Wang j tm shift primers-final_2

Eco-Efficient Agriculture for the Poor
High-throughput SNP genotyping by
single-tube PCR with Tm-shift primers
Claritza M.G
Wang Jun et al .2005

INTRODUCTION:

Perfil de Amplificación
Hot Start 95°C 12 min
1 95°C 20 seg Denaturac
2 Tm 1min Annealing
3 72°C 30 seg 40 ciclos Extension
5 72°C 5 min Ext. Final
6 10°C 5 min
Condiciones _Articulo (wang,J. 2005)
Reactivos [ ] Stock [ ] Final VT= 15µL
Agua - - 2.1 µL
Buffer 10X 1X 1.5 µL
MgCl2 25 mM 2 mM 1.2 µL
dNTPs 20 mM 0.2 mM 0.15 µL
Primer Fa 10 µM 0.2 µM 0.3 µL
Primer Fb 10 µM 0.2 µM 0.3 µL
Primer R 10 µM 0.2 µM 0.3 µL
SyBRGreen 1X 0.2X 3 µL
DMSO 100% 5% 0.75µL
Rox Dye 10 µM 0.25 µM 1 µL
Taq _Gold 5 U/ µL 1.8 U 0.4 µL
D N A 4 ng/µL 1 ng/µL 4 µL

Primer Design
Primer alelo especifico Primer común ( PR)
1.)Tm = 59 -62°C 1.) Tm = 63-70°C
2.)Longitud = 15 -22 pb ó 15-27 pb 2.) Longitud = 22-27 pb
3.) Adicionar en su extremo 5': 3.) Se diseña a 20 pb del SNP
a.)Short-GC = 6 pb al primer con menor Tm ( que tiene 3´A ó T)
b.) Long-GC= 14 pb al primer con mayor Tm ( que tiene 3´G ó C)
4.) Adicionar en su extremo 3' 1 base que identifica el SNP
Tamaño del Amplicon: 40 - 80 pb
SNP
Primer Fa
Primer Fb
Primer R
Primers alelo especificos

Análisisdelascurvasdemelting
Algoritmodeagrupamientok-mediasquecalsificalasmuestrasen4categoriasbasadasenel
centroidemáscercano:elprogramamarcalasmuestrasquepertenecenaungrupoenparticular
(t-stadisticoalto).Lasmuestrasquesedesplazan1°Cdespuésdelanormalización:sonmuestrasatipicas
Se utilizael programaSDS2.1compatible con el ABI paracalcularladerivadanegativadel cambio
de fluoresencia:
los valores de meltingson exportados aarchivo de texto: hojade Excel ó aun software inde
pendiente que realizaunaserie de algoritmos de normalización que permiten lecturasemi
automáticade los genotipos:Trazan sobre cadamuestraun grafico de dispersión de los datos
integrados del areade los 2picos

Secuencia 26 pb-GC:
1.)Inicialmente Long –GC (26 pb) a 1 solo primer_ éste alelo predominaba en el PCR
2.)En la versión avanzada ( Figura 1):Short-GC (6pb)/ Long –GC (14 pb) a ambos
primers. Diferencia de 8 pb permitio proporcionar la temp adecuada para discriminar
alelos por diferencias en el Tm
3.)Otras combinaciones. Diferencia de 7-8 pb
4.)La combinación 6 GC/14GC fue la más exitosa en terminos de proporcionar la temp
adecuada para discriminar alelos

Principio de método Método de validación

Taq
1.)Mejora la especificidad y discrimina mismatches entre primer-molde
2.)Anticuerpos Antitaq, pueden ser utilizados para un hot start de ésta
enzima y obtener resultados similares a Taq Gold
3.) Mastermix con 40mMKCl incremente la especificidad y evita
la extensionde primers mismatched
Buffer 10X PH=8( 500mMKCL;100mMT/HCL; 1% Triton x-100; 1mg/ml BSA)
Taq fragmento Stoffel
1.) Mejora mucho más las especificidad y mínimiza la formación
de dimeros de primers
2.) Se activa con calor :Utiliza un hot start ( 95°C por 12minutos)
Nota : Para la mayoria de las pruebas Taq fragmento stoffel
y taq Gold trabajaron igualmente bien
Taq Gold_version frag Stoffel
PruebadevalidaciónparaincrementarlaespecificidadalelicaenelPCR

Genotype Calling

Ventajas de genotipar por Tm shift

KBIOSCIENCE
How KASP work
Kompetitive Allele Specific PCR

X = Datos integrados para el alelo 1
Y = datos integrados para el alelo 2
Allele discrimination SNP Data

GRACIAS

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