Toxocara spp
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Este estudio realizó una caracterización molecular de Toxocara spp. en heces de gatos callejeros en Ahvaz, Irán, utilizando PCR, identificando una prevalencia del 45% de infección, mayormente de T. cati. Se destacó que la infección es común en gatos callejeros, con un notable 96.8% de las muestras positivas para T. cati. Los resultados sugieren que los métodos moleculares son efectivos para detectar bajos niveles de parásitos en heces.
Toxocara spp
- 1. PCR-Based Molecular Characterization of Toxocara spp. Using Feces of Stray Cats: A Study from Southwest Iran Shahram Khademvatan., Fakher Rahim., Mahdi Tavalla, Rahman Abdizadeh, Mahmoud Hashemitabar 2013 PARASITOLOGIA Betty Rivera H.
- 2. INTRODUCCION Toxocara spp, son nematodos parasitarios que se encuentran en el intestino de animales. Los huevos eliminados en las materias fecales de estos animales maduran en el medio ambiente. Existen diferentes especies de estos nematodos Toxocara canis Toxocara cati Toxocara leonina Toxocara malaysiensis Infectando a caninos y felinos principalmente Sin embargo, si el humano ingiere los huevos larvados de forma accidental puede infectarse produciendo toxocariasis y sus manifestaciones clínicas conocidas como síndrome de larva migrante visceral o larva migrante ocular.
- 3. Toxocara spp El gusano de Toxocara spp. Adulto mide aproximadamente 4-6 cm largo (machos) y 6-10 cm largo (hembras). Toxocara tiene tres labios en el extremo anterior del gusano. También poseen alas cervicales grandes estriadas Son esféricos , con una cubierta externa gruesa y tienen una superficie punteada. El tamaño difiere ligeramente: T. canis 80-85 micrómetros por 75 micrómetros. T. cati miden 65-75 micrómetros. T. leonina miden 75-85 micrómetros por 60- 75 micrómetros. HUEVOS Vermes adultos
- 5. EPIDEMIOLOGIA •Es una parasitosis cosmopolita , relacionada con animales domésticos, como perros y gatos. (zoonosis) •se presenta principalmente en niños que conviven con estos animales y que tengan contacto con tierra en donde pueden estar los huevos infectantes. CUADRO CLINICO •se presentan lesiones principalmente en hígado, pulmones, cerebro y ojos, donde producen granulomas de cuerpo extraño. •Estas lesiones están asociadas a hipereosinofilia e hipergamaglobulinemia DIAGNOSTICO •La enfermedad se sospecha clínicamente. •La presencia de anticuerpos demostrados por ELISA o por otros métodos contribuye al diagnóstico, pero la confirmación se hace exclusivamente por el hallazgo de las larvas en los tejidos. TRATAMIENTO •Regularmente no se utillzan anti-helmínticos, aunque el tiabendazol y el mebendazol tienen cierta acción en las etapas iniciales, antes de formarse el granuloma. •En caso de toxocariasis ocular podría realizarse un procedimiento quirúrgico
- 7. Las condiciones climáticas: en verano la T° ronda entre los 48°C– 50°C, el invierno también es de clima cálido con lluvias ligeras a moderadas. No se requirió un permiso especial para la recolección y en los estudios de campo no se involucraron especies protegidas o en riesgo. 140 muestras de heces de gato fueron recolectadas entre enero y mayo del 2012, en espacios públicos de la ciudad, estos fueron puestos en bolsas plásticas y almacenados a 4°C y fueron procesadas dentro de las 24 horas Las muestras que no se utilizaron fueron desechadas higiénicamente Objetivo: Identificar a Toxacara spp y determinar prevalencia de T.cati en gatos callejeros en la ciudad de Ahvaz, en Iran. Área de estudio, diseño y población
