![大規模発現量観測の小史
各遺伝子由来のタグの計数
ランダムに抽出したmRNA中の，特定の部位の配列を特定し，遺伝子発
現量の推定を行う方法
SAGE [Velculescu et al. 1995], BodyMap [Kawamoto et al. 2000]
2003年頃の段階で，定量性を得るために，一つの組織から100万タ
グを超えるデータを取ることを目標にしていた．
CAGE [Shiraki et al. 2003], 5 -SAGE [Hashimoto et al. 2004]
RNA-seq [Ryan et al., 2008, Maher et al. 2009]
ハイブリベースの方法
予め，各遺伝子に対応したプローブを用意しておき，そこにハイブリし
たmRNAタグの量を，蛍光量などに変換して，観測する
マイクロアレイ [Tse-Wen, 1983, Schena et al. 1995]](https://image.slidesharecdn.com/20141217sigbiopub-141217082915-conversion-gate01/85/RNAseq-A-Review-3-320.jpg)
![RNA-seq解析の流れ
リードをゲノムへマッピング
各遺伝子上のリード数を計数
各サンプル毎
各サンプル毎
まとめて表を作成する
全体で１つ
ゲノム配列が決定されいてる種を想定
変動発現遺伝子
の抽出
クラスタリング等
正規化
機能解析
1. RNA-seqでは，各ライブラリか
ら出てくるタグ数が一致しないの
で，仮想的に一致させる．遺伝子
長でもタグ数は異なる．
2. サンプルによってバイアスがあ
ることがあり，必要に応じて補正
を要する．
1の例として，RPKM [Montazavi et al., 2008]
遺伝子(Exon)上の全リード * 1,000
実験で読まれた全リード(100万単位) * 遺伝子(Exon)長
2は，マイクロアレイ時にも行われていた．
非常に高発現な数遺伝子の変動に全体が
ひきずられる結果，数千遺伝子が変動している
ように見えてしまう．](https://image.slidesharecdn.com/20141217sigbiopub-141217082915-conversion-gate01/85/RNAseq-A-Review-7-320.jpg)
![RNA-seq解析の流れ
リードをゲノムへマッピング
各遺伝子上のリード数を計数
各サンプル毎
各サンプル毎
まとめて表を作成する
全体で１つ
ゲノム配列が決定されいてる種を想定
変動発現遺伝子
の抽出
クラスタリング等
正規化
機能解析
RNA-seq時代になって，
Biological replicateを取るこ
とが必須となっている．
そのreplicateを使って，2群間比
較を行い，統計的に有意な発現変
動のある遺伝子群を抽出する
edgeR [Robinson et al. 2010],
DESeq [Anders et al. 2010],
SAGE法の後期では，同様の研究が
行われており，その理論を
RNA-seqに転用している．](https://image.slidesharecdn.com/20141217sigbiopub-141217082915-conversion-gate01/85/RNAseq-A-Review-8-320.jpg)
![負の二項分布を用いたモデル化
• ポアソン分布に分散を表す変数を加えたい
• 負の二項分布を用いて表すモデル化が採用されている (edgeR,
DESeq, cuffdiff2など)
• 負の二項分布は，ポアソン分布に変数を１つ加えたもの，あるいは，
複数のポアソン分布の混合分布として計算することが可能．
• 計測点が3点のみでは計算した分散の値が信頼出来ない問題は解消さ
れていないことに注意．
P(Y = y) =
✓
n
y
◆
py
(1 p)n y
二項分布：
負の二項分布：
の値をとっているわけではなく，
など，様々な状態を反映している
全に一致した値になることは無い
NA-seq を利用した多くの 2 群間
群から複数回のサンプル（生物学
，2 群間の比較が行われる．各遺
応の無い 2 群間比較の問題と考え
で行われる実験の回数は，実験費
意の難しさから，各群の実験が 3
少ないことも多い．この少ない実
題となる．
用される検定として t 検定（ス
挙げられる．t 検定では，2 群間
来かを検定する．
の RNA-seq を行ったとする．そ
, Aa とする．同様に群 B から b
れぞれ B1, B2, ..., Bb とする．こ
ことが知られている．一方，実際にデータを調べると，
大きい所では，分散が λ より大きな値を取っている事
られている ([4] の Figure 1，あるいは [2] の Supplemn
Text Figure 2.)．このため，ポアソン分布を用いて検
