Ortiga
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Este documento presenta un anteproyecto para evaluar los reguladores de crecimiento ANA/BAP/KIN en el establecimiento in vitro de la planta ortiga (Urtica Urens L.) mediante organogénesis directa a partir de segmentos nodales. El proyecto consistirá en cuatro fases: 1) establecimiento de plantas madres, 2) desinfección de segmentos nodales usando diferentes concentraciones de NaClO, 3) inducción usando concentraciones de BAP y KIN, y 4) multiplicación usando concentraciones de ANA,
Ortiga
- 1. FORMATO ANTEPROYECTO INFORMACIÓN GENERAL Título del proyecto: EVALUACION DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO ANA/BAP/KIN EN EL ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE LA PLANTA Ortiga (Urtica Urens L.) MEDIANTE ORGANOGENESIS DIRECTA A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES. GRADO GRUPO 11º 2 Nombre de los investigadores Roles Dirección electrónica Santiago Echeverri Trujillo Líder Set0309@gmail.com Juan Pablo Molina Barrientos Colíder Rjcowman@gmail.com Andrés Zapata Gallego Redactor Andreszpt23@gmail.com Yeison Camilo Giraldo Giraldo Utilero yeicam20@gmail.com Daniela Jiménez Guzmán Comunicadora Danijg28@gmail.com - Nombre del profesor asesor: William Pérez Campo CATEGORÍA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN ÁREA TEMÁTICA Investigación científica Biotecnología Ingenierías y Tecnología - Tutor (asesor externo- adulto responsable administrativo para el manejo de recursos financieros y físicos): Robinson Salazar Días Duración del proyecto Valor del proyecto Aporte externo Aporte Institucional 4 meses $ 400.000 $ 0 - ¿El proyecto es continuación de una propuesta presentada anteriormente?: SI NO ¿Cuál es la innovación?
- 2. Título de la investigación EVALUACION DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO ANA/BAP/KIN EN EL ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE LA PLANTA Ortiga (Urtica Urens L.) MEDIANTE ORGANOGENESIS DIRECTA A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES. Resumen En la presente investigación se va a describir el proceso de estandarización de la técnica del cultivo in vitro de la planta ortiga (Urtica Urens L.) Se utilizará la técnica de organogénesis directa, es decir, los órganos se originan directamente desde el explante. La técnica del cultivo in vitro en la ortiga hasta hoy no se ha realizado, actualmente solo se han hecho investigaciones previas. Se llevará la planta al sistema in vitro, para ello se tendrán en cuenta cuatro fases. La primera fase consiste en establecer las plantas madres, dichas plantas de obtuvieron en fincas y en viveros; una vez establecida la planta madre, se extraerán los segmentos nodales y se les realizará un proceso desinfección en donde se probarán diferentes concentraciones de NaClO para determinar cuál es la cantidad a la que el explante responda mejor (Con menos hongos, quemaduras y bacterias) En esta fase se harán distintas repeticiones, al menos tres por cada concentración para tener cantidades precisas. Una vez desinfectado el material se continuará con la inducción, en esta fase se realizará la composición del medio de cultivo MS, en el cual se evaluarán las concentraciones necesarias de reguladores de crecimiento BAP y KIN, aquí también se deben hacer al menos tres pruebas por cada concentración, luego se procederá a la fase siguiente: La multiplicación. En esta fase se probaran distintas concentraciones del regulador de crecimiento ANA (Ácido Naftilacético) con el que mejor tenga resultado en la fase de inducción, por último se sacarán los resultados obtenidos de la fase de multiplicación para determinar que concentraciones son más aptas para la multiplicación