Smistamento delle proteine traffico vescicolare

RETICOLO ENDOPLASMATICO (RE) Reticolo endoplasmatico rugoso (RER) Reticolo endoplasmatico liscio (REL)

RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO (REL) E’ COSTITUITO DA UN SISTEMA DI SACCHE TUBULARI AGRANULARI biosintesi lipidica deposito del Calcio detossificazione da farmaci metabolismo dei carboidrati (GLUCOSO 6 FOSFATASI)

REL E BIOSINTESI LIPIDICA Avviene ad opera di enzimi posti sulla faccia citosolica della membrana del REL FOSFOLIPIDI DI MEMBRANA (principalmente fosfatidilcolina) TRIACILGLICEROLI : accumulati nel lume in goccioline …. lipidiche che verrano conservate negli adipociti STEROLI (ormoni steroidei, colesterolo) nelle cellule endocrine delle gonadi e della corteccia surrenale

REL COME DEPOSITO INTRACELLULARE DI Ca ++ Le membrane del REL sono in grado di produrre con grande efficienza GRADIENTI DI Ca++ TRASDUZIONE DEI SEGNALI STIMOLO NERVOSO CONTRAZIONE MUSCOLARE

DETOSSIFICAZIONE ENZIMI CHE TRASFERISCONO L’OSSIGENO : OSSIGENASI (CITOCROMO P450)

COMPOSTI LIPOSOLUBILI COMPOSTI IDROSOLUBILI NETURALIZZAZIONE METILAZIONE DEMETILAZIONE IDROSSILAZIONE OSSIDAZIONE RIDUZIONE CONIUGAZIONE CON AA O ACIDI CONUIGAZIONE CON UN COMPOSTO MOLTO POLARE CHE NE PERMETTE IL PASSAGGIO NEL SANGUE E LA ELIMINAZIONE RENALE O L’IMMISSONE NELLA BILE E LA SUCCESSIVA ELIMINAZIONE CON LE FECI ALCUNI COMPOSTI DOPO I PROCESSI DI NEUTRALIZZAZIONE VENGONO TRASFORMATI IN C. MAGGIORMENTE TOSSICI : ALCUNI VELENI E PROCANCEROGENI

DETOSSIFICAZIONI O SINTESI PROTTETIVE REAZIONI CHIMICHE DI BIOTRASFORMAZIONE FASE I FASE II FASE I O FUNZIONALIZZAZIONE CONVERTONO LE SOSTANZE IN UN METABOLITA PIU ’ POLARE OSSIDAZIONE RIDUZIONE IDROLISI

FASE II CONIUGAZIONE CON UN SUBSTRATO ENDOGENO ACIDO GLUCURONICO ACIDO SOLFORICO ACIDO ACETICO AMINOACIDI

OSSIDAZIONI AVVENGONO NEL RE AD OPERA DI UN COMPLESSO E “drug metabolizing system” MONOOSSIGENASI CHE RICHIEDONO NADPH ED O 2 (CITOCROMI P450) RIDUZIONI AVVENGONO NEL CITOSOL E NEL REL DEL FEGATO E DI ALTRI TESSUTI IDROLISI AVVENGONO IN VARI TESSUTI AD OPERA DI ESTERASI E PROTEASI

ETANOLO Alcool deidrogenasi NAD dip. MEOS NADP dipendente Catalasi utilizza H 2 O 2 ACETALDEIDE ETANOLO ACETALDEIDE + NADH + H + ACETALDEIDE ACETATO +NADH + H + ACETATO ACETIL CoA INDUCIBILE DAL SUBSTRATO A.deidrogenasi

ACETALDEIDE LA SUA VELOCITA’ DI FORMAZIONE E’ SUPERIORE ALLA SUO CATABOLISMO ACCUMULO DANNI PRODOTTI DALL’ACETALDEIDE: INIBIZIONE SINTESI PROTEICA BLOCCO IMMISSIONE IN CIRCOLO LIPOPROTEINE DANNO MEMBRANE INIBIZIONE OX MITOCONDIALE DANNO CITOSCHELETRO

GLUCURONAZIONE ACIDO GLUCURONICO+FENOLI O ACIDI AROMATICI: COMPOSTI MENO TOSSICI E PIU ’ SOLUBILI MOLTI FARMACI SUBISCONO CONIUGAZIONE GLUC. I GLUCURONIDI POSSONO ESSERE SCISSI E RIACQUISTARE IL LORO POTERE TOSSICO (B-GLUCURONIDASI EPATICHE O DAI BATTERI PRESENTI NELLA VESCICA: IN QUESTO CASO LA PRESENZA DEI COMPOSTI TOSSICI NELLA VESCICA PUO ’ DARE LUOGO A TUMORI : DERIVATI DELL’ANILINA)

