Tese

Extracção de Conhecimento de Dados obtidos por Simulação da
Desnaturação Proteica
por
Elisabeth Silva Fernandes
Dissertação de Mestrado em Análise de Dados e Sistemas de Apoio à Decisão
Orientador: Professor Alípio Jorge
Co-Orientador: Professor Rui Brito, Universidade de Coimbra
Faculdade de Economia
Universidade de Porto
2007

i
“If there is a hurricane, you always see the signs of it in the sky for days ahead, if you
are at sea. They do not see it ashore because they do not know what to look for, he
thought.”
Ernest Hemingway, In The Old Man and the Sea (1952)

ii
Nota Biográfica
Elisabeth Silva Fernandes é natural de Caracas, Venezuela, onde residiu até aos 6 anos.
Em 1988 iniciou o seu percurso escolar em Amares. Em 2005 concluiu a licenciatura
em Matemática no Ramo Científico da Matemática Aplicada pela Faculdade de
Ciências da Universidade do Porto. No mesmo ano inscreve-se no Mestrado em Análise
de Dados e Sistemas de Apoio à Decisão.

iii
Agradecimentos
No final desta dissertação gostaria de agradecer a todos os que me ajudaram a cumprir
este objectivo pessoal, sem eles não teria sido possível realizar este trabalho.
Ao Professor Rui Brito agradeço a pronta disponibilidade, para esclarecimentos de
dúvidas, e os conselhos científicos muito importantes para a compreensão do problema
em estudo.
À Professora Paula Brito pela atenção e disponibilidade com que me recebeu para
esclarecer dúvidas importantes para a resolução do problema.
Ao Professor Alípio o meu sincero muito obrigada pela dedicação com que orientou
todo o trabalho, a pronta disponibilidade, os conselhos, a paciência e todo o apoio que
foi fundamental para a realização deste trabalho.
Aos meus pais e às minhas irmãs pela compreensão, quando não estive presente em
momentos importantes da família, e pelo apoio nas horas em que desanimei. Ao meu
namorado pela paciência com que me ouviu falar horas a fio da dissertação e pelas
palavras de incentivo.
E finalmente, gostaria de agradecer o facto deste trabalho fazer parte do projecto,
2007/2010 - PTDC/BIA-PRO/72838/2006, “Procura de regras de alto nível em
dobragem e desdobragem de proteínas: das doenças amiloidogénicas à previsão da
estrutura proteica”.

iv
Resumo
Nesta dissertação é apresentado um processo de Extracção de Conhecimento de dados
obtidos a partir de simulações da desnaturação de uma proteína. A proteína em estudo,
designada por Transtirretina (TTR), é causadora da “Doença dos Pezinhos” (cujo nome
científico é polineuropatia amiloidótica familiar (PAF)).
A propriedade molecular em estudo é a variação da distância do aminoácido ao centro
de massa. Esta medida foi registada ao longo de 10 desnaturações de TTR, 5 simulações
de uma variante normal WT-TTR e 5 simulações de uma variante mutada L55P-TTR, e
obtiveram-se 10 quadros de dados com dimensões elevadas. Com a aplicação de
técnicas de Data Mining procurou-se extrair conhecimento útil destes dados.
A análise multidimensional consistiu, inicialmente, em obter três partições dos 127
aminoácidos da TTR, uma primeira partição que só considera as 5 corridas da TTR no
estado normal, uma segunda partição que só considera a informação das 5 corridas da
TTR no estado mutado, e uma terceira partição que considera toda a informação das 10
simulações (excepto do aminoácido nº55). A 1ª e 2ª partições permitiram comparar os
clusters obtidos para cada variante de TTR e foram detectadas diferenças significativas
nos clusters. Com a terceira partição obtiveram-se os aminoácidos representativos de
cada cluster (14 aminoácidos) reduzindo-se assim o número de elementos em análise.
Pretendia-se ainda encontrar eventos, isto é, mudanças de comportamento significativas
dos aminoácidos, e para tal estudou-se isoladamente os aminoácidos representativos.
Foram procurados dois eventos que consistem na comparação dos aminoácidos dois a
dois quanto às suas posições relativamente ao centro de massa. Com os eventos obtidos
foram procuradas regras de associação, que relacionam os eventos e a variante de TTR
com mais propensão para ocorrência de determinado evento. Para complementar o
estudo foi feita uma procura de um terceiro evento por aminoácido (com os 127
aminoácidos) e foram obtidas regras de associação que indicam qual a variante de TTR
com mais probabilidade de ocorrência desse evento.
Através do estudo da variação desta propriedade molecular da proteína ao longo do
processo de desnaturação, obtiveram-se resultados que podem contribuir para uma
melhor compreensão dos mecanismos moleculares da PAF.

v
Índice
Resumo.....................................................................................................iv
Índice......................................................................................................... v
Índice de figuras.....................................................................................vii
Índice de tabelas......................................................................................ix
1 Introdução.......................................................................................... 1
1.1 Objectivos.......................................................................................................1
1.2 Estrutura do trabalho.......................................................................................2
2 As Proteínas ....................................................................................... 3
2.1 Aminoácidos...................................................................................................4
2.2 Estruturas das Proteínas...................................................................................5
2.3 Patologias humanas e Enrolamento proteico....................................................8
2.4 O Processo de enrolamento das Proteínas......................................................10
2.4.1 A Hipótese Termodinâmica......................................................................10
2.4.2 Paradoxo de Levinthal..............................................................................11
2.4.3 Funil de Folding.......................................................................................11
2.5 Dinâmica Molecular - Simulação da desnaturação proteica ...........................13
2.6 Propriedades Moleculares..............................................................................15
2.7 Novas medidas em estudo .............................................................................16
3 Extracção de Conhecimento de Dados (KDD) ............................... 18
3.1 Processo de Extracção de Conhecimento.......................................................19
3.1.1 Data Mining – Tarefas..............................................................................20
3.1.2 Metodologia.............................................................................................21
3.2 Análise de clusters.........................................................................................23
3.2.1 Clustering hierárquico..............................................................................26
3.3 Eventos .........................................................................................................34
3.4 Regras...........................................................................................................36
3.4.1 Regras de Associação...............................................................................36
4 Processo de Extracção de Conhecimento de dados de simulação de
Desnaturação Proteíca ........................................................................... 39
4.1 Descrição dos dados......................................................................................40
4.1.1 Estudo Preliminar.....................................................................................41
4.2 Clustering hierárquico...................................................................................44
4.2.1 Clustering de cada variante da proteína TTR ...........................................45
4.2.2 Partição consenso.....................................................................................50
4.2.3 Escolha dos Aminoácidos que representam cada uma das classes.............56
4.3 Procura de Eventos........................................................................................58
4.3.1 Comparação de aminoácidos dois a dois...................................................58
4.3.2 Procura de alterações significativas por aminoácido. ................................65

vi
4.4 Procura de Regras de Associação ..................................................................68
4.5 Valor das regras obtidas ................................................................................70
4.5.1 Como controlar o risco de falsas descobertas?..........................................70
4.5.2 Como medir a aleatoriedade das regras obtidas?.......................................72
5 Conclusão......................................................................................... 74
Bibliografia............................................................................................. 76
Anexos..................................................................................................... 76
Anexo I – Análise Univariada..................................................................................84
A. Valores máximos e mínimos atingidos em cada corrida............................84
B. Gráficos do aminoácido da posição 55 ao longo das 10 simulações ..........86
Anexo II – Classificação hierárquica - Resultados ...................................................88
A. Clustering da WT-TTR ............................................................................88
A1- Optimização dos Índices de Milligan e Cooper .............................................88
A2- Custering de cada corrida da WT-TTR..........................................................90
A3- Partição consenso da WT-TTR ...................................................................101
B. Clustering da L55P-TTR ........................................................................102
B1 – Optimização dos Índices de Milligan e Cooper..........................................102
B2- Clustering de cada corrida da L55P-TTR ....................................................103
C. Partição consenso - sem a posição 55 .....................................................113
D. Escolha dos aminoácidos Representativos (sem pos. 55) .......................113
Anexo III – Eventos...............................................................................................114
A. Comparação de aminoácidos dois a dois.................................................114
Evento Nº 1 - “troca” de posição entre dois aminoácidos ...................................114
Evento Nº 2 - “ Existem duas trocas de comportamento de dois aminoácidos em
relação ao centro de massa da proteína”.............................................................115
B. Procura de um evento por aminoácido....................................................117
Anexo IV- Regras de Associação...........................................................................120
A. Análise Gráfica da regra nº1...................................................................120
Anexo V- Código em R.........................................................................................122

vii
Índice de figuras
Figura 1 - Estrutura Primária ........................................................................................6
Figura 2 - Estrutura Secundária ....................................................................................6
Figura 3 - Estrutura Terciária........................................................................................7
Figura 4 - Estrutura Quaternária ...................................................................................7
Figura 5 - Estrutura das proteínas .................................................................................7
Figura 6 – Modelo de formação de placas de amilóide..................................................8
Figura 7 – Representação Esquemática da estrutura tridimensional do tetramero WT-
TTR (A) e de uma subunidade da WT-TTR (B).....................................................9
Figura 8 - (a) Funil de Folding (conceito de paisagem de energia): O caminho A indica
um processo rápido de folding, o caminho B indica um processo de folding mais
lento; (b) Superfície de Energia do processo de folding........................................12
Figura 9 - Ilustração das várias superfícies..................................................................15
Figura 10 - Variação da distância dos aminoácidos ao centro de massa.......................16
Figura 11 - Distâncias aos 3 vizinhos mais próximos do átomo X...............................17
Figura 12 – Dados 3-D ...............................................................................................17
Figura 13 – Evolução das técnicas de Análise de Dados .............................................18
Figura 14 – “O caminho para o conhecimento”...........................................................19
Figura 15 - Modelo CRISP-DM..................................................................................22
Figura 16 - Fases de uma Análise de Clusters. ............................................................24
Figura 17 - Critério de Validação Externo ..................................................................29
Figura 18 - Critério de Validação Interno....................................................................30
Figura 19 - Critério de Validação Relativo..................................................................30
Figura 20 - Tipos de Episódios ...................................................................................35
Figura 21-Processo de Extracção de Conhecimento....................................................40
Figura 22 - Representação do sistema usado nas simulações de Dinâmica Molecular..41
Figura 23 – Variação da distância do carbono alpha dos aminoácidos GLY_1 (a) e
VAL_71 (b) ao centro de massa da TTR ao longo de uma simulação de
desnaturação da variante WT-TTR (WTRUN2)...................................................43
Figura 24 - Matriz das classificações para cada tipo de proteína TTR ........................46
Figura 25 - Partição da WT-TTR e da L55P-TTR.......................................................49
Figura 26 - Índices de Milligan e Cooper – G2 e G3 - para a simulação WTRUN2....50
Figura 36 – Partição consenso na sequência de aminoácidos inicial............................55
Figura 37- Aminoácidos Representativos....................................................................57
Figura 38 – Zona de Viragem .....................................................................................58
Figura 39 – LEU_17 aproxima-se do centro de massa ao mesmo tempo que GLU_42 se
afasta do centro de massa.....................................................................................59

viii
Figura 40 – (a) Os 10 eventos mais frequente nas 10 simulações; (b) Os 10 eventos
mais frequentes nas simulações da WT-TTR; (c) Os 10 eventos mais frequentes
nas simulações da variante L55P-TTR. ................................................................60
Figura 41 –Procura do evento 1- ALA_91 troca com GLU_42 ao longo das 5 corridas
da WT-TTR. Na corrida WT2 e na corrida WT6 existe troca, com estabilidade de
300 frames...........................................................................................................61
Figura 42 – Procura do evento 1- ALA_91 troca com GLU_42 ao longo das 5 corridas
da L55P-TTR. Não se verifica a ocorrência do evento. ........................................61
Figura 43 – Teste de Kruskal- Wallis..........................................................................62
Figura 44 – O tempo foi dividido em três secções, procura-se a situação em que a
relação de dois aminoácidos com o centro de massa é trocada duas vezes e
mantêm-se ao longo de n frames de cada secção. .................................................62
Figura 45 –Procura do evento 17 - GLU_42_troca_2x_A_ALA_91 ao longo das 5
corridas da L55P-TTR. Na corrida L55_3 não existem duas trocas de
comportamento....................................................................................................63
Figura 46 – Teste de Kruskal-Wallis...........................................................................64
Figura 47 – Análise gráfica do evento “existência de uma alteração significativa no
comporta-mento do aminoácido PRO_86” que se verifica nas corridas WT2, WT3,
WT4, WT5, WT6, L55_1.....................................................................................66
Figura 48 – Análise gráfica do evento “existência de uma alteração significativa no
comporta-mento do aminoácido PRO_86” nas corrdas onde não se verifica o
evento..................................................................................................................66
Figura 49 – Teste Kruskal-Wallis ...............................................................................67
Figura 50 – Evolução da distância ao centro de massa do aminoácido LEU_55 da
variente WT-TTR. ...............................................................................................86
Figura 51 – Evolução da distância ao centro de massa do aminoácido LEU_55 da
variente WT-TTR. ...............................................................................................87
Figura 52 - Índices de Milligan e Cooper – G2 e G3 para a simulação WTRUN2 ......88
Figura 57 - Clustering de cada corrida da WT-TTR ....................................................90
Figura 58 - Dendrograma WT-TTR..........................................................................101
Figura 59 - Índices de Milligan e Cooper – G2 e G3 para a simulação L55PRUN1..102
Figura 64 - Clustering de cada corrida da L55P-TTR................................................103
Figura 65 - Dendrograma L55P-TTR........................................................................112
Figura 66 - Dendrograma TTR .................................................................................113

ix
Índice de tabelas
Tabela 1 - Principais funções das proteínas....................................................................3
Tabela 2 – Aminoácidos................................................................................................5
Tabela 3 – Tarefas de Data Mining..............................................................................21
Tabela 4 – Algumas Medidas de Interesse ...................................................................38
Tabela 5 - Máximos e mínimos da distância do carbono alpha ao centro de massa.......42
Tabela 6 – Número de clusters para cada simulação da WT-TTR ................................46
Tabela 7 - Número de clusters para cada simulação da L55P-TTR ..............................46
Tabela 8 - Número de clusters óptimas para cada simulação........................................54
Tabela 9 - Partição Consenso.......................................................................................55
Tabela 10- Frequência do evento nº1 para cada variante de TTR .................................63
Tabela 11 – Eventos mais frequentes na proteína L55P-TTR e que não se verificam na
WT-TTR .............................................................................................................64
Tabela 12- Eventos mais frequentes na WT-TTR.........................................................64
Tabela 13 - Comportamento do aminoácido PRO_86 ..................................................65
Tabela 14 – Aminoácidos com comportamentos mais variáveis...................................67
Tabela 15 - WTRUN2- Classificação hierárquica: elementos das 14 classes................90
Tabela 20 – Clustering da WT (Partição I).................................................................101
Tabela 21 – Clustering da L55PRUN1: 15 classes.....................................................104
Tabela 22 - Clustering da L55PRUN2: 17 classes......................................................105
Tabela 26 – Classificação L55 (PartiçãoII) ................................................................112
Tabela 27 – Aminoácidos Representativos.................................................................113
Tabela 28- Eventos “troca” de posição entre dois aminoácidos..................................114
Tabela 29- Eventos “troca” de posição entre dois aminoácidos..................................115
Tabela 30- Aminoácidos onde se verificou o evento “alteração significativa no
comportamento do aminoácido”........................................................................117
Tabela 31 - Frequência dos eventos e janela onde ocorre a alteração mais significativa
(com maior declive)...........................................................................................118

1
1 Introdução
Actualmente são realizados inúmeros esforços no estudo e investigação das causas e
curas para variadíssimas doenças. Nas últimas décadas novas doenças têm sido alvo de
importantes estudos, entre as quais as doenças amilóides. Deste grupo de maleitas
fazem parte doenças bem conhecidas como o Alzheimer e a Paramiloidose (mais
conhecida por Doença dos Pezinhos). (Brito et. al., 2004)
Várias são as tentativas para perceber as origens das doenças amilóides. Sabe-se por
exemplo que estas estão associadas a alterações conformacionais e à agregação das
proteínas associadas a estas doenças. A procura da origem destas doenças tem
despertado o interesse entre os bioquímicos e não só. Actualmente, este é um problema
multidisciplinar no qual são utilizadas ferramentas de diferentes áreas.
Os quadros de dados em estudo nesta área têm dimensões elevadas o que exige aos
estudiosos a procura de novos métodos de análise, métodos estes que permitam obter o
maior conhecimento possível sem perda de informação. O que se verifica é que as
técnicas de Extracção de Conhecimento de Dados permitem atingir este objectivo. Com
o aumento do volume de dados nas diversas áreas de estudo, os métodos de Data
Mining têm sido refinados e adaptados às novas situações.
1.1 Objectivos
Nesta dissertação pretende-se, com a ajuda de técnicas de Extracção de Conhecimento
de Dados, analisar a desnaturação da proteína causadora da Paramiloidose, transtirretina
(TTR). O objectivo é estudar a distância dos aminoácidos ao centro de massa da
proteína ao longo da desnaturação da proteína TTR e encontrar características desta que
possam contribuir, positivamente, para a futura descoberta das causas e soluções desta
doença.

2
1.2 Estrutura do trabalho
Esta dissertação está dividida em duas partes: uma primeira onde são explicados os
fundamentos teóricos necessários para a compreensão do problema em estudo; e uma
segunda parte onde é apresentada toda a análise efectuada aos dados.
Do desenvolvimento teórico fazem parte os capítulos 2 e 3. No capítulo 2 são
introduzidas algumas definições da biologia molecular e são apresentadas as razões de
tão grande interesse nesta área da investigação. No capítulo 3 são abordadas as Técnicas
de extracção de conhecimento de dados utilizadas neste estudo.
No capítulo 4 é apresentado todo o processo de extracção de conhecimento dos dados
resultantes das simulações de desnaturação proteica. Neste capítulo são apresentadas as
várias análises efectuadas aos dados e os resultados obtidos com a aplicação das
técnicas de extracção de conhecimento referidas no capítulo 3.
No capítulo 5 consta a conclusão do trabalho desenvolvido. Em anexo está toda a
informação necessária para complementar o estudo realizado ao longo desta dissertação.

3
2 As Proteínas
A palavra proteína deriva da palavra grega “proteios”, que significa “ primeiro”. Esta
designação tem origem na elevada importância das proteínas na vida, uma vez que as
proteínas têm um elevado peso na constituição dos organismos vivos (Morrison et. al.,
1992).
As proteínas são macromoléculas que desempenham funções biológicas fundamentais
para o equilíbrio dos organismos vivos. Estas funções são múltiplas e as principais
encontram-se resumidas na Tabela 1.
Tabela 1 – Principais funções das proteínas
Função Exemplo
Estrutural
Conferem rigidez e consistência
aos tecidos
Colagénio - proteína de alta
resistência da pele
Enzimática
Catalisam e regulam as reacções
bioquímicas
Lipases - transformam os
lípidos nas suas unidades
Hormonal
Exercem uma função específica
sobre algum órgão ou estrutura
Insulina
Defesa
Defesa contra elementos estranhos
ao organismo
Anticorpos
Transporte
Entre as várias actividades de
transporte podem, por exemplo,
transportar gases para as células
Hemoglobina
Segundo Morrison et. al., (1992) as proteínas dividem-se em duas grandes classes:
proteínas fibrosas, insolúveis em água, e proteínas globulares, solúveis em água ou
em soluções aquosas. Esta classificação está relacionada com a forma das moléculas. As
proteínas fibrosas são estruturas alongadas e filamentosas. As proteínas globulares
apresentam-se dobradas sobre si próprias e formam unidades compactas.
Diversos factores do meio podem levar à destruição/desnaturação da molécula da
proteína, tais como a variação da temperatura, do pH, ou a presença de agentes
químicos. Desta forma a proteína perde a estrutura tridimensional que lhe permitia
desempenhar as suas funções no organismo. Um exemplo simples de desnaturação

4
ocorre com o ovo estrelado, isto é, as proteínas da clara do ovo quando sujeitas a
temperaturas elevadas desnaturam e precipitam. Este é o motivo pelo qual a clara do
ovo adquire a cor branca (Morrison et. al., 1992).
A perda da estrutura tridimensional de uma proteína leva à perda das suas funções, em
alguns casos origina a formação de agregados fibrilares os quais se depositam nos
tecidos originando diversas doenças. Para uma melhor compreensão do problema em
estudo, do ponto de vista bioquímico, nas próximas secções são abordados os seguintes
temas: como é constituída uma proteína, quais as suas estruturas possíveis, quais as
consequências de proteínas mal formadas e quais as características moleculares de
interesse para o seu estudo.
2.1 Aminoácidos
As proteínas são constituídas por aminoácidos. Cada uma destas unidades é um ácido
orgânico COOH− no qual o carbono próximo do grupo (chamado carbono alfa) está
também ligado a um grupo 2NH− . O carbono alfa também se liga a uma cadeia lateral
(R), que é diferente para cada aminoácido, isto é, as características de cada aminoácido
variam consoante a composição química da cadeia lateral. Os vinte aminoácidos
existentes na natureza foram classificados, quanto à sua cadeia lateral, em quatro
grupos: ácidos, básicos, polares e não polares. (Robertis et. al., 1987)
Os aminoácidos diferem no tamanho e em várias propriedades físicas e químicas
nomeadamente a hidrofobicidade, isto é, o quanto os aminoácidos evitam a água (Cejtin
et. al., 2002). O efeito hidrofóbico tem como resultado a associação das partes
hidrofóbicas (apolares) das moléculas quando em meio aquoso sendo esta interacção,
por vezes, conhecida como “ligação hidrofóbica”. Os aminoácidos que tendem a
interagir favoravelmente com a água são classificados como hidrofílicos.

5
Na primeira coluna da Tabela 2 é possível observar as famílias de aminoácidos, sendo
esta classificação importante para na análise dos dados comparar alguns dos resultados
obtidos.
Tabela 2 – Aminoácidos
Família do
Aminoácido Designação Símbolo com 3 letras Símbolo com 1 letra
Lisina LYS L
Arginina ARG RBásico
Histidina HIS H
Ácido Aspártico ASP D
Ácido
Ácido Glutâmico GLU E
Asparagina ASN N
Glutamina GLN Q
Serina SER S
Treonina THR T
Polar (hidrofílicos)
Tirosina TYR Y
Triptofano TRP W
Glicina GLY G
Valina VAL V
Leucina LEU L
Isoleucina ILE I
Prolina PRO P
Fenilalanina PHE F
Metionina MET M
Não Polar
(hidrofóbicos)
Alanina ALA A
Cisteína CYS C
Fonte: Alberts et. al., 1994, pp.56.
2.2 Estruturas das Proteínas
As proteínas são sintetizadas como uma sequência linear de aminoácidos. Na cadeia de
aminoácidos estabelecem-se interacções entre eles o que origina o enrolamento da
proteína. No final, deste processo de enrolamento, a proteína adquire uma estrutura
tridimensional única.
A estrutura tridimensional de uma proteína pode ser descrita em quatro níveis.

6
- Estrutura primária: Consiste na sequência linear aleatória de aminoácidos que
formam uma cadeia polipeptídica. A sequência de aminoácidos tem elevada
importância, pois basta a troca de dois aminoácidos, ou a substituição de um qualquer
para produzir importantes alterações biológicas. Por exemplo, a doença hereditária
denominada por anemia falsiforme tem origem na substituição de um aminoácido na
molécula de hemoglobina.
Figura 1 - Estrutura Primária
- Estrutura secundária: é o resultado do arranjo espacial entre aminoácidos próximos
na cadeia peptídica. Dois dos principais elementos de estrutura secundária são:
- α -hélice: tipo mais comum da estrutura secundária que se caracteriza por uma
estrutura helicoidal estabilizada por ligações de hidrogénio estabelecidas entre os grupos
CO− e NH− de aminoácidos que distam entre si 4 resíduos. (Morrison et. al., 1996).
- folha β : estrutura estendida, constituída por associação lateral de segmentos
peptídicos numa orientação paralela ou anti-paralela, mantida por ligações de
hidrogénio.
Fonte: Alberts B. et. al.,1994.
Figura 2 - Estrutura Secundária
- Estrutura terciária: A estrutura terciária está relacionada com as dobras da cadeia
proteíca sobre ela mesma. Esta estrutura descreve um arranjo espacial global dos
aminoácidos numa proteína, podendo estes estar bastante separados entre si na
sequência linear.

