéril na placa, ou embebendo um algodão estéril, para evitar
dessecação do meio, durante o período de incubação da prova. Tampar a placa e após 24h, 48h e
72h, examinar a preparação em microscópio ótico. A presença de hifas hialinas, septadas e
ramificadas, característica o gênero Candida e se houver formação de clamidósporos indica Candida
albicans. Formação exclusiva de artrósporos permite identificação de Geotrichum, mas quando são
formados também blastoconídios trata-se de Trichosporon. O meio de ágar fubá ou farinha de milho
pode ser adquirido no comércio (CornMeal agar) mas sua formulação é simples , ressaltando-se que
de todos as maneiras, deve-se acrescentar a substância tensoativa tween 80, para que a prova dê
resultados confiáveis. O meio tem a seguinte composição e preparo:
Meio ágar Fubá
Fubá 20 g
Ágar 10 g
Tween 80 5 ml
Adicionar o fubá em 250 ml de água e ferver até borbulhar. Filtrar o fubá em gaze dobrada em quatro.
Dissolver o ágar em 250 ml de água. Restaurar o volume da infusão de fubá para 250 ml, com água
quente, juntar as suspensões, ajustar o pH para 6,6 – 6,8 e adicionar o Tween 80. Distribuir volumes
de 5 ml em tubos e esterilizar em autoclave a 120ºC por 15 minutos.

Mod VII - 15
Cultivo em lâmina para prova de filamentação e clamidósporo
PROVA DA UREASE
Semear uma alçada da levedura na superficie do meio de urease (ágar uréia de Christensen).
Incubar à temperatura de 37ºC.
A mudança da cor do meio para rosa bispo em 24 h, indica reação positiva.
PROVA DE ASSIMILAÇÃO DE FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO OU AUXANOGRAMA
Nessa prova são usados 2 meios, que podem ser adquiridos no comércio, na forma desidratada (Yeast
Nitrogen Base e Yeast Carbon Base) ou formulados. A levedura é semeada "pour plate",
homogeneizando-se 2 ml de uma suspensão das colônias, a cada meio fundido ou semeada na
superfície de cada um dos meios, previamente, distribuídos em 2 placas de Petri. São então
adicionadas pequenas alíquotas de diferentes carboidratos que servem de fonte de carbono, sobre a
superfície do meio isento de carbono. Várias substâncias, incluindo álcoois, proteínas e aminoácidos
servem de fontes de nitrogênio e são colocadas sobre a superfície do meio isento de nitrogênio. Após
incubação à temperatura ambiente ou 25°C, por período de uma semana, a levedura irá assimilar e
crescer em volta de determinadas fontes, de acordo com o metabolismo característico de sua espécie.
A leitura é feita pelo halo de turvação resultante do crescimento e indica prova de assimilação positiva
para a respectiva fonte. Os resultados são comparados a tabelas existentes na bibliografia
recomendada e um exemplo simplificado consta na tabela abaixo.
Identificação das principais leveduras de interesse médico
Cultivo
em
lâmina
Assimilação FermentaçãoLevedura Tg
Hifa Ar
Ur
Sa Ma La Ce Tr Ra X I NO3 Gl Sa Ma La Ra Tr
C. albicans + + - - + + - - + + + - - + - + - - V
C. tropicalis - + - - + + - V + + + - - + V + - - +
C. parapsilosis - + - - + + - V + + + - - + - - - - V
C. krusei - + - - - - - - - - - - - + - - - - -
C.guilliermondii - + - - + + - + + + + - - + + - - + V
C. glabrata - - - - - - - - + - - - - + - - - - +
C. neoformans - - - + + + - V + V + + - - - - - - -
Geotrichum - + + - - - - - - - + - - V - - - - -
Trichosporon - + + V + + + + V V + V - - - - - - -
Rhodotorula sp - - - + + V - V + + + - - - - - - - -
Saccharomyces - - - - + + - - V + - - - + + + - + V
Tg = tubo germinativo, Ar = artrósporo, Ur= urease, Sa = sacarose, Ma=maltose,La = lactose, Ce = celubiose, Tr
= trealose, Ra = rafinose, X = xilose, I = inositol,NO3 = nitrato, Gl = glicose, + = pos, - = neg, V= variável
Lâmina
Lamínula
ágar fubá
Bastão de vidro
3 estrias com inóculo
da levedura
Água estéril sobre
papel de filtro