ACETILAZIONE ELIMINAZIONE DI SOSTANZE TOSSICHE CONTENENTI GRUPPI AMINICI : SULFAMIDICI CONIUGAZIONE SOLFORICA AVVIENE NEL FEGATO E NELLA MUCOSA INTESTINALE FENOLO E ACIDO SOLFORICO LE SOSTANZE SONO PIU ’ SOLUBILI DEI FENOLI E QUINDI PIU ’ FACILMENTE ELIMINABILI COME I GLUCURONIDI POSSO ESSERE RIPRISTINATI O NEL FEGATO O NELLA VESCICA

TRASFORMAZIONI METABOLICHE CON AUMENTO DELLA TOSSICITA’ METABOLIZZAZIONE DEI VELENI CON FORMAZIONE DI COMPOSTI PIU ’ TOSSICI O PER DEGRADAZIONE DEL COMPOSTO O PER COMBINAZIONE CON SOSTANZE PRODOTTE NELL’ORGANISMO (SINTESI LETALE) CCl 4, FLUOROACETATO ETIONINA

RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO (RER) SISTEMA DI SACCHI APPIATTITI MEMBRANOSI (CISTERNE) RIBOSOMI SUL LATO CITOSOLICO DELLA MEMBRANA Sintesi di proteine integrali di membrana; proteine localizzate all’interno dei sistemi di endomembrane quali: reticolo endoplasmatico, Golgi, lisosomi, endosomi, vescicole e vacuoli; proteine destinate alla secerzione Glicosilazione delle proteine (fase iniziale) Corretto ripiegamento proteine e assemblaggio proteine multimeriche, controllo della qualità delle proteine. Numerose altre attività enzimatiche

LE PROTEINE SINTETIZZATE DEVONO POI PASSARE LA MEMBRANA DELL’ORGANULO BERSAGLIO: TIPI DI TRASPORTO TRASLOCATORI PROTEICI (mitocondri, reticolo endoplasmatico, perossisomi) PORI NUCLEARI (nucleo) TRASPORTO VESCICOLARE (Golgi, membrana, lisosomi, spazio extracellulare)

SINTESI DI PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA PROTEINE DEI SISTEMI DI ENDOMEMBRANE PROTEINE DI SECREZIONE IN UNA CELLULA EUCARIOTE VENGONO SINTETIZZATE OLTRE 10.000 PROTEINE DIVERSE, CIASCUNA DELLE QUALI DEVE RAGGIUNGERE LA PROPRIA CORRETTA DESTINAZIONE. ANOMALIE NELLO SMISTAMENTO DELLE PROTEINE SONO ALLA BASE DI IMPORTANTI PATOLOGIE UMANE

Le proteine vengono sintetizzate, utilizzando le informazioni degli RNA messaggeri, sia a livello dei ribosomi liberi (che si trovano nel citoplasma) sia a livello dei ribosomi associati alle membrane ( reticolo endoplasmatico rugoso ). La destinazione di queste proteine è differente a seconda di dove sono state prodotte RIBOSOMI LIBERI: Proteine che rimangono nel citosol (glicolisi, citoscheletro) Nucleo Mitocondri Perossisomi RIBOSOMI ASSOCIATI AL RE Proteine di membrana Proteine secretorie Proteine di organelli: Golgi, lisosomi,endosomi, vacuoli Ribosomi liberi Ribosomi associati al reticolo endoplasmatico

Ribosomi liberi e legati alle membrane Gli stessi ribosomi ciclano tra poliribosomi liberi e di membrana. Come fanno le cellule ad identificare le due classi di proteine e ad identificare i loro siti di sintesi? Grazie a segnali di indirizzamento

SEGNALI DI INDIRIZZAMENTO: sequenze e segnali di idrofobicità-carica IL DESTINO DI OGNI PROTEINA È CONTROLLATO DALLA SUA COMPOSIZIONE IN AMINOACIDI ALCUNI SEGNALI ENTRANO IN FUNZIONE QUANDO LA PROTEINA È COMPLETATA, ALTRI AGISCONO GIÀ DURANTE LA SINTESI PROTEINE INGEGNERIZZATE IN MODO TALE DA INSERIRE SEQUENZE SEGNALE ANOMALE, SARANNO SMISTATE IN SEDI ANOMALE LE SEQUENZE SEGNALE SONO NECESSARIE E SUFFICIENTI PER DETERMINARE IL DESTINO DI UNA PROTEINA

SI POSSONO DISTINGUERE DUE PERCORSI PRINCIPALI • LA VIA SECRETORIA • LA VIA CITOPLASMATICA

VIA SECRETORIA: LO SMISTAMENTO INIZIA DURANTE LA TRADUZIONE

VIA CITOPLASMATICA : LO SMISTAMENTO INIZIA DOPO IL COMPLETAMENTO DELLA TRADUZIONE

LA VIA SECRETORIA, O VESCICOLARE , INTERESSA PROTEINE DESTINATE: • AD ESSERE SECRETE DALLA CELLULA • A FAR PARTE COME PROTEINE INTRINSECHE DELLE MEMBRANE • PROTEINE SOLUBILI CHE RISIEDONO ALL’INTERNO DEL DEI COMPARTIMENTI DEL SISTEMA DI ENDOMEMBRANE CHE INCLUDONO RE, COPLESSO DI GOLGI, LISOSOMI, ENDOSOMI, VESCICOLE E VACUOLI VEGETALI.