7
Figura 3 - Estrutura Terciária
- Estrutura quaternária: Certas proteínas são constituídas por mais de uma cadeia
proteica, a estrutura quaternária é o resultado da disposição espacial relativa de
subunidades proteicas em proteínas complexas formadas por duas ou mais cadeias
polipeptídicas.
Figura 4 - Estrutura Quaternária
Na Figura 5 encontram-se ilustradas diferentes estruturas que uma proteína pode tomar
proteínas.
Figura 5 - Estrutura das proteínas

8
Cada proteína tem uma estrutura primária e tridimensional única, e como tal, cada
proteína desempenha uma função biológica específica.
A hidrofobicidade, mencionada anteriormente, é referida por vários autores como um
factor importante na organização da estrutura tridimensional de uma proteína.
(Kauzmann W. 1964), (Cejtin, H. 2002), (Pace, C. N. 1996). Segundo Kauzmann W.
(1964), 25 a 40% dos aminoácidos de uma cadeia paptídica são hidrofóbicos. Este tipo
de aminoácidos tem pouca afinidade com a água, logo espera-se que as proteínas
tendam a enrolar-se de tal forma que estes aminoácidos fiquem no interior da molécula.
Nos trabalhos de Shirley et. al., (1992) e Pace et. al., (1996) é referido que o efeito
hidrofóbico tem sido considerado como uma força dominante no enrolamento das
proteínas, no entanto as ligações de hidrogénio são também um factor relevante. As
pontes de hidrogénio desempenham um importante papel no enrolamento das cadeias
polipeptídicas e na formação da estrutura secundária.
2.3 Patologias humanas e Enrolamento proteico
As proteínas são macromoléculas com funções importantíssimas nas células, logo é
fundamental que o enrolamento das proteínas seja um processo bem sucedido, pois caso
contrário, pode originar alterações graves no processo biológico e por vezes
irreversíveis.
Das várias patologias originadas pelo errado enrolamento proteico, neste trabalho irá ser
dada especial atenção às Amiloidoses. As amiloidoses são doenças que têm origem na
acumulação, sob a forma de placas, de quantidades elevadas de proteína
incorrectamente enrolada (proteína insolúvel) nos tecidos. (Quintas et. al., 2001)
Fonte: Quintas et. al., (2001)
Figura 6 – Modelo de formação de placas de amilóide

9
As doenças amilóides são classificadas consoante os sinais clínicos e o tipo de proteína
amilóide envolvida. Neste trabalho a doença amiloidótica em estudo é a Paramiloidose
também designada por Polineuropatia Amiloidótica Familiar tipo I, de Andrade ou tipo
Português, ou mais vulgarmente “Doença dos Pezinhos”. Esta doença foi descrita pela
primeira vez pelo neurologista português Mário Corino de Costa Andrade. (Andrade,
1952)
A Paramiloidose é uma doença neurológica, crónica, progressiva e hereditária de
transmissão autossómica dominante1
que afecta o sistema nervoso. O gene responsável
pela produção da proteína mutada característica desta doença localiza-se no braço longo
do cromossoma 18. A proteína expressa por este gene é a Transtirretina (TTR) que é
uma proteína homotetramérica, isto é, a TTR é constituída por 4 monómeros cada um
dos quais constituídos por 127 aminoácidos. (Luís, 2006)
A estrutura tridimensional da TTR encontra-se representada simplificadamente na
Figura 7.
Fonte: Quintas et. al., 1999.
Figura 7 – Representação Esquemática da estrutura tridimensional do tetramero WT-TTR (A) e
de uma subunidade da WT-TTR (B)
Quando a TTR sofre uma mutação pode obter-se uma variante patogénica da proteína.
A proteína mutada mais comum no tipo português é a TTR Val30Met que resulta da
substituição de uma Valina na posição 30 por uma Metionina. Actualmente são
conhecidas mais de 80 variantes patogénicas da TTR (Luis, 2006).
1
Um indivíduo portador do gene desta doença (seja homozigótico ou heterozigótico) vai manifestá-la.

10
Uma das variantes mais amiloidogénicas é a Leu55Pro (L55P-TTR), esta variante é
resultado da substituição da Leucina na posição 55 por uma Prolina. Neste trabalho, irão
ser estudados dados relacionados com esta variante patogénica e com a proteína não
mutada designada por wild-type (WT-TTR).
2.4 O Processo de enrolamento das Proteínas
Nas últimas 5 a 6 décadas foram apresentadas várias hipóteses para procurar
compreender como é que uma proteína atinge a sua estrutura tridimensional nativa2
.
Neste capítulo é apresentada uma síntese dos trabalhos desenvolvidos.
2.4.1 A Hipótese Termodinâmica
Durante a década de 50, do século XX, Christian Anfinsen procurou dar resposta às
seguintes questões:
- Porque é que a proteína enrola para a estrutura nativa?
- Será ajudada por outras moléculas?
- Porque é que a estrutura nativa é única?
Para responder a estas questões Anfinsen realizou várias experiências com a proteína
RNaseA que deram origem à hipótese termodinâmica (HT). Segundo a HT o
enrolamento das proteínas é um processo espontâneo, acompanhado pela libertação de
energia livre no qual o sistema passa a ocupar um estado de menor energia, portanto
mais estável. Logo o estado mais estável no enrolamento da proteína é o estado nativo
porque corresponde ao estado de energia mais baixo. (Honig, 1999)
Segundo esta hipótese, o estado nativo é único porque é determinado por uma sequência
de aminoácidos única e a procura do estado nativo é aleatória.
Em 1968, Cyrus Levinthal mostrou que a hipótese termodinâmica não resolvia todas as
questões no enrolamento proteico. (Levinthal, 1968)
2
Conformação obtida no final do processo de enrolamento/folding da sequência de aminoácidos.

11
2.4.2 Paradoxo de Levinthal
A hipótese de que o processo de enrolamento/folding ocorre de forma aleatória através
de todas as conformações possíveis até encontrar a conformação correcta foi refutada
em 1968 por Cyrus Levinthal através de um argumento simples. Considere-se uma
proteína com 100 aminoácidos e cada aminoácido com 2 conformações possíveis,
porque dois é o número mínimo de conformações por aminoácido. O que se obteria
seriam 100
2 conformações possíveis, entre as quais está a que corresponde ao estado
nativo. Considere-se ainda que a proteína levaria 1 picosegundo a tentar cada
combinação, que é o tempo de vibração térmica, então o tempo necessário para explorar
todo o espaço conformacional seria 100
2 ps que é aproximadamente 10
109.3 × anos. Mas
o tempo de vida estimado do Universo é de 10
104.1 × anos! Lenvinthal concluiu que a
HT não explica a escala de tempo do processo de folding das proteínas. (Levinthal,
1968) (Honig, 1999)
Para resolver este problema Levinthal, C. (1968) propôs a Hipótese Cinética, na qual
defende que o estado nativo não corresponde ao estado termodinâmico mais estável,
mas sim, ao estado de energia mínima que é o mais acessível do ponto de vista cinético.
Segundo Honig (1999) na década de 90, verificou-se que esta hipótese por si só também
não resolvia a questão e surge uma teoria unificada, que se baseia na natureza estatística
do processo (Wolynes et. al., 1995) (Dill e Chan, 1997).
2.4.3 Funil de Folding
Segundo a actual perspectiva de enrolamento das proteínas, este ocorre numa hiper-
superfície de energia num espaço com algumas centenas ou milhares de graus de
liberdade, em que as zonas de baixa energia (‘vales’) se encontram separadas umas das
outras por barreiras de energia (‘cumes’). Esta superfície é uma função de energia
potencial complexa e multidimensional (Honig, 1999). Se esta superfície for muito
acidentada, a proteína vai encontrar muitas barreiras de energia. Se por outro lado for
muito plana, a proteína vai andar eternamente à procura do seu estado nativo. Logo a
proteína precisa de uma orientação para explorar a paisagem de energia até atingir o seu

12
estado nativo. A topografia da paisagem de energia é em forma de funil, para que a
proteína deslize de uma forma mais fácil até ao estado nativo (Figura 8).
(a) (b)
Figura 8 - (a) Funil de Folding (conceito de paisagem de energia): O caminho A indica um processo
rápido de folding, o caminho B indica um processo de folding mais lento; (b) Superfície de Energia
do processo de folding.
O topo do funil corresponde a todas as conformações desnaturadas possíveis, que são as
conformações menos estáveis, ou seja, de maior energia. À medida que a proteína se
enrola a energia vai diminuindo até atingir o mínimo global na conformação nativa.
(Honig, 1999)
Esta nova perspectiva reconcilia as hipóteses termodinâmica e cinética, porque o estado
nativo pode ser o estado termodinâmico mais estável, e a procura desse estado não é
aleatória uma vez que existem vários caminhos de folding possíveis (Pande et. al.,
1998). Os caminhos de folding implicam “uma boa definição da sequência de eventos”
(Levinthal, 1968) onde “evento” é a transição de uma fase para a outra.
Pande et. al., (1998) introduz o termo “neo-clássico” para definir esta nova perspectiva
porque o processo de folding da proteína pode ser entendido como uma extensão da
teoria clássica que considera o mecanismo estatístico do processo. No entanto, ainda
não está tudo resolvido! Para proteínas pequenas pode garantir-se que se sabe quase
tudo mas para proteínas grandes os mecanismos de folding ainda são desconhecidos.
Desde a segunda metade do século XX vários investigadores se empenham em analisar
o folding das proteínas. Em 1999, Honig, apresenta uma análise da evolução dos
estudos. Segundo este autor verificaram-se importantes avanços na previsão da estrutura
das proteínas, no entanto, para Honig, este progresso depende em parte da combinação

13
entre a compreensão dos princípios fisico-químicos e a análise sofisticada de
informação válida.
Segundo Pande (1998) a natureza dos caminhos de folding pode, em príncipio, ser
completamente compreendida através de simulação directa em computador onde todos
os detalhes são acessíveis. Desta forma, faz todo o sentido, obter simulações da
desnaturação proteíca da TTR, para encontrar características importantes desta proteína
através de técnicas de extracção de conhecimento de dados.
2.5 Dinâmica Molecular - Simulação da desnaturação proteica
Analisar e compreender as relações entre a sequência e a estrutura das proteínas tornou-
se uma tarefa central na “Era pós-genoma”, e terá grande impacto na genética,
bioquímica e na química farmacêutica. A descrição detalhada do processo de folding
ajuda a compreender melhor a origem de diversas doenças (Pande et. al., 2003).
Trabalhos recentes mostram a importância da simulação da desnaturação proteica para
os estudos da Biologia Molecular. No entanto, as simulações de Dinâmica Molecular
apresentam o problema de elevado custo de recursos computacionais.
A Dinâmica Molecular pode ser usada para simular a dinâmica de estruturas
conhecidas, ou para descrever uma estrutura de uma sequência a partir da minimização
da energia potencial.
A Dinâmica Molecular clássica está baseada na segunda lei de Newton ou nas equações
de movimento de Newton. Nestas equações cada átomo é considerado um ponto com
massa im :
2
2
,...,2,1,
dt
rd
rNiFrm i
iiii === &&&& (2.5.1)
onde ( )iiii zyxr ,,= é o vector das coordenadas cartesianas do i-ésimo átomo, ir&& é a
respectiva aceleração, iF é o vector de forças que actuam no i-ésimo átomo, e N é o
número de átomos. (Scheraga et. al., 2007)

14
Para aproximar os mecanismos naturais entre os átomos, tais como colisões e fricções, é
utilizada a dinâmica de Lengevin. Isto é, à equação (2.5.1) são adicionados dois novos
termos: a força potencial que actua sob o átomo i, Uir∇− , e o vector de forças
aleatórias, ( )tRi , resultantes da colisão entre o átomo i e as molecular do solvente.
Desta forma obtém-se a Equação de Langevin (2.5.2).
( ) ( ) NitRrmrrrUF iiiiNri i
,...,2,1,,...,, 21 =+−−∇= &γ (2.5.2)
Em que, ir& é a velocidade do átomo i e iγ é o coeficiente de fricção.
Nas simulações é assumido que o vector ( )tRi tem média zero e as forças aleatórias em
tempos diferentes são não correlacionadas. Considere-se ω a frequência característica
do sistema, quando ωγ 2>> a equação (2.5.2) reduz-se a uma equação diferencial de
primeira ordem:
( ) ( ) NitRrmrrrU iiiiNri
,...,2,1,,...,,0 21 =+−−∇= &γ (2.5.3)
Integrando as equações de movimento obtém-se uma trajectória que descreve as
posições, velocidades e acelerações dos átomos, e como eles variam ao longo do tempo.
Esta trajectória é uma série de sub estados entre o estado inicial e o final, separados por
um pequeno intervalo de tempo (por exemplo, picosegundo)
Os campos de forças mais utilizados, para calcular as forças potencias da equação
(2.5.2), na descrição de sistemas proteicos, são CHARMM (Brooks et. al., 1983),
AMBER (Pearlman et al., 1995), GROMOS (Berendsen et. al., 1995) e CVFF (Ewing
et. al., 1999). A escolha de um destes campos é feita consoante os custos
computacionais implicados na descrição do sistema e a precisão na representação das
forças que actuam no sistema (Scheraga et. al., 2007).
As Simulações de Dinâmica Molecular para obtenção dos dados em estudo neste
trabalho foram realizadas através do programa NAMD (Kalé et. al., 1999), usando a
versão 27 do campo de forças CHARMM.
Para analisar a evolução dos resíduos de aminoácidos ao longo da simulação serão
apresentadas algumas propriedades úteis na análise de trajectórias de Dinâmica
Molecular.

15
2.6 Propriedades Moleculares
As propriedades moleculares definidas nesta secção permitem analisar as trajectórias
obtidas por simulações de Dinâmica Molecular, neste caso, simulações de desnaturação
da TTR. Através dos valores obtidos por algumas destas medidas foram encontrados
resultados que se podem revelar de extrema importância para a compreensão da
Biologia Molecular do Sistema.
Várias são as propriedades moleculares que podem ser calculadas ao longo de uma
simulação, nomeadamente, a Raiz do Desvio Quadrático Médio, o Raio de Giração, a
estrutura secundária, as ligações de hidrogénio, e os contactos nativos. (Brito et. al.,
2004)
Uma das mais conhecidas medidas variação da conformação molecular é a Raiz do
Desvio Quadrático Médio, cuja expressão matemática é a seguinte:
( ) ( )( )
∑=
−
=
n
i
ii
n
txtx
RMSD
1
2
0
(2.4.1)
onde ( )txi é a posição do i-ésimo átomo no instante t e n é o número de átomos.
Uma outra medida usada é a área da superfície molecular acessível ao solvente,
designada por SASA. A superfície de uma molécula determina várias das suas
propriedades físicas e químicas, o que torna a superfície molecular uma característica
interessante e importante.
Adaptado de Wei et. al., 2004
Figura 9 - Ilustração das várias superfícies
A superfície acessível ao solvente (SASA) é determinada usando uma “esfera de prova”
(molécula de água com 1.4
o
A de raio) que “rola” à volta da molécula. A superfície

16
imaginária descrita pelo centro da esfera de prova fornece uma estimativa da superfície
molecular acessível ao solvente (SASA).
A SASA é Global quando é calculada a superfície global da proteína que está exposta
ao solvente. Quando se calcula esta superfície para cada aminoácido temos a SASA por
resíduo.
Noutros trabalhos, no âmbito deste projecto, foram analisadas séries temporais que
descrevem os valores de SASA ao longo da desnaturação da proteína TTR (Azevedo et.
al, 2005) (Ferreira, et. al., 2007). Neste trabalho decidiu-se estudar uma nova medida
para que, sendo o problema abordado de outro ponto de vista, se possam tirar novas
conclusões e complementar todo o trabalho desenvolvido anteriormente.
2.7 Novas medidas em estudo
Neste trabalho a medida em estudo é a Variação da Distância do Carbono Alfa de
cada resíduo ao Centro de Massa da Proteína ao longo da desnaturação.
O que se pretende com esta medida é obter um quadro de dados com 127 séries
temporais, em que cada série descreve a variação da distância do carbonoα de um
aminoácido ao Centro de Massa da Proteína, ao longo da desnaturação da proteína TTR.
Figura 10 - Variação da distância dos aminoácidos ao centro de massa
Para trabalho futuro, foi ainda proposta uma outra medida que consiste em calcular,
para cada aminoácido, os 3 aminoácidos mais próximos da seguinte forma:
- Para todos os átomos, ia , dos aminoácidos, iA , são calculadas as distâncias entre
átomos.
- Para cada aminoácido iA são registados os 3 valores mais baixos, que correspondem
aos três aminoácidos com átomos mais próximos de iA .

17
Por exemplo, como vemos na Figura 11, se para o aminoácido A, que possui o átomo X
as distâncias mais curtas forem d1, d2 e d3, então o aminoácido A está mais próximo
dos aminoácidos A1, A2 e A3.
Figura 11 - Distâncias aos 3 vizinhos mais próximos do átomo X.
As distâncias serão calculadas para cada instante t de uma simulação, logo para cada
aminoácido no instante it vamos obter um vector ( 1A , 2A , 3A , 321 ,, ddd ). Este conjunto
de dados constitui um “cubo” de dados, para cada simulação, da forma:
Figura 12 – Dados 3-D
Devido à elevada dimensão dos dados obtidos por esta medida e à dificuldade em obtê-
los, partiu-se para o estudo da Variação da distância dos aminoácidos ao centro de
massa.
Inicialmente pensou-se que a análise da Variação da Distância dos aminoácidos ao
Centro de Massa poderiam não complementar a informação obtida, em trabalhos
anteriores, com a análise dos valores da SASA. Mas após alguma análise exploratória
concluiu-se que seria interessante analisar a evolução das Distâncias dos Aminoácidos
ao Centro de Massa da Proteína. Para esta análise foi necessário aplicar técnicas de Data
Mining que permitissem extrair conhecimento interessante.

18
3 Extracção de Conhecimento de Dados (KDD)
Segundo Fayyad et. al., (1996) a Extracção de Conhecimento em Bases de Dados
(KDD) é o processo não trivial de identificar padrões válidos, novos, potencialmente
úteis e compreensíveis nos dados. O Data Mining é um passo da KDD que consiste num
tipo particular de algoritmos que, sob aceitáveis limitações de eficiência computacional,
produzem uma enumeração particular de padrões dos dados.
Com o desenvolvimento e a disseminação dos computadores, a informação compilada
cresceu exponencialmente. Os analistas tiveram a oportunidade de organizar e analisar
toda a informação que apareceu rapidamente. Os métodos tradicionais de análise dos
dados, nos vários sectores (industrial, empresarial, financeiro, farmacêutico, etc),
tornaram-se lentos e dispendiosos.
Em 1996, Fayyad et. al., afirmam que “é necessária uma nova geração de técnicas e
ferramentas computacionais para extrair conhecimento útil de grandes bases de dados.”
No trabalho de Liu et. al., (2002) é analisada a utilidade das aplicações de Data Mining.
Segundo este autor as aplicações de KDD trouxeram benefícios significativos aos
negócios, reduzindo custos, aumentando os lucros e elevando a qualidade dos serviços.
No ínicio do século apresenta-se um cenário em que os dados que surgem apresentam
elevadas dimensões, existe uma rápida construção de ferramentas de análise e os
resultados são apresentados de forma perceptivel ao utilizador de tal forma que este
possa tirar o melhor proveito do conhecimento obtido. Na Figura 13 é possível observar
a evolução das técnicas de Extracção de Conhecimento para acompanhar as
necessidades crescentes de tratamento de informação.
Figura 13 – Evolução das técnicas de Análise de Dados

19
Para analisar os dados em estudo nesta dissertação foram aplicadas técnicas de Data
Mining que permitam extrair conhecimento útil, isto é, conhecimento que contribua para
o avanço em direcção ao diagnóstico ou tratamento das doenças relacionadas com o
deficiente enrolamento da TTR.
3.1 Processo de Extracção de Conhecimento
O processo da extracção de conhecimento é um processo interactivo e iterativo que
envolve vários passos. (Fayyad et. al., 1996) Na Figura 14 podem observar-se as etapas
seguidas para a obtenção de conhecimento.
Fonte: Adaptado de Fayyad et. al., 1996(2).
Figura 14 – “O caminho para o conhecimento”.
Segundo Fayyad et. al., (1996) o processo de obtenção de conhecimento começa com a
compreensão do problema em estudo, dos dados. Segue-se uma fase de preparação dos
dados, designada por “Preprocessing”, onde os dados em estudo são tratados, isto é, são
aplicadas operações básicas, por exemplo, extracção de ruído ou outliers. Os dados em
estudo podem ser transformados ou reduzidos para, por exemplo, diminuir o número de
variáveis em consideração (“Transformation”).

20
Na etapa de “Data Mining” decide-se qual a função de data mining a aplicar aos dados.
Define-se o objectivo do modelo obtido pelo algoritmo de data mining e selecciona-se o
método e os parâmetros apropriados para o problema em estudo. Os resultados obtidos
são apresentados com formas de representação próprias para cada tipo de método.
A etapa “Interpretation/Evaluation” inclui interpretar os resultados obtidos, eliminar
informação redundante, traduzir os resultados em linguagem acessível aos leitores e
possivelmente voltar a etapas anteriores (pode, por exemplo, chegar-se à fase de
avaliação e decidir-se voltar a transformar os dados para aplicar um outro método).
3.1.1 Data Mining – Tarefas
Ao longo do Processo de Extracção de Conhecimento de dados uma das etapas que
importa destacar é a etapa de “Data Mining”. Consoante o tipo de dados em estudo e o
objectivo da sua análise, podem definir-se diferentes tarefas de Data Mining, as quais
podem ser classificadas em duas categorias:
- descriptive data mining: consiste em descrever e apresentar caracteristicas gerais dos
dados;
- predictive data mining: consiste na construção de modelos, realização de inferências e/
ou predição do comportamento de novos conjuntos de dados.
As principais tarefas de Data Mining são Classificação, Clustering, Regressão,
Previsão, Associação (Berry, 2000). Na Tabela 3 são apresentadas estas tarefas, e
algumas das técnicas mais populares em Data Mining, que foram definidas em função
do objectivo do processo de extracção de conhecimento.

21
Tarefa Técnicas Definição/Objectivo
Classificação
Árvores de Decisão; Regras de
Classificação
Classificar novos indivíduos/variáveis a
partir da classificação de
indivíduos/variáveis dos dados de treino.
Clustering
Classificação hierárquica; K-
means
Definir grupos nos indivíduos/variáveis
dos dados baseados numa métrica de
semelhança.
Regressão
Regressão Linear; Regressão
Local; Árvores de Regressão;
Redes Neuronais; Algoritmos
Genéticos
Desenvolver um modelo que descreva o
comportamento dos indivíduos/variáveis
em estudo.
Previsão
Regressão Linear; Regressão
Local; Árvores de Regressão;
Redes Neuronais; Algoritmos
Genéticos; Árvores de Decisão
Prever o valor de um novo item a partir do
modelo obtido.
Associação Regras de Associação
Descobrir relações de associação entre um
conjunto de itens.
Tabela 3 – Tarefas de Data Mining
3.1.2 Metodologia
A falta de metodologia na obtenção do conhecimento pode ser um entrave à obtenção
do mesmo, e para resolver este problema, no ano 2000, foi apresentado o modelo
CRISP-DM (Cross-Industry Standard Process for Data Mining), (Shearer, 2000) que
pretende ser um modelo standard, isto é, pretende-se que a partir deste modelo o
utilizador apresente o processo de KDD para o seu problema.
Segundo a metodologia CRISP-DM a implementação de um processo KDD pode ser
desenvolvido ao longo de seis etapas.
Como mostra a Figura 15 as fases do modelo CRISP-DM são as seguintes:

22
- Compreensão da actividade (Business Understanding): esclarecer os objectivos e os
requisitos sob o ponto de vista do negócio; é definido um plano para atingir os
objectivos.
- Compreensão dos dados (Data Understanding): como o nome indica, procura-se
entender os dados, isto é, pretende-se que nesta fase se encontrem problemas nos dados,
subconjuntos interessantes e problemas de qualidade nos dados.
- Preparação dos Dados (Data Preparation): das tarefas de preparação de dados fazem
parte selecção de tabelas, registos e atributos, transformação e limpeza de dados.
- Modelação (Modeling): aplicação de modelos aos dados e refinação de parametros.
Por vezes é necessário adaptar os dados aos modelos que se pretendem aplicar, logo é
frequentemente necessário voltar à fase de preparação dos dados.
- Avaliação (Evaluation): avaliação do modelo aplicado para verificar se este atinge os
objectivos do negócio.
- Acção/ Produção (Deployment): utilização e aplicação do modelo, aqui o analista
pode, por exemplo, recomendar acções mediante os resultados obtidos.
Fonte: (Shearer, 2000)
Figura 15 - Modelo CRISP-DM
Para desenvolver o processo de Extracção de Conhecimento desta dissertação,
procurou-se seguir uma linha de raciocínio tendo em conta o processo descrito por
Fayyad et. al.,(1996) e as fases da metodologia CRISP-DM.

23
3.2 Análise de clusters
Na etapa de Data Mining, do processo KDD desta dissertação, a primeira técnica
utilizada para comprender e encontrar semelhanças entre os aminoácidos da TTR foi a
análise de clusters. A análise de clusters é uma técnica multivariada muito usada para
analisar sequências genéticas e pode ser usada em vários tipos de dados: dados
genéticos, dados temporais, dados geográficos, etc.
Saporta (1990) sustenta que o objectivo dos métodos de classificação é construir uma
partição de um conjunto de objectos dos quais são conhecidas as distâncias dois a dois.
Os clusters obtidos devem ser o mais homogéneos possível e distintos entre si.
Nesta tese pretende-se aplicar a análise de clusters para explorar os dados da proteína
TTR, para reduzir a dimensão dos dados e para gerar hipóteses. Estes objectivos vão de
encontro com os objectivos gerais da análise de clusters definidos no trabalho de
Branco (2004).
Objectivos da análise de clusters:
a. Exploração dos dados: este é o objectivo mais imediato da análise de clusters,
isto é, encontrar uma estrutura/partição nos dados.
b. Redução de dados: Se os grupos forem homogéneos significa que cada grupo
pode ser substituído pelo seu representante.
c. Geração de hipóteses: Podem ser encontrados grupos não esperados, o que
pode eventualmente levar a conjecturas e hipóteses para explicar a classe
encontrada.
d. Predição: Os elementos do mesmo grupo tendem a ter características
semelhantes, este facto torna possível predizer propriedades de um outro
elemento quando comparado com os elementos de um grupo.
Para obter as classes finais são seguidos alguns passos importantes da análise de
clusters, na Figura 16 são apresentadas as fases de uma análise de clusters adaptadas do
trabalho de Gordon (1999)

24
Fonte: Adaptado de Gordon (1999)
Figura 16 - Fases de uma Análise de Clusters.
A análise de clusters tem como ponto de partida um quadro de dados inicial ou um
quadro de proximidades.
(i) O quadro de dados, geralmente, é da forma “indivíduos vs variáveis”.
pj
j
ix
n
iX
.........................1
.
.
....
.
.
.
.
1
















=
Dado o conjunto E de elementos a classificar, o elemento j
ix é o valor que o
indivíduo Ej ∈ assume na variável i .

