06 citogenetica
- 1. Citogenetica : analisi dei cromosomi NUMERO , MORFOLOGIA e…. • CROMATINA : contenuto granulare del nucleo (DNA e proteine) - eterocromatina (elementi ripetitivi) - eucromatina (sequenze trascritte) • CROMOSOMI : 46 molecole di DNA duplicate e spiralizzate visibili durante la divisione cellulare (metafase) - n° caratteristico per ogni specie - lunghezza e morfologia definite - bandeggio caratteristico con sostanze coloranti (Giemsa, Quinacrine)
- 2. 1956 Tijo e Levan 46 cromosomi umani 1959 Anomalie di numero trisomia 21: s. di Down 45, X : s. di Turner 47, XXY : s. di Klinefelter 1960 Anomalie di struttura Cromosoma di Philadelphia (LMC) 1968 Caspersson Bandeggio cromosomico Trattamento di cellule in metafase con soluzione ipotonica t(7;11)(p15;p15)
- 3. Linfociti T PHA Colchicina Blocco in metafase Soluzione ipotonica e fissazione FISH (1982) ibridazione fluorescente in situ denaturazione del DNA cromosomico e ibridazione con sonda fluorescente
- 4. microscopio ottico - bandeggio G Analisi convenzionale del cariotipo
- 5. ideogrammi p = braccio corto q = braccio lungo numerazione delle bande dal centromero al telomero Analisi convenzionale (microscopio ottico)
- 6. Come si riconoscono i singoli cromosomi ? Posizione del centromero metacentrico acrocentrico p q p q Analisi convenzionale (microscopio ottico)
- 7. telomero telomero centromero Bandeggio G caratteristico bande G CHIARE ricche in GC molti geni bande G SCURE ricche in AT pochi geni
- 8. risoluzione cariotipo: 400 550 850 ( n. bande totali per corredo aploide ) Cromosoma 7 Diverse risoluzioni di bandeggio G 16 bande 24 bande 46 bande
- 9. Bandeggio C (eterocromatina) Notare le grandi regioni eterocromatiche dei cromosomi 1 e 9 Analisi convenzionale (microscopio ottico) 9 9 1 1
- 10. Indicazioni all’analisi del cariotipo • Cariotipo costituzionale : – sospetto clinico di patologia cromosomica – ritardo di crescita o di sviluppo, facies dismorfica, malformazioni multiple – ritardo mentale – genitali ambigui o disgenesia gonadica – sterilità e coppie con aborti ripetuti – storia famigliare positiva per anomalie cromosomiche • Aborto spontaneo, morte alla nascita o neonatale • Gravidanze con età materna > 35 anni • Neoplasie (ematologiche)
- 11. Anomalie del cariotipo • Anomalie di numero : – Trisomie (21, 13, 18, X, Y) – Monosomie (45, X) – Tri- Tetra-ploidie (3N, 4N con N=23) • Anomalie di struttura : – Traslocazioni (bilanciate e non) – Inversioni, cromosomi ad anello, isocromosomi – Delezioni, duplicazioni • Sindromi da instabilità cromosomica e siti fragili : – Atassia-Telangiectasia, Anemia di Fanconi, S. di Bloom.. – X fragile • Citogenetica oncologica : – Traslocazioni cromosomiche caratteristiche..
- 12. Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali (68.159 nati vivi) Crom. sessuali in MASCHI 1 / 360 Crom. sessuali in FEMMINE 1 / 580 Aneuploidie degli autosomi 1 / 700 Anomalie strutturali (autosomi, X e Y) 1 / 375 Tipo di anomalia Incidenza Totale anomalie = 442 1 / 154 Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.
- 13. Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali (68.159 nati vivi) Crom. sessuali in MASCHI (43.612) 1 / 360 47,XXY 1 / 1.000 47,XYY 1 / 1.000 altre aneuploidie X o Y 1 / 2.350 Crom. sessuali in FEMMINE (24.547) 1 / 580 45,X 1 / 4.000 47,XXX 1 / 900 altre aneuploidie X 1 / 2.700 Tipo di anomalia Incidenza Totale anomalie = 442 1 / 154 Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.