LA VIA CITOPLASMATICA INTERESSA PROTEINE DESTINATE: A RIMANERE NEL CITOSOL (ENZIMI GLICOLITICI) PROTEINE PERIFIERICHE DELLA SUPERFICIE INTERNA DELLA MEMBRANA PROTEINE CHE SONO TRASPORTATE NEL NUCLEO PROTEINE DESTINATA E PEROSSISOMI, MITOCONDRI, CLOROPLASTI

LA VIA SECRETORIA: IPOTESI DEL SEGNALE: PRESENZA DI UN CODICE DI INDIRIZZO A LIVELLO DELLE PROTEINE. BLOBEL 1999: PREMIO NOBEL PER LA MEDICINA SEGNALE N-TERMINALE COSTITUITO 16-30 AMINOACIDI CON UN GRUPPO DI 6-12 AMINOACIDI IDROFOBICI, SPESSO PRECEDUTO DA UNO O PIÙ AMINOACIDI A CARICA POSITIVA. TALE SEQUENZA PUO’ ESSERE ANCHE INTERNA E NON APPENA ESCE DAL RIBOSOMA NE INNESCA L’ATTACCO AL RE ED IL MOVIMENTO DEL PEPTIDE NASCENTE ALL’INTERNO DELLE CISTERNE, ATTRAVERSO UN CANALE ACQUOSO PROTEICO DELLA MEMBRANA

La sequenza segnale porta il ribosoma al traslocatore Il segnale è poi tagliato L’indirizzamento è CO-TRADUZIONALE .

La sequenza N-terminale è riconosciuta: da un complesso proteico NAC (Nascent Associated Complex) che le protegge da altre possibili interazioni da un complesso ribonucleico particella SRP (particella di riconoscimento del segnale) cosituita da una molecola di RNA (7S) e da sei proteine diverse. SRP lega un recettore per SRP presente sulla membrana del RE

Il legame di SRP alla sequenza segnale induce una pausa nella sintesi, per facilitare l’interazione con il recettore. SPR lega la sequenza segnale ed anche SPR receptor sulla membrana ER Il ribosoma viene quindi posizionato a livello del traslocone

Ribosoma legato la traslocone Il poro del traslocone ed il tunnel del ribosoma si allineano: il peptide è traslocato attraverso l’anello del poro nel lume del RE. Terminata la sintesi il ribosoma è rilasciato ed il canale si chiude

Le tappe sopra descritte sono regolate dal legame e dall’idrolisi del GTP: Sia SRP che il suo recettore sono proteine G

Sintesi di una proteina solubile Il poro del traslocatore si apre dopo il legame con la leader sequence. Dopo la traslocazione il poro si chiude ed il traslocatore si apre lateralmente e rilascia il peptide segnale

NON APPENA IL POLIPEPTIDE NASCENTE ENTRA NELLE CISTERNE DEL RE, SI TROVA AD INTERAGIRE CON UNA MOLTITUDINE DI ENZIMI LOCALIZZATI SULLA PARTE E NEL LUME LA PEPTIDASI DEL SEGNALE (PROTEINA INTEGRALE LOCALIZZATA IN PROSSIMITA’ DEL TRASLOCONE ) RIMUOVE LA PORZIONE N-TERMINALE CONTENENTE LA SEQUENZA SEGNALE LA OLIGOSACCARILTRANSFERSI (PROTEINA INTEGRALE LOCALIZZATA IN PROSSIMITA’ DEL TRASLOCONE ) , AGGIUNGE CARBOIDRATI NEL LUME SONO PRESENTI ANCHE PROTEINE CHAPRON CHE CONSENTONO IL CORRETTO RIPIEGAMENTO SONO PRESENTI ANCHE DISOLFUROISOMERASI CHE CATALIZZANO LA FORMAZIONE DI PONTI DISOLFURO FRA I RESIDUI DI CISTEINA. DI FONDAMENTALE IMPORTANZA PER LA STABILITA’ DELLE PROTEINE PRESENTI SULLA SUPERFICIE CELLULARE EXTRACELLULARE O PER LE PROTEINE DI SECREZIONE

RETICOLO ENDOPLASMATICO : LA PORTA DI INGRESSO PER IL PERCORSO BIOSINTETICO DELLA CELLULA Il reticolo endoplasmatico è il compartimento membranoso più esteso della cellula. Sulla sua membrana possono aderire molti ribosomi (13 milioni) negli epatociti. Rappresenta anche la sede di smistamento delle proteine Destinate: al Golgi, ai lisosomi ed allo spazio extracellulare: viene considerato la porta di ingresso per il percorso biosintetico della cellula.