25
As variáveis podem ser classificadas consoante as suas características. Para as
variáveis podem ser definidos os seguintes tipos:
- Variáveis numéricas ou quantitativas – o conjunto de chegada da aplicação
associada a cada variável aleatória é ℜ , as variáveis aleatórias induzem
preordens.
- Variáveis nominais ou ordinais – a cada variável aleatória está associado um
conjunto de estados, ou modalidades, e a um objecto corresponde um e um só
estado de cada variável.
- Variáveis binárias – é um caso particular das variáveis nominais ou ordinais,
que ocorre quando o número de estados possíveis de uma variável è igual a dois.
(ii) O quadro de proximidades é também designado por função de comparação. Como
refere Sousa, (2000) define-se função de comparação entre elementos de E como
uma aplicação +
ℜ→× 0: EEγ . Esta função pode ser do tipo semelhança, ou de
dissemelhança, entre pares de objectos, ou variáveis, permitindo quantificar o seu
estado de semelhança ou de dissemelhança.
Uma dissemelhança satisfaz as seguintes propriedades: (Gordon, 1999:15)
1. ( ) ( ) Eyxxydyxd ∈∀= ,,,,
2. ( ) Exxxd ∈∀= ,0,
3. ( ) yxyxd =⇒= 0,
Uma semelhança satisfaz as seguintes propriedades: (Saporta, 1990)
1. jiss jiij ,,∀=
2. jisij ,,0 ∀≥
3. ijs é tanto maior quanto maior for a semelhança entre objectos.

26
Em muitos estudos a medida de proximidade mais fácil de calcular é a
semelhança entre objectos. Em geral, pode obter-se uma dissemelhança ijd a
partir da semelhança ijs , estabelecendo uma relação entre a semelhança e a
dissemelhança dos mesmos objectos, por exemplo, ijij skd −= ( k constante
adequada). (Gordon, 1999:15)
Para cada tipo de dados existem várias medidas de proximidade definidas e
propostas por diversos autores nomeadamente Gordon (1999), Hartigan (1975),
Saporta (1990).
3.2.1 Clustering hierárquico
O clustering hierárquico consiste em obter um conjunto de partições de E em classes
cada vez menos finas obtidas a partir de reagrupamentos sucessivos de partes. Um
clustering hierárquico representa-se por um dendrograma ou árvore de classificação.
Existem dois tipos de métodos de clustering hierárquico: os métodos ascendentes ou
aglomerativos e os descendentes ou divisíveis.
O método ascendente, ou aglomerativo, considera, inicialmente, cada indivíduo como
sendo uma classe e vai agrupando-os de acordo com as suas proximidades. O algoritmo
pára quando se obtiver uma única classe.
O método descendente, ou divisível, consiste em aplicar dicotomias sucessivas ao
conjunto E até se obter os elementos todos isolados.
A. Método Aglomerativo
O método aglomerativo é um método muito usado, sendo este o método utilizado nesta
dissertação. Os passos seguidos num algoritmo de Classificação Hierárquica
Ascendente (CHA) como refere Sousa (2000) são:
Passo 0: Considerar os objectos iniciais ( Econjunto ), isto é, definir a partição
mais fina. Definir a função de comparação entre os objectos e entre classes.

27
Passoi : ( ki ,...,1= )
Determinar o par ou pares de classes 1−iP que verificam o critério de agregação,
isto é, obter os pares que verificam o mínimo de ( ){ }1,:, −∈ iPBABAd .
Actualizar a partição, { } { }( ){ } { }BABAPP ii ∪∪∪= − 1 .
Actualizar os valores da matriz de proximidades entre partes de E .
Uma abordagem um pouco diferente do algoritmo é apresentada em Hartigan (1975).
No algoritmo de CHA podem ser introduzidos critérios de paragem, por exemplo, impor
o número de classes da última partição, ou limitar o valor da função de comparação
entre partes.
Ao longo do algoritmo é necessário calcular as distâncias entre as classes que se vão
formando e é neste ponto que os algoritmos aglomerativos diferem. Os métodos mais
usados são: Ligação Simples (Single linkage), Ligação Completa (Complete linkage),
Ligação Média (Average linkage), Método centróide e finalmente o Método de Ward.
B. Critérios de Agregação
Neste trabalho são usados o método da Ligação Média e o método de Ward.
Ligação Média
No método da Ligação Média a distância entre classes é distância média dos pares de
elementos.
BA
n
i
n
j
ij
AB
nn
d
d
A B
∑∑= =
=
1 1
Esta ideia de distância é simples, este método foi um dos primeiros a ser construído, é
um método robusto adequado para isolar classes de forma esférica ou elipsoidal. Este

28
método actua sobre a matriz de proximidades, enquanto que o método seguinte é mais
complexo e actua sobre a matriz de dados.
Método de Ward
No método de Ward (Ward, 1963) as classes são formadas de modo a minimizar a soma
dos quadrados dos erros. Segundo Saporta (1990) este é o critério de agregação mais
indicado para distâncias euclideanas. Os elementos de E são considerados como uma
nuvem de pontos num espaço p
ℜ e o critério de agregação consiste em minimizar a
variação de inércia interclasse. Como os dados em estudo, neste trabalho, são as
distâncias dos aminoácidos ao centro de massa da TTR, faz todo o sentido utilizar este
critério de agregação.
Se se considerarem dois clusters A e B, este método minimiza o incremento da soma
dos quadrados, ou seja, minimiza a perda de informação resultante da aglutinação.
Seja ( )BAC SWSWSW −− o incremento da soma dos quadrados quando A e B são
aglutinados, onde ( )
2
1
∑∑∈ =
−=
Ai
p
j
jAijAA xxSW é a soma dos quadrados dos erros dentro do
cluster A, ( )
2
1
∑∑∈ =
−=
Bi
p
j
jBijBB xxSW é a soma dos quadrados dos erros dentro do cluster
B e ( )
2
1
∑∑∈ =
−=
Ci
p
j
jCijCC xxSW é a soma dos quadrados do cluster BAC ∪= .
Notação: ijAx ( ijBx ) é a observação do objecto i do cluster A( B ) na variável j , jAx e
jBx são as médias da variável j nos clusters A e B . (Branco, 2004)
Em cada iteração o algoritmo calcula todos os pares possíveis de clusters e calcula o
valor do incremento para cada união. O algoritmo selecciona os pares que minimizam o
valor do incremento, isto é, escolhe os pares que minimizam a perda de informação.
Após obtenção das classes a questão que se coloca é se os clusters obtidos nos fornecem
a melhor partição do espaço.

29
Para algoritmos hierárquicos alguns autores recorrem a métodos gráficos. Segundo
Maroco (2003) através do gráfico do índice de difusão versus número de clusters é
possível escolher o número de clusters. Grandes alterações no nível de fusão
correspondem à aglutinação de grupos muito diferentes, logo estas alterações podem
indicar o número ideal de clusters.
De acordo com Pal et. al., (1995), citado por Silva (2005), se o algoritmo de
classificação tiver como único parâmetro de entrada o número de classes, faz-se variar
de 2 até ao valor máximo maxk , podendo considerar-se nk ≤max .
No ponto seguinte são abordadas algumas medidas que permitem a escolha do número
de clusters.
C. Escolha do número de clusters
Segundo Gordon (1999), Halkidi (2001), Jakel (2004) e Kovacs (2003) as medidas de
validação de clusters podem ser agrupadas segundo 3 tipos de critérios. Mediante a
estratégia utilizada para validar a partição obtida temos:
- Critérios Externos: avaliam-se os resultados mediante informação externa fornecida a
priori e não utilizada na análise. Esta análise é baseada na hipótese nula de aleatoriedade
dos dados, para testar esta hipótese são utilizados testes estatísticos. Pode usar-se, por
exemplo, técnicas de Monte Carlo para validar a análise de clusters.
Adaptado de Faceli et. al., (2005)
Figura 17 - Critério de Validação Externo

30
- Critérios Internos: Medem a qualidade do clustering com base nos dados originais
(matriz de proximidades). Neste critério são usadas medidas que se baseiam em
quantidades e características inerentes aos dados e ao esquema de classificação.
(Halkidi, 2001)
Figura 18 - Critério de Validação Interno
- Critérios Relativos: comparam diferentes estruturas, construídas a partir dos mesmos
objectos, para encontrar o melhor clustering a partir de diferentes resultados. Pode ainda
ser usado para comparar diversos algoritmos de agrupamento.
Figura 19 - Critério de Validação Relativo

31
A escolha da melhor partição dos objectos em estudo é uma questão analisada por
diversos autores e têm sido apresentados muitos métodos de escolha do número de
classes. Halkidi et. al., (2000) sustentam que os critérios externos e internos são
baseados em métodos estatísticos mas têm como desvantagem a elevada complexidade
computacional.
A forma como o índice é aplicado é que define se o critério de utilização do índice é
interno ou relativo. A aplicação de um índice com um critério relativo consiste no
cálculo do seu valor para vários clusterings, o “melhor” clustering vai ser o que
optimiza o índice. Para efectuar o clustering dos aminoácidos da TTR é necessário
definir como escolher o número de classes.
Alguns dos índices mais usados com o critério relativo são os seguintes:
− Estatística de Hubert (Jain e Dubes, 1988)
− Família da Índices de Dunn (Halkidi et. al.,, 2001)
− Índice de Davies-Bouldin (Jain e Dubes, 1988)
− Estatística de Silhuettes (Rousseeuw, 1987)
− Índice de Calinski-Harabasz (Calinski e Harabasz, 1974)
− Índice de Krzanowski e Lai (Krzanowski e Lai, 1985)
“Índices de Milligan e Cooper”
Devido ao elevado número de índices e regras de paragem disponíveis, em 1985,
Milligan e Cooper apresentaram um estudo comparativo detalhado de 30 índices. Neste
estudo, através de uma avaliação de Monte Carlo são analisados os índices em data sets
artificiais, foram aplicados quatro algoritmos de agrupamento hierárquico e através do
critério externo encontraram-se os índices que recuperavam a verdadeira estrutura de
grupo. Neste estudo foram escolhidos 5 índices, e desde então, estes índices passaram a
ser designados na literatura por “Índices de Milligan e Cooper”.

32
Segundo Milligan & Cooper (1985) os “melhores” índices são os seguintes:
− Goodman & Kruskal (G2)
Segundo Gordon (1999) este índice é muito utilizado em estudos de
classificação. Após obtenção dos clusters são feitas comparações entre as
dissemelhanças intraclusters e interclusters. A comparação diz-se concordante
(respectivamente discordante) se a dissemelhança dentro dos clusters é mais
muito mais baixa (resp. elevada) que a dissemelhança interclusters. O índice é
então dado por:
( ) ( )
( ) ( )−++
−−+
=
ss
ss
G2
onde ( )+s e ( )−s representam o número de pares concordantes e discordantes
respectivamente, envolvendo os valores das matrizes de dissemelhança e
ultramétricas. O valor máximo desta medida indica o número de clusters a reter.
Em Gordon (1999) este índice tem a designação de “ 2G ” sendo esta a mesma
designação utilizada na biblioteca “fpc” do R (Hennig, 2004), que é utilizado no
capítulo 4.
− Índice-C (G3)
Este índice é dado por:
( )
minmax
min
DD
DcD
−
−
Onde D é a soma das dissemelhanças intra-classes. O valor mínimo desta
medida indica o número de classes óptimo. Este índice é definido em Gordon
(1999) como sendo o índice 3G e esta mesma nomenclatura é usada na
bibliotece “fpc” do R (Hennig, 2004), que é utilizado no capítulo 4.

33
− Índice de Calinski & Harabasz definido por:
( )
( )
( )
( )kn
kW
k
kB
kCH
−
−
=
1
)(
Onde ( ) ( )∑ ∑= ∈
=
k
l Cx
r
r
gxdkW
1
2
, e ( ) ( )∑≠=
=
jiji
ji CCdistkB
,1,
2
, sendo rg o centro de
gravidade da classe r e ( )ji CCdist , é a dissemelhança entre classes. Escolhe-se
o número de classes que maximiza este índice.
− Índice de Duda & Hart:
Segundo Silva (2005) este índice é baseado na razão entre a soma dos quadrados
das dissemelhanças intraclasses das duas classes candidatas a serem reunidas
( 2W ), e a soma dos quadrados das dissemelhanças da classe resultante da reunião
( 1W ). A hipótese de uma classe é rejeitada, ou seja, as duas classes candidatas
não se reúnem, se a razão for menor que um dado parâmetro.
( ) ( )( ) ( )[ ] 2/12
12 //812/21/ mppzpWW ππ −−−<
− Índice de Beale definido por:








−





−
−





 −
≡ 12
2
1 /2
2
21 p
m
m
W
WW
F
Se o valor de F for significativamente elevado rejeita-se a hipótese nula (isto é,
não se divide o cluster). F segue uma distribuição ( )pmpF 2, − . (Gordon, 1999)
Este índice aplica-se a métodos hierárquicos descendentes (Silva, 2005).
Uma descrição detalhada destes Índices pode ser encontrada em Gordon (1999) e Silva
(2005).

34
Segundo Sarle (1993) os critérios escolhidos por Milligan e Cooper são apropriados
apenas para clusters compactos ou levemente alongados, de preferência
aproximadamente multivariados normais.
Em 2005, Bertrand e Bell Mufti definiram um índice de estabilidade estatístico da
partição (designado por BB) e compraram-no com dois índices de Milligan e Cooper,
chegam à conclusão que o índice BB, por eles proposto, para os dois quadros de dados
utilizados no estudo, fornece melhores resultados.
Nesta dissertação foram utilizadas medidas de validação segundo o critério relativo.
Devido à sua elevada credibilidade, para a escolha da “melhor” partição dos
aminoácidos, foram calculados e optimizados os índices G2 e G3 de Milligan e Cooper,
otiveram-se grupos de aminoácidos e foi possível comparar e analisar os clusters
obtidos, como será mostrado no capítulo 4.2 Clustering hierárquico.
3.3 Eventos
Um dos pontos que se pretende desenvolver, neste trabalho, é encontrar características e
acontecimentos interessantes nas séries temporais dos aminoácidos em estudo. Desta
forma, estando em estudo um conjunto de dados volumoso, ao nível de uma propriedade
dos aminoácidos, pretende-se obter características das simulações para obter
conhecimento a outro nível.
No estudo de séries temporais são, por vezes, procuradas alterações do comportamento
das séries e acontecimentos raros dentro do contexto em análise. Nesta dissertação
procura-se, a partir das séries que descrevem o comportamento dos aminoácidos ao
longo da desnaturação, encontrar eventos, isto é, econtrar uma ocorrência ou uma
eventualidade no comportamento do aminoácido que se destaque relativamente ao seu
comportamento geral ao longo da simulação.
Mannila et. al.,(1995,1997) definem uma sequência de eventos como uma sequência de
acções de utilizadores num sistema e definem um episódio como sendo uma colecção
de eventos que ocorrem relativamente próximos uns dos outros numa dada ordem.

35
Estes autores consideraram três tipos de episódios como mostra a figura seguinte:
Figura 20 - Tipos de Episódios
(a) Episódio sequencial: sequência de eventos, em que entre os eventos (A, B, C)
podem ocorrer outros eventos.
(b) Episódio em paralelo: neste caso não existem exigências quanto à ordem dos
três eventos.
(c) Episódio não-sequencial e não paralelo: Neste episódio ocorrem os eventos A
e B que precedem os eventos C e D, não existe ordem entre A e B ( ou C e D),
as quatro ocorrências devem ser próximas.
Um problema básico em analisar sequências de eventos está em encontrar episódios
frequentes, isto é, dada uma classe de episódios e uma sequência de eventos, o problema
consiste em encontrar todos os episódios que acontecem frequentemente numa dada
sequência.
Nos trabalhos de Mannila e Toivonen (1995,1997) é considerado que um evento está
sempre associado ao tempo de ocorrer, logo uma sequência de eventos é um conjunto
do tipo ( ) ( )nn tAtAS ,,...,, 11= em que iA pertence ao conjunto de eventos 0E
(conjunto de eventos tipo pré-definido) e it é o instante em que iA ocorre.
Em 1999, Guralnik e Srivastava, apresentam uma definição mais abrangente de evento.
Este autores definem um evento como sendo uma mudança significativamente
qualitativa de um fenómeno dinâmico que mantém o comportamento alterado tempo
suficiente para ser considerado um acontecimento raro.
No seu trabalho, Guralnik e Srivastava (1999) procuram identificar os pontos da escala
temporal em que a mudança de comportamento ocorre. O chamado problema da
procura de “pontos de mudança” em séries temporais consiste em determinar o número

36
de pontos de troca de comportamento e escolher uma função que encaixe entre os
diferentes pontos de troca. Guralnik e Srivastava (1999) propõem um algoritmo para
encontrar os “pontos de mudança”, isto é, pretendem encontrar eventos interessantes em
séries temporais.
Nesta dissertação pretende-se procurar, nas séries temporais dos aminoácidos,
mudanças de comportamento significativas ao longo de determinado tempo, isto é,
procuram-se eventos frequentes e relevantes no comportamento dos aminoácidos da
proteína TTR.
Depois de encontrar os eventos frequentes podem ser usadas regras para descrever
relações entre os eventos e o tipo de proteína com maior propensão para ocorrência de
um evento. Pretende-se ainda utilizar as relações obtidas para prever o tipo de proteína
onde ocorre determinado evento.
3.4 Regras
Em 1998, Das et. al., apresentam um trabalho onde abordam o problema da procura de
regras em séries temporais. Neste trabalho as séries temporais são discretizadas e o
algoritmo calcula regras do tipo: se ocorre A então B ocorre no tempo T, 





→ BA
T
.
Onde A e B são letras do alfabeto obtidas pela discretização das séries. Um trabalho
análogo foi desenvolvido por Azevedo et. al., (2005) com valores de SASA
discretizados e obtidos por simulação da desnaturação da TTR.
3.4.1 Regras de Associação
As regras de associação foram definidas por Agrawal, R., et al. em 1993, da seguinte
forma:
Seja { }miiI ,...,1= um conjunto de items distintos, e D um conjunto de transacções,
onde cada transacção T é um conjunto de items tal que IT ⊆ . Associado a cada
transacção está um identificador único, designado por TID. Uma Regra de Associação
é uma implicação do tipo YX → , onde IX ⊂ , IY ⊂ , e . ( X é o

37
antecedente e Y é o consequente). Uma regra YX ⇒ tem confiança c se %c das
transacções em D que contêm X também contêm Y , e suporte s se %s das
transacções em D contêm YX ∪ .
O antecedente e o consequente de uma regra podem conter mais do que um item. Para
medir o interesse de uma regra podem ser usadas medidas objectivas e medidas
subjectivas. Segundo Silberschatz et.al., (1996) das medidas objectivas fazem parte, por
exemplo, o Suporte e a Confiança.
O suporte mede a associação entre o antecedente X e o consequente Y , não relaciona
possíveis dependências entre X e Y e é dado por:
( )YXP ∩=suporte
A confiança é a frequência relativa da regra, isto é, é a frequência de ocorrência do
consequente quando se verifica o antecedente.
( ) ( )
( )XP
YXP
XYP
∩
== |confiança
No entanto, o suporte pode não ser interessante porque suportes elevados podem
resultar de padrões triviais. No caso de X e Y serem independentes a confiança da
regra é ( )YP e se ( )YP for superior à confiança mínima obtem-se uma relação entre
acontecimentos independentes! (Veloso, 2003)
Devido a estes problemas com o suporte e com a confiança foram estudas e definidas
outras medidas. Na Tabela 4 são apresentadas três medidas de interesse de uma regra,
por exemplo, o lift que permite avaliar o grau de dependência do consequente em
relação ao antecedente.
Diversas medidas de interesse foram definidas e comparadas nos trabalhos de: Azevedo
(2007), Bayardo (1999), Liu (2000), Lenca (2006), Hahsler (2007) e Omiecinski (2003).

38
Designação Fórmula Referência
Lift
( )
( ) ( )YPXP
YXP ∩
Brin, 1997 (a)
Conviction
( ) ( )
( )YXP
YPXP
∩
Brin, 1997 (b)
Ganascia ( ) 1|*2 −YXP Ganascia, 1991
Tabela 4 – Algumas Medidas de Interesse
Quanto à escolha da medida correcta para cada tipo de dados em Tan (2002) é
apresentado um estudo comparativo de 20 medidas onde são descritas as propriedades
das medidas e é apresentado um algoritmo de escolha de medidas. Neste estudo é ainda
desmonstrado que não existem medidas consistentemente melhores que outras para
todos os casos.
Em 1993 é apresentado o primeiro algoritmo para a procura de Regras de Associação,
designado por AIS (Agrawal et. al., 1993). Desde o aparecimento deste algorimo vários
foram os métodos desenvolvidos para melhorar a procura de regras, como por exemplo:
• Apriori (AprioriTid, AprioriHybrid) (Agrawal, 1994);
• Partition Technique (Savasere, 1995);
• Sampling Technique (Toivinen, 1996 (a));
• Método DIC (Brin et. al., 1997);
Nesta dissertação é utilizado o programa CAREN (Azevedo, 2003) no qual as regras
são geradas tendo em conta o Algoritmo Apriori (Agrawal et. al., 1994). Este algoritmo
está divido em duas partes:
- na primeira parte são extraídos os itens frequentes que têm suporte superior ao suporte
mínimo fixado.
- na segunda são procuradas as regras que tenham um grau de confiança mínimo e tais
que todas as combinações de itens tenham um suporte mínimo fixado à partida.
Uma descrição mais pormenorizada deste algoritmos pode ser vista em Agrawal e
Srikant (1994) e Azevedo (2003). Trabalhos mais recentes tentam desenvolver e aplicar
algoritmos de regras de associação específicos para dados temporais (Mennis and Liu
2003; Sarker et al. 2003; Dafas e Garcez 2005).

39
4 Processo de Extracção de Conhecimento de dados de
simulação de Desnaturação Proteíca
Com o objectivo de encontrar características relevantes do processo de desenrolamento
da proteína TTR foi desenvolvido um processo de extracção de conhecimento, dos
dados obtidos por simulação do desenrolamento da TTR, que é apresentado neste
capítulo.
Numa primeira abordagem, efectuou-se uma análise exploratória dos dados de 10
simulações para visualizar o comportamento geral das séries. Depois partiu-se para uma
análise multivariada. Como em estudo estão duas variantes de TTR (a wild-type e a
variante patogénica L55P) obtiveram-se duas partições dos aminoácidos, uma partição
que tem em conta a informação contida nos dados das simulações da variante WT-TTR
(partição I) e uma segunda partição que tem em conta a informação obtida por
simulação da desnaturação da variante L55P-TTR (partição II).
De seguida, desenvolveu-se um processo mais elaborado para, a partir de todos os dados
obtidos por simulação (da variante WT-TTR e da variante L55P-TTR), escolher
aminoácidos que representem o comportamento da proteína TTR nas 10 simulações.
Isto é, a partir dos dados obtidos por simulação dos 127 aminoácidos obteve-se uma
partição destes que considera toda a informação das 10 simulações (partição consenso –
partição que se obtem a partir de várias partições do mesmo conjunto de objectos). Para
esta partição foi calculado o aminoácido representativo de cada cluster e reduziu-se a
dimensão dos dados em estudo de 127 aminoácidos para 15 aminoácidos
representativos.
Na fase de procura de eventos foram comparados os aminoácidos representativos dois a
dois, procuraram-se dois tipos eventos diferentes ao longo das 10 simulações e
obtiveram-se frequências de ocorrência dos dois eventos. Esta fase foi ainda
complementada com a procura de um terceiro evento nas 10 simulações, a procura deste
evento foi efectuada ao longo das séries dos 127 aminoácidos.
Após obter as ocorrências de cada evento foram procuradas regras de associação que
associam a ocorrência do evento ao tipo de proteína.
Na Figura 21 é apresentado esquematicamente todo o processo de extracção de
conhecimento desenvolvido.

40
Figura 21-Processo de Extracção de Conhecimento
4.1 Descrição dos dados
Os dados em estudo foram obtidos a partir de simulações da desnaturação da proteína
TTR e foram fornecidos por Rui Brito cujo trabalho “Protein Folding and Unfolding
Simulations: A New Challenge for Data Mining” foi o ponto de partida desta tese.
Os valores da Variação da Distância do Carbono Alpha de cada resíduo ao Centro de
Massa da proteína foram obtidos ao longo de simulações de Dinâmica Molecular do
Desdobramento Proteico (MDPUS) da proteína TTR (Brito et. al., 2004).
Os passos seguidos foram os seguintes:
- Obtiveram-se as coordenadas da proteína TTR a partir da sua estrutura cristalográfica
e adicionam-se átomos de hidrogénio. Representaram-se todos os átomos
explicitamente (1917 átomos da proteína).
- As moléculas de água foram controladas e introduzidas através dos programas Dowser
(Zhang, 1996) e Solvate (Grubmiller, 1996). Com o programa Solvate foram também
introduzidos 145 mM de iões de NaCl à volta de proteína.
O sistema final, ilustrado na Figura 22, é constituído por 1917 átomos da proteína,
14418 moléculas de água, 45 iões de sódio e 40 iões de cloro, no total o sistema possui
45256 átomos.