Mod VII - 16
FERMENTAÇÃO DE ACÚCARES OU ZIMOGRAMA
A capacidade de fermentar carboidratos, ao lado do auxanograma, irá completar o perfil bioquímico da
levedura permitindo, em regra, a identificação acurada de gênero e espécie (QUADRO 3). As
características morfológicas são fundamentais para concluir a identificação, desde que diversas
espécies têm perfis bioquímicos idênticos, mas morfologias distintas. Para o zimograma,
diversas fontes de carboidratos são colocadas em tubos respectivos, contendo meio básico líquido. A
levedura é semeada em cada tubo e após período de até 15 dias a 25°C, a fermentação é revelada
por formação de bolhas de gás, observadas dentro de tubos de Durhan, colocados previamente,
durante a preparação do meio básico.
IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS
A identificação de fungos filamentosos tem, como fundamento, a observação da morfologia da colônia
e aspectos microscópicos. A análise da colônia visa observar: cor, textura, superfície, pigmento
difusível no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura
primária do fungo. Porém, o mais adequado é a análise a partir da “colônia gigante’, ou seja, uma
cultura feita no ponto central de uma camada de ágar distribuído em placa de Petri. A velocidade de
crescimento, que pode ser rápida (< 7 dias), intermediária (8 a 14 dias) ou lenta (> 15 dias) é
fundamental para identificação presuntiva do fungo.
A observação das estruturas microscópicas, tais como: hifa hialina ou demácia, septada ou cenocítica,
forma, disposição e formação dos esporos, são suficientes, em geral, para a identificação de fungos
filamentosos. Em alguns grupos porém, como os fungos demácios, pode ser necessário também uso
de provas bioquímicas. A morfologia microscópica é melhor visualizada com a técnica de microcultivo
que preserva a disposição original dos esporos sobre as hifas e mantém íntegras certas estruturas
formadoras de esporos, por ex. esporângios que são órgãos de reprodução de zigomicetos.
Os fungos filamentosos, patogênicos ou contaminantes ambientais, potencialmente oportunistas,
formam um grupo muito extenso, impossível de ser tratado neste Manual. Para identificação das
diversas espécies ou grupos existe bibliografia especializada de textos, manuais e atlas, indicados no
final deste capítulo. Dentro do objetivo deste Manual serão ilustrados aspectos microscópicos de
alguns fungos de interesse em medicina (vide Figuras adiante).
TÉCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS FILAMENTOSOS
Colocar sobre uma lâmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estéril, um cubo de ágar: ASD
ou ágar batata. A lâmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lâmina, ou um
pequeno bastão de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fósforo. Semear o fungo, a partir de
repique recente, nos 4 lados do cubo de ágar. Recobrir com uma lamínula esterilizada. Fazer uma
câmara úmida, adicionando 1 a 2 ml de água destilada estéril no fundo da placa ou embeber um
pequeno chumaço de algodão estéril, para evitar a dessecação do meio de cultura, durante o
crescimento do fungo. Tampar a placa e deixar à temperatura ambiente por 7 a 10 dias, até que se
observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentação.
Após esse período, inativar a esporulação, adicionando 1 ml de formol ao algodão e vedando a placa
com fita adesiva durante 24h-48h. O vapor de formaol, além de inativar o fungo, irá auxiliar na
fixação das estruturas microscópicas. Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente,
uma vez que nela deverão estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante
azul de lactofenol-algodão (“Cotton Blue”) e montar sobre uma lâmina. Desprezar o cubo de ágar e,
em seu lugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com lamínula, para visualizar esporos e
hifas também aderidos à lâmina. Observar em microscópio ótico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da
hifa, forma disposição e formação de esporos.
O corante azul de lactofenol-azul algodão, utilizado na microscopia de culturas de fungos filamentosos,
é formulado e preparado da seguinte forma:

Mod VII - 17
Azul de lactofenol-algodão
Ácido lático 20g
Cristais de fenol 20g
Glicerina 20g
Azul algodão 0,05g
Água destilada 20g
Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar
Esperar 24 h e filtrar
O azul algodão pode ser substituído pelo azul de metileno.
Técnica de microcultivo para análise microscópica de fungos filamentosos
Fungos anemófilos de hifas hialinas e septadas (hialohifomicetos)
Lâmina
Lamínula
Cubo de
ágar
Bastão de vidro
4 inóculos de fungo nas
laterais do cubo
Água estéril sobre
papel de filtro