L’ambiente del lume favorisce il corretto ripiegamento e l’assemblaggio delle proteine e la divisione fra le proteine di secrezione, le proteine lisosomiali e le altre proteine neosintetizzate. La segregazione delle proteine neosintetizzate nel lume del RER, le sottrae dal citosol e consente che siano modificate e spedite verso la loro destinazione finale, sia fuori alla cellula che all’interno degli organuli.

SINTESI DELLE PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA Le proteine integrali di membrana, tranne quelle dei mitocondri e dei cloroplasti, vengono sintetizzate sul RER. Queste proteine vengono trasferite al RER co-traduzionalmente, con lo stesso meccanismo descritto per la sintesi delle proteine di secrezione, ma presentano due regioni: la sequenza di inizio del trasferimento e la sequenza di arresto del trasferimento

la sequenza di inizio del trasferimento e la sequenza di arresto del trasferimento sono costituite da aa idrofobici che, transitando nel traslocatore inducono un suo cambiamento conformazionale: quando il traslocone (a forma di clessidra) incontra la sequenza Stop-transfer , si apre e rilascia la proteina

Orientamento della estremità C-terminale Le cariche elettriche intorno al segmento transmembrana determinano la polarità della proteina. La presenza di residui aminoacidici carichi positivamente orienta la porzione verso il citosol : Il C-terminale può essere esterno o citosolico ed è il traslocone a determinarne il corretto orientamento

Proteine di membrana multipasso Contengono numerose tratti idrofobici, contengono cioè diverse sequenze alternate di inizio ed arresto del trasferimento. Le sequenze di inizio non vengono rimosse dalla peptidasi del segnale e rimangono inserite nel doppio strato lipidico grazie alle loro caratteristiche idrofobiche.

TUTTE LE PROTEINE TRANSMEMBRANA, MONO E MULTIPASSO PRESENTI NEL GOLGI, NEI LISOSOMI, NELLA MAMBRANA PLASMATICA, MA ANCHE QUELLE DEL LUME DEL GOLGI E DEI LISOSOMI, SEGUONO QUESTA VIA CHE INIZIA NEL RE E PROSEGUE AI VARI COMPARTIMENTI ATTRAVERSO UN PROCESSO DI TRASFERIMENTO MEDIATO DA VESCICOLE. QUANDO UNA MEMBRANA SI MUOVE DA UN COMPARTIMENTO ALL’ALTRO LA SUA COMPOSIZIONE VIENE MODIFICATA AD OPERA DEGI ENZIMI IVI RESIDENTI LA MAGGIOR PARTE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA DEL RE VIENE MODIFICATA DALL’ATTACCO COVALENTE DI UNA O PIU’ CATENE OLIGOSACCARDICHE COSITUENDO COSI’ LE GLICOPROTEINE BIOSINTESI DELLE MEMBRANE NEL RE

ASIMMETRIA DELLE MEMBRANE L’ASIMMETRIA VIENE STABILITA INIZIALMENTE NEL RE QUANDO LIPIDI E PROTEINE VENGONO INCORPORATI IN MODO DIVERSO NEI DUE STRATI TALE ASIMMETRIA VIENE MANTENUTA QUANDO LA MEMBRANA PASSA DA UN COMPARTIMENTO ALL’ALTRO PER GEMMAZIONE E PER FUSIONE I COMPONENTI SITUATI SULLA SUPERFICIE CITOSOLICA DEL RE, SARANNO LOCALIZZATI SULLA SUP CITOSOLICA DELLE VESCICOLE DI TRASPORTO, SULLA SUP CITOSOLICA DEL GOLGI, E SULLA SUPERFICIE INTERNA (CITOPLASMATICA) DELLA MEMBRANA PLASMATICA. LO STESSO PER I COMPONENTI DELLA PARTE LUMINALE DELLA MEMBRANA

SINTESI DEI LIPIDI DI MEMBRANA LA MAGGIOR PARTE DEI LIPIDI E’ SINTETIZZATA NEL RE. ECCEZIONI: SLINGOMIELINE, GLICOLIPIDI: RE E POI GOLGI ALCUNI LIPIDI DI MITOCONDRI E CLOROPLASTI: NELLA SEDE STESSA GLI ENZIMI SONO LOCALIZZATI NELLA MEMBRANA DEL RE I LIPIDI INTEGRATI NELLA PORZIONE CITOSOLICA DEL RE VENGONO TRASPORTATI AL GOLGI ED ALLA MEMBRANA PLASMATICA. NEL PERCORSO VENGONO MODIFICATI