41
Fonte: Brito (2004)
Figura 22 - Representação do sistema usado nas simulações de Dinâmica Molecular
O sistema foi elevado até à temperatura desejada sob a dinâmica de Langevin (dinâmica
que tenta aproximar os mecanismos naturais através de modelos simples).
Os parâmetros usados ao longo das simulações foram de 1 atm de pressão constante
(com a aplicação do método de Langevin (Feller et al., 1995)) e volume constante. Na
simulação de controlo o sistema foi sujeito a uma temperatura de 310 K e nas restantes
simulações a temperatura foi de 500 K (Brito, 2004).
Neste estudo foram simuladas várias desnaturações proteicas da proteína TTR no seu
estado natural WT-TTR e da proteína mutada L55P-TTR. Os valores da Distância do
Carbono Alpha da cada resíduo ao Centro de Massa foram registados e em estudo temos
5 quadros de dados com valores da WT-TTR (WTRUN2,WTRUN3,WTRUN4,
WTRUN5, WTRUN6) e 5 quadros de dados com valores da L55P-TTR. (L55PRUN1,
L55PRUN2, L55PRUN3, L55PRUN4, L55PRUN5).
4.1.1 Estudo Preliminar
Seja n é o número de frames e p o número de aminoácidos em estudo, o quadro de
dados que se obtêm contêm pn× observações e tem n linhas e p colunas. Cada coluna é
considerada como um ponto no espaço de dimensão n munido de uma estrutura
euclideana. As coordenadas de cada ponto são obtidas a partir dos valores dos
p aminoácidos da observação correspondente.

42
pj
j
ix
n
iX
.........................1
.
.
....
.
.
.
.
1
















=
Neste trabalho a matriz de dados tem 127 aminoácidos (43% hidrofóbicos) e 10001
registos, onde j
ix é o valor que o aminoácido j assume na frame i . As estruturas são
guardadas a cada picosegundo, isto é, 10000 em 10 nanosegundos de simulação mais a
estrutura inicial (tempo 0).
Numa primeira análise efectuou-se um estudo unidimensional dos aminoácidos com o
objectivo de analisar o seu comportamento ao longo da simulação da desnaturação da
TTR.
Na Tabela 5 são apresentados os valores máximos e mínimos atingidos nas dez
simulações.
Tabela 5 - Máximos e mínimos da distância do carbono alpha ao centro de massa
Corrida Mínimo(
0
Α ) Aminoácido Tempo(ps) Máximo(
0
Α ) Aminoácido Tempo(ps)
WTRUN 2 0,183 VAL_71 7023 43,284 GLY_1 6370
WTRUN 3 1,487 VAL_71 9891 40,44 GLY_1 1592
WTRUN 4 0,953 LEU_55 8678 40,053 GLY_1 1996
WTRUN 5 0,54 CYS_10 (*) 8468 50,332 GLU_127 6516
WTRUN 6 1,723 VAL_32 8096 40,139 GLY_1 7077
L55PRUN 1 0,139 ALA_37 9559 45,725 GLU_127 7686
L55PRUN 2 0,14 CYS_10 9049 38,376 GLU_127 9544
L55PRUN 3 1,02 VAL_71 9851 40,393 GLU_127 4085
L55PRUN 4 1,256 VAL_32 3687 38,678 GLY_1 6794
L55PRUN 5 1,14 VAL_14 4015 37,794 GLY_1 9824
(*) nesta corrida o aa. VAL_71 atinge o valor 0,547
0
Α
Quando se observa um filme da simulação da desnaturação proteica verifica-se,
visualmente, que as pontas da cadeia polipeptídica parecem perdidas no espaço, isto é,
entram e saem do “novelo” proteico como se fossem elementos esquecidos pela
proteína.

43
Quando se analisam os dados da simulação verifica-se, como era de esperar, que os
valores máximos são atingidos pelos aminoácidos das regiões terminais da cadeia
polipetídica. Na WT-TTR é a GLY_1 (hidrofóbico) que atinge mais vezes o valor
máximo enquanto que na L55P-TTR é a GLU_127. Os valores máximos na WT-TTR
são, nestas simulações, sempre superiores a 40.
Quanto aos aminoácidos que atingem o valor mínimo, na WT-TTR temos a VAL_71
que se destaca como sendo o aminoácido que atinge mais vezes o valor mínimo de
distância ao centro de massa. Na Figura 23 é possível observar o comportamento dos
aminoácidos GLY_1 e VAL_71 ao longo da desnaturação da TTR
(a) (b)
Figura 23 – Variação da distância do carbono alpha dos aminoácidos VAL_71 (a) e GLY_1 (b) ao
centro de massa da TTR ao longo de uma simulação de desnaturação da variante WT-TTR
(WTRUN2).
Ao longo da simulação WTRUN2, a GLY_1 mantêm valores sempre superiores a 10 e
apresenta um comportamento irregular, com frequentes afastamentos e aproximações ao
centro de massa. A Val_71 apresenta sempre valores inferiores a 10
0
Α , o que indica que
este resíduo se mantém sempre muito próximo do centro de massa ao longo da
simulação.
No Anexo I -A estão representados os gráficos com a localização de cada aminoácido
relativamente ao centro de massa nos instantes em que são atingidos os máximos e
mínimos para cada corrida.
Quanto aos instantes, em que são atingidos os valores extremos, importa referir o
seguinte:

44
- na WT-TTR o valor mínimo é sempre atingido depois dos 7000 ps, enquanto que na
L55P-TTR existem duas simulações onde o mínimo é atingido mais cedo (entre os 3500
ps e 4550 ps);
- na L55P-TTR o valor máximo é atingido depois dos 6500 ps, em 4 das 5 corridas,
enquanto que na WT-TTR o máximo é sempre atingido antes dos 7100 ps, sendo que
em duas corridas a GLY_1 afasta-se do centro de massa no início da corrida (1592 ps e
1996 ps).
No Anexo I-B pode ainda observar-se o comportamento do aminoácido da posição 55
nas duas variantes da proteína. Na L55P-TTR, em 3 das 5 corridas a PRO_55, tende a
afastar-se do Centro de Massa (toma valores superiores a 20
0
Α ). Na WT-TTR, em 3 das
5 corridas a LEU_55 mantêm valores no intervalo [0,10]
0
Α .
4.2 Clustering hierárquico
Uma forma de analisar grandes volumes de dados consiste em classificá-los em grupos
que revelem padrões entre si. No trabalho “A Closer Look on Protein Unfolding
Simulations through Hierarquical Clustering” (Ferreira et al., 2007), os autores
apresentam a aplicação do clustering hierárquico a um quadro de dados de variação de
SASA ao longo de diversas simulações de desnaturação da WT-TTR. A medida em
estudo foi a SASA e a construção do dendrograma foi enriquecida com informação dos
aminoácidos (distância entre os aminoácidos na estrutura primária, a distância espacial
entre resíduos ao longo da desnaturação e a propensão para a hidrofobicidade).
Nesta dissertação um dos objectivos da aplicação do clustering hierárquico é identificar
e comparar os clusters obtidos para cada variante de TTR. Pretende-se partir das 5
corridas de cada variante da TTR e obter duas partições dos aminoácidos que tenham
em conta a informação das cinco corridas da WT-TTR, obtendo-se a Partição I, e a
informação das cinco corridas da L55P-TTR, obtendo-se a Partição II. Um outro
objectivo é obter uma partição dos aminoácidos que considere toda a informação obtida
pelas 10 simulações (Partição consenso). A partir das classes obtidas pretende-se ainda
escolher o aminoácido representativo por classe, desta forma pode-se reduzir a
complexidade do problema passando de 127 aminoácidos em estudo para 15 que
representam o comportamento geral da TTR.

45
Cada corrida em estudo é um conjunto de 127 séries temporais e o que se pretende é
agrupar séries temporais, como referem Caiado el al.,(2006) o clustering de séries
temporais tornou-se uma área importante de pesquisa em várias áreas. Nos seus
trabalhos, Caiado et al. estudam, por exemplo, como agrupar séries temporais com e
sem o mesmo comprimento. Em Caiado el al.,(2006) é apresentada um métrica para o
clustering de séries temporais, que permite destingiur séries estacionárias de séries não-
estacionárias. Esta métrica é baseada no periodograma normalizado e é utilizado o
algoritmo de clustering hierárquico.
Nesta dissertação as séries apresentam todas o mesmo comprimento e o objectivo é
agrupar os aminoácidos relativamente à propriedade em estudo, isto é, os aminoácidos
que ficam no mesmo grupo, em princípio têm tendência para, ao longo da desnaturação,
apresentarem valores parecidos de distância ao centro de massa.
Para calcular e obter as classes foram utilizados as seguintes bibliotecas do R statistical
package: class, MASS, fpc. (Hennig, 2004)
4.2.1 Clustering de cada variante da proteína TTR
Nesta secção é apresentado como foram obtidas duas partições dos 127 aminoácidos da
proteína TTR. Considerem-se as cinco simulações da variante WT-TTR, para cada
corrida obteve-se uma partição dos aminoácidos. Para escolher o número de clusters
foram calculados e optimizados os índices G2 e G3 de Milligan e Cooper. Com as 5
partições foi construída uma partição consenso.
Nestas classificações a medida de dissemelhança usada foi a distância Euclideana
porque as variáveis são quantitativas contínuas e todas obtidas da mesma medida.
Quanto ao critério de agregação utilizou-se o método de Ward, indicado por vários
autores como sendo o melhor método para distâncias Euclideanas.
No Anexo II-A1 é apresentada a escolha do número de classes para cada clustering.

46
Tabela 6 – Número de clusters para cada simulação da WT-TTR
Nº de clusters
WTRUN2 14
WTRUN3 13
WTRUN4 14
WTRUN5 14
WTRUN6 13
Considerando as cinco simulações da variante L55P-TTR, para cada corrida obteve-se
uma partição dos aminoácidos. Para escolher o número de clusters foram novamente
calculados e optimizados os índices G2 e G3 de Milligan e Cooper. Com as 5 partições
foi construída uma partição consenso. No Anexo II-B1 é apresentada a escolha do
número de classes para cada clustering.
O número de classes obtido para cada clustering da L55P-TTR é dado na Tabela 7:
Tabela 7 - Número de clusters para cada simulação da L55P-TTR
Nº de clusters
L55PRUN1 15
L55PRUN2 17
L55PRUN3 14
L55PRUN4 13
L55RUNP5 11
A partir destas classificações pretende-se obter uma classificação para cada tipo de
proteína, isto é, pretende-se utilizar as 5 classificações da WT-TTR e obter uma partição
única dos resíduos. Para a L55P-TTR o processo é análogo. Desta forma pretende-se
diminuir o erro de classificação que se obteria se fosse só considerada uma corrida de
cada tipo de proteína. O que se obteve foram duas matrizes com 127 aminoácidos e 5
classificações para cada resíduo, logo estas matrizes têm de dimensões 127 x 5, como se
pode observar na Figura 24.
Figura 24 - Matriz das classificações para cada tipo de proteína TTR

47
A partir desta matriz pretende-se obter uma partição dos aminoácidos que considera as
classificações das cinco simulações. Para tal foi necessário definir uma medida de
dissemelhança e aplicar a classificação hierárquica sob a matriz de classificações.
Medida de dissemelhança
Partindo do princípio que os resíduos que se mantêm a distâncias semelhantes do centro
de massa são aqueles que ficam mais vezes na mesma classe, pretende-se uma medida
de dissemelhança na qual:
- a dissemelhança é nula para aminoácidos que ficam sempre na mesma classe;
- a dissemelhança é máxima para aminoácidos que nunca ficam na mesma
classe.
Como os aminoácidos com comportamentos semelhantes serão aqueles que mais
vezes ficaram na mesma classe, a medida de proximidade, aqui definida, compara os
resíduos dois a dois e conta o número de vezes que estes ficam na mesma classe,
tomando valores entre 0 e 5. A aplicação definida é { }5,4,3,2,1,0: 55
→ℜ×ℜD .
Considerem-se, por exemplo, dois resíduos cujos vectores na matriz das classificações
são os seguintes:
( )1,1,1,2,31 =aa ( )4,2,3,4,32 =aa
Estes aminoácidos só ficaram no mesmo cluster no primeiro clustering (partição da
primeira simulação), neste caso o valor de dissemelhança é 4. Se no primeiro
aminoácido o vector fosse ( )1,1,3,2,3'1 =aa a dissemelhança seria 3.
Verificação das propriedades de uma dissemelhança:
1. 0≥ijd , a dissemelhança entre dois resíduos é sempre maior ou igual a
zero.
2. jidd jiij ,,∀= . No exemplo anterior, a dissemelhança entre 1aa e 2aa é 4,
que é igual à dissemelhança entre 2aa e 1aa que também é 4.

48
3. jiij xxd =⇒= 0 a dissemelhança é nula quando os dois vectores das
classificações forem iguais.
Os valores da matriz de dissemelhanças são frequências absolutas no intervalo [0,5].
Partição consenso
Na introdução do Capítulo 3 já foi apresentada uma breve definição de partição
consenso, nesta secção pretende-se definir com mais exactidão em que consiste uma
partição consenso. Chama-se “Partição consenso” à partição obtida apartir de um
conjunto de diferentes partições obtidas dos mesmo individuos. Dadas 2≥t partições
( )trTr ,...,1= dos mesmos n objectos, a partição consenso sintetiza a informação
contida no conjunto de dados original e fornece um bom sumário das relações entre os
objectos. Os clusterings originais devem ser obtidos por análise dos objectos utilizando
t diferentes clusterings. (Gordon, 1999)
Neste ponto pretende-se obter uma partição dos aminoácidos para cada tipo de proteína
considerando as 5 partições de cada uma, logo o que se pretende é obter uma partição
consenso para WT-TTR e outra para a L55P-TTR. Para obter estas partições foi
aplicado o clustering hierárquico à matriz das classificações e o critério utilizado foi o
da Ligação Média.
O resultado do clustering sobre a matriz das classificações da WT-TTR é uma partição
dos 127 aminoácidos (partição I), que considera a informação das cinco simulações da
WT-TTR (Figura 25). A partição obtida divide os 127 aminoácidos em 11 grupos (ver
Tabela 20, Anexo II-A3).
Analogamente se obtêm uma partição dos 127 aminoácidos (partição II) mas
considerando a informação das cinco simulações da L55P-TTR. Isto é, aplicando a
classificação hieráquica à matriz das classificações da L55P-TTR (Figura 25), com a
medida de semelhança definida anteriormente e o critério de Ligação Média. A partição
obtida divide os 127 aminoácidos em 15 grupos (Tabela 26, Anexo II-B3).

49
Algumas considerações
As partições obtidas não têm o mesmo número de clusters, é interessante verificar o
seguinte:
- existem pequenos subgrupos de aminoácidos que se mantêm sempre juntos em todas
as classificações.
Figura 25 - Partição da WT-TTR e da L55P-TTR
- existem aminoácidos distantes na estrutura primária que ficam no mesmo cluster. Por
exemplo, nas duas partições obtidas, podem encontrar-se a SER_8 e LYS_9 no mesmo
cluster da SER_112, PRO_113 e TYR_114 (Anexo II, Tabela 20 e Tabela 26).
- na partição WT-TTR a LEU_55 ficou numa classe com elementos próximos na
estrutura primária (como GLY_53, GLU_54, HIS_56, GLY_57 e LEU_58) (ver Anexo
II – Classificação hierárquica - Resultados-A3 - Partição consenso da WT-TTR, Tabela
20, cluster 9) enquanto que na partição L55P-TTR a PRO_55 ficou na mesma classe
que aminoácidos distantes na estrutura primária (por exemplo, LYS_15, ALA_109) (ver
Anexo II-B3, Tabela 26, cluster 5)
- a sequência TYR_116, SER_117, THR_118, THR_119, ALA_120 constitui um grupo
isolado na partição da L55P-TTR (Anexo II-B3, Tabela 26) enquanto que na partição da
WT-TTR (Anexo II-A3, Tabela 20) estão no mesmo cluster que VAL_121, VAL_122 e
THR_123.
- Os aminoácidos LEU_12, MET_13, VAL_14, VAL_30, VAL_32, VAL_71, ILE_73,
ILE_107 ficaram nos mesmos cluster nas duas partições.
- a sequência ASN_124, PRO_125, LYS_126 e GLU_127 na partição I constitui um
cluster isolado e na partição II estão associados a HIS_88.

50
Até este ponto o objectivo era encontrar uma partição dos aminoácidos para cada tipo de
proteína e comparar resultados. No ponto seguinte pretende-se obter uma partição
(partição III) dos aminoácidos que considere a informação das 10 corridas, tendo em
conta que na posição 55 o aminoácido é diferente para as duas proteínas.
4.2.2 Partição consenso
Nesta secção pretende-se obter uma partição dos aminoácidos que considere a
informação das 10 simulações. Inicialmente efectuou-se o clustering para cada uma das
corridas sem o aminoácido da posição 55, porque na posição 55 na WT-TTR está uma
leucina e na L55-TTR está uma prolina. A escolha do número de classes segue o mesmo
raciocínio que na secção anterior.
Para a escolha do número de classes, em cada corrida, foram calculados e optimizados
os Índice de Validação das classes, G1 e G2, de Milligan e Cooper. Os índices foram
calculados num intervalo maior que o apresentado, no entanto só foram apresentados no
intervalo 10 a 20 porque um número superior a 20 classes ficam muito afastado do
critério nk ≤max (Pal et al., 1995), e menos que 10 classes não optimizou os índices
em nenhum caso. O critério de agregação usado, para cada cluster hierárquico, foi o
método de Ward e como medida de proximidade usou-se a distância euclideana.
Na Figura 28 o índice G3 apresenta a quebra mais acentuada de 13 para 14 classes, o
que indica que 14 será um bom número de classes, como no índice G2 de 13 para 14
existe uma aumento elevado de G2, a escolha do númer de classes para WTRUN2 foi de
14.
Figura 26 - Índices de Milligan e Cooper – G2 e G3 - para a simulação WTRUN2

51
Na corrida WTRUN3 o índice G2 atinge um valor óptimo para 13 classes e o índice G3
atinge o valor mínimo para 13 classes também, logo o número de classes escolhido para
particionar os 126 aminoácidos nesta corrida é 13.
Na corrida WTRUN4 o índice G2 atinge um máximo local expressivo para 14 classes e
o índice G3 verifica um mínimo local para o mesmo número de classes.
Na corrida WTRUN5 a escolha do número de classes foi 14 por ser um máximo local
do índice G2 e um mínimo local do índice G3.

52
Na corrida WTRUN6 os índices apresentam um comportamento regular. No entanto
para 13 classes verifica-se uma oscilação, sendo 13 o número de classes escolhido.
Na variante WT-TTR verifica-se que o facto de ser retirado o aminoácido da posição 55
não efectou o número de classes escolhidas, sendo o número de classes de cada corrida
igual ao número de classes escolhidas para obter a partição consenso da WT-TTR
(Tabela 6).
Na corrida L55PRUN1 existe um máximo local do índice G2 para 15 classes, no índice
G3 existe um mínimo para o mesmo número de classes, logo foi escolhida uma partição
com 15 classes dos 126 aminoácidos.
Na corrida L55PRUN2 a escolha do número de classes foi 16, uma vez que existe uma
pequena oscilação.

53
Na corrida L55PRUN3 o número de classes escolhido foi 13.

54
Na Tabela 8 é apresentado o número de clusters que optimiza os índices nas diferentes
corridas.
Tabela 8 - Número de clusters óptimas para cada simulação
Nº de clusters Nº de clusters
WTRUN2 14 L55PRUN1 15
Na segunda e na terceira corrida de L55P-TTR o número de clusters é diferente ao
número de clusters obtidos anteriormente (Tabela 7). Desta forma verifica-se que ao
retirar o aminoácido da posição 55 o número de classes varia na variante L55P-TTR,
logo este aminoácido influência o comportamento dos outros aminoácidos.
Para obter a partição final considerou-se uma matriz (126 por 10) com os dez
clusterings obtidos e efectuou-se um novo clustering sob esta matriz. Isto é, pretende-se
a partição que vai obter a informação “consensual” das 10 partições.
O critério de agregação usado foi o da Ligação Média e a medida de proximidade usada
é análoga à dissemelhança definida anteriormente, mas neste caso, toma valores entre 0
e 10 { }( )10,...,1,0: 55
→ℜ×ℜD . A dissemelhança entre dois aminoácidos toma o valor
10 quando estes nunca estiveram no mesmo cluster, e é nula quando aos dois resíduos
lhes foi sempre atribuído o mesmo cluster.

55
A partição consenso (partição III) foi obtida por corte do dendrograma em h=10 (Anexo
II-C, Figura 66) e divide os aminoácidos em 14 classes.
Tabela 9 - Partição Consenso
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
GLY_1 GLU_7 CYS_10 LEU_12 ASP_18 ALA_19 VAL_20 VAL_28 ARG_34 ALA_36 GLU_62 SER_112 TYR_116 ASN_124
PRO_2 SER_8 PRO_11 MET_13 PRO_24 GLY_22 ARG_21 ALA_29 PRO_43 THR_40 GLU_63 PRO_113 SER_117 PRO_125
THR_3 LYS_9 LEU_17 VAL_14 ALA_25 SER_23 ALA_37 ALA_45 PHE_44 VAL_65 PHE_64 TYR_114 THR_118 LYS_126
GLY_4 LYS_35 LYS_48 LYS_15 ILE_26 THR_60 ASP_38 SER_46 ILE_68 GLU_66 TRP_79 SER_115 THR_119 GLU_127
THR_5 TRP_41 THR_49 VAL_16 ASN_27 GLU_61 ASP_39 GLY_47 THR_96 ASN_98 HSD_88 VAL_121 ALA_120
GLY_6 GLU_42 HSD_56 VAL_30 SER_50 SER_77 LYS_80 ASP_74 ALA_97 ASP_99 VAL_122
GLY_67 GLY_57 HSD_31 GLU_51 TYR_78 ALA_81 ALA_91 SER_100 THR_123
LYS_76 LEU_58 VAL_32 SER_52 LEU_82 GLU_92 GLY_101
GLU_89 TYR_105 PHE_33 THR_59 GLY_83 VAL_93 PRO_102
HSD_90 THR_106 GLY_53 THR_75 ILE_84 VAL_94 ARG_103
LEU_110 GLU_54 ARG_104 SER_85 PHE_95
LEU_111 TYR_69 PRO_86
LYS_70 PHE_87
VAL_71
GLU_72
ILE_73
ILE_107
ALA_108
ALA_109
Figura 36 – Partição consenso na sequência de aminoácidos inicial
Nos clusters obtidos verifica-se que:
- os clusters apresentam dimensões variadas, sendo o cluster mais pequeno constituido
pelos 4 últimos aminoácidos da cadeia.

56
- o cluster 4 possui 19 aminoácidos dos quais 13 são hidrofóbicos e de posições
afastadas na cadeia inicial (por exemplo, LEU_12 e ALA_109).
- existem aminoácidos afastados na estrutura primária que estão no mesmo cluster, por
exemplo CYS_10 e LEU_111 (cluster 3).
4.2.3 Escolha dos Aminoácidos que representam cada uma das classes
Quando o número de objectos em estudo é elevado, e após obter a partição dos objectos,
a análise do comportamento geral de cada cluster pode ser simplificada através da
escolha de elementos representativos dos clusters.
O elemento representativo não garante que este tem as mesmas características que os
representados, no entanto, como os aminoácidos estão ligados em cadeia irá haver uma
tendência para que o comportamento de um aminoácido seja acompanhado pelos
aminoácidos vizinhos.
Para a escolha dos aminoácidos representativos poder-se-ia ter subdividido cada cluster
mediante a organização dos aminoácidos na cadeia, e escolher um aminoácido de cada
subgrupo (obter-se-iam mais de 30 representativos). Mas o que se pretende é distiguir as
duas variantes da proteína. Logo o grupo de aminoácidos representativos deve ser
pequeno uma vez que só estão em análise dez corridas.
Neste estudo o elemento representativo de cada cluster é o elemento mais próximo do
centróide (para uma medida de distância adequada aos objectos em estudo).
O conjunto final de aminoácidos, que representa o comportamento geral dos
aminoácidos ao longo das 10 simulações, foi obtido da seguinte forma:
- para cada corrida foram calculados os aminoácidos representativos de cada classe, isto
é, os aminoácidos mais próximos do centróide de cada classe.
- para cada classe o aminoácido escolhido como representativo é o que mais vezes foi
representativo nas 10 corridas. Por exemplo, se na classe 1, ao longo das 10 corridas, o

57
aminoácido Ai foi representativo 7 vezes então este é escolhido como sendo o
aminoácido representativo da classe (ver AnexoII - B, Tabela 27).
Figura 37- Aminoácidos Representativos
Os aminoácidos considerados para a procura dos eventos são os aminoácidos represen-
tativos e o resíduo da posição 55, porque como uma diferença entre os dois tipos de
proteína é o aminoácido da posição 55 pode ser interessante procurar eventos com este
aminoácido. Em seguida são enumerados os aminoácidos representativos da proteína
TTR:
- GLY_4, MET_13, LEU_17, PRO_24, ARG_34, GLU_42, GLU_63, SER_77,
LYS_80, ALA_91, ASN_98, SER_112, SER_117, ASN_124, e POS_55.
Seja qual for o número de índividuos em estudo, a escolha dos elementos
representativos dos clusters permite obter uma análise geral do fenómeno em estudo e
simplifica um pouco o problema. Corre-se o risco de perdermos algum pormenor na
análise, que pode vir a indentificar-se muito relevante para a situação em questão. No
entanto, a filosofia seguida nesta tese foi de que perante um problema complexo
devemos torná-lo mais simples, para que exista um ponto de partida e uma linha de
raciocínio completa e bem definida.