行うと，特に発現量が大きい遺伝子に対して，本来の
上に低い P 値を算出する可能性がある．
過分散が起きた場合に，適用されるモデルが負の二
布である．負の二項分布を用いた検定は，以下のよう
式化される
定式化 4 確率変数を Y として，パラメータ p と r
いると，負の二項分布は
P(Y = y) =
y + r − 1
r
py
(1 − p)r
と表せる．また，ガンマ関数 Γ(x) =
∞
0
e−t
tx−1
dt が
が自然数の時，Γ(x) = (x − 1)! である事を用いると，
P(Y = y) =
Γ(y + r)
Γ(r)Γ(y + 1)
py
(1 − p)r
となる．期待値は pr/(1 − p)，分散は pr/(1 − p)2
であ
P(Y = y) =
✓
y + r 1
r
◆
py
(1 p)r
=
(y + r)
(r) (y + 1)
py
(1 p)r
正規化の時点で離散値では
なくなっているので，
連続値が扱えて嬉しい．](https://image.slidesharecdn.com/20141217sigbiopub-141217082915-conversion-gate01/85/RNAseq-A-Review-13-320.jpg)
![まとめと今後の課題
• RNA-seqの導入によって，マイクロアレイに比べて定量性が高まっただ
けでなく，タグをランダムサンプリングするモデルが導入でき，統計的
なモデル化が進んだ
• 現在まで，（SAGE法の延長による）過分散を考慮した発現差の統計解
析(DESeq, edgeR)と，RNA-seqから生まれた選択的スプライシング解析
(cuffdiff)の2つの道で研究が進んでおり，これらの融合が進んでいる．
• これ以上モデルを複雑にすることは，オーバーフィットとの戦いになる
のではないかと思われる．
• 今後の方向性として
• アリル特異性の解析 [Akama et al. NAR 2014]
• 多サンプルに対する解析
• クラスタ分析との融合など，が考えられるだろう．
• RNA-seqが，PacBioなどを利用した全長観測可能なものになると，
スプライシングのモデル化が容易になる可能性がある．](https://image.slidesharecdn.com/20141217sigbiopub-141217082915-conversion-gate01/85/RNAseq-A-Review-18-320.jpg)
RNAseqによる変動遺伝子抽出の統計: A Review
- 2. 2 DNA(ゲノム) mRNA 遺伝子 タンパク質 細胞 Illustrations are © 2011 DBCLS Licensed under a Creative Commons 表示 2.1 日本 License
- 3. 大規模発現量観測の小史 各遺伝子由来のタグの計数 ランダムに抽出したmRNA中の，特定の部位の配列を特定し，遺伝子発 現量の推定を行う方法 SAGE [Velculescu et al. 1995], BodyMap [Kawamoto et al. 2000] 2003年頃の段階で，定量性を得るために，一つの組織から100万タ グを超えるデータを取ることを目標にしていた． CAGE [Shiraki et al. 2003], 5 -SAGE [Hashimoto et al. 2004] RNA-seq [Ryan et al., 2008, Maher et al. 2009] ハイブリベースの方法 予め，各遺伝子に対応したプローブを用意しておき，そこにハイブリし たmRNAタグの量を，蛍光量などに変換して，観測する マイクロアレイ [Tse-Wen, 1983, Schena et al. 1995]
- 6. RNA-seq解析の流れ リードをゲノムへマッピング TopHat, STARなど 各遺伝子上のリード数を計数 HTSeq, RSEMなど 遺伝子数 n サンプル数 m 各サンプル毎 各サンプル毎 まとめて表を作成する 全体で１つ ゲノム配列が決定されいてる種を想定 変動発現遺伝子 の抽出 クラスタリング等 正規化 機能解析 Splicing が考慮出来る必要あり 注：必ずしも各ソフトウエアが上記を 綺麗に切り分けている訳ではない． たとえばTopHatは計数まで行える．
- 7. RNA-seq解析の流れ リードをゲノムへマッピング 各遺伝子上のリード数を計数 各サンプル毎 各サンプル毎 まとめて表を作成する 全体で１つ ゲノム配列が決定されいてる種を想定 変動発現遺伝子 の抽出 クラスタリング等 正規化 機能解析 1. RNA-seqでは，各ライブラリか ら出てくるタグ数が一致しないの で，仮想的に一致させる．遺伝子 長でもタグ数は異なる． 2. サンプルによってバイアスがあ ることがあり，必要に応じて補正 を要する． 1の例として，RPKM [Montazavi et al., 2008] 遺伝子(Exon)上の全リード * 1,000 実験で読まれた全リード(100万単位) * 遺伝子(Exon)長 2は，マイクロアレイ時にも行われていた． 非常に高発現な数遺伝子の変動に全体が ひきずられる結果，数千遺伝子が変動している ように見えてしまう．