- 14. Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali (68.159 nati vivi) Aneuploidie degli autosomi 1 / 700 Trisomia 21 1 / 830 Trisomia 18 1 / 7.500 Trisomia 13 1 / 22.700 altre aneuploidie 1 / 34.000 Anomalie strutturali (autosomi, X e Y) 1 / 375 Bilanciate ( Non Robertsoniane ) 1 / 885 Bilanciate ( Robertsoniane ) 1 / 1.100 Sbilanciate ( Non Robertsoniane) 1 / 1.800 Sbilanciate ( Robertsoniane ) 1 / 13.600 Tipo di anomalia Incidenza Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.
- 15. Incidenza di anomalie cromosomiche in stadi diversi di vita fetale e neonatale incidenza 1 / 2 1 / 50 1 / 160 Anom. numeriche 96 % 85 % 60 % Anom. strutt. Bilanciate --- 10 % 30 % Anom. strutt. Sbilanciate 4 % 5 % 10 % aborti feti di madri >35 1° trimestre amniocentesi nati vivi Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.
- 16. Frequenza di anomalie cromosomiche in aborti spontanei con cariotipo anomalo ( su 8.841 aborti spontanei non selezionati ) Aneuploidie Trisomie autosomiche 52 % Monosomie autosomiche < 1% 45,X 19 % Triploidie 16 % Tetraploidie 6 % Altre 7 % Tipo di anomalia % sul totale delle anomalie Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.
- 17. Esito di 10.000 concepimenti Triploidie / Tetraploidie 170 170 100 % ---- 45,X 140 139 99 % 1 Trisomia 13 112 112 100 % ---- Trisomia 18 20 19 85 % 1 Trisomia 21 45 35 78 % 10 Altre trisomie 209 208 99.5% 1 Riarrang. Sbilanciati 27 23 85 % 4 47,XXY 47,XXX 47,XYY 19 4 21 % 15 Aborti spontanei Concepimenti N. % nati vivi Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus. Cariotipo Normale 9.200 750 8 % 8.450 Cariotipo Anomalo 800 750 94 % 50 Totale 10.000 1.500 15 % 8.500
- 18. Anomalie Cromosomiche • numeriche – trisomie (cromosoma aggiuntivo) – monosomie (perdita di un cromosoma) – poliploidie (multipli di 23 crom. aggiuntivi) – ESAC (cromos. anomalo sovrannumerario)
- 21. Trisomia 21 47, XY,+ 21
- 22. Sindrome di Down (1/800) • Facies caratteristica • brachicefalia, occipite piatto, collo corto • bassa statura, ipotonia • mani corte e larghe, piega palmare, clinodattilia • ritardo mentale (QI: 30-60) • cardiopatie (30-35%), atresia duodenale, fistolaTE • rischio aumentato di leucemie • prematura senilità, segni Alzheimer-like 95% : trisomie libere (ND materna - meiosi 1: 90%) 4% : traslocazioni robertsoniane rob(14;21) rob(21;22) < 1% : isocromosoma 21, mosaici, trisomie parziali
- 23. Sindrome di Down: Trisomia 21 libera da NON disgiunzione meiotica 90% dei casi materna 10% dei casi paterna o materna rischio empirico di ricorrenza per la coppia : 1%
- 24. Incidenza della sindrome di Down 15-19 1/1250 20-24 1/1400 25-29 1/1100 30 1/900 33 1/625 1/420 1/370 35 1/385 1/250 1/250 37 1/225 1/150 1/175 40 1/100 1/70 1/80 42 1/65 1/40 1/30 44 1/40 1/25 1/25 Età materna Alla nascita Amniocentesi Villocentesi 16ma sett. 9-11ma set t. Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.