58
4.3 Procura de Eventos
Nesta secção são apresentados os eventos, isto é, foram analisadas as séries dos
aminoácidos e procuraram-se mudanças significativas no comportamento destes ao
longo das simulações. Na procura de eventos foram efectuadas duas abordagens, uma
primeira onde se compara o comportamento dos aminoácidos representativos dois a dois
e se procura um tipo de ocorrência; uma segunda abordagem onde é procurado um
acontecimento pré-definido por aminoácido.
4.3.1 Comparação de aminoácidos dois a dois
Relaccionar o comportamento dos aminoácidos dois a dois, ao longo da desnaturação, é
uma tarefa que permite, por um lado, obter conhecimento do comportamento dos
aminoácidos ao longo da desnaturação e permite, principalmente, verificar e comparar
as ocorrências dos eventos entre as duas variantes de TTR. Para comparar os
aminoácidos dois a dois foram definidos dois eventos:
- Evento Nº 1 - “troca” de posição entre dois aminoácidos.
No evento “troca” de posição entre dois aminoácidos é procurada a ocorrência da
seguinte situação: um aminoácido afasta-se do centro de massa e outro aproxima-se do
centro de massa, em simultâneo e durante um intervalo de tempo. Esta “troca” de
comportamento entre dois aminoácidos considera-se significativa se se mantêm ao
longo de, pelo menos, n frames e nesse caso temos um evento, sendo n um valor dado.
Para encontrar este tipo de eventos são calculadas novas séries temporais, a partir da
diferença das séries dos aminoácidos dois a dois e procuram-se mudanças de sinal com
elevada estabilidade destas novas séries. A estabilidade do sinal foi definida como
sendo um número n de frames, antes e depois da zona de viragem, em que o sinal se
mantém.
Figura 38 – Zona de Viragem

59
Partindo do conjunto dos aminoácidos representativos foi procurado o evento: “o
aminoácido i (que está mais afastado do centro de massa que o aminoácido j ao longo
de 300 frames) ‘troca’ com o aminoácido j e mantêm esse comportamento ao longo de
300 frames”.
A escolha do número n de frames foi feita mediante o número de eventos encontrados,
com um número superior a 300 (foram experimentados os valores 350 e 400) não se
obtinham eventos em algumas corridas, com um n inferior a 300 (foram experimentados
os valores 250 e 200) obtinha-se um número muito elevado de eventos e com elevada
frequência. Pretende-se estudar um acontecimento interessante da proteína que ocorra
mas que não seja muito frequente.
Por exemplo, na Figura 39 é possível observar que o aminoácido GLU_42 está mais
afastado do centro de massa que LEU_17 (ao longo de mais de 300 frames). No
decorrer do tempo da simulação LEU_17 fica mais afastada do centro de massa que
GLU_42, num intervalo de 773 frames, voltado a estar a distâncias semelhantes do
centro de massa.
Figura 39 – LEU_17 aproxima-se do centro de massa ao mesmo tempo que GLU_42 se afasta do
centro de massa, o mesmoa contece entre ALA_91 e GLU_42.
Na procura deste tipo de ocorrências foram encontrados 95 eventos. No Anexo III-A,
Tabela 28, estão descritos os eventos obtidos.
Nos gráficos da Figura 40 são apresentados os 10 eventos mais frequentes (os gráfico
foram obtidos a partir do Excell). Verifica-se que os eventos nº 84 - “SER_117 spw

60
GLU_42” e nº 90 - “SER_117 spw SER_112” acontecem nas 5 corridas da WT-TTR,
enquanto que na proteína L55P-TTR só acontece três vezes.
(a) (b)
(c)
Figura 40 – (a) Os 10 eventos mais frequente nas 10 simulações; (b) Os 10 eventos mais frequentes
nas simulações da WT-TTR; (c) Os 10 eventos mais frequentes nas simulações da variante L55P-
TTR.
Por outro lado verifica-se que o evento 18 - “ASN_124 spw GLU_63” e o evento 33 -
“ASN_98 spw SER_77” acontecem nas cinco corridas da L55P-TTR enquanto que na
WT-TTR só acontece duas vezes.
Pode ainda constatar-se que o evento 41- “GLU_63 spw LYS_80” acontece em 4
corridas da L55-TTR e não acontece na WT-TTR. Os eventos 84 -”SER_117 spw
GLU_42” e 90 - “SER_117 spw SER_112” ocorreram nas mesmas simulações. O
evento 1 só se verifica em duas corridas da WT-TTR (em alguns gráficos da L55P-TTR
existem trocas entre a ALA_91 e a GLU_42 mas não se mantêm ao longo de 300
frames (ver Figura 41 e Figura 42).

61
Figura 41 –Procura do evento 1- ALA_91 troca com GLU_42 ao longo das 5 corridas da WT-TTR.
Na corrida WT2 e na corrida WT6 existe troca, com estabilidade de 300 frames.
Figura 42 – Procura do evento 1- ALA_91 troca com GLU_42 ao longo das 5 corridas da L55P-
TTR. Não se verifica a ocorrência do evento.
O valor médio da frequência deste evento na proteína WT-TTR é de 1,64 sendo inferior
ao valor médio registado na proteína L55P-TTR de 2,48. Neste contexto, foi utilizado o
teste de Kruskall-Wallis em que o objectivo era analisar se as frequências de ocorrência
deste tipo de evento apresentam diferenças significativas consoante o tipo de proteína.
Para a realização deste teste foi utilizada a biblioteca stats do programa R- Statistical
package.

62
Considere-se o ensaio de:
0H : Os dois tipos proteínas têm a mesma distribuição
vs
1H : As proteínas não possuem a mesma média ( ) ( )21 XEXE ≠
Figura 43 – Teste de Kruskal- Wallis
Como p-value obtido foi inferior a 0.01 então Rejeito 0H com 99% de confiança, isto é,
não existe evidência estatística para aceitar a hipótese de que as duas amostras
independentes possuem distribuição idêntica. Logo existe uma diferença significativa na
frequência dos eventos consoante o tipo de proteína.
- Evento Nº 2 - “ Existem duas trocas entre os aminoácidos”
Neste evento são procurados pares de aminoácidos que “trocam” duas vezes ao longo da
simulação. O tempo foi dividido em três secções e em cada secção procura-se uma
janela de n frames onde um aminoácido está mais próximo do centro de massa que o
outro aminoácido alternadamente.
Figura 44 – O tempo foi dividido em três secções, procura-se a situação em que a relação de dois
aminoácidos com o centro de massa é trocada duas vezes e mantêm-se ao longo de n frames de cada
secção.
Por exemplo, se na primeira janela o aminoácido i está mais afastado do centro de
massa que o aminoácido j então temos o evento tipo A que se designa:
AA_i_troca_2x_A_AA_j (isto é, o aminoácido i troca duas vezes com o aminoácido j).
Se na primeira janela o aminoácido j está mais afastado do centro de massa que o
aminoácido i então temos o evento tipo B que se designa: AA_i_troca_2x_B_AA_j.

63
O valor de n escolhido foi 200 porque, para valores superiores a 200 não se
encontravam eventos em algumas corridas (foi experimentado n=300) e para valores
inferiores a 200 registam-se um número elevado de situações, isto é, deixamos de
encontrar o evento, duas trocas de relação com o centro de massa com elevada
estabilidade e obtemos ocorrências de um fenómeno com elevada frequência.
O evento ALA_91_troca_2x_A_PRO_55 (Tabela 10) significa que o aminoácido ALA_91
ao longo de 200 frames, nas primeiras 2000 frames, está mais afastado do centro de
massa que PRO_55; entre as 2000 e as 8000 frames existe um intervalo de 200 frames
em que PRO_55 se mantêm mais afastado do centro de massa que ALA_91; e entre as
8000 e as 10000 volta a ser ALA_91 que está mais afastado do centro de massa que
PRO_55 ao longo de 200 frames. Esta situação só se verifica em duas simulações da
proteína L55P-TTR.
Tabela 10- Frequência do evento nº1 para cada variante de TTR
Nº Evento L55 WT
1 ALA_91_troca_2x_A_PRO_55 2 0
Na Tabela 29 do Anexo III – Eventos é possivel observar as frequências de cada evento
para cada variante de TTR. Verifica-se que o evento que ocorre com mais frequência na
proteína L55P-TTR é o evento 17 - GLU_42_troca_2x_A_ALA_91.
Figura 45 –Procura do evento 17 - GLU_42_troca_2x_A_ALA_91 ao longo das 5 corridas da
L55P-TTR. Na corrida L55_3 não existem duas trocas de comportamento.

64
Os eventos que ocorrem três vezes na L55P-TTR e nenhuma vez na WT-TTR são
apresentados na Tabela 11.
Tabela 11 – Eventos mais frequentes na proteína L55P-TTR e que não se verificam na WT-TTR
Nº Evento Freq_L55
6 ALA_91_troca_2x_B_SER_117 3
50 LEU_17_troca_2x_A_POS_55 3
55 LEU_17_troca_2x_B_PRO_24 3
58 LEU_17_troca_2x_B_SER_77 3
81 SER_77_troca_2x_A_ALA_91 3
17 GLU_42_troca_2x_A_ALA_91 4
As frequências de ocorrência destes eventos na proteína WT-TTR são baixas, sendo o
seu valor máximo de três. Os eventos seguintes só ocorrem três vezes nesta proteína.
Tabela 12- Eventos mais frequentes na WT-TTR.
Nº Evento Freq_L55 Freq_WT
22 GLU_42_troca_2x_B_ASN_124 0 3
74 PRO_24_troca_2x_B_SER_112 1 3
O valor médio da frequência do evento Nº2 na proteína WT-TTR é de 0,72 sendo, mais
uma vez, inferior ao valor médio registado na proteína L55P-TTR que é 1.44. Com o
teste estatístico de Kruskal- Wallis pretende-se verificar se as frequências médias são
significativamente diferentes entre a proteína WT-TTR e a variante L55P-TTR.
Considere-se o ensaio de:
0H : Os dois tipos proteínas têm a mesma distribuição
vs
1H : As proteínas não possuem a mesma média ( ) ( )21 XEXE ≠
Figura 46 – Teste de Kruskal-Wallis
Como p-value obtido é superior a 0.05, não rejeito 0H com 95% de confiança. Neste
evento o teste de comparação de médias não indica que existam diferenças entre as
médias de ocorrência das duas variantes de TTR.

65
4.3.2 Procura de alterações significativas por aminoácido.
O Evento procurado neste ponto foi a existência de uma alteração significativa no
comportamento de cada aminoácido e foram analisados os 127 aminoácidos nas dez
simulações. Neste caso não foram utilizados só os aminoácidos representativos porque
este procedimento tem um baixo custo computacional.
O que se pretende é encontrar mudanças de comportamento dos aminoácidos que
possam ser interessantes para análises futuras. Considerou-se que uma mudança de
comportamento interessante seria a alteração rápida da distância do aminoácido ao
centro de massa da proteína em poucas frames. Isto é, para uma janela de tamanho n
(relativamente pequena) o módulo do declive da recta que une o valor máximo de
distância ao centro de massa ao valor mínimo, é elevado.
Neste contexto encontraram-se eventos em 66 aminoácidos, para uma janela de 200
frames, que estão apresentados Tabela 30 – Anexo III-B. As frequências registadas são
baixas, no entanto, no aminoácido PRO_86 verificam-se alterações significativas de
comportamento nas 5 simulações da WT-TTR e em uma simulação da L55P-TTR (ver
Figura 47 e Figura 48).
Tabela 13 - Comportamento do aminoácido PRO_86
Aminoácido Frequência Simulação
Início-janela
(ps)
Fim-janela
(ps)
PRO_86 55 WTRUN2 7536 7736
PRO_86 53 WTRUN3 305 505
PRO_86 16 WTRUN4 626 826
PRO_86 88 WTRUN6 2544 2744
PRO_86 20 WTRUN5 4197 4397
PRO_86 27 L55PRUN1 8328 8528
Importa ainda salientar que, no aminoácido GLY_83 foram registadas 4 alterações
significativas em 4 simulações de L55P-TTR e no aminoácido GLY_57 foram
registadas 4 alterações significativas do comportamento em 3 simulações da proteína
L55P-TTR e numa simulação de WT-TTR.

66
Figura 47 – Análise gráfica do evento “existência de uma alteração significativa no comporta-mento
do aminoácido PRO_86” que se verifica nas corridas WT2, WT3, WT4, WT5, WT6, L55_1.
Figura 48 – Análise gráfica do aminoácido PRO_86 nas corrdas onde não se verifica o evento.
Os aminoácidos que apresentam mais alterações bruscas de comportamento, ou seja,
onde mais vezes o declive da recta é superior a 1, são apresentados na Tabela 14, na

67
qual a coluna Frequência apresenta o número de vezes que, numa Simulação, o
aminoácido se aproxima ou afasta do centro de massa rapidamente.
Na Tabela 31- Anexo III-B são apresentados todos os aminoácidos onde se registaram
alterações de comportamento, frequências dessas alterações, as simulações e o intervalo
de tempo onde se verificam os valores elevados de declive.
Tabela 14 – Aminoácidos com comportamentos mais variáveis
Aminoácido Frequência Simulação
PRO_24 211 L55PRUN4
ALA_108 142 WTRUN3
GLY_47 135 WTRUN2
GLU_51 134 L55PRUN5
ALA_120 131 WTRUN2
VAL_30 130 WTRUN2
ASN_27 128 WTRUN3
GLY_57 124 L55PRUN2
SER_52 112 WTRUN5
THR_3 104 L55PRUN4
Para analisar se existe diferença significativa entre as frequências médias de ocorrência
deste tipo de evento consoante o tipo de proteína foi efectuado o teste de Kruskal-
Wallis. Considerem-se as seguintes hipóteses:
0H : As duas proteínas têm a mesma distribuição ou
vs
1H : Pelo menos uma das distibuições dá valores mais elevados do que os da outra
Figura 49 – Teste Kruskal-Wallis
Como o p-value é inferior a 0.01 então Rejeito H0 com 99% de confiança, isto é, não
existe evidência estatística para aceitar a hipótese de que as duas amostras
independentes possuem distribuição idêntica. Logo existe uma diferença significativa na
frequência dos eventos consoante o tipo de proteína.

68
Uma abordagem, que poderia ser desenvolvida futuramente, seria considerar dois tipos
de alterações significativas, isto é, considerar “aproximação rápida ao centro de massa”
e “afastamento rápido do centro de massa”. E numa análise isolada, dos aminoácidos
com compotamento mais variável, registar os tempos de ocorrência desses
comportamentos e estudar relações possíveis entre as ocorrências vs tempo e o tipo de
proteína.
Podem ser definidos outros eventos que se considerem interessantes para analisar a
desnaturação da TTR. Neste trabalho foram procurados eventos simples para ser
cumprida e definida uma linha de raciocínio. No futuro, pode, eventualmente, partir-se
para abordagens mais complexas, por exemplo, incluir o factor tempo nos eventos.
Com os eventos obtidos podem usar-se regras para descrever relações entre os eventos e
o tipo de proteína. Pode obter-se relações do tipo: “se o aminoácido i “troca” com o
aminoácido j, e o aminoácido k “troca” com o aminoácido l, então a proteína em
estudo é a WT-TTR com Y% de probabilidade”.
Podem ainda ser estudadas relações entre eventos e pares de aminoácidos. Por exemplo,
“se o aminoácido i está a uma distância do centro de massa entre 10 e 20, então o
aminoácido j está a uma distância do centro de massa entre 40 e 45, com X% de
probabilidade” (um estudo semelhante foi desenvolvido na análise dos valores de
SASA em Azevedo et. al., (2005)).
Os eventos registados neste capítulo permitiram a procura de regras de associação que
distingam as duas variantes de TTR. No capítulo seguinte são apresentadas as regras de
associação encontradas que relacionam eventos e variante de TTR.
4.4 Procura de Regras de Associação
Nesta secção são apresentadas as regras de associação obtidas, que relacionam evento e
variante de TTR. Para obter as regras foi utilizado o programa CAREN e procuraram-se
regras com valores de suporte e confiança elevados. O programa foi aplicado para três
tabelas, cada uma das quais continha na primeira coluna o nome dos eventos e na
segunda coluna o nome de cada corrida. A cada tabela foram ainda acrescentadas 10

69
linhas com nome da variante (na primeira coluna - WT ou L55P) e nome da corrida (na
segunda coluna – WT2,…,WT6, L55P1,…, L55P5).
• Evento Nº 1 - “Verifica-se uma troca de posição entre dois aminoácidos”
Para este tipo de evento obteve-se a regra:
Regra nº1: ASN_98_spw_SER_77 & ASN_124_spw_GLU_63 L55P
Suporte=0.5; Confiança=1; Lift=2; Conviction= ∞
A regra obtida indica que, nas simulações em estudo, a probabilidade de estarmos
perante a variante L55P-TTR sabendo que:
- o aminoácido ASN_98 está afastado do centro de massa enquanto SER_77 está
próximo (ao longo de 300 frames) trocando depois de posição mantendo o
comportamento ao longo de 300 frames;
- e do aminoácido ASN_124 estar mais afastado centro de massa que GLU_63 (ao
longo de 300 frames) trocando depois de posição, relativamente ao centro de massa,
ao longo de 300 frames;
é de 100%.
Pode ainda concluir-se que o antecedente e o consequente são positivamente
dependentes porque o valor da medida de interesse lift é superior a 1. O valor de
conviction também é superior a 1, logo segundo esta medida, a regra obtida é
interessante. Com os gráficos do Anexo IV-A é possivel verificar a ocorrência dos
eventos da regra nº1.
• Evento Nº 2 - “ Verificam-se duas trocas entre os aminoácidos”
Para este tipo de evento a única regra encontrada foi:
Regra nº2: GLU_42_troca_2x_A_ALA_91 L55
Suporte=0.4; Confiança=1; Lift=2; Conviction= ∞
A regra obtida indica que, a probabilidade de estarmos perante a proteína L55P-
TTR sabendo que o aminoácido GLU_42 está mais afastado do centro de massa
enquanto ALA_91 está mais próximo, ao longo de 200 frames da primeira secção e
nas secções seguintes alternam o comportamento, é de 100%. O valor de lift e de

70
conviction é mais uma vez superior a 1, o que indica que a regra obtida é
interessante.
• Evento por aminoácido - existência de uma alteração significativa no
comportamento do aminoácido
Para este evento as duas regras obtidas indicam duas situações já mencionadas no
capítulo anterior, não acrescentam informação nva. No entanto o lift destas regras é
superior a 1, o que nos indica que quanto mais o aminoácido GLY_83 apresentar um
comportamento irregular maior é a propensão de este pertencer à variante L55P-
TTR. Por outro lado o valor de conviction é superior a um, o que indica que estas
regras são interessantes.
Regra nº3: GLY_83 L55
Sup = 0.4 Conf = 1; Lift=2; Conviction= ∞
Regra nº4: PRO_86 WT
Sup = 0.5 Conf = 0.83; Lift=1.66; Conviction=30
Nesta fase do trabalho surgiram algumas questões. Qual o valor destas regras? Será que
o número de simulações em análise é suficiente para obtermos conclusões seguras do
comportamento da TTR? Qual o risco de falsas descobertas? Na secção seguinte são
abordadas e discutidas estas questões.
4.5 Valor das regras obtidas
Nesta secção pretende-se analisar o valor das regras obtidas e o risco de falsas
descobertas. Uma vez que só estão em estudo 10 simulações, será que as regras obtidas
acontecem por acaso? Poderia ter-se obtido o mesmo resultado por acaso?
4.5.1 Como controlar o risco de falsas descobertas?
Segundo Webb (2006) as regras de associação só são interessantes se representam
correlações não-triviais entre todos os items. No seu trabalho “Discovering Significant
rules” são analisadas técnicas, para controlar o risco de falsas descobertas na obtenção
de regras de associação. Estas técnicas baseiam-se no uso de testes estatísticos para
seleccionar só as regras interessantes.

71
Uma das técnicas apresentadas por Webb (2006), designada por “Within-search
approach”, consiste em aplicar testes estatísticos às regras e ajustando o nível de
singnificância, através do “ajustamento de Bonferroni”, é definido o tamanho do espaço
de procura de onde as regras devem ser extraídas. Através deste ajustamento é possível
controlar, com mais rigor, o risco de falsas descobertas. Segundo Webb (2006) este
método é útil quando o espaço de procura é pequeno ou o número de regras candidatas é
grande.
Trabalhos recentes mostram o elevado interesse dos analistas no estudo de métodos para
controlar o risco de falsas descobertas. Podem ser encontradas diferentes abordagens
nos trabalhos de Benjamini (2001), Bruzzese (2003) e Webb (2006).
Um método útil para validar regras é o “método holdout”. Este método consiste em
partir os dados em dois conjuntos, um conjunto de exploração para obter as regras
candidatas, e um conjunto de teste que é utilizado para escolher as regras finais
(aplicando, por exemplo, uma avaliação estatística (Webb, 2006)). Nesta tese colocou-
se a hipótese de se aplicar o método holdout, mas não foi utilizado porque só estão em
estudo 10 simulações da desnaturação da TTR. Com mais simulações o poder estatístico
aumentaría e o erro diminuiría. Mas aqui surge uma outra questão quantas simulações
são necessárias?
Os baixos orçamentos obrigam a que sejam efectuadas poucas simulações dos
fenómenos em estudo, o que aumenta o risco de falsas descobertas. Para tentar resolver
esta questão alguns autores têm desenvolvido modelos para calcular o número de
corridas necessárias para obter resultados reais.
No trabalho de Wei et. al., (2004) são analisados factores que influenciam na escolha
da dimensão do exemplo, tais como, a variabilidade da população (que deve ser fixada
consoante o estudo), o valor de significância (para aplicar os testes-t) ou o rácio de
falsos positivos/negativos. O objectivo de Wei et. al. era fornecer uma indicação de
como calcular um número aproximado de corridas. Segundo estes autores a
variabilidade de dados Humanos é geralmente elevada, logo são sempre necessárias
muitas corridas para um estudo.

72
No trabalho de Warnes (2006) é proposto um modelo de estimação do tamanho do
exemplo, o qual foi implementado no package ssize do R. Todas estas abordagens
são muito recentes e susceptiveis de muitas dúvidas uma vez que os parâmetros a
optimizar em cada modelo dependem do contexto do problema em estudo.
4.5.2 Como medir a aleatoriedade das regras obtidas?
Segundo Witten I. (1999) a “aleatoriedade” de uma regra, ou seja, a probabilidade de
uma regra aleatória dar o mesmo resultado (ou melhor) do que uma dada regra (R) é
dada por:
( ) ( )
( ) ( )
∑∑ =
−
−
=


















==
Pt
pi
T
t
PT
it
P
i
Pt
pi
PRm
,min,min
casostemacertosi
Valores baixos de ( )Rm indicam boas regras porque se pretende que a probabilidade de
uma regra aleatória, com o mesmo suporte da regra R, dar o mesmo resultado, ou
melhor, que a regra R seja baixa.
Em que:
P - nº total de casos da classe nos dados.
T - nº total de casos nos dados.
p - número de casos da classe que a regra selecciona.
t - nº total de casos que a regra selecciona.
Para analisar esta medida de aleatoriedade foi efectuado o seu cálculo para as duas
últimas regras apresentadas no capítulo anterior.
Cálculo da aleatoriedade das seguintes regras:
R3: GLY_83 L55
Sup = 0.40000 Conf = 1.00000

73
( ) ( )
( ) ( )
02381.0casostemacertosi
5,4min
4
10
5
5
5
5
5,4min
4
3 =


















== ∑∑ =
−
= i
ii
i
PRm
R4: PRO_86 WT
Sup = 0.50000 Conf = 0.83333
( ) ( )
( ) ( )
019841.0casostemacertosi
5,5min
5
10
5
5
5
5
5,5min
5
4 =


















== ∑∑ =
−
= i
ii
i
PRm
A probabilidade de se obterem aleatoriamente regras tão boas ou melhores que as
obtidas é relativamente baixa. Significa que se gerarmos aleatoriamente eventos 100
vezes, cerca de uma dessas vezes resultará numa regra semelhante. O valor de 2%,
embora baixo, não deixa de apresentar alguns riscos de obtermos uma regras tão boa ou
melhor que a obtida ao acaso.