- 8. RNA-seq解析の流れ リードをゲノムへマッピング 各遺伝子上のリード数を計数 各サンプル毎 各サンプル毎 まとめて表を作成する 全体で１つ ゲノム配列が決定されいてる種を想定 変動発現遺伝子 の抽出 クラスタリング等 正規化 機能解析 RNA-seq時代になって， Biological replicateを取るこ とが必須となっている． そのreplicateを使って，2群間比 較を行い，統計的に有意な発現変 動のある遺伝子群を抽出する edgeR [Robinson et al. 2010], DESeq [Anders et al. 2010], SAGE法の後期では，同様の研究が 行われており，その理論を RNA-seqに転用している．
- 9. 発現比率と統計的有意差 • MA plot Robinson M D et al. Bioinformatics 2010;26:139-140 © The Author(s) 2009. Published by Oxford University Press. (平均)発現量 発現差 Fig
- 10. 分割表による検定 • 一般に，Fisherの正確確率検定，カイ二乗検定など． • タグ発現解析では，ポアソン分布を用いた検定が使われる • 二項分布を考えた場合でもpが小さい場合に相当し，ポア ソン分布で良く近似できる 150 100 1750 1900 1900 2000 Case Ctrl Total Gene1由来 Gene1以外由来 2000回のサンプルで，100回起きる事象が あるとき，1900回のサンプルで，150回事 象が起こる p=100/2000=0.05の確率で表が出るコイ ンを1900回投げ150回表が出る 単位時間tあたり，0.05t 回事象が起こると き，(150/1900)t回事象が起こる確率 二項分布 ポアソン分布
- 11. Biological replicate はどうするか • CaseもControlも3回ずつ取られている状況を考える • ポアソン分布の枠組みでは，Biological replicateを 直接は扱えない． • 例えば，20回ずつ取られていれば，各遺伝子毎にt 検定も有効かもしれないが，3回では検定の検出力 が足りない • ましてやt検定の前提条件が満たされているか，確 かめられる回数でもない． • 実際には，統計検定が最終的な目標ではないので，「費 用の問題」「それだけ実験をするなら，他の条件を観 測したい」などで，大量のreplicate が取られることは 無い． • とはいえ，ある程度の有意差検定を行いたい 遺伝子数n Control Case
- 12. 本当に二項分布/ポアソン分布なのだろうか？ • 二項分布の分散は np(1-p)．ポアソン分布は λ(∼np) • 黒線が理論線．青点が実際の分散 • 理論値よりも分散が遥かに大きい．特に発現量が大きい時に顕著 • ポアソン分布で検定すると，発現量が大きい時，殆ど発現量に変 化がないのに，有意差が生まれてしまう←モデルが誤っている Anders, S., et al. (2013). Nature Protocols Fig
- 13. 負の二項分布を用いたモデル化 • ポアソン分布に分散を表す変数を加えたい • 負の二項分布を用いて表すモデル化が採用されている (edgeR, DESeq, cuffdiff2など) • 負の二項分布は，ポアソン分布に変数を１つ加えたもの，あるいは， 複数のポアソン分布の混合分布として計算することが可能． • 計測点が3点のみでは計算した分散の値が信頼出来ない問題は解消さ れていないことに注意． P(Y = y) = ✓ n y ◆ py (1 p)n y 二項分布： 負の二項分布： の値をとっているわけではなく， など，様々な状態を反映している 全に一致した値になることは無い NA-seq を利用した多くの 2 群間 群から複数回のサンプル（生物学 ，2 群間の比較が行われる．各遺 応の無い 2 群間比較の問題と考え で行われる実験の回数は，実験費 意の難しさから，各群の実験が 3 少ないことも多い．この少ない実 題となる． 用される検定として t 検定（ス 挙げられる．t 検定では，2 群間 来かを検定する． の RNA-seq を行ったとする．そ , Aa とする．同様に群 B から b れぞれ B1, B2, ..., Bb とする．こ ことが知られている．一方，実際にデータを調べると， 大きい所では，分散が λ より大きな値を取っている事 られている ([4] の Figure 1，あるいは [2] の Supplemn Text Figure 2.)