Mod VII - 18
Dermatófitos agentes de micoses cutâneas
Dermatófitos agentes de micoses cutâneas
IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS DIMÓRFICOS
Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sob determinadas condições, assumir forma de
levedura, diminuindo a capacidade de filamentação e dividindo-se por brotamento, conferindo às
colônias aspecto cremoso. Esta fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30°C, de
preferência a 37°C. São fungos de crescimento lento (>15 dias) no primo-isolamento (Histoplasma
capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix
schenckii. A identificação é feita pela comprovação do dimorfismo e pelo aspecto microscópico
característico de cada fase.
FUNGO ANEMÓFILO DE
HIFAS HIALINAS E
CENOCÍTICAS
(ZIGOMICETO)
Rhizopus
FUNGO ANEMÓFILO
DE HIFAS SEPTADAS E
MARRONS
(DEMÁCIO)
Cladosporium

Mod VII - 19
Paracoccidioides brasiliensis in vivo e in vitro (37°C).
Histoplasma capsulatum (a) e Sporothrix schenckii (b) in vitro (25ºC).
a b

Mod VII - 20
5. DESCRIÇÃO DAS PRINCIPAIS MICOSES
As localizações topográficas mais frequentes, relacionadas aos agentes fúngicos, serão apresentadas
de forma resumida.
Agentes etiológicos e localizações topográficas
Derma-
tófitos
H.
capsulatum
P.
brasiliensis
S.
schenckii
Aspergillus
sp
Candida
sp
C.
neoforman
Zigo-
micetos
Trato
respiratório
X X X X X X
Sangue X X X X X X
Osso X X X X X
Medula óssea X
Pele e Unha X X
Pelo X
Cérebro X X X X X X
Líquor X X X
Ouvidos X
Olhos X X
Fígado e Baço X X
Naso-faringe X X X X
Mucosas X X X
Tecido sub-
cutâneo e
gânglios
X X X X X
Trato urinário X X X
Trato
gastrointestinal
X X
DERMATOFITOSES (TINEAS)
São infecções fúngicas limitadas às camadas superfíciais queratinizadas da pele, pelos e unhas,
popularmente, conhecida como “epinge” ou “frieira”, dependendo da localização das lesões que são
extremamente pruriginosas. Em imunodeprimidos podem acometem tecidos subcutâneos.
Agentes etiológicos: Microsporum spp, Trichophyton spp e Epidermophyton floccosum
Ocorrência: universal, acometendo indivíduos de qualquer idade, sexo ou raça.
Fontes de infecção: contágio direto com animais, solo ou indivíduo infectado.
Procedimento laboratorial:
Amostra: escamas de pele, unha e cabelos
Exame da amostra com KOH a 20%, revela hifas regulares, hialinas, septadas, refrigentes,
frequentemente artrosporadas.
Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxílio de uma alça em “L”, de forma a ficar em
perfeito contato com o meio de cultura. As colônias de dermatófitos geralmente, crescem a partir
do 10º dia de incubação à temperatura ambiente e os fungos são identificados pela sua morfologia
macroscópica e microscópica. No Brasil, os dermatófitos mais freqüentes são T. rubrum e M.
canis.