74
5 Conclusão
Nesta dissertação foi desenvolvido um processo de extracção de conhecimento dos
dados obtidos por simulação de desnaturações da proteína TTR para atingir um
objectivo, obter mais conhecimento sobre os mecanismos de desnaturação da TTR.
Inicialmente foi efectuada uma análise unidimensional aos dados para a compreensão
dos dados em estudo, foram encontradas diferenças interessantes dos valores mínimos e
máximos da distância ao centro de massa consoante a variante de TTR. Depois partiu-se
para uma análise multidimensional onde são aplicadas técnicas de Data Mining
fundamentais para a extracção de conhecimento dos dados.
Uma vez que estavam em análise duas variantes de TTR, obtiveram-se duas partições
dos 127 aminoácidos da proteína. Uma primeira partição que considera a informação
das 5 simulações da variante WT-TTR, e uma segunda partição que considera a
informação das 5 simulações da variante L55P-TTR. Verificou-se que as duas partições
obtidas são muito diferentes, no entanto existem aminoácidos que ficam sempre no
mesmo cluster, o que pode ser interessante para análise do ponto de vista bioquímico.
Com o objectivo de escolher os aminoácidos que representam o comportamento geral da
proteína, obteve-se uma partição dos 126 aminoácidos (sem o aminoácido da posição
55), que considera toda a informação das 10 simulações, isto é, obteve-se uma partição
consenso. A obtenção desta partição consenso permitiu a aplicação de um método muito
interessante e útil, porque partindo de n quadros de dados (ou seja, um cubo de
informação) é possível resumir a informação toda numa partição dos índividuos.
Com esta partição seleccionaram-se os elementos representativos de cada classe e o
aminoácido da posição 55, isto é, passou-se de um conjunto de 127 aminoácidos para
um conjunto mais pequeno, de 15 aminoácidos. A partir dos 15 aminoácidos
representativos foram procurados dois eventos que comparam os aminoácidos dois a
dois relativamente ao centro de massa da TTR. Após a obtenção destes eventos,
obtiveram-se regras de associação que relacionam o evento com a variante de TTR que
tem mais propensão para a ocorrência desse evento. Estas regras podem vir a tornar-se
muito úteis porque se se obtiver um elevado grau de certeza da regra, poderá vir a
identificar-se o tipo de variante de TTR se ocorrer o antecedente da regra.

75
Para complementar este estudo foi ainda procurado um terceiro evento por aminoácido,
para os 127 aminoácidos da TTR, e obtiveram-se regras que relacionam o evento
“alterações bruscas de comportamento do aminoácido” com a variante de TTR que tem
mais propensão para verificar esta ocorrência no aminoácido.
Várias poderão ser as questões levantadas ao longo deste trabalho, no Capítulo 4.5
foram abordados alguns pontos, dos quais se pode concluir que existe ainda muito
trabalho a fazer para se poderem obter conclusões seguras quanto às características e
mecanismos de desnaturação de TTR que possam ajudar na descoberta de conhecimento
sobre a Doença dos Pezinhos.
O processo aqui apresentado pode ser aplicado, por exemplo, em valores de SASA
obtidos por simulação da desnaturação da TTR, seria interessante comparar os
resultados obtidos com os valores de SASA, com os resultados obtidos nesta tese. O
mesmo processo pode ainda ser aplicado noutros contextos.
O processo desenvolvido apresenta algumas características que o torna interessante para
trabalhos futuros, porque pode ser aplicado a um número grande de simulações, e cada
etapa deste processo pode ser desenvolvida e reformulada. Por exemplo, podem ser
implementadas outros algoritmos de obtenção de clusters, os clusters podem ser
avaliados com outros critérios, os aminoácidos representativos podem ser obtidos de
outras formas, podem ser procurados outro tipo de eventos, pode incluir-se o factor
tempo aos eventos (desenvolver, por exemplo, um estudo de Data Mining Geo-
Temporal), pode ser aplicada uma análise sequêncial e podem ainda ser implementadas
outras técnicas de Data Mining.
No final desta tese são imensos os pontos positivos, fica a sensação de que se poderá
fazer muito mais e de que este trabalho contribuiu de forma positiva para o estudo da
TTR.

76
Bibliografia
Agrawal, R., Imielinski, T., Swami, A. “Mining association rules between sets of items
in large data bases.” SIGMOD Conference On Management of Data, Maio 1993: 207-
216.
Agrawal, R., Srikant, R. “Fast Algorithms for Mining Association Rules.” International
Conference On Very Large Databases, Santiago, Chile, 1994: 487-499.
Agrawal, R., Srikant, R. “Mining Sequential Patterns.” Eleventh International Conf. on
Data Engineering, 1995: 3-14.
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. Molecular Biology of
The Cell. Garland Publishing 3ª Edição, 1994.
Andrade C. “A peculiar form of peripheral neuropathy: familial atypical generalized
amyloidosis with special involvement of the peripheral nerves.” Brain, 1952: 75:408-
427.
Azevedo, P. J. “CAREN A java based Apriori implementation for classification
purposes.” (Personal Communication), 2003.
Azevedo, P., Cândida Silva, Rodrigues, J., Ferreira, N., Brito, R. “Detection of
Hydrophobic Clusters in Molecular Dynamics Protein Simulations Using Association
Rules.” ISBMDA , 2005: 329-337.
Azevedo, P., Jorge, A. “Comparing Rule Measures for Predictive Association Rules.”
Springer Berlin / Heidelberg- European Conference on Machine Learning , 2007: 510-
517.
Bayardo, R., Agrawal, R. “Mining the Most Interesting Rules.” 5th International
Conference on Knowledge Discovery and Data Mining, KDD - 99, , 1999: 145-153.
Berendsen HJC, Van der Spoel D, Van Drunen R. “GROMACS: a messagepassing
parallel molecular dynamics implementation.” Comp. Phys. Commum., 1995: 91:43-56.
Berry, M J. A., Linoff, Gordon S. Data Mining Techniques. New York: Jonh Wiley &
Sons, Inc., 2004.
Bertrand P., Mufti, G. “Loevinger's measures of rule quality for assessing cluster
stability.” Computacional Statistics and Data Analysis 50, 2005: 992-1015.
Bertrand, P., Mulfi, G, Moubarki, L. “Determining the number of groups from measures
of cluster stability.” Conf. Int. Symp. on Applied Shochastic Models and Data Analysis ,
2005.

77
Bittner, T. “Rough sets in spatio-temporal data mining .” Proceedings of International
Workshop on Temporal, Spatial and Spatio-Temporal Data Mining 89--104.
Branco, J. Uma Introdução à Análise de Clusters. Évora : Congresso Anual de
Sociedade Portuguesa de Estatística, 2004.
Brin, S., Motwani, R., Silverstein, C. “Beyond market baskets: generalizing association
rules to correlations.” ACM SIGMOD/PODS'97 , 1997: 265-276 (a).
Brin, S., Motwani, R., Ullman, J.D., Tsur, S. “Dynamic itemset counting and
implication rules for market basket data.” ACM SIGMOD 1997 Int. Conf. on
Management of Data, 1997: 255-264 (b).
Brito, R., Dubitzky, Rodrigues J. “Protein Folding and Unfolding Simulations: A New
Challenge for Data Mining.” A Journal of Integrative Biology , 2004: Vol 8, Nº 2.
Brock, G., Pihur, V., Datta, S., Datta, S. “clValid: Validation of Clustering Results.”
Contributed Packages. 27 de 1 de 2008. http://www.louisville.edu/~g0broc01/research
(acedido em 30 de 1 de 2008).
Brooks BR, Bruccoleri RE, Olafson BD, States DJ, Swaminathan S, Karplus M.
“CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics
calculations.” J. Comput. Chem., 1983: 4:187-217.
Bruzzese D., Davino C. Significant Knowledge Extraction from Association Rules.
2006. http://www.iasc-
isi.org/Proceedings/2006/COMPSTAT_Satellites/KNEMO/Lavori/Papers%20CD/Davi
no%20Bruzzese.pdf (acedido em 8 de 2007).
Bruzzese D., Davino C. “Visual Post- Analusis of Association Rules.” Journal of Visual
Languages and Computing, 2003: 621-635.
Caiado, J., Crato, N., Peña, D. “A periodogram-based metric for time series
classification.” Computacional Statistics & Data Analysis, 2006: 2668-2684.
Calinski, R., Harabasz, J. “A dendrite method for clustering analysis.” Communications
in Statistics 3, 1974: 1-27.
Cejtin, H., Edler, J., Gottlieb, A., Helling, R., Li, H., Philbin, J., Wingreen, N., Tang, C.
“Fast tree search for enumeration of a lattice model of protein folding.” The Journal of
chemical physics Vol. 116, Nº1, 2002: 352-359.
Coenen, F., G. Goulbourne and P. Leng. “Tree Structures for Mining Association Rules
.” In Data Mining and Knowledge Discovery, 25-51. Kluwer Academic Publishers,
2004.

78
Costa, J., Bação. “O Papel do Data Mining Geo-Espacial nos Location Based Services.”
Porto: 3ª Conferência da Associação Portuguesa de Sistemas de Informação Porto, de
15 a 17 Outubro, 2003.
Dafas, P., Garcez, A. “Applied temporal rule mining to time series.” School of
Informatics London. 2006.
http://www.soi.city.ac.uk/project/DOC_TechReport/TR_2006_DOC_01.pdf (acedido
em 2007).
Das, G., Lin, K.I., Mannila, H., Renganathan, G., Smyth, P. “Rule Discovery from time
series.” Fourth International Conference on Knowledge Discovery and Data Mining,
1998: 16-22.
Dill, K. A. & Chan, H. S. “From Levinthal to pathways to funnels.” Nature Structure
Biology Nº4, 1997: 10-19.
Ewing CS, Thacher TS, Hagler AT. “Derivation of Class II force fields 7. Nonbonded
force field parameters for organic compounds.” Journal Physic Chemestry B 103, 1999:
6998-7014.
Faceli, K., Carvalho, A., Souto, M. “Validação de Algoritmos de Agrupamento.” 2005.
ftp://ftp.icmc.usp.br/pub/BIBLIOTECA/rel_tec/RT_254.pdf (acedido em 8 de 2007).
Faísca, P. “O Mistério das Proteínas.” Gazeta da Física, Sociedade portuguesa da
Física,Art. 07, Vol 29_3,, 2004: 33-39.
Fayyad (2), U., Piatetsky-Shapiro, Padhraic S. “From Data Mining to Knowledge
Discovery in Databases.” Advances in Knowledge Discovery and Data Mining
(Advances in Knowledge Discovery and Data Mining, AAAI Press), 1996: 1-34.
Fayyad, U., Piatetsky-Shapiro G. “The KDD Process for Extracting Useful knowledge
from Volumes of Data.” Communications of the ACM Vol.39, Nº11, November 1996:
27-34.
Feller, S. E., Zhang, Y. H., Pastor, R. W., et al. “Constant-pressure molecular-dynamics
simulation - the Langevin piston method.” Journal of Chemestry and Physic Nº103,
1995: 4613-4621.
Ferreira, P., Silva, C., Brito, R., Azevedo, P. “A Closer Look on Protein Unfolding
Simulations through Hierarquical Clustering.” Computational Intelligence and
Bioinformatics and Computational Biology, 2007: 461 - 468.
Ganascia, J., G. Deriving the learning bias from rule properties. Clarendon Press New
York, NY, USA, 1991.
Gomes, C. M. “Implicações do (des)rolamento proteíco em patologias humanas.” 2005.
http://www.itqb.unl.pt/~gomes/articles/pat.pdf (acedido em 5 de 2007).

79
Gonçalves, E. “Regras de Associação e suas Medidas de Interesse Objectivas e
Subjectivas.” Journal of Computer Science Vol 6, 2005.
Gordon, A. D. Classification 2nd Edition. Chapman & Hall/CRC, 1999.
Grubmuller, Helmut. Solvate 1.0. 1996.
www.mpibpc.mog.de/groups/grubmueller/start/software/solvet/docu.html (acedido em
2007).
Guralnik V., Srivastava J. “Event Detection from Series Data.” Fifth ACM SIGKDD
international conference on Knowledge discovery and data mining , 1999: 33-42.
Hahsler, M., Hornik, K. “New Probabilistic Interest Measures for Association Rules.”
Mitarbeiter: Michael Hahsler . Março de 2007. http://www.ai.wu-
wien.ac.at/~hahsler/research/hyperConfidence_IDA2007/hyperConfidence.pdf (acedido
em 2007).
Halkidi, M., Batistakis, Y., Vazirgiannis, M. “On Clustering Validation Techniques.”
Montagem por Kluwer Academic Publishers. Journal of Intelligent Information
Systems, 17:2/3, 2001: 107-145.
Hartigan, J. In Clustering Algorithms, Cap.2;9. John Wiley & Sons, 1975.
Hennig, C. Package fpc Version 1.1-1. 22 de 4 de 2004. http://cran.r-
project.org/web/packages/fpc/index.html (acedido em 2007).
Honda, R., Takimito, H., Konoshi, O.,. “Semantic Indexing and Temporal Rule
Discovery for Time-series Satellite Images.” International Workshop on Multimedia
Data Mining. Boston, 2000. 82-90.
Honig, B. “Protein Folding: From the Levinthal Paradox to Structure Prediction.”
Journal Molecular Biology, 1999: 283-293.
Huang, Y. F., C. M. Wu. “Mining Association Rules Using Prunning Techniques.”
International Conference in Data Mining, 2002: 227-234.
Imielinski, T., Mannila, H. “A Database Perspective on Knowledge on Discovery.”
Communications of the ACM Nº11 39 (1996): 58-64.
Jain, A., Dubes, R. Algorithms for Clustering Data. Prentice Hall, 1988.
Jakel, J., Nollenburg, M.,. “Validation in the Cluster Analysis of Gene Expressiom
Data.” 2004. http://i11www.iti.uni-karlsruhe.de/members/noelle/pub/jn-vcage-04.pdf
(acedido em 7 de 2007).

80
Kalé, L., Skeel, R., BBhandarkar, M., Brunner, R., Gursoy, A., Krawetz, N., Philips, J.,
Shinozaki, A., Varadarajan, K., Schulten, K. “NAMD2: Greater Scability for Parallel
Molecular Dynamics.” Journal of Computational Physics, 1999: 151, 283-312.
Kauzmann, W. “The three dimensional Structures of Proteins.” Biophysical Journal 4
(1964): 43-54.
Kovacs, F., Legány, C., Babos, A. “Cluster Validity Measurement Techniques.” 6th
International Symposium of Hungarian Researchers on Computational Intelligence.
Budapest, 2005.
Krzanowski, W., Lai, Y. “A criterion for determining the number of groups in a. dataset
using sum of squares clustering.” Biometrics 44 (1985): 23-34.
Lenca, P., Vaillant B., Meyer P., Lallich S. Association Rule interestingness measures:
experimental and theoretical studies. Vol. 1. Lyon: PM-PP-06-06 , 2006.
Levinthal, C. “Are there pathways for protein folding.” Journal de Chemie Physique 65,
1968: 44.
Liu, B., Hsu W., Chen, S., Ma, Y. Analysing the subjective Interestingness of
Association Rules. IEEE, Intelligent Systems, 2000.
Liu, B., Hsu, W., Chen, S. “Analysing the subjective Interestingness of Association
Rules.” IEEE Inteligent Systems 15 (2000): 47-55.
Liu, B., Pednault, E., Smyth, P. “Business Applications of Data Mining.”
Communications of the ACM 45 (2002): 49-53.
Luis, M. “Polineuropatia Amiloidótica Familiar do Tipo Português: do artigo original ao
futuro.” Sinapse -Sociedade Portuguesa de Neurologia 6 (2006): 40-42.
Mannila H., Toivonen H. “Discovering generalized episodes using minimal
occurrences.” Knowledge Discovery and Data Mining, 1996: 146-151.
Mannila, H., Toivonen H., Verkamo A. “Discovery of Frequent Episodes in Event
Sequences.” Kluwer Academic Publishers, 1997: 259-289.
Mannila, H., Toivonen, H., Verkamo A. “Discovering frequent episodes in sequences.”
1st Int'l Conference on Knowledge and Data Mining, 1995: 210-215.
Maroco, J. Análise Estatistica com utilização do SPSS. Edições Silabo, 2003.
Mennis, J., Liu, J. W. “Mining Association Rules in Spatio- Temporal Data.” 7th
International Conference on GeoComputation. 2003.

81
Milligan, G., Cooper, M. “An examination of procedures for determining the number of
clusters in a data set.” Pchychometrika 50, 1985: 159-179.
Morrison, R., Boyd R. Química Orgânica. Fundação Caloustre Gulbenkian 6ª Edição
Cap. 36, 1992.
Murteira, Bento José Ferreira. Probabilidades e Estatística. McGraw-Hill, 1990.
Nunes, A., Barroso, A., Pacheco, J., Tavares, M., Mimoso, J., Gama, M., Faísca, P.,
Ferreira, P., Patrício, P., Álvares, R., Konotop, V. PRISMA à Luz da Física.
http://cftc.cii.fc.ul.pt/PRISMA/capitulos/capitulo4/modulo4 (acedido em 10 de 2007).
Omiecinski, E. R. “Alternative interest measures for mining associations in databases.”
IEEE Transaction on Knowledge and Data Engineering 15, n.º 1 (2003): 57-69.
Pace C. N., Shidley, B. A., Macnutt, M., Gajiwala, K. “Forces contributing to the
conformational stability of Proteins.” The FASEB Journal 10 (1996): 75-83.
Pal, N. R:, Bezdek, J. C. “On Cluster validity for fuzzy c-means model.” IEEE
Transactions on Fuzzy Systems 3 (1995): 370-379.
Pande V., Baker I., Chapman J., Elmer S. P., Khaliq S., Larson S.M., Rhee Y.M., Shirts
M.R., Snow C.D., Sorin E.J., Zagrovic B. “Atomistic protein Folding Simulations on
the Submillisecond Time Scale Using Worldwide Distributed Computing.” Biopolymers
68 (2003): 91-109.
Pande, V., Grosberg, A., Tanaka, T., Rokhsar, D. “Pathways for protein folding: is a
"new view" needed?” Currente Opinion in Structural Biology 8 (1998): 68-79.
Pearlman DA, Case DA, Caldwell JW, Ross SW, Cheatham TE III, et al. “AMBER, a
package of computer programs for applying molecular mechanics, normal-mode
analysis, molecular-dynamics and free-energy calculations to simulate the structural and
energetic properties of molecules.” Comput. Phys. Commum, 1995: 91:1-41.
Quintas, A., Saraiva, M., Brito, R. “The Tetrameric Protein Transthyretin Dissociates to
a Non-native Monomer in Solution.” Biological Chemistry 274 , n.º 46 (1999): 32943-
32949.
Quintas, A., Vaz, D., Cardoso, I., Saraiva, M., Brito, R. “Tetramer Dissociation and
Monomer Partial Unfolding Precedes Protofibril Formation in Amyloidogenic
Transthyretin Variants.” Biological Chemistry 276, Nº29, n.º 29 (2001).
R., Pereira M. Modelo de Predicção da Conformação Tridimensional de Proteínas
Globulares a partir do método AB INITIO utilizando Rede Neural com uma função de
base radial. Tese Doutoramento, Florianópolis: Universidade Federal Santa Catarina
Florianópolis, 2006.

82
Robertis, E., Robertis, E. Jr. Biologia Celular e Molecular. 13. Fundação Caloustre
Gulbenkian , 1987.
Roddick, J., Spiliopoulou M. “A survey of Temporal Knowledge Discovery Paradigms
and Methods.” IEEE Transactions on Knowledge and Data Engineering. 14 (2002).
Rousseeuw, P., J. “Sillouettes: a graphical aid to the interpretation and validation of
cluster analysis.” Journal of Computational and Applied Mathematics 20, 1987: 53-65.
Saporta, G. Probabilités analyse des donnés et atatistique. Gulf Publishing, 1990.
Sarker, B. K., Mori, T., Uehara, K. “Parallel algorithms for mining association rules in
time series data.” Technical Report 2745/2003 (2003): 1-13.
Sarle, W. S., Kuo, A.H. “The MODECLUS procedure.” Technical Report Cary
(NC:SAS Institute Inc.), 1993: 256.
Savasere, A., Omiecinski, E., Navathe, S. “An efficient algorithm for mining
association rules in large databases.” 21th International Conference On Very Large
Databases, 1995: 432-444.
Shearer, C. “The CRISP-DM Model: The New Blueprint for Data Mining.” Journal of
Data Warehousing 5 Nº 4 (2000): 4:19.
Shirley, B. A., Stanssens, P., Hahn, U. & Pace, C. N. “Contribution of hydrogen
bonding to the conformational stability of ribonuclease T1.” Biochemistry 31 (1992):
725-732.
Silberschatz, A., Tuzhilin, A. “What Makes Patterns Interesting in Knowledge
Discovery Systems.” IEEE Trans. Knowledge and Data Engineering 8 (1996): 970-974.
Silva, H. “Métodos de Partição e Validação em Análise Classificatória baseados em
Teoria de Grafos.” Tese Doutoramento, FCUP, 2005.
Sousa, F. “Novas Metodologias e Validação em Classificação Hierárquica Ascendente.”
Tese Doutoramento, Universidade Nova de Lisboa, 2000.
Tan, P-N, Kumar, V., Srivastava, J. “Selecting the Right Interestingness Measure for
Association Patterns.” Fourth International Conference on Knowledge Discovery and
Data Mining, 2002: 121-127.
Tan, P-N., Kumar V. “Interesting Measures for Association Pattern: A Perspective.”
Workshop on Postprocessing in Machine Learning and Data Mining, 2000.
Toivinen, H. “Sampling Large Databases for Association Rules.” 22nd Very Large Data
Base Conference, 1996: 134-145 (a).

83
Toivonen, H. “Discovery of Pattenrs im Large Data Collections.” Dep.of Computer
Science, Seria A, Report A-1996-5, 1996.
Veloso, M. “Regras de Associação Aplicadas a um Método de Apoio ao Planeamento
de Recursos Humanos.” Dissertação de Mestrado em Análise de Dados e Sistemas de
Apoio à Decisão, Faculdade Economia Porto, Porto, 2003.
Vonesh, F.E., Chinchilli, V.M. Linear and Nonlinear Models for the analysis of
repeated measures. New York: Marcel Dekker, 1997.
Ward, J. H. “Hierarchical grouping to optimize an objective function.” Journal of the
American Statistical Association 58 (1963): 236-244.
Warnes, G. “Sample size estimation for microarray experiments.” 2006.
http://www.urmc.edu/smd/biostat/people/faculty/manuscripts/0606_warnes_liu.pdf
(acedido em 9 de 2007).
Webb, Geoffrey I. “Discovering significant rules.” International Conference on
Knowledge Discovery and Data Mining, 2006: 434-443.
Wei, C., Li, J., Bumgarner, R. “Sample size for detecting differentially expressed genes
microarray experiments.” BMC Genomics, 2004.
Wei, G., Sun, Y., Zhou, Y., Feig, M. “Molucular Multiresolution Surfaces.” 2005.
http://arxiv.org/PS_cache/math-ph/pdf/0511/0511001v1.pdf (acedido em 2007).
Witten I., Frank E. Data Mining: practical machine learning tools abd techniques with
Java implementatons. Morgan Kaufman Publishers, 1999.
Wolynes, P. G., Onuchic, J. N. & Thirumalai, D. “Navigating the folding routes.”
Science 267 (1995): 1619-1620.
Zhang, L., Hermans, J. “Hydrophilicity of cavities in proteins.” Proteins: Structure,
Function and Genetics 24, 1996: 433-438.
Zien, A., Fluck, J., Zimmer, R., Lengauer, T. “Microarrays: How many do you need?”
Journal of Computational Biology, 2003: 653-667.

84
Anexos
Anexo I – Análise Univariada
A. Valores máximos e mínimos atingidos em cada corrida
Cada gráfico representa a posição dos 127 aminoácidos no instante onde é atingido o
valor máximo de distância ao centro de massa, e o valor mínimo ao longo da simulação
da desnaturação da proteína TTR.
Para a variante WT-TTR temos 10 gráficos, dois para cada corrida. Por exemplo, na
corrida WTRUN2 o valor mínimo da distância ao centro de massa é atingido aos 7023
ps pelo aminoácido que fica entre a posição 60 e 80, isto é, pela VAL_71.

85
Para a variante L55P-TTR são apresentados os 10 gráficos seguintes:

86
B. Gráficos do aminoácido da posição 55 ao longo das 10 simulações
Figura 50 – Evolução da distância ao centro de massa do aminoácido LEU_55 da variente WT-
TTR.

87
Figura 51 – Evolução da distância ao centro de massa do aminoácido LEU_55 da variente WT-
TTR.

88
Anexo II – Classificação hierárquica - Resultados
A. Clustering da WT-TTR
A1- Optimização dos Índices de Milligan e Cooper
Na simulação WTRUN2, pela análise gráfica do índice G2 (que deve ser maximizado),
verifica-se que a quebra mais acentuada acorre de 14 para 15, isto é, existe uma
mudança significativa no valor dos índices para 14 clusters. No índice G3 (que deve ser
minimizado) existe uma queda acentuada de 13 para 14 classes. O número de classes
escolhido foi 14.
Figura 52 - Índices de Milligan e Cooper – G2 e G3 para a simulação WTRUN2
Para o quadro de dados WTRUN3 verifica-se que o número de classes que optimiza os
índices é 13.
Quanto às restantes simulações o critério de escolha do número de classes é análogo. Na
corrida WTRUN4 o número de classes onde se verificam alterações significativas dos
índices é 14. O mesmo acontece na corrida WTRUN5. Quanto à corrida WTRUN6 os
gráficos obtidos não apresentam grandes alterações, no entanto para 13 classes
apresentam uma pequena perturbação.