- 8. Procesamiento y análisis Para el aislamiento de los huevos se utilizo el método de flotación por sacarosa Las muestras fueron re suspendidas en agua destilada y centrifugadas x 5 min a 1000 rpm Se agregaron 30 ml de agua destilada al sedimento y al sobrenadante se le agregó 15 ml de de sacarosa (Merck) y fue centrifugado a 800 g por 5 min La capa superior del liquido fue separado y centrifugado a 1000xg por 5 min. El sedimento fue re suspendido en 50 ml de agua destilada y centrifugado x 5 min a 5000rpm, el sobrenadante fue descartado y el sedimento fue examinado bajo el microscopio a 10x y 40 x
- 9. Aislamiento de ADN y PCR Extracción de DNA El DNA fue extraído de los huevos de Toxocara spp utilizado un kit de extracción: QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen AG, Hombrechtikon, (Suiza) 1- la muestra fue sometida a un proceso de congelamiento-descongelamiento y digestión por proteinasa K durante toda la noche (16 h) Primers seleccionados desde la región (ITS2) de: Tcan1 (59- AGTATGATGGGCGCGCCAAT-39) T. canis and Tcat1 NC2 (59-TAGTTTCTTTTCCTCCGCT-39) NC2 T. cati (59- GGAGAAGTAAACTC-39) PCR para la amplificación de DNA se utilizo 50 mL de reactivos que contienen 250 mM de cada deoxynucleotide. 100 pmol de cada primer. 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9). 3 mM MgCl2. 10% dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma). 2 U of Taq DNA polymerase (Fermentas). 10–15 ng de un patrón de DNA.
- 10. Para la PCR se utilizo un termociclador (MyCycler; Bio-Rad, Hercules, CA) El ciclo de amplificación consistió : Un ciclo inicial a 94°C por 30 s; • Etapa de denaturacion de 35 ciclos a 94°C por 60 s • annealing a 58°C por 30 s. • Etapa de extensión a 72°C por 30 s. • Un ciclo de extensión final a 72°C por 10 min. ELECTROFORESIS PCR Finalmente , 20 mL de los productos de la PCR fueron puestos en un gel de agarosa 1.8% conteniendo ethidium bromide en 16Tris-borate EDTA buffer along con 1444–80 bp DNA ladder (Fermentas).
- 11. Secuenciación de ADNr Se realizo tomando 20 ejemplares positivos para Toxocara spp al azar, usando para la secuenciación MGW con los mismos primers usados para la PCR. Los resultados fueron analizados con Chromas software. Se utilizo un BLAST que permitió encontrar secuencias exactas lo mas idénticas posible a la de las muestras. Estudio filogenético Se realizo comparando las secuencias obtenidas con otras secuencias obtenidas de un Genbank, topología es similar entre los árboles obtenidos BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (Herramienta básica de búsqueda de alineación local) Se concluyo que la topología es similar entre los árboles obtenidos los valores de 75% y más en la prueba bootstrap de precisión filogenética indican un agrupamiento fiable entre diferentes miembros de Toxocara spp
- 12. RESULTADOS
- 13. Método de flotación revelo de 140 muestras recolectadas, 63 positivas (45%) De 63 muestras positivas 96.8% mostraron 370 pares de base que fueron de correspondientes a T.cati y el resto mostro 380 pares de base correspondiente a T.cani
- 14. Discusión El estudio logro confirmar que los gatos callejeros que circulan por las áreas urbanas están infectados y la prevalencia es mas alta que en cualquier otro lugar de Irán Se esperaba que en la parte céntrica de la ciudad la prevalencia fuera menor debido a que las condiciones socio-económicas y sanitarias son mejores. Gracias al método de PCR con los primers ITS2 se logro establecer que el 96.8% de los gatos estaba infectado por Toxocara cati, y que el restante estaba infectado por Toxocara canis, se había reportado anteriormente perros infectados por T.cati pero era inusual un reporte de gatos infectados por T.canis y que esto también podría ocurrir por el aumento de perros callejeros La diferenciación de Toxocara spp. Usando métodos moleculares como PCR son suficiente sensibles para detector baja cantidad de parásitos y pueden identificar los huevos de Toxocara spp en la heces.
- 15. GRACIAS!!!
- 16. ¿ Que es la PCR ? Es un método molecular que nos permite amplificar ( copiar muchas veces) secuencias de ADN. :P