LA MAGGIOR PARTE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA DEL RE VIENE MODIFICATA DALL’ATTACCO COVALENTE DI UNA O PIU’ CATENE OLIGOSACCARDICHE COSITUENDO COSI’ LE GLICOPROTEINE IMPORTANZA FUNZIONALE IMPORTANZA NEL FOLDING GLICAZIONE DELLE PROTEINE

GLICOSILAZIONE DELLE PROTEINE La maturazione delle proteine sintetizzate avviene preliminarmente nel RER e si completa nel Golgi, comprendendo una fase detta di glicosilazione la glicosilazione aggiunge catene laterali di carboidrati a specifici residui amminoacidici delle proteine esistono due tipi di glicosilazione: la glicosilazione legata ad azoto (N-glicosilazione) la glicosilazione legata ad ossigeno ( O-glicosilazione)

Funzione della glicosilazione delle proteine La glicosilazione avviene per più motivi. Innanzitutto perché una proteina glicosilata raggiunge un f olding corretto e, in questo modo, può esplicare la propria funzione. Inoltre la glicosilazione protegge dall'attacco di proteasi ed aumenta la solubilità della molecola proteica che viene dunque stabilizzata in tutti gli aspetti. Infine il meccanismo glicosidico permette lo svolgimento del controllo di qualità Il principio di riconoscimento avviene sulla base della presenza o meno di un particolare residuo di glucosio sulla struttura glicosidica. La maggior parte delle proteine che vengono glicosilate, nelle cellule eucariotiche, sono destinate a diventare proteine di membrana: le catene di zuccheri vanno a formare infatti il glicocalice che circonda il plasmalemma (membrana plasmatica).

La N-glicosilazione vede l'aggiunta di una catena glucidica standard a livello dell'atomo di azoto di una catena laterale di asparagina ad opera di glucosiltransferasi. La N-glicosilazione ha inizio nel reticolo endoplasmatico rugoso a carico di una catena peptidica ancora in corso di traduzione.

La prima fase consiste nel trasferimento di una catena di 14 zuccheri (2 di N-acetilglucosammina, 3 di glucosio e 9 di mannosio) ad un residuo laterale di asparagina.

L'oligosaccaride è assemblato all'interno del reticolo endoplasmatico a partire da singoli carboidrati, ed è trasferito da uno speciale enzima (la glicosiltransferasi) da una molecola di dolicolfosfato (molecola incorporata nella membrana del RE) alla proteina, come singolo elemento

I primi 7 zuccheri: 5 mannosi e 2 residui di N Acetil Glucosamina sono traferiti nel citosol. Il dolico subisce flippaggio e ruota all’interno del RE Dove vengono aggiunti i restanti zuccheri: 4 mannosi e 3 glucosi. Completato lo zucchero viene trasferito al residuo di asparagina ed Il dolicolo puo’ essere esportato sul versante citosolico

Mutazioni che determinano la totale assenza della N-glicosilazione, causano la morte dell’embrione prima dell’impianto. Mutazioni che determinano la parziale alterazione della N-glicosilazione, causano gravi disordini ereditari. Negli organismi più evoluti l’oligosaccaride di base subisce una serie di modifiche nel RE come la rimozione di 2 glucosi. Questo è un passaggio fondamentale nella vita della glicoproteina neosintetizzata, che viene valutata da un sistema di controllo di qualità, prima di passare nel compartimento successivo della via biosintetica.

Ruolo della N- glycosilation nel folding Le glicoproteine con 1 Glu, si leganono ad una molecola chaperon: calnexina o calreticulina che rimuove il Glu e rilascia la proteina. Se la proteina non è ripiegata correttamente, viene riconosciuta da una glucosyl transferase (GT) che le glicosila

Il processo si ripete fino a quando la proteina non raggiunge il folding corretto. Se la proteina non è in grado di raggiungere un folding corretto, viene distrutta

Le proteine misfolded vengono esportate attraverso un meccanismo di «traslocazione inversa» nel citoplasma dove vengono degradate dai proteasomi

Struttura dei Proteasomi: Hsp60 chaperones Sono costituite da 7 subunità polipeptidiche suddivise in due classi: alfa e beta, impilate le une sulle altre. Le subunità centrali (beta), sono dotati di attività proteolitica.

La selezione delle proteine è basata sulla stabilità biologica della proteina stessa. Ogni proteina possiede una longevità caratteristica : alcune sopravvivono per minuti, altre per settimane. Tutte , indipendentemente dal loro tempo di sopravvivenza, vengono degradate dai proteasomi. La degradazione avviene previa marcatura con una piccola proteina altamente conservata: l’ ubiquitina

La proteina poli-ubiquitinata si lega al cappuccio del proteasoma La catena di ubiquitina viene rimossa ed il polipeptide denaturato ad opera della subunità beta del proteasoma mediante l’energia fornita da ATP

