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ヒ ー ト マ ッ プ 図
• 組織ごとにクラスタリングされた
• 肝臓でmir-122の発現が高かった
（赤矢印）
• mir-122は肝臓特異的に発現する
miRNAであることが論文で報告さ
れている[1]
脳脳肝
臓
肝
臓
精
巣
精
巣
[1] Landgraf P, et al.
A mammalian microRNA expression atlas based on
small RNA library sequencing.
Cell. 2007 Jun 29;129(7):1401-14. PubMed PMID: 17604727](https://image.slidesharecdn.com/23mirna-seqslideshare-141218231932-conversion-gate01/85/miRNA-_-23-21-320.jpg)
miRNAデータ解析入門_第23回勉強会資料
- 1. m i R N A デ ー タ 解 析 入 門 第 2 3 回 勉 強 会 資 料 2013年6月15日
- 2. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 2 m i R N A と は • タンパク質をコードしない、ノンコーディングRNAの一種 • 他の遺伝子のイントロンのアンチセンス鎖などから転写 される • 転写後、ヘアピン構造のprecursor miRNAになった後、 Dicerによって切り出されて長さ20～25bp程度のmature miRNAとなって機能する • miRNA上の一部分が他の遺伝子の一部分に結合する ことで遺伝子の発現が制御される • 細胞の発生、分化、増殖、がん化などに深く関与するこ とが知られている http://ja.wikipedia.org/wiki/MiRNA
- 3. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 最 近 の m i R N A 関 連 記 事 3 BioToday 2013-05-10 マイナビウーマン 2013-04-27 MTPro 2013-05-08 日経バイオテクONLINE 2013-04-11
- 4. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 4 m i R N A 解 析 の 一 般 的 な 流 れ Single-endで シーケンシング アダプタを除去 10bp未満を 破棄 既知配列と比較 mature miRNA, other ncRNA, exon, intergenic/intronic 既知 miRNA 発現量正規化 TPM（*1） サンプル間比較 SAM（*2）、Fold Change *1: transcript per million *2: Significance Analysis of Microarrays データのクリーニング・解析前処理 アノテーション リードを クリーニング 既知 other ncRNA 参考： BMC Genomics. 2010 May 7;11:288. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20459673 BGI Japan http://www.bgisequence.com/jp/services/sequencing-services/rna-sequencing/small-rna-sequencing/ intergenic/intronic にある 未知転写物 新規 miRNA 新規miRNA予測 ターゲット予測 Pathway分類 GO分類 発現比較 転写物＋両端70bpを miRNA予測 既知 exon uniqueなFastaに変換してから解析することが多い 二次構造や 既知モデルとの比較 Pathway分類 GO分類
- 5. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 5 m i R N A の シ ー ケ ン シ ン グ • 原則的にSingle End • シーケンシング長は35～50bp程度で十分 • miRNAのキャプチャキット – mirVana™ miRNA Isolation Kit （ライフテクノロジー） – TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit （イルミナ） など
- 6. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 6 テ ス ト デ ー タ を 用 い た 解 析 例
- 7. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. テ ス ト デ ー タ • 哺乳類miRNAをGAII、Single End でシーケンシングした結果が公開されている – http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/study?acc=ERP000773 • 今回はそのうちのヒト由来3組織×2サンプル＝計6サンプルを使用 7 ID 説明 リード長 リード数 ERR038405 ヒト 脳由来 miRNA 43 21,758,606 ERR038406 43 20,241,515 ERR038410 肝臓由来 51 10,514,371 ERR038411 26 8,399,589 ERR038415 精巣由来 26 7,130,991 ERR038416 26 9,378,202
- 8. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 8 テ ス ト デ ー タ の ク オ リ テ ィ を チ ェ ッ ク • FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）でチェック – → クオリティスコアの低いリードが入っている – → 一部のサンプルでアダプタ配列が混入している クリーニングが必要
- 9. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. ク リ ー ニ ン グ • クリーニング条件 – クオリティスコアが20未満の塩基を80%以上含むリードを破棄 – クオリティスコアが20未満の塩基をトリミング – トリミングの結果、10bpより短くなったリードを破棄 • FastX-Toolkit（fastq_quality_filter、fastq_quality_trimmer）でクリーニング • クリーニング前後のリード配列を、FastQC （http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）でチェック 9 $ fastq_quality_filter -i SRR060981.fastq -q 20 -p 80 -Q33 | fastq_quality_trimmer -t 20 -l 10 -Q33 -o SRR060981_clean.fastq
- 10. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 10 ク リ ー ニ ン グ 前 後 の ク オ リ テ ィ 比 較 クオリティの悪い塩基・ リードが除去された
- 11. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. ア ダ プ タ 配 列 除 去 • 一部のサンプルで以下のアダプタの混入が確認された – Illumina PCR Primer Index 1 • TACAGTCCGACGATCTCGTATGCCGTCTTC • CTACAGTCCGACGATCTCGTATGCCGTCTT – Illumina Single End Adapter 2 • TCGTATGCCGTCTTCTGCTTGAAAAAAAAA • cutadapt（http://code.google.com/p/cutadapt/）を用いてアダプタ除去を行った 11