．このため，ポアソン分布を用いて検 行うと，特に発現量が大きい遺伝子に対して，本来の 上に低い P 値を算出する可能性がある． 過分散が起きた場合に，適用されるモデルが負の二 布である．負の二項分布を用いた検定は，以下のよう 式化される 定式化 4 確率変数を Y として，パラメータ p と r いると，負の二項分布は P(Y = y) = y + r − 1 r py (1 − p)r と表せる．また，ガンマ関数 Γ(x) = ∞ 0 e−t tx−1 dt が が自然数の時，Γ(x) = (x − 1)! である事を用いると， P(Y = y) = Γ(y + r) Γ(r)Γ(y + 1) py (1 − p)r となる．期待値は pr/(1 − p)，分散は pr/(1 − p)2 であ P(Y = y) = ✓ y + r 1 r ◆ py (1 p)r = (y + r) (r) (y + 1) py (1 p)r 正規化の時点で離散値では なくなっているので， 連続値が扱えて嬉しい．
- 14. 変数 r を無限に飛ばすと，負の二項分布はポアソン分布に近似できる． 期待値を表す新たな変数として λ = pr 1−p を導入すると，p = λ r+λ である．こ れを，負の二項分布の式に代入して，変形する． f(y; k, r) = P(Y = y) = Γ(y + r) Γ(r)Γ(y + 1) py (1 − p)r = λy y! · Γ(y + r) Γ(r)(r + λ)r · 1 1 + λ r r ここで r を無限に飛ばすと，第 1 項は r に依存せず，第 2 項は 1，第 3 項は 指数関数に収束するので， lim r→∞ f(y; k, r) = λy y! 1 eλ これは，期待値 λ のポアソン分布である． 証明 ■
- 15. 各遺伝子の発現量の分散を推定する • 経験的に，分散は発現量に依存する • 発現量が近い場合，分散も類似すると考えて 回帰問題を考えることで，分散の推定を行っ ている． • DESeqの例：サンプルi, 遺伝子gに対し，分散 を次の式で推定する． Anders, S., et al. (2013). Nature Protocols µ(i, g) + t(i)2 ⌫(g) 正規化後の 推定発現量 サンプルの 総タグ数 パラメータ 遺伝子毎の値． この値を回帰で 求める 過分散を表す項 Fig
- 16. 分布は推定できた．検定はどうする？ • 分布が複雑で，解析的にはp値が求まらない． • 求めた負の二項分布に従った乱数を発生させ，シミュレーションでp 値を求める (DESeq) • あるいは，フィッシャーの正確確率検定の様に，観測された値以上に 極端な場合を数え上げる (edgeR) • 例えばDESeqの戦略では • 遺伝子g由来のタグがControl から NA回，CaseからNB回が観測された とすると • Control と Caseは独立だと仮定するしPr(Y=NA)Pr(Y=NB)を計算 • 負の二項分布から乱数を2個(N1, N2)発生させ Pr(Y=N1)Pr(Y=N2)を計算 • 元の値より，p値が小さくなるような乱数の割合がp値 • 最後は，False Discovery Rate (FDR)によって，多重検定補正を行う
- 17. Cuffdiffについて • Cuffdiff(2)は，edgeRやDESeqと違い，RNA-seq，特にSplicing variant を定量化する話が根本にある． • １つの遺伝子が複数のスプライシングバリアントを保つ場合， 各リードがどのスプライシングバリアントに属するかを，最 尤推定を用いて定式化 • 発現量の分散モデルに関しては，DESeqのモデルを踏襲 • 但し，各exonを負の二項分布で表して，その混合分布（ベー タ負の二項分布）を発現のモデルにしている • 最近は，edgeRやDESeqも，スプライスバリアントの定量に力 を入れているようである．
- 18. まとめと今後の課題 • RNA-seqの導入によって，マイクロアレイに比べて定量性が高まっただ けでなく，タグをランダムサンプリングするモデルが導入でき，統計的 なモデル化が進んだ • 現在まで，（SAGE法の延長による）過分散を考慮した発現差の統計解 析(DESeq, edgeR)と，RNA-seqから生まれた選択的スプライシング解析 (cuffdiff)の2つの道で研究が進んでおり，これらの融合が進んでいる． • これ以上モデルを複雑にすることは，オーバーフィットとの戦いになる のではないかと思われる． • 今後の方向性として • アリル特異性の解析 [Akama et al. NAR 2014] • 多サンプルに対する解析 • クラスタ分析との融合など，が考えられるだろう． • RNA-seqが，PacBioなどを利用した全長観測可能なものになると， スプライシングのモデル化が容易になる可能性がある．