Mod VII - 21
PARACOCCIDIOIDOMICOSE
Doença granulomatosa, crônica que pode acometer pele, mucosas, linfonodos, sistema respiratório,
trato gastrointestinal, adrenais, fígado, baço e SNC. Apresenta grande variabilidade de manifestações
clínicas, desde formas localizadas até formas disseminadas de mau prognóstico, na dependência da
resposta imune do hospedeiro. Existe também a paracoccidioidomicose-infecção, em que o indivíduo
não apresenta sinais e sintomas mas, demonstra por testes intradérmicos positivos, que entrou
anteriormente, em contato com o fungo. Apresenta muitas semelhanças com a tuberculose.
Agente etiológico: Paracoccidioides brasiliensis
Ocorrência: países da América Latina, principalmente Brasil.
Amostra: raspado de lesão e mucosa, secreção do trato respiratório, aspirado de linfonodos,
tecido obtido por biópsia.
Exame direto com KOH a 20% revela a presença da forma leveduriforme constituída de células
grandes (10µm a 60 µm), globosas, com parede celular dupla e refringente e com múltiplos
brotamentos, à semelhança de “roda de leme”, orelhas de “Mickey Mouse” ou argolas
entrelaçadas.
Cultura: fungo dimórfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas desenvolvidas a < 30ºC são
filamentosas, de cor branca, cotonosa, com sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas,
septadas e fragmentadas em esporos multiformes. As colônias incubadas entre 30ºC a 35°C são
de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as formas características
leveduriformes que permitem a identificação do agente.
HISTOPLASMOSE
Doença que acomete primariamente o sistema retículoendotelial. A infecção pode ser localizada ou
generalizada. A histoplasmose primária afeta o sistema respiratório e a histoplasmose progressiva
atinge fígado, baço, linfonodos, mucosas, médula óssea, etc. Em indivíduos hígidos, a infecção tem
bom prognóstico porém atualmente, é importante infecção oportunista associada à Aids, nos quais
ocorre a forma grave e disseminada.
Agente etiológico: Histoplasma capsulatum
Ocorrência: distribuição universal, principalmente em países de clima temperado.
Fontes de infecção: inalação de esporos presentes em aerossóis formados por solos contaminados
com excretas de galinhas e morcêgos.
Amostra: secreção do trato respiratório, sangue, punção de médula óssea, tecido obtido por
biópsia de mucosas e outros.
Exame microscópico direto, sem coloração, requer muita habilidade do técnico. Recomenda-se
coloração por Giemsa, para melhor visualização do agente em de cortes histológicos, onde se
evidencia sob imersão, pequenas leveduras (2-5 µm), intracelulares, dentro de células
mononucleares.
Cultura: fungo dimórfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo que no primo-isolamento é
mais fácil obter a forma filamentosa de cor branca, aspecto cotonoso e sulcado, à temperatura <
30ºC. A confirmação do dimorfismo é feita através de repique em meio rico (BHI) e incubação
entre 30°C e 35º
C. A transformação da forma filamentosa ou miceliana à fase leveduriforme, é
vista com a formação de pequenas (2-5 µm) leveduras em brotamento. A identificação porém, é
feita pela micromorfologia da forma filamentosa, com a observação de esporos grande-
macroconídios- arredondados e com inúmeras espículas ou granulações na parede celular,
chamados hipnósporos ou esporos tuberculados.
ESPOROTRICOSE
Infecção crônica cuja forma clínica mais freqüente em nosso meio é a forma linfangítica nodular
ascendente. Atinge em geral, uma das extremidades sob forma de lesão ulcerada no ponto de
inoculação e acomete a drenagem linfática regional com formação de gomas no trajeto. As formas
disseminadas são raras, em paciente imunocompetentes, mas frequentes em pacientes com Aids.

Mod VII - 22
Agente etiológico: Sporothrix schenckii
Ocorrência: doença de distribuição universal que acomete principalmente, trabalhadores rurais e
floristas.
Amostra: aspirado das lesões gomosas ou tecido subcutâneo.
Exame microscópico da amostra apresenta baixa sensibilidade mas, exame de cortes de tecido
corados, pode revelar leveduras em forma de “charuto” ou apenas formas ovaladas com divisão
em brotamento (blastoconídios).
Cultura: fungo dimórfico que se desenvolve bem em ASD, entre 7 a 12 dias e cuja forma
filamentosa (< 30°C) apresenta hifas hialinas finas e septadas com esporos disposto em arranjo
semelhante à flor "margarida". A forma leveduriforme (> 30°C), não é característica do gênero e
requer meios ricos acrescidos de sangue, cisteina e submetidos a tensão de CO2. O interesse na
obtenção da fase leveduriforme é para a diferenciar o agente da esporotricose, do gênero
Sporothricum, fungo filamentoso não-dimórfico e anemófilo de meio ambiente. A forma
filamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identificação do agente.
ASPERGILOSE
A aspergilose pode se apresentar em indivíduos imunocompetentes, como lesões localizadas em
unhas, pés, canal auditivo, olhos e forma bronco-pulmonar alérgica. Em pacientes
imunocomprometidos, tende à forma disseminada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente,
associada a neutropenia ou à doenças debilitantes.
Agente etiológico: Aspergillus fumigatus (o mais comumente isolado)
Ocorrência: tem distribuição universal. É crescente o número de relatos desta doença como infecção
secundária em pacientes em tratamento prolongado com antibiótico e corticosteróides, doenças
debilitantes como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropênicos, e em lesões de tecidos
subcutâneos, da pele ou da córnea.
Amostra: secreção do trato respiratório, material de biópsia e lavado brônquico.
O exame microscópico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 µm de diâmetro e que se
ramificam em ângulo de até 45º.
Cultura: colônias de Aspergillus fumigatus, a espécie mais associada à doença em humanos,
podem ser facilmente, isoladas em ASD, em até 7 dias (crescimento rápido) com
desenvolvimento, na superfície do meio, de filamentos brancos-hifas - que se tornam verde a
verde-acinzentado, com a formação de esporos.
CRIPTOCOCOSE
A criptococose é uma infecção subaguda ou crônica que envolve primariamente, os pulmões, com
tropismo pelo sistema nervoso central -meninges-, podendo atingir pele e outros tecidos.
Agente etiológico: Cryptococcus neoformans
Ocorrência: no homem, a distribuição da doença é universal.
Amostra: líquor, secreção do trato respiratório ou de lesão de pele, aspirado de formação tumoral
subcutânea e tecidos obtidos por biópsia. O exame laboratorial deverá incluir urina, de preferência
após massagem prostática, para monitorar a presença do agente na próstata que constitui seu
órgão de reserva.
Exame obrigatoriamente, com tinta nanquim para observação de células capsuladas, com
diâmetro variável, entre 5 µm a 20 µm, que sugerem Cryptococcus sp.
Cultura: secreção do trato respiratório, líquor e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer
outro meio, desde que não contenham cicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce
rápido (< 7 dias) entre 25°C e 37°C, sob forma de colônias mucóides de coloração creme à parda.
A identificação de gênero e espécie é feita através de provas bioquímicas, como: teste da urease e
auxanograma.