89

90
A2- Custering de cada corrida da WT-TTR
Figura 57 - Clustering de cada corrida da WT-TTR
Tabela 15 - WTRUN2- Classificação hierárquica: elementos das 14 classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
GLY_1 SER_8 CYS_10 LEU_12 ASP_18 VAL_20 PRO_24 ARG_34 LYS_48 ALA_81 ILE_107 SER_112 ALA_120 ASN_124
PRO_2 LYS_9 PRO_11 MET_13 ALA_19 ARG_21 ALA_25 LYS_35 THR_49 LEU_82 ALA_108 PRO_113 VAL_121 PRO_125
THR_3 SER_50 LEU_17 VAL_14 GLY_22 ALA_37 ILE_26 TRP_41 GLY_53 GLY_83 ALA_109 TYR_114 VAL_122 LYS_126
GLY_4 GLU_51 VAL_28 LYS_15 SER_23 ASP_38 ASN_27 GLU_42 GLU_54 ILE_84 LEU_110 SER_115 THR_123 GLU_127
THR_5 SER_52 ALA_29 VAL_16 ALA_36 ASP_39 THR_75 PRO_43 LEU_55 SER_85 LEU_111 TYR_116
GLY_6 THR_60 ALA_45 VAL_30 THR_40 LYS_76 PHE_44 HSD_56 PRO_86 SER_117
GLU_7 GLU_61 SER_46 HSD_31 VAL_65 GLU_89 GLY_67 GLY_57 PHE_87 THR_118
GLU_62 GLY_47 VAL_32 GLU_66 HSD_90 ILE_68 LEU_58 THR_119
GLU_63 ASP_74 PHE_33 ASN_98 ARG_104 THR_96 THR_59
PHE_64 ALA_91 TYR_69 ASP_99 ALA_97
SER_77 GLU_92 LYS_70 SER_100
TYR_78 TYR_105 VAL_71 GLY_101
TRP_79 THR_106 GLU_72 PRO_102
LYS_80 ILE_73 ARG_103
HSD_88 VAL_93
VAL_94
PHE_95

91
Gráficos para visualização do comportamento de alguns aminoácidos da simulação
WTRUN2.

93
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
GLY_1 THR_5 SER_8 CYS_10 LEU_12 VAL_14 LYS_15 ASP_18 VAL_20 ALA_37 TYR_116 VAL_122 ASN_124
PRO_2 GLY_6 LYS_9 PRO_11 MET_13 VAL_30 VAL_16 PRO_24 ARG_21 ASP_38 SER_117 THR_123 PRO_125
THR_3 GLU_7 ALA_19 ALA_45 LEU_17 VAL_71 HSD_31 ASN_27 ALA_36 ASP_39 THR_118 LYS_126
GLY_4 GLY_22 HSD_56 VAL_28 GLU_72 VAL_32 ARG_34 THR_40 GLY_83 THR_119 GLU_127
SER_23 GLY_57 ALA_29 ILE_73 LYS_70 PRO_43 GLU_62 ILE_84 ALA_120
ALA_25 LEU_58 PHE_33 GLU_92 PHE_44 GLU_63 SER_85 VAL_121
ILE_26 THR_75 SER_46 VAL_93 SER_50 LYS_80
LYS_35 HSD_90 GLY_47 ILE_107 SER_52 ALA_81
TRP_41 TYR_105 LYS_48 ALA_108 THR_59 LEU_82
GLU_42 THR_49 ALA_109 ILE_68 PRO_86
GLU_51 GLY_53 LYS_76 PHE_87
THR_60 GLU_54 SER_77 ASP_99
GLU_61 LEU_55 TYR_78 SER_100
PHE_64 TYR_69 GLU_89 GLY_101
VAL_65 ASP_74 THR_96 PRO_102
GLU_66 ALA_91 ALA_97
GLY_67 VAL_94 ARG_104
TRP_79 PHE_95 SER_112
HSD_88 THR_106
ASN_98 LEU_110
ARG_103 LEU_111
PRO_113
TYR_114
SER_115

94
WTRUN3.

95
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
GLY_1 THR_3 GLU_7 CYS_10 LEU_12 MET_13 VAL_14 ALA_19 VAL_20 ALA_36 ALA_37 ALA_81 TYR_116 VAL_122
PRO_2 GLY_4 SER_8 PRO_11 LEU_17 GLY_53 LYS_15 GLY_22 ARG_21 THR_40 ASP_38 LEU_82 SER_117 THR_123
THR_5 LYS_9 ASP_18 ASN_27 HSD_56 VAL_16 TRP_41 GLU_61 LYS_80 ASP_39 GLY_83 THR_118
GLY_6 SER_23 PRO_24 VAL_28 GLY_57 GLU_54 GLU_42 GLU_62 PRO_86 ILE_84 THR_119
LYS_35 ALA_25 ALA_29 LYS_70 LEU_55 GLU_66 GLU_63 PHE_87 SER_85 ALA_120
PRO_43 ILE_26 VAL_30 GLU_72 VAL_71 LYS_76 PHE_64 PRO_102 VAL_121
THR_60 ARG_34 HSD_31 ILE_73 VAL_93 TRP_79 VAL_65
GLY_67 PHE_44 VAL_32 GLU_92 HSD_88 SER_100
SER_77 ALA_45 PHE_33 VAL_94 GLU_89 GLY_101
TYR_78 SER_50 SER_46 PHE_95 ASP_99 ARG_103
ASN_98 GLU_51 GLY_47 ILE_107 PRO_113 TYR_114
ARG_104 SER_52 LYS_48 ALA_108 SER_115 ASN_124
SER_112 THR_59 THR_49 ALA_109 PRO_125
GLU_127 ILE_68 LEU_58 LYS_126
THR_75 TYR_69
HSD_90 ASP_74
ALA_97 ALA_91
TYR_105 THR_96
THR_106
LEU_110
LEU_111

96
WTRUN4.

97
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
GLY_1 GLY_6 LEU_12 LYS_15 ASP_18 ALA_19 VAL_28 ARG_34 ALA_36 ALA_37 SER_50 GLY_53 SER_112 ASN_124
PRO_2 GLU_7 MET_13 VAL_16 PRO_24 VAL_20 ALA_29 LYS_35 THR_40 ASP_38 GLU_51 GLU_54 PRO_113 PRO_125
THR_3 SER_8 VAL_14 LEU_17 ALA_25 ARG_21 ALA_45 TRP_41 GLU_62 ASP_39 SER_52 LEU_55 TYR_114 LYS_126
GLY_4 LYS_9 VAL_30 TYR_105 ILE_26 GLY_22 SER_46 GLU_42 GLU_63 LYS_80 THR_59 HSD_56 SER_115 GLU_127
THR_5 CYS_10 HSD_31 THR_106 ASN_27 SER_23 GLY_47 PRO_43 ASN_98 ALA_81 THR_60 GLY_57
PRO_11 VAL_32 ILE_107 THR_75 LYS_48 PHE_44 ASP_99 LEU_82 GLU_61 LEU_58
PHE_33 ALA_108 LYS_76 THR_49 PHE_64 SER_100 GLY_83 TYR_116
TYR_69 ALA_109 SER_77 ASP_74 VAL_65 GLY_101 ILE_84 SER_117
LYS_70 LEU_110 TYR_78 ALA_91 GLU_66 SER_85 THR_118
VAL_71 LEU_111 TRP_79 GLY_67 PRO_86 THR_119
GLU_72 HSD_88 ILE_68 PHE_87 ALA_120
ILE_73 GLU_89 THR_96 VAL_121
GLU_92 HSD_90 ALA_97 VAL_122
VAL_93 PRO_102 THR_123
VAL_94 ARG_103
PHE_95 ARG_104

98
WTRUN5.

99
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
GLY_1 THR_5 GLU_7 SER_8 CYS_10 PRO_11 LEU_12 MET_13 LEU_17 ASP_18 ALA_19 ALA_36 GLY_101
PRO_2 GLY_6 VAL_20 LYS_9 ILE_26 VAL_28 ALA_29 VAL_14 ARG_34 PRO_24 GLY_22 THR_40 PRO_102
THR_3 ARG_21 GLU_62 ASN_27 LYS_48 PHE_33 LYS_15 PRO_43 LYS_35 SER_23 ASP_99
GLY_4 ALA_37 GLU_63 SER_50 THR_49 ALA_45 VAL_16 PHE_44 TRP_41 ALA_25 SER_100
ASP_38 PHE_64 GLU_51 THR_59 SER_46 VAL_30 GLY_53 GLU_42 GLU_61 PRO_113
ASP_39 VAL_65 SER_52 ASP_74 GLY_47 HSD_31 ILE_68 THR_60 LYS_76 TYR_114
LYS_80 TRP_79 THR_75 GLU_92 GLU_54 VAL_32 THR_96 GLU_66 SER_77
ALA_81 HSD_88 ALA_91 TYR_105 HSD_56 LEU_55 ALA_97 GLY_67 TYR_78
LEU_82 ARG_104 TYR_116 GLY_57 LYS_70 LEU_110 SER_112 GLU_89
GLY_83 SER_117 LEU_58 VAL_71 LEU_111 VAL_122 HSD_90
ILE_84 THR_118 TYR_69 GLU_72 VAL_121 ASN_98
SER_85 THR_119 ILE_73 ILE_107 ARG_103
PRO_86 ALA_120 VAL_93 ALA_108 SER_115
PHE_87 VAL_94 ALA_109 THR_123
PHE_95 ASN_124
THR_106 PRO_125
LYS_126
GLU_127

100
WTRUN6.

101
A3 - Partição consenso da WT-TTR
Clustering da proteína WT-TTR usando os 5 clusterings anteriores de cada simulação.
Figura 58 - Dendrograma WT-TTR
Corte do dendrograma em h=4.
Tabela 20 – Clustering da WT (Partição I)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
GLY_1 SER_8 CYS_10 LEU_12 ASP_18 VAL_20 ARG_34 ALA_36 GLY_53 TYR_116 ASN_124
PRO_2 LYS_9 PRO_11 MET_13 PRO_24 ARG_21 LYS_35 THR_40 GLU_54 SER_117 PRO_125
THR_3 ALA_19 LEU_17 VAL_14 ALA_25 ALA_37 TRP_41 ASP_99 LEU_55 THR_118 LYS_126
GLY_4 GLY_22 VAL_28 LYS_15 ILE_26 ASP_38 GLU_42 SER_100 HSD_56 THR_119 GLU_127
THR_5 SER_23 ALA_29 VAL_16 ASN_27 ASP_39 PRO_43 GLY_101 GLY_57 ALA_120
GLY_6 THR_60 ALA_45 VAL_30 SER_50 LYS_80 PHE_44 PRO_102 LEU_58 VAL_121
GLU_7 GLU_61 SER_46 HSD_31 GLU_51 ALA_81 GLU_66 VAL_122
GLU_62 GLY_47 VAL_32 SER_52 LEU_82 GLY_67 THR_123
GLU_63 LYS_48 PHE_33 THR_59 GLY_83 ILE_68
PHE_64 THR_49 TYR_69 THR_75 ILE_84 THR_96
VAL_65 ASP_74 LYS_70 LYS_76 SER_85 ALA_97
TRP_79 ALA_91 VAL_71 SER_77 PRO_86
HSD_88 TYR_105 GLU_72 TYR_78 PHE_87
ASN_98 THR_106 ILE_73 GLU_89
ARG_103 LEU_110 GLU_92 HSD_90
SER_112 LEU_111 VAL_93 ARG_104
PRO_113 VAL_94
TYR_114 PHE_95
SER_115 ILE_107
ALA_108
ALA_109

102
B. Clustering da L55P-TTR
B1 – Optimização dos Índices de Milligan e Cooper
Quanto à escolha do número de classes para a proteína L55P-TTR o raciocínio é o
mesmo. Desta forma, na primeira corrida, o número de classes escolhido é 15 como se
pode observar na figura seguinte:
Figura 59 - Índices de Milligan e Cooper – G2 e G3 para a simulação L55PRUN1
Na corrida L55PRUN2 a escolha do número de clusters não é fácil uma vez que os
gráficos se aproximam de rectas. No entanto, para 19 classes, o valor do Índice G2
apresenta uma pequena flutuação, e o valor do Índice G3 decresce bastante de 18 para
17 classes.

103
B2 - Clustering de cada corrida da L55P-TTR
Figura 64 - Clustering de cada corrida da L55P-TTR

104
Tabela 21 – Clustering da L55PRUN1: 15 classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
GLY_1 THR_5 CYS_10 LEU_12 LYS_15 LEU_17 ASP_18 PRO_24 ARG_34 ALA_36 TRP_41 LEU_58 TRP_79 TYR_116 VAL_122
PRO_2 GLY_6 PRO_11 MET_13 VAL_16 ASN_27 ALA_19 ALA_25 LYS_35 ALA_37 GLU_42 THR_59 LYS_80 SER_117 THR_123
THR_3 GLU_7 ALA_91 VAL_14 VAL_28 LYS_48 VAL_20 ILE_26 GLY_67 ASP_38 THR_96 THR_60 ALA_81 THR_118 ASN_124
GLY_4 SER_8 GLU_92 VAL_30 ALA_29 THR_49 ARG_21 SER_112 ILE_68 ASP_39 ALA_97 GLU_61 LEU_82 THR_119 PRO_125
LYS_9 VAL_93 HSD_31 PRO_43 SER_50 GLY_22 PRO_113 HSD_88 THR_40 ASN_98 GLU_62 GLY_83 ALA_120 LYS_126
VAL_94 VAL_32 PHE_44 GLU_51 SER_23 TYR_114 GLU_89 GLU_63 ASP_99 ILE_84 VAL_121 GLU_127
PHE_95 PHE_33 ALA_45 SER_52 SER_115 HSD_90 PHE_64 SER_100 SER_85
TYR_69 SER_46 GLY_53 VAL_65 GLY_101 PRO_86
LYS_70 GLY_47 THR_75 GLU_66 PRO_102 PHE_87
VAL_71 GLU_54 LYS_76 ARG_103
GLU_72 PRO_55 SER_77 ARG_104
ILE_73 HSD_56 TYR_78
GLY_57 LEU_110
ASP_74 LEU_111
TYR_105
THR_106
ILE_107
ALA_108
ALA_109
L55PRUN1.

105
Tabela 22 - Clustering da L55PRUN2: 17 classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
GLY_1 THR_5 SER_8 CYS_10 LEU_12 LYS_15 LEU_17 ASP_18 PRO_24 ALA_36 ALA_37 TRP_41 PRO_43 SER_50 GLU_92 SER_112 SER_117
PRO_2 GLY_6 LYS_9 PRO_11 MET_13 VAL_16 ARG_34 ALA_19 ALA_25 THR_40 ASP_38 GLU_42 PHE_44 GLU_51 VAL_93 PRO_113 THR_118
THR_3 GLU_7 VAL_65 VAL_28 VAL_14 GLU_54 LYS_35 VAL_20 ILE_26 LYS_80 ASP_39 HSD_88 ALA_45 SER_52 VAL_94 TYR_114 THR_119
GLY_4 GLU_62 GLU_66 ALA_29 VAL_30 PRO_55 HSD_90 ARG_21 ASN_27 ALA_81 GLU_89 SER_46 GLY_53 PHE_95 SER_115 ALA_120
GLU_63 PRO_102 PHE_33 HSD_31 HSD_56 ALA_91 GLY_22 THR_60 LEU_82 VAL_121 GLY_47 TYR_116
ASN_98 ARG_103 TYR_69 VAL_32 GLY_57 THR_96 SER_23 GLU_61 GLY_83 VAL_122 LYS_48
ASP_99 LYS_70 VAL_71 LEU_58 ALA_97 PHE_64 ILE_84 THR_123 THR_49
SER_100 ASP_74 GLU_72 THR_59 LEU_110 GLY_67 SER_85 ASN_124
GLY_101 TYR_105 ILE_73 ALA_108 LEU_111 ILE_68 PRO_86
THR_106 ALA_109 THR_75 PHE_87
ILE_107 LYS_76 PRO_125
SER_77 LYS_126
TYR_78 GLU_127
TRP_79
ARG_104

106
L55PRUN2.

107
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
GLY_1 THR_3 GLU_7 SER_8 LYS_9 CYS_10 ILE_107 GLU_54 VAL_28 VAL_30 ASN_98 TYR_116 VAL_121 PRO_125
PRO_2 GLY_4 GLU_62 VAL_65 HSD_56 PRO_11 LEU_12 PRO_55 ALA_29 HSD_31 ALA_36 SER_117 VAL_122 LYS_126
THR_5 GLU_63 GLU_66 GLY_57 TYR_105 MET_13 LEU_17 PHE_33 VAL_32 THR_40 THR_118 THR_123 GLU_127
GLY_6 ASP_99 PRO_102 LEU_58 THR_106 VAL_14 ARG_34 TYR_69 VAL_71 PHE_87 THR_119 ASN_124
ALA_81 SER_100 ARG_103 THR_59 LYS_15 HSD_90 LYS_70 GLU_72 HSD_88 ALA_120
LEU_82 GLY_101 ALA_19 LYS_35 VAL_16 LEU_110 ASP_74 ILE_73 PRO_113
GLY_83 VAL_20 GLY_22 THR_96 ALA_108 LEU_111 ALA_91 TYR_114
ILE_84 ARG_21 SER_23 ALA_97 ALA_109 THR_75 ALA_45
PHE_64 THR_60 ASP_18 PRO_43 SER_46
TRP_79 GLU_61 PRO_24 PHE_44 GLY_47
LYS_80 GLY_67 ALA_25 LYS_48 GLU_92
SER_85 SER_77 ILE_26 THR_49 VAL_93
PRO_86 TYR_78 ASN_27 GLY_53 VAL_94
ALA_37 SER_115 ILE_68 PHE_95
ASP_38 LYS_76
ASP_39 ARG_104
TRP_41
GLU_42
GLU_89
SER_50
GLU_51
SER_52
SER_112
L55PRUN3.

108
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
GLY_1 GLU_7 ARG_103 PRO_11 ILE_107 LEU_17 VAL_65 GLU_62 ALA_81 SER_50 HSD_56 HSD_88 ASP_99
PRO_2 SER_8 THR_96 TYR_105 LEU_12 LEU_110 GLU_66 GLU_63 LEU_82 GLU_51 GLY_57 ASN_124 SER_100
THR_3 GLY_67 ALA_97 THR_106 MET_13 LEU_111 SER_23 PHE_64 GLY_83 SER_52 LEU_58 PRO_125 GLY_101
GLY_4 LYS_9 ASN_27 LYS_15 VAL_14 LYS_48 SER_77 ALA_19 ILE_84 GLU_54 THR_59 LYS_126 PRO_102
THR_5 LYS_35 ILE_68 VAL_16 VAL_30 GLY_47 TYR_78 GLY_22 VAL_20 THR_49 PRO_55 GLU_127
GLY_6 ALA_25 ARG_104 ALA_108 HSD_31 TYR_116 SER_115 THR_60 ARG_21 GLY_53
ILE_26 CYS_10 ALA_109 VAL_32 SER_117 ASP_18 GLU_61 TRP_79
LYS_76 ARG_34 VAL_28 VAL_71 PRO_24 PRO_113 LYS_80
TRP_41 PRO_43 ALA_29 GLU_72 SER_112 TYR_114 SER_85
GLU_42 PHE_44 PHE_33 ILE_73 ALA_36 PRO_86
GLU_89 VAL_121 TYR_69 THR_40 ALA_37
HSD_90 LYS_70 ASP_38
THR_75 ASP_74 ASP_39
ASN_98 ALA_91 PHE_87
VAL_122 ALA_45
THR_123 SER_46
GLU_92
VAL_93
VAL_94
PHE_95
THR_118
THR_119
ALA_120

109
L55PRUN3.

110
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
GLY_1 GLY_4 GLU_7 CYS_10 MET_13 ASP_18 VAL_20 ARG_34 TRP_79 ALA_91 ASN_98
PRO_2 THR_5 SER_8 PRO_11 VAL_14 PRO_24 ARG_21 PRO_43 LYS_80 GLU_92 ASP_99
THR_3 GLY_6 LYS_9 LEU_12 LYS_15 ALA_25 ALA_36 PHE_44 ALA_81 VAL_93 SER_100
ALA_37 ALA_19 LEU_17 VAL_16 ILE_26 THR_40 ILE_68 LEU_82 VAL_94 GLY_101
ASP_38 GLY_22 VAL_28 VAL_30 ASN_27 GLU_63 TYR_105 GLY_83 PHE_95 PRO_102
ASP_39 SER_23 ALA_29 HSD_31 SER_50 PHE_64 THR_119 ILE_84 ARG_103
LYS_35 PHE_33 VAL_32 GLU_51 VAL_65 ALA_120 SER_85
TRP_41 ALA_45 GLY_53 SER_52 GLU_66 PRO_86
GLU_42 SER_46 GLU_54 LEU_58 ASN_124 PHE_87
GLU_61 GLY_47 PRO_55 THR_59 PRO_125 HSD_88
GLU_62 LYS_48 LYS_70 THR_60 LYS_126 GLU_127
GLY_67 THR_49 VAL_71 THR_75
GLU_89 HSD_56 GLU_72 LYS_76
HSD_90 GLY_57 ILE_73 SER_77
SER_112 TYR_69 ILE_107 TYR_78
PRO_113 ASP_74 ALA_108 THR_96
TYR_114 THR_106 ALA_109 ALA_97
SER_115 LEU_110 ARG_104
VAL_121 LEU_111
VAL_122 TYR_116
THR_123 SER_117
THR_118

112
B3 - Partição consenso da L55P-TTR
Figura 65 - Dendrograma L55P-TTR
Classificação obtida com um corte do dendrograma em h=4.
Tabela 26 – Classificação L55 (PartiçãoII)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
GLY_1 GLU_7 CYS_10 LEU_12 LYS_15 LEU_17 ASP_18 PRO_24 ALA_36 SER_50 THR_60 TRP_79 HSD_88 ASN_98 TYR_116
PRO_2 SER_8 PRO_11 MET_13 VAL_16 ARG_34 ALA_19 ALA_25 ALA_37 GLU_51 GLU_61 LYS_80 ASN_124 ASP_99 SER_117
THR_3 LYS_9 VAL_28 VAL_14 GLU_54 PRO_43 VAL_20 ILE_26 ASP_38 SER_52 GLU_62 ALA_81 PRO_125 SER_100 THR_118
GLY_4 LYS_35 ALA_29 VAL_30 PRO_55 PHE_44 ARG_21 ASN_27 ASP_39 GLY_53 LEU_82 LYS_126 GLY_101 THR_119
THR_5 TRP_41 PHE_33 HSD_31 HSD_56 LYS_48 GLY_22 ILE_68 THR_40 GLY_83 GLU_127 PRO_102 ALA_120
GLY_6 GLU_42 ALA_45 VAL_32 GLY_57 THR_49 SER_23 THR_75 GLU_63 ILE_84 ARG_103
GLY_67 SER_46 VAL_71 LEU_58 LEU_110 LYS_76 PHE_64 SER_85
GLU_89 GLY_47 GLU_72 THR_59 LEU_111 SER_77 VAL_65 PRO_86
HSD_90 TYR_69 ILE_73 ALA_108 TYR_78 GLU_66 PHE_87
SER_112 LYS_70 ILE_107 ALA_109 THR_96
PRO_113 ASP_74 ALA_97
TYR_114 ALA_91 ARG_104
SER_115 GLU_92
VAL_121 VAL_93
VAL_122 VAL_94
THR_123 PHE_95
TYR_105
THR_106

113
C. Partição consenso - sem a posição 55
Figura 66 - Dendrograma TTR
D. Escolha dos aminoácidos Representativos (sem pos. 55)
Tabela 27 – Aminoácidos Representativos
Classe WT_2 WT_3 WT_4 WT_5 WT_6 L55_1 L55_2 L55_3 L55_4 L55_5 Aa. Repr
1 GLY_4 GLY_4 GLY_4 THR_3 GLY_4 GLY_4 GLY_4 GLY_4 THR_3 GLY_4 GLY_4
2 GLU_89 GLU_42 GLU_89 GLU_66 GLU_66 GLU_42 LYS_35 LYS_35 GLU_89 GLU_42 GLU_42
3 TYR_105 LEU_17 LEU_17 THR_49 LEU_17 LEU_110 THR_105 CYS_10 LEU_17 LYS_48 LEU_17
4 LYS_15 MET_13 ALA_108 LYS_15 LYS_70 MET_13 LYS_70 TYR_69 THR_106 VAL_32 MET_13
5 PRO_24 PRO_24 ILE_26 ILE_26 SER_52 ASN_27 PRO_24 ILE_26 SER_50 SER_50 PRO_24
6 SER_23 SER_77 ALA_19 LYS_76 SER_77 SER_23 LYS_76 SER_77 GLY_22 LYS_76 SER_77
7 LYS_80 LEU_82 ALA_81 LYS_80 LYS_80 ILE_84 SER_85 ALA_37 ASP_38 LYS_80 LYS_80
8 GLU_92 ALA_29 ALA_91 ALA_91 VAL_28 VAL_94 VAL_94 ALA_29 VAL_28 ALA_45 ALA_91
9 PHE_44 ARG_34 ARG_34 ARG_34 ARG_34 THR_96 THR_96 ARG_34 ARG_34 PRO_43 ARG_34
10 VAL_65 ASN_98 SER_100 ALA_63 ASN_98 GLY_101 ASN_98 ALA_36 ASN_98 ASP_99 ASN_98
11 GLU_63 GLU_63 GLU_63 GLU_63 GLU_62 GLU_62 GLU_63 GLU_62 GLU_61 GLU_62 GLU_63
12 SER_112 PRO_113 PRO_112 SER_112 VAL_122 SER_112 SER_112 PRO_113 LEU_111 SER_112 SER_112
13 THR_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117 SER_117
14 ASN_124 ASN_124 ASN_124 ASN_124 ASN_124 PRO_125 ASN_124 ASN_124 ASN_124 ASN_124 ASN_124
Na classe 5 existe um caso de empate, isto é, 2 aminoácidos são representativos 3 vezes
(PRO_24, ILE_26) uma vez que estes dois aminoácidos estão próximos na cadeia
pepetídica, em principio um acompanha o comportamento do outro. Logo pode
escolher-se qualquer um. O mesmo acontece na classe 4.Para as classes 2 e 8, como
existem empates, dos aminoácidos repetidos escolheram-se aqueles que não estão
próximos na cadeia polipeptídica aos aminoácidos representativos já seleccionados nas
outras classe. O objectivo é ter um conjunto de aminoácidos uniformemente distribuidos
pela cadeia, para que estes representem o comportamento de toda a cadeia.