- 12. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. ア ダ プ タ 配 列 除 去 • cutadapt実行前後の各アダプタ（全長）出現数 12 ID Illumina PCR Primer Index 1 TACAGTCCGACGATCTCGTA TGCCGTCTTC Illumina PCR Primer Index 1 CTACAGTCCGACGATCTCGT ATGCCGTCTT Illumina Single End Adapter 2 TCGTATGCCGTCTTCTGCTT GAAAAAAAAA 除去前 除去後 除去前 除去後 除去前 除去後 ERR038405 8 0 16 0 3 0 ERR038406 264 0 495 0 45 0 ERR038410 2 0 2 0 0 0 ERR038411 0 0 0 0 0 0 ERR038415 0 0 0 0 0 0 ERR038416 0 0 0 0 0 0 アダプタが全長で入っているようなものは完全に除去できた →アダプタが断片的に入っているようなものはどうか？
- 13. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. ア ダ プ タ 配 列 除 去 • cutadapt実行前後の各アダプタ（前半15塩基）出現数 13 ID Illumina PCR Primer Index 1 TACAGTCCGACGATCTCGTA TGCCGTCTTC Illumina PCR Primer Index 1 CTACAGTCCGACGATCTCGT ATGCCGTCTT Illumina Single End Adapter 2 TCGTATGCCGTCTTCTGCTT GAAAAAAAAA 除去前 除去後 除去前 除去後 除去前 除去後 ERR038405 82 45 99 39 552 0 ERR038406 1,402 91 2,217 78 21,281 11 ERR038410 2 0 2 0 3 0 ERR038411 5 0 4 1 38 0 ERR038415 27 0 14 0 77 0 ERR038416 154 3 124 2 995 0 「アダプタ断片」は少し残っている可能性がある
- 14. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. ア ダ プ タ 配 列 除 去 • cutadapt実行前後の各アダプタ（後半15塩基）出現数 ※赤字配列をgrep 14 ID Illumina PCR Primer Index 1 TACAGTCCGACGATCTCGTA TGCCGTCTTC Illumina PCR Primer Index 1 CTACAGTCCGACGATCTCGT ATGCCGTCTT Illumina Single End Adapter 2 TCGTATGCCGTCTTCTGCTT GAAAAAAAAA 除去前 除去後 除去前 除去後 除去前 除去後 ERR038405 552 0 130 0 3 0 ERR038406 21,281 11 4894 3 48 3 ERR038410 3 0 2 0 0 0 ERR038411 38 0 0 0 0 0 ERR038415 77 0 0 0 0 0 ERR038416 995 0 3 0 0 0 ※3つ目のアダプタの 前半15塩基と同じ 「アダプタ断片」は少し残っている可能性がある
- 15. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 15 ア ノ テ ー シ ョ ン • fastqをfastaに変換（配列が同一のものは1つにまとめる） • 作成したfastaを、既知mature miRNAデータにマッピング（blastn）し、 最もe-valueの小さい結果を採用した • mature miRNAにマッピングできなかったものはprecursor miRNA、 ncRNA、既知遺伝子の順にマッピングし、アノテーションをつけた miRBase V19 mature miRNA miRBase V19 precursor miRNA Rfam V11 other ncRNA refSeq Gene not mapped not mapped not mapped
- 16. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 16 既 知 h u m a n m a t u r e m i R N A の 発 現 比 較 • サンプルごとに総リード数は異なる（＝実験時のバイアスなど） →サンプル間で発現を比較するには補正が必要 ID アダプタ 除去後 ERR038405 59,245 ERR038406 723,434 ERR038410 460 ERR038411 32,323 ERR038415 157,294 ERR038416 656,099 例えばあるmiRNAが ERR038406に15リード、ERR038410に13リード あった場合、単純に 「ERR038406のほうが発現が高い」とは言えない →「マップできたリード数」などで補正する
- 17. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 17 既 知 h u m a n m a t u r e m i R N A の 発 現 比 較 • 各サンプルにおける発現量（補正前）
- 18. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 18 既 知 h u m a n m a t u r e m i R N A の 発 現 比 較 • 各サンプルにおける発現量（補正後） – 「human mature miRNAにマップできたリード数（単位：100万）」で割る
- 19. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 19 既 知 h u m a n m a t u r e m i R N A の 発 現 比 較 • 補正による発現量の変化の例 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 ERR038405 ERR038406 ERR038410 ERR038411 ERR038415 ERR038416 hsa-let-7g-5p 補正前 補正後
- 20. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 20 ヒ ー ト マ ッ プ 図 • 補正後の発現量データをRに読み込む > mirna <- read.table("補正後の発現量ファイル", header=T, row.names=1) 補正後発現量の合計が大きい順 50データを用いた
- 21. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 21 ヒ ー ト マ ッ プ 図 • 組織ごとにクラスタリングされた • 肝臓でmir-122の発現が高かった （赤矢印） • mir-122は肝臓特異的に発現する miRNAであることが論文で報告さ れている[1] 脳脳肝 臓 肝 臓 精 巣 精 巣 [1] Landgraf P, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 2007 Jun 29;129(7):1401-14. PubMed PMID: 17604727
- 22. Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved. 22 ま と め • miRNAシーケンシングデータ解析で留意すべき点 – アダプタが混入していたら、適切に除去する – 既知miRNAやncRNAにマッピングしてアノテーションをつける – 新規miRNAを予測するソフトもある – 発現量を比較する場合は「マッピングできたリード数」などで補正する
- 23. Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved. 23 アメリエフ バイオインフォマティクス 調査リクエストサービス バイオ研究の解析に使用するソフトや解析手法について、 無償で調査するサービスです。調査結果はアメリエフの ブログでご紹介いたします。 申込みフォーム http://goo.gl/g3SOtU ア メ リ ク