In certi casi le proteine misfolded si originano con velocità superiore rispetto a quella di esportazione nel citoplasma. Si attiva la risposta UPR (Unfolded protein response) Sensori proteici localizzati nel RE monitorizzano la concentrazione delle misfolded. In condizioni normali i sensori sono inattivi perché legati a chaperon (BiP) un aumento della concentrazione di unfolded determina il reclutamento di BiP e la attivazione dei sensori che dimerizzano e si auto fosforilano innescando una serie di segnali come:

La regolazione di geni che codificano per: chaperoni proteine coinvolte nel trasporto delle misfolded fuori dal RE ubiqutine La fosforilazione di eIF2, fattore di inizio della sintesi proteica, che si inattiva; determinando un rallentamento nella sintesi proteica

Controllo di qualità della sintesi di proteine

Le proteine che hanno subito sia la glicosilazione che la prima modificazione vengono trasportate, tramite vescicole, all'apparato del Golgi. Qui subiscono una sequenza ordinata di importanti cambiamenti e smistate verso le loro destinazioni definitive. In questo modo la cellula può regolare il trasporto di proteine, lipidi e carboidrati di nuova sintesi anche all’esterno (esocitosi). Smistamento delle proteine dal RE al Golgi, lisosomi, membrana e spazio extracellulare

L’apparato di Golgi E’ costituito da un insieme di cisterne appiattite, impilate le une sulle altre e a tratti fenestrate. Ogni cisterna è formata di membrane simili a quelle del RE, disposte a delimitare uno spazio di circa 10nm, che si allarga nelle regioni laterali (30-50nm).

Ogni pila può contenere da 3 a 20 cisterne. L’apparato di Golgi è un organulo strutturalmente e funzionalmente polarizzato La faccia cis è in genere rivolta verso il nucleo ed adiacente al RE; la faccia trans è rivolta verso la membrana plasmatica della cellula. La parte intermedia costituisce le cisterne mediali Il lato cis rappresenta la faccia immatura forma la rete cis del Golgi:CGN Il lato trans corrisponde alla faccia matura forma la rete trans del Golgi:TGN

La polarità dell’apparato di Golgi Nell’apparato di Golgi si distinguono tre compartimenti diversi ciascuno dotato di specifici enzimi ed adibito ad una determinata fase della elaborazione delle glicoproteine giunte dal RER. I tre compartimenti sono detti cis , mediano e trans .

FUNZIONI DEL COMPLESSO DI GOLGI Completamento della glicosilazione delle glicoproteine, iniziata nel RER Aggiunta di gruppi fosfato, solfato ed acidi grassi a proteine provenienti dal RER Sintesi di molecole polisaccaridiche e di alcuni lipidi e glicolipidi Produzione e smistamento degli enzimi lisosomali

La differenza fondamentale rispetto alla glicazione nel RE è la specificità. Nel reticolo endoplasmatico la glicosilazione è un evento "seriale", che non varia al variare del substrato. Nel Golgi ogni specifica proteina viene riconosciuta e modificata in base alla futura funzione. Si possono verificare rimozioni o aggiunte di singoli zuccheri o di catene più lunghe. La specificità delle singole catene glucidiche è il meccanismo utilizzato dalla cellula per lo smistamento delle proteine alle varie sedi di destinazione (lisosomi, membrana, perossisomi ). Completamento della glicosilazione delle glicoproteine iniziata nel RER

FUNZIONI DEL COMPLESSO DI GOLGI Nel Golgi si completa la sintesi della componente oligosaccaridica delle glicoproteine, iniziata nel RER

O-glicosilazione La O-glicosilazione è un processo altamente specifico, che non vede l'aggiunta "seriale" di carboidrati alla proteina in processazione. Si svolge completamente nell'apparato del Golgi, dove zuccheri vengono legati al peptide a livello dell'atomo di ossigeno delle catene laterali di serina o treonina. L'aggiunta riguarda un singolo carboidrato alla volta; solitamente il numero di zuccheri legati durante questo processo è limitato a pochi residui.

Dal reticolo trans Golgi gemmano vescicole con destino diverso

Trasporto vescicolare Il trasporto vescicolare usa gemmazione e fusione di vescicole. I componenti solubili sono trasportati insieme a membrane La superficie delle vescicole è rivestita da uno strato proteico con due funzioni fondamentali: fungono da dispositivo meccanico per la formazione della vescicola cositiuiscono un meccanismo per la selezione del materiale da trasportare i rivestimenti proteici operano questa selezione in virtù della loro affinità specifica per le code citosoliche delle protiene integrali della membrana donatrice

Sono state distinte diverse categorie di vescicole rivestite in base: alle proteine che costituiscono il loro rivestimento, al loro ruolo nel traffico cellulare ed al loro aspetto in microscopia

I tre principali tipi di vescicole sono : vescicole rivestite da COPII (spostano i materiali in avanti dal RE al Golgi) vescicole rivestite da COPI (spostano il materiale in senso retrogrado dal Golgi al RE) vescicole rivestite da CLATRINA (spostano il materiale dal TGN verso i lisosomi, gli endosomi ed i vacuoli. Spostano i materiali anche dalla membrana plasmatica ai compartimenti citoplasmatici lungo la via endocitotica e sono coinvolte nel traffico dagli endosomi ai lisosomi)

Le vescicole lisosomali che si staccano dal RER sono vescicole rivestite di clatrina

Clatrina : complesso proteico a 3 braccia (triskelion) formato da tre polipeptidi più grandi (heavy) e da tre più piccoli (light) in grado di polimerizzare e formare strutture esagonali a gabbia

LA FORMAZIONE ELLE VESCICOLE DERIVA DALLA POLIMERIZZAZIONE DELLA CLATRINA. CHE NECESSITA DELLA PRESENZA DI ALTRE MOLECOLE DI MEMBRANA: ADAPTINE IN GRADO DI RICONOSCERE IL CARGO DA TRASFERIRE LA POLIMERIZZAZIONE FA SOLLEVARE LA MEMBRANA ED ACCRESCERE LA VESCICOLA CHE SI STACCA DALLA MEMBRANA MEDIANTE L’INTERVENTO DI UNA PROTEINA LA DINAMINA. LE VESCICOLE MIGRANO NEL CITOSOL UTILIZZANDO ANCHE IL CITOSCHELETRO E SI FONDONO CON LE MEMBRANE DEGLI ORGANULI BERS AGLIO

IL RICONOSCIMENTO DELL’ORGANULO BERSAGLIO E’ MEDIATO DALLE PROTEINE SNARE (SNAP Receptor) E DALLE GTPasi Rab LE SNARE v-SNARE t-SNARE SONO PROTEINE FIBROSE ANCORATE ALLE MEMBRANE CAPACI DI RCONOSCIMENTO RECIPROCO. TALE RICONOSCIMENTO DETERMINA L’AVVICINAMENTO DELLE DUE MEMBRANE E LA FUSIONE SUCCESSIVA LE GTPasi Rab SONO IMPLICATE SIA NEL TRASFERIMENTO DELLE VESCICOLE LUNGO I MICROTUBULI , CHE NEL RICONOSCIMENTO DELLE SNARE

Il rivestimento di clatrina si disassembla, lasciando la vescicola nuda, ma dotata della sua vSNARE La vSNAre riconosce la tSNARE specifica e determina l’attacco della vescicola sulla membrana bersaglio Le SNARE, con il contributo di altre proteine, mediano la fusione delle due membrane e poi si liberano per un nuovo ciclo operativo

Le SNARE, oltre a fornire specificità nell’indirizzamento, contribuiscono anche alla fusione della membrana delle vescicole con quella del bersaglio. La specificità delle SNARE in una determinata vescicola sembra dipendere dal contenuto di questa o meglio dalle caratteristiche del recettore di carico posto sulla sua membrana.

Fusione delle membrane Dopo la fusione, le SNARE avvolte vengono separate ad opera di una proteina detta NSF che utilizza ATP. Proteine accessorie intervengono per favorire la fusione dei foglietti lipidici.

Dal reticolo trans del Golgi originano i lisosomi

I lisosomi Le proteine lisosomiali giungono a questo compartimento entrando inizialmente nel RE (grazie ad una sequenza di indirizzamento) a livello del Golgi vengono etichettate per poter essere indirizzate ai lisosomi. Questo indirizzamento è si basa sulla loro glicazione ad opera di un mannosio (fosforilato in posizione 6)

Il segnale mannoso-fosfato delle idrolasi lisosomali Produzione e smistamento degli enzimi lisosomali Nel compartimento cis il Golgi separa i futuri enzimi lisosomali dalle proteine destinate ad essere secrete

L’enzima GlcNAc fosfotransferasi riconosce specificamente le idrolasi lisosomali

Endocitosi Pinocitosi Fagocitosi Endocitosi mediata da recettori

L’endocitosi mediata da recettori costituisce una via d’accesso specifica nella cellula animale LDL: low density lipoprotein. Rappresenta la forma di trasporto del colesterolo alle cellule Difetti che alterano l’espressione o il funzionamento dei recettori di LDL sono alla base dell’aterosclerosi.

Endocitosi mediata da recettori nel ciclo della transferrina

GLI ENDOSOMI Attraverso il processo endocitotico prendono origine gli endosomi che internalizzano i materiali dall’esterno all’interno del citoplasma. Il comparto endosomico funge da centrale di smistamento della via endocitotica diretta verso l’interno. L’ambiente acido dell’endosoma induce molti recettori a liberarsi del loro bagaglio molecolare e ritornare nel loro dominio di membrana. Le molecole internalizzate negli endosomi sono prevalentemente destinate ai lisosomi per essere digerite.