Mod VII - 23
CANDIDÍASE
Candidiase é uma doença com manifestações clínicas variadas. As infecções aguda e crônica mostram
lesões na boca, faringe, pele, unhas, sistema broncopulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente,
endocardite, meningite, fungemia ou infecções em outras localizações podem ser observadas.
Agentes etiológicos: Candida albicans e outras espécies, que estão freqüentemente, envolvidas em
casos de micoses oportunistas em pacientes debilitados. São os principais agentes etiológicos de
Infecções hospitalares. As espécies de Candida podem ser isoladas de vários locais do corpo humano,
como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vagina, região perianal e trato gastrointestinal.
Ocorrência: - universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para
desenvolvimento da doença, tais como: desnutrição, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia,
quimioterapia e uso de corticosteróides, manipulação endovenosa inadequada, neoplasias e outras
doenças debilitantes.
Amostra: (dependerá da sintomatologia clínica) fragmentos de pele e unhas; raspados da mucosa
oral, vaginal ou anal; secreção do trato respiratório, sangue, liquor, urina e fezes.
Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com solução de KOH 20%. Secreção do
trato respiratório ou material de mucosa podem ser examinados pela coloração de Gram. A
levedura aparece como células arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pequenas
células podem ter diâmetro de 2-6µm, mas formas maiores são também observadas.
Cultura: o crescimento é rápido (24-72h) entre 25°C e 37ºC. O aparecimento ocorre em torno de
3 a 4 dias, com formação de colônias com coloração branca à bege. A habilidade de formar tubo
germinativo e/ou clamidósporos na prova de cultivo em lâmina, permite a identificação de
C.albicans. Para a identificação das outras espécies do gênero Candida deve-se, além do cultivo
em lâmina, procecer-se à assimilação de fontes de carbono e nitrogênio (auxanograma) e
fermentação de fontes de carbono (zimograma) .
ZIGOMICOSE
Infecção geralmente, subaguda de evolução rápida que acomete indivíduos debilitados,
transplantados, diabéticos descompensados ou ainda com Aids. Pode acometer seios paranasais,
tecido subcutâneo, pulmão e vasos sanguíneos, causando embolia no SNC e trombose. A micose, em
indivíduos imunodeficientes é, em geral, fatal se o diagnóstico não for rápido e o tratamento específico
não for prontamente, estabelecido.
Agentes etiológicos: fungos da classe dos Zigomicetos, compreendendo os gêneros Mucor, Rhizopus
e Absidia, entre outros.
Ocorrência: distribuição universal.
Amostra: secreção de sinus nasal ou tecidos obtidos por biópsia de seios paranasais ou lesões
subcutâneas.
Exame com KOH a 20%, revela hifas hialinas e largas (6-50µm), cuja característica principal é a
ausência de septos, que caracterizam as hifas cenocíticas, desse grupo de fungos.
Cultura: fungos de crescimento rápido (< 72 h) a 25ºC em ASD, com hifas áereas abundantes. A
identificação é feita pela microscopia da colônia que evidencia hifas cenocíticas e esporos contidos
dentro de estruturas fechadas denominads esporângios.

Mod VII - 24
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