114
Anexo III – Eventos
A. Comparação de aminoácidos dois a dois
Evento Nº 1 - “troca” de posição entre dois aminoácidos
Para cada corrida foram procuradas as trocas entre aminoácidos. Nos ficheiros a
designação dos dois aminoácidos LEU_55 e PRO_55 foi substituida pela designação
POS_55 para ser considerada uma posição única.
Tabela 28- Eventos “troca” de posição entre dois aminoácidos
Nº Evento Freq_WT Freq_L55P Nº Evento Freq_WT Freq_L55P
1 ALA_91 spw GLU_42 2 0 30 ASN_98 spw LEU_17 2 3
2 ALA_91 spw GLY_4 0 1 31 ASN_98 spw LYS_80 0 1
3 ALA_91 spw LEU_17 1 2 32 ASN_98 spw PRO_24 2 4
4 ALA_91 spw LYS_80 0 1 33 ASN_98 spw SER_77 2 5
5 ALA_91 spw MET_13 0 2 34 GLU_42 spw GLY_4 1 3
6 ALA_91 spw PRO_24 1 2 35 GLU_63 spw ALA_91 0 2
7 ALA_91 spw SER_77 1 3 36 GLU_63 spw ARG_34 0 2
8 ARG_34 spw ALA_91 3 4 37 GLU_63 spw ASN_98 0 3
9 ARG_34 spw GLY_4 0 1 38 GLU_63 spw GLU_42 2 2
10 ARG_34 spw LEU_17 3 4 39 GLU_63 spw GLY_4 4 4
11 ARG_34 spw LYS_80 0 1 40 GLU_63 spw LEU_17 1 2
12 ARG_34 spw MET_13 1 2 41 GLU_63 spw LYS_80 0 4
13 ARG_34 spw PRO_24 1 2 42 GLU_63 spw MET_13 0 1
14 ARG_34 spw SER_77 0 2 43 GLU_63 spw PRO_24 1 2
15 ASN_124 spw ALA_91 1 0 44 GLU_63 spw SER_77 3 2
16 ASN_124 spw ASN_98 3 2 45 LEU_17 spw GLU_42 1 3
17 ASN_124 spw GLU_42 0 1 46 LEU_17 spw GLY_4 1 2
18 ASN_124 spw GLU_63 2 5 47 LYS_80 spw GLU_42 0 2
19 ASN_124 spw GLY_4 3 4 48 LYS_80 spw GLY_4 4 3
20 ASN_124 spw LEU_17 2 2 49 LYS_80 spw LEU_17 0 2
21 ASN_124 spw LYS_80 4 4 50 LYS_80 spw PRO_24 1 1
22 ASN_124 spw PRO_24 3 2 51 LYS_80 spw SER_77 0 1
23 ASN_124 spw SER_112 2 2 52 MET_13 spw GLU_42 0 1
24 ASN_124 spw SER_117 4 4 53 MET_13 spw GLY_4 0 1
25 ASN_124 spw SER_77 3 1 54 POS_55 spw ALA_91 2 4
26 ASN_98 spw ALA_91 2 3 55 POS_55 spw ARG_34 2 4
27 ASN_98 spw ARG_34 1 2 56 POS_55 spw ASN_124 2 2
28 ASN_98 spw GLU_42 2 4 57 POS_55 spw ASN_98 2 3
29 ASN_98 spw GLY_4 3 3 58 POS_55 spw GLU_42 2 3
59 POS_55 spw GLU_63 2 3 78 SER_112 spw LYS_80 2 2
60 POS_55 spw GLY_4 2 3 79 SER_112 spw PRO_24 2 1

115
61 POS_55 spw LEU_17 2 4 80 SER_112 spw SER_77 2 3
62 POS_55 spw LYS_80 2 3 81 SER_117 spw ALA_91 1 3
63 POS_55 spw MET_13 0 3 82 SER_117 spw ARG_34 2 3
64 POS_55 spw PRO_24 2 3 83 SER_117 spw ASN_98 4 4
65 POS_55 spw SER_112 2 2 84 SER_117 spw GLU_42 5 3
66 POS_55 spw SER_117 2 3 85 SER_117 spw GLU_63 3 2
67 POS_55 spw SER_77 2 3 86 SER_117 spw GLY_4 3 2
68 PRO_24 spw GLU_42 3 3 87 SER_117 spw LEU_17 1 3
69 PRO_24 spw GLY_4 1 3 88 SER_117 spw LYS_80 1 2
70 PRO_24 spw LEU_17 0 2 89 SER_117 spw PRO_24 2 4
71 SER_112 spw ALA_91 1 1 90 SER_117 spw SER_112 5 3
72 SER_112 spw ARG_34 1 1 91 SER_117 spw SER_77 4 3
73 SER_112 spw ASN_98 3 4 92 SER_77 spw GLU_42 0 1
74 SER_112 spw GLU_42 2 3 93 SER_77 spw GLY_4 3 3
75 SER_112 spw GLU_63 2 2 94 SER_77 spw LEU_17 1 2
76 SER_112 spw GLY_4 1 3 95 SER_77 spw PRO_24 1 3
77 SER_112 spw LEU_17 1 2
Evento Nº 2 - “ Existem duas trocas de comportamento de dois aminoácidos
em relação ao centro de massa da proteína”
Tabela 29- Eventos “troca” de posição entre dois aminoácidos
Nº Eventos L55P WT
1 ALA_91_troca_2x_A_POS_55 2 0
2 ALA_91_troca_2x_B_ARG_34 2 0
3 ALA_91_troca_2x_B_ASN_124 1 0
4 ALA_91_troca_2x_B_ASN_98 2 0
5 ALA_91_troca_2x_B_SER_112 2 1
6 ALA_91_troca_2x_B_SER_117 3 0
7 ARG_34_troca_2x_A_SER_117 1 0
8 ARG_34_troca_2x_B_GLU_63 1 0
9 ARG_34_troca_2x_B_SER_112 1 1
10 ASN_124_troca_2x_A_POS_55 0 1
11 ASN_98_troca_2x_A_GLU_63 0 1
12 ASN_98_troca_2x_A_POS_55 2 0
13 ASN_98_troca_2x_A_SER_112 1 1
14 ASN_98_troca_2x_A_SER_117 2 0
15 ASN_98_troca_2x_B_ASN_124 3 2
16 ASN_98_troca_2x_B_GLU_63 2 0
17 GLU_42_troca_2x_A_ALA_91 4 0
18 GLU_42_troca_2x_A_LEU_17 1 0
19 GLU_42_troca_2x_A_POS_55 1 0
20 GLU_42_troca_2x_A_PRO_24 0 1
21 GLU_42_troca_2x_A_SER_117 2 2
24 GLU_42_troca_2x_B_LYS_80 2 0
25 GLU_42_troca_2x_B_SER_112 1 0
26 GLU_42_troca_2x_B_SER_77 1 0
27 GLU_63_troca_2x_A_ASN_124 1 1
28 GLU_63_troca_2x_A_POS_55 2 0
29 GLU_63_troca_2x_A_SER_117 1 0
31 GLY_4_troca_2x_A_ASN_124 1 2
32 GLY_4_troca_2x_A_ASN_98 0 1
33 GLY_4_troca_2x_A_GLU_42 1 0
34 GLY_4_troca_2x_A_GLU_63 3 2
35 GLY_4_troca_2x_A_LEU_17 1 1

116
36 GLY_4_troca_2x_A_LYS_80 0 1
37 GLY_4_troca_2x_A_POS_55 0 1
38 GLY_4_troca_2x_A_PRO_24 0 1
39 GLY_4_troca_2x_A_SER_112 1 1
42 GLY_4_troca_2x_B_ASN_124 1 1
43 GLY_4_troca_2x_B_ASN_98 2 1
44 GLY_4_troca_2x_B_GLU_42 1 0
45 GLY_4_troca_2x_B_GLU_63 2 1
46 GLY_4_troca_2x_B_LYS_80 3 2
47 GLY_4_troca_2x_B_SER_112 1 0
48 GLY_4_troca_2x_B_SER_77 1 0
49 LEU_17_troca_2x_A_ALA_91 1 1
50 LEU_17_troca_2x_A_POS_55 3 0
51 LEU_17_troca_2x_B_ASN_124 2 1
52 LEU_17_troca_2x_B_ASN_98 2 0
53 LEU_17_troca_2x_B_GLU_63 1 0
54 LEU_17_troca_2x_B_LYS_80 1 0
55 LEU_17_troca_2x_B_PRO_24 3 0
56 LEU_17_troca_2x_B_SER_112 2 1
59 LYS_80_troca_2x_A_ALA_91 2 0
60 LYS_80_troca_2x_A_ARG_34 1 0
61 LYS_80_troca_2x_A_ASN_124 2 1
62 LYS_80_troca_2x_A_ASN_98 2 0
63 LYS_80_troca_2x_A_GLU_63 2 0
64 LYS_80_troca_2x_A_POS_55 2 1
65 LYS_80_troca_2x_A_SER_112 2 0
66 LYS_80_troca_2x_A_SER_117 2 2
67 PRO_24_troca_2x_A_ALA_91 2 0
68 PRO_24_troca_2x_A_ARG_34 1 1
69 PRO_24_troca_2x_A_POS_55 2 1
70 PRO_24_troca_2x_A_SER_117 2 1
71 PRO_24_troca_2x_B_ASN_124 0 2
72 PRO_24_troca_2x_B_ASN_98 1 0
73 PRO_24_troca_2x_B_GLU_63 1 0
76 SER_112_troca_2x_A_POS_55 2 2
77 SER_112_troca_2x_A_SER_117 1 2
78 SER_112_troca_2x_B_ASN_124 1 2
80 SER_117_troca_2x_B_ASN_124 1 2
81 SER_77_troca_2x_A_ALA_91 3 0
82 SER_77_troca_2x_A_ARG_34 2 0
83 SER_77_troca_2x_A_ASN_124 1 0
84 SER_77_troca_2x_A_ASN_98 1 0
86 SER_77_troca_2x_A_SER_117 1 2
87 SER_77_troca_2x_B_ASN_124 1 1
88 SER_77_troca_2x_B_ASN_98 1 0
89 SER_77_troca_2x_B_GLU_63 1 1

117
B. Procura de um evento por aminoácido
Tabela 30- Aminoácidos onde se verificou o evento “alteração significativa no comportamento do
aminoácido”.
Evento Freq_WT Freq_L55P Evento Freq_WT Freq_L55P
GLY_4 0 1 ALA_91 1 0
LYS_9 0 1 PHE_95 1 0
ARG_21 0 1 ALA_108 1 0
ASP_38 0 1 LEU_110 1 0
PRO_43 0 1 LEU_111 1 0
SER_46 0 1 SER_112 1 0
VAL_65 0 1 SER_117 1 0
SER_77 0 1 THR_119 1 0
HSD_90 0 1 VAL_121 1 0
ALA_97 0 1 ASN_124 1 0
ASN_98 0 1 PRO_2 1 1
SER_100 0 1 THR_3 1 1
THR_106 0 1 GLY_6 1 1
GLY_22 0 2 SER_8 1 1
PRO_24 0 2 SER_23 1 1
ILE_84 0 2 LYS_35 1 1
GLY_83 0 4 GLY_47 1 1
VAL_16 1 0 GLU_51 1 1
ASP_18 1 0 VAL_94 1 1
ILE_26 1 0 PRO_102 1 1
ASN_27 1 0 THR_118 1 1
VAL_30 1 0 THR_123 1 1
ARG_34 1 0 GLY_57 1 3
ALA_37 1 0 ALA_29 2 0
ALA_45 1 0 HSD_31 2 0
SER_52 1 0 LYS_48 2 0
GLY_53 1 0 THR_59 2 0
LEU_55 1 0 ALA_120 2 0
LEU_58 1 0 GLY_1 2 1
GLU_66 1 0 GLU_92 2 1
GLY_67 1 0 GLY_101 2 1
LEU_82 1 0 TYR_116 2 1
GLU_89 1 0 PRO_86 5 1

118
Tabela 31 - Frequência dos eventos e janela onde ocorre a alteração mais significativa (com maior
declive).
Aa Freq Simulação I-janela F-janela Aa Freq Simulação I-janela F-janela
ASP_38 15 L55_1 9658 9858 GLY_83 7 L55_5 766 966
GLY_22 16 L55_1 2398 2598 ILE_84 7 L55_5 2218 2418
GLY_47 3 L55_1 8328 8528 LYS_9 26 L55_5 5049 5249
GLY_6 39 L55_1 2034 2234 THR_123 3 L55_5 4607 4807
GLY_83 31 L55_1 6652 6852 ALA_120 131 WT2 431 631
HSD_90 35 L55_1 81 281 ALA_29 14 WT2 8946 9146
PRO_102 3 L55_1 3633 3833 ASP_18 28 WT2 3196 3396
PRO_86 27 L55_1 8328 8528 GLU_89 62 WT2 7932 8132
SER_46 2 L55_1 641 841 GLY_1 83 WT2 342 542
THR_118 18 L55_1 8386 8586 GLY_101 49 WT2 124 324
GLU_92 32 L55_2 6777 6977 GLY_47 135 WT2 2630 2830
GLY_57 124 L55_2 1191 1391 GLY_53 2 WT2 3520 3720
PRO_24 77 L55_2 7909 8109 GLY_67 46 WT2 2837 3037
SER_8 38 L55_2 8223 8423 HSD_31 2 WT2 6527 6727
TYR_116 1 L55_2 9405 9605 LEU_111 21 WT2 1264 1464
ALA_97 44 L55_3 4518 4718 PHE_95 64 WT2 4130 4330
GLY_1 6 L55_3 4213 4413 PRO_86 55 WT2 7536 7736
GLY_101 6 L55_3 2105 2305 VAL_30 130 WT2 7698 7898
GLY_4 13 L55_3 8249 8449 ALA_108 142 WT3 198 398
GLY_57 3 L55_3 4426 4626 ALA_91 18 WT3 1 201
GLY_83 11 L55_3 1737 1937 ASN_27 128 WT3 3520 3720
PRO_2 1 L55_3 3452 3652 GLU_66 77 WT3 4722 4922
PRO_43 39 L55_3 4455 4655 GLU_92 83 WT3 256 456
SER_23 1 L55_3 5230 5430 GLY_6 14 WT3 1439 1639
VAL_65 26 L55_3 2185 2385 HSD_31 62 WT3 9520 9720
ARG_21 94 L55_4 9764 9964 ILE_26 33 WT3 526 726
ASN_98 9 L55_4 4785 4985 LEU_110 43 WT3 550 750
GLY_83 19 L55_4 5247 5447 LYS_48 19 WT3 9222 9422
ILE_84 5 L55_4 4420 4620 PRO_86 53 WT3 305 505
LYS_35 19 L55_4 3538 3738 THR_118 54 WT3 2716 2916
PRO_24 211 L55_4 3771 3971 THR_123 47 WT3 4968 5168
SER_100 12 L55_4 6007 6207 THR_59 6 WT3 7510 7710
SER_77 3 L55_4 2925 3125 ASN_124 79 WT4 124 324
THR_106 16 L55_4 4457 4657 GLY_57 24 WT4 218 418
THR_3 104 L55_4 535 735 LYS_48 41 WT4 6299 6499
VAL_94 4 L55_4 8527 8727 PRO_86 16 WT4 626 826
GLU_51 134 L55_5 2941 3141 ALA_120 18 WT5 1794 1994
GLY_22 59 L55_5 3864 4064 ALA_37 55 WT5 5773 5973

119
GLY_57 1 L55_5 8516 8716 GLU_51 14 WT5 8818 9018
GLY_1 24 WT5 1834 2034 VAL_16 14 WT5 3248 3448
LEU_55 13 WT5 4962 5162 ALA_29 41 WT6 1104 1304
PRO_102 5 WT5 9177 9377 ALA_45 2 WT6 5693 5893
PRO_2 4 WT5 3862 4062 ARG_34 29 WT6 594 794
PRO_86 20 WT5 4197 4397 GLU_92 6 WT6 426 626
SER_112 12 WT5 456 656 GLY_101 1 WT6 6170 6370
SER_117 5 WT5 5554 5754 LEU_58 12 WT6 1807 2007
SER_23 1 WT5 1154 1354 LEU_82 2 WT6 3945 4145
SER_52 112 WT5 3750 3950 LYS_35 29 WT6 9692 9892
THR_119 39 WT5 8464 8664 PRO_86 88 WT6 2544 2744
THR_3 2 WT5 5064 5264 SER_8 19 WT6 1511 1711
THR_59 4 WT5 1076 1276 TYR_116 67 WT6 8194 8394
TYR_116 1 WT5 4532 4732 VAL_94 84 WT6 719 919
VAL_121 30 WT5 273 473

120
Anexo IV- Regras de Associação
A. Análise Gráfica da regra nº1

121

122
Anexo V- Código em R
#Read data
dad<-read.csv(choose.files(),sep='t')
attach(dad)
#Moving Average Filter
d<-VAL_71
m<-length(d)
n<-15
apply(as.array((n+1):m),1,function(x)mean(d[(x-n):x]))->s
plot(s,type = "l",ylab='Dist_C_ALPHA_VAL_71_ CM',xlab='Tempo')
##Statistics
mean(WTRUN2[-1])->medias
summary(WTRUN2[-1])->sumario
cor(WTRUN2[,-1], method = "pearson", use = "complete")->corr
write.table(corr,'correlações.txt')
##Plots
d<-VAL_71
m<-length(d)
n<-15
op <- par(mfrow = c(1,2))
plot(s,type = "l",ylab='Dist_C_ALPHA_VAL_71_ CM',xlab='Tempo',ylim =
c(0,40))
title(main = "VAL_71", font.main = 4)
d<-GLY_1
m<-length(d)
n<-15
plot(s,type = "l",ylab='Dist_C_ALPHA_GLY_1_ CM',xlab='Tempo',ylim =
c(0,40))
title(main = "GLY_1", font.main = 4)
d<-SER_50
m<-length(d)
n<-20
apply(as.array((n+1):m),1,function(x)mean(d[(x-n):x]))->F
matplot(c(1, 10002), c(0,40), type= "n", xlab = "Tempo", ylab =
"Distância ao centro de massa",main = "WT_SER_23_spw_SER_50")
matpoints(s, pch = "l")
matpoints(F, pch = "l",col = "blue")
legend(1, 32, c("SER_23", "SER_50"), pch = "**",col =
c('black','blue'))
##Find number of clusters – Millican & Cooper Index
m<-t(run[,-1][,-55])
ind<-NULL
for (i in 10:20){
ds<- dist(m,method='euclidean')
tr<- hclust(ds,method='ward')
ind<-
c(ind,cluster.stats(ds,cutree(tr,i),silhouette=TRUE,G2=TRUE,G3=TRUE)$g
3)
ind}
L55_5_G3<-ind

123
tudoWT_s55<-
rbind(WT2_G2,WT2_G3,WT3_G2,WT3_G3,WT4_G2,WT4_G3,WT5_G2,WT5_G3,WT6_G2,W
T6_G3)
tudoL55_s55<-
rbind(L55_1_G2,L55_1_G3,L55_2_G2,L55_2_G3,L55_3_G2,L55_3_G3,L55_4_G2,L
55_4_G3,L55_5_G2,L55_5_G3)
##Hierarchical Clustering
hclust(dist(t(WTRUN2[,-1]), method = "euclidean"), method = "ward")-
>tree
plclust(tree, hang = 0.1, unit = TRUE, level = FALSE, main =
"Dendrograma",hmin =0, xlab = NULL, ylab = "Distância")
cutree(tree,14)->aWTRUN2
write.table(aWTRUN2,'cl_WTRUN2.txt')
plot(rep(1,127),col=aWTRUN2,pch=20,xlab='Aminoácidos', ylab='Classes
atribuídas')
##Dissimilarities
d <- matrix(0,127,127)
m<-clWT
rownames(d)<-rownames(m)
for(i in 1:(nrow(m)-1)) for(j in (i+1):nrow(m)) d[i,j]<-d[j,i]<-
sum(as.numeric((m[i,]!=m[j,])))
rownames(d)<-rownames(m)
colnames(d)<-rownames(m)
d
plclust(hclust(as.dist(d),method = "average"))
cutree(hclust(as.dist(d),method = "average"),h=4)->cl_finais_WT
write.table(cl_finais_WT,'cl_finais_WT.txt')
plot(rep(1,127),col=cl_finais_WT,pch=20,xlab='Aminoácidos',
ylab='Classes atribuídas', main='Classificação_WT')
##Representatives Aa.
aa<-NULL
for (i in 1:14){
t(run)[-1,][classes==i,]->t
m<-apply(t,2,mean)
rbind(m,t)->d
dist(d)->t1
as.matrix(t1)->t1
which.min(t1[-1,1])->aa1
aa<-c(aa,aa1)
aa
}
##Find events
# EV1
n=300
run<-WTRUN2
attach(run)
res<-
c('GLY_4','GLU_42','LEU_17','MET_13','PRO_24','SER_77','LYS_80','ALA_9
1','ARG_34','ASN_98','GLU_63','SER_112','SER_117','ASN_124','PRO_55')
evento<-NULL

124
for(i in 2:length(res)){
for(j in 1:(i-1)){
s <- as.numeric(run[res[i]]>run[res[j]])
soma<-vector(mode = "numeric", length =(length(s)-n+1) )
for(l in 1:length(soma)){
soma[l]<-sum(s[l:(l+n-1)])
}
a<-length(which(soma==0))
b<-length(which(soma==n))
if (a>0 & b>0)
evento<-rbind(evento,paste(res[i],'spw',res[j]))
print(evento)
}
}
# EV2
n=200
for(i in 1:(length(res)-1)){
for(j in (1+i):(length(res))){
print(i)
print(j)
s <- as.numeric(run[,res[i]]>run[,res[j]])
soma<-vector(mode = "numeric", length =(length(s)-n+1))
for(l in 1:length(soma)){
soma[l]<-sum(s[l:(l+n-1)])
}
#plot(soma,type='l')
if (length(which(soma[1:2000]==n))>0 &
length(which(soma[2001:(10002-n-2000)]==0))>0
& length(which(soma[(10002-n-2000+1):(10002-n+1)]==n))>0)
evento<-rbind(evento,paste(res[i],'troca_2x_A',res[j]))
if (length(which(soma[1:2000]==0))>0 &
length(which(soma[2001:(10002-n-2000)]==n))>0
& length(which(soma[(10002-n-2000+1):(10002-n+1)]==0))>0)
evento<-rbind(evento,paste(res[i],'troca_2x_B',res[j]))
}
print(evento)
}
eventoF<-rbind(eventoF,cbind(evento,rep('WT6',length(evento))))

125
#EV_P_AA
WTRUN2[,-1]->run
attach(run)
m<-NULL
evento<-NULL
n<-200
a<-NULL
Freq<-NULL
time<-NULL
for(j in 1:127){
print(j)
v<-run[,j]
for(i in 1:(length(v)-n)){
Max<-max(v[i:(i+n-1)])
Min<-min(v[i:(i+n-1)])
x1<-which.max(v[i:(i+n-1)])
x2<-which.min(v[i:(i+n-1)])
m[i]<-abs((Max-Min)/(x1-x2))
}
f<-length(which(m>1))
M<-which.max(m)
if (f>=1)
a<-cbind(a,j)
if (f>=1)
Freq<-cbind(Freq,f)
if (f>=1)
time<-cbind(time,M)
}
t(rbind(a, Freq,time))
#Find frequent events
freq<-table(ev[,1])
rownames(freq)<-c(1:length(freq))
barplot(sort(freq,decreasing=T)[1:10],col=c('lightblue'),horiz=T)
title(main = "Events frequencies", font.main = 4)
freq1<-table(ev[1:156,1])
rownames(freq1)<-c(1:length(freq))
barplot(sort(freq1,decreasing=T)[1:10],col=c('lightblue'),horiz=T)
title(main = "Eventos mais frequentes na WT-TTR", font.main = 4)
freq2<-table(ev[156:391,1])
rownames(freq2)<-c(1:length(freq2))
barplot(sort(freq2,decreasing=T)[1:10],col=c('lightcyan'),horiz=T)
title(main = "Eventos mais frequentes na L55P-TTR", font.main = 4)

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