I materiali destinati alla degradazione arrivano al lisosoma seguendo vie diverse

Dal trans Golgi originano vescicole di esocitosi

I segnali possono essere di sequenza di zone unite nella struttura

IL RITORNO AL RER ALCUNE PROTEINE DAL GOLGI VENGONO RIPORTATE AL RER CON UN TRASPORTO RETROGRADO

ASSUNZIONE POST-TRADUZIONALE DI PROTEINE DA PARTE DI MITOCONDRI NUCLEO PEROSSISOMI CLOROPLASTI

SMISTAMENTO DELLE PROTEINE DAL CITOSOL AI MITOCONDRI Mitocondri e plastidi hanno 2 membrane diverse interna ed esterna Le proteine sintetizzate nel citosol contengono una sequenza segnale amminoterminale “sequenza di indirizzamento ai mitocondri” che viene rimossa da una peptidasi del segnale, generando la proteina matura

Il trasferimento delle proteine richiede la presenza di complessi traslocatori TOM TIM dotati di una porzione di riconoscimento della porzione di indirizzamemto della proteina e di una porzione che costituisce il vero canale idrofilo per il passaggio della proteina La sequenza segnale ha la conformazione di un’alfa elica con una superficie basica

Trasporto nei mitocondri Il trasporto attraverso le due membrane avviene probabilmente nei contact sites

Il rilascio delle Hsp70 citosoliche consuma ATP Il trasferimento richiede pontenziale elettrochimico Le Hsp70 mitocondriali consumano ATP Il passaggio delle proteine può avvenire solo se la conformazione è mantenuta il più lineare possibile, questo è reso possibile da molecole chaperon della famiglio delle Hsp70 citosoliche

Hsp70 guida l’importazione delle proteine

Trasporto mitocondriale: proteine di membrana

TRASPORTO NUCLEARE Una delle caratteristiche più peculiari della membrana nucleare è costituita dalla presenza di aperture specializzate, chiamate PORI NUCLEARI

Ogni poro è costituito da un canale cilindrico che si estende attraverso le due membrane, permettendo la comunicazione tra citosol e nucleoplasma. Le due membrane sono fuse tra di loro a livello di ogni singolo poro formando un canale tappezzato da una complicata struttura proteica , il COMPLESSO DEL PORO Il complesso del poro nucleare ha un diametro di 80-100 nm.

Il complesso del poro (NPC) contiene più di 100 diversi tipi di subunità proteiche. Le subunità assumono una organizzazione ottagonale, protrudono da entrambi i lati dell’involucro nucleare. I NPC contengono al loro interno una struttura detta trasportatore, responsabile probabilmente del movimento delle macromolecole attraverso la membrana nucleare. Altre proteine collegano le otto subunità , dette anche bracci. Ci sono poi proteine che ancorano il NPC alle membrane ed altre che formano una specie di gabbia nel lato del nucleosoma

NPC ha una struttura a tre anelli Gli anelli sono coassiali e sono collegati alle braccia radiali. Il poro centrale è all’interno

Trasporto nel complesso del poro Molecole <50 kDa diffondono liberamente. Le altre sono trasportate da recettori di importazione nucleare

L’ATTRAVERSAMENTO DEL COMPLESSO DEL PORO DA PARETE DI MOLECOLE CON MASSA SUPERIORE A 50kDa E’ MEDIATO DALLA SEQUENZA DI LOCALIZZAZIONE NUCLEARE (NLS): brevi sequenze di aminoacidi carichi positivamente come lisina ed arginina

TALI SEQUENZE RICONOSCONO I RECETTORI DI IMPORTAZIONE NUCLEARE CHE RICONOSCONO LE PROTEINE DEL COMPLESSO DEL PORO E TRASLOCANO L’INTERO COMPLESSO DAL CITOPLASMA AL NUCLEO: I RECETTORI DILOCALIZZAZIONE NUCLEARE FUNGONO DA NAVETTE DI TRASPORTO IL PROCESSO E’ MEDIATO DA PARTICOLARI PROTEINE G : LE PROTEINE Ran CHE ACCOMPAGNANO IL COMPLESSO RECETTORE-CARGO DENTRO E FUORI DAL NUCLEO, OSCILLANDO FRA UNO STATO ATTIVO NUCLEARE (LEGATO AL GTP) ED UNO STATO INATTIVO, CITOPLASMATICO (LEGATO AL GDP)

Ran GTPase dirigono il trasporto ALCUNE MOLECOLE ENTRATE NEL NUCLEO NON VI RIMANGONO (PROTEINE CHE REGOLANO LA TRASCRIZIONE) MA PER ESSERE INATTIVATE DEVONO ESSERE ESPORTATE SEQUENZE DI ESPORTZIONE NUCLEARE NES SONO RICONOSCIUTE DA RECETTORI DI ESPORTAZIONE

Il legame con Ran-GTP induce il rilascio del cargo

Trasporto nei peroxisomi Il trasporto è guidato da una sequenza di 3 amino acidi di solito at C-terminale

Smistamento delle proteine traffico vescicolare

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