- 25. Sindrome di Down: Trisomia 21 da traslocazione “robertsoniana” (4%) rob (14;21) rob (21;22) i (21;21)
- 30. Cugina di I° grado con figlia Down, rischio per la gravidanza in corso ? ? 37 35 33 Rara possibilità di Down “ereditario” se trisomia NON libera: R = 4% (rarissimo mosaicismo germinale con RR solo per la coppia) 4% 2% 1% 0.5% 0.25% 0.125% Rischio per età : a 29 anni 1/1100 a 37 anni 1/225
- 31. D. cromosoma ad anello E. traslocazioni N A reciproche N A AN robertsoniane N N A F. sito fragile AN A. delezioni interstiziale N A terminale N A B. duplicazioni tandem N A invertita N A C. inversioni paracentrica pericentrica N A AN
- 33. 10 10der 11 11der
- 34. Conseguenze delle anomalie cromosomiche di struttura • perdita / acquisizione di materiale genetico – monosomie parziali – trisomie parziali • interessamento di un gene/i nel punto di rottura – perdita di funzione di un gene – formazione di un gene di fusione – difetto di imprinting • nessuna conseguenza in termini quantitativi o di funzione genica ma: – inattivazione della X normale nelle t (X;A) – segregazione sbilanciata alla meiosi o mitosi – predisposizione ad ulteriori riarrangiamenti
- 36. 7 sett 8 sett 2 2
- 37. Sindrome di Miller-Dieker Genitore sano: inv. peric. crom.17 Figlio con M-D: dup (17q), del (17p) Sonde: LIS-1 (17p13.3) RARα (17q12)
- 40. Madre a mosaico e unica linea nella figlia SP510/02
- 42. SONDA BCR(22q11)-ABL(9q34) crom. 22 crom. 22 crom. 9 crom. 9 NEGATIVA
- 45. Sonda: DiGeorge 22q11.2 (gene Tuple1) Controllo 22q13.3 (gene ARSA)
- 46. Sindrome da delezione 22q11.2 3 fenotipi, anche nella stessa famiglia: • sindrome di DiGeorge (in neonati): – difetto cell. T (ipoplasia timo) – ipo-calcemia (ipoparatirodismo) • sindrome Velo-Cardio-Faciale (di Shprintzen): – anomalie cranio-faciali e del palato – bambini con voce nasale • Cardiopatia tronco-conale (sindrome di Takao): – predominano le anomalie cardiache – tetralogia di Fallot, interruzzione arco aortico (tipo B) – tronco arterioso, destropos. arco aortico, art. succl. destra aber. Fenotipo “CATCH”: Cardiac Abnormality, T cell defect, Clefting, Hypocalcemia
- 47. Sindrome da delezione 22q11.2 • Incidenza : 1/2000-4000 nati • 5% dei neonati con difetti cardiaci • > 40% di Tetralogia di Fallot + atresia v. polmonare • > 60% di Tetralogia di Fallot + assenza di v. polmonare 3 Mb delezione sindrome del 22q11.2 duplicazione sindrome “cat eye”
- 48. Sonde: • Williams 7q11.23 • controllo 7q31 Sindrome di Williams Delezione 7q11.23
- 49. Sindrome di Williams-Beuren Volto caratteristico: ripienezza peri / supra orbitale (specie supero-laterale), sopraciglia e ciglia rade nella regione mediana, gote gonfie ribassate….
- 50. Volto caratteristico: …. naso corto con sella nasale schiacciata filtro liscio e lungo iride stellata Difetto cardiaco: stenosi aortica sopra-valvolare Ritardo mentale con personalità estroversa A volte ipercalcemia nell’infanzia sinostosi radio-ulnare (10% dei casi)
- 52. Sonda cromosoma- specifica nucleo in interfase cromosomi in metafase
- 53. FISH su nuclei in interfase Normale Trisomia 21
- 54. Anomalie cromosomiche multiple (cromos. 1, 3, 6 e 11)
- 55. Traslocazione complessa 1, 3, 6, 11
- 56. Traslocazione complessa 1, 3, 6, 11
- 57. Traslocazione complessa 1, 3, 6, 11
- 59. CGH Comparative Genome Hybridization Identificazione di regioni cromosomiche perse o amplificate Cellule tumorali Cellule normali Estrazione del DNA e marcatura con fluorocromi Ibridazione metafasi Piastre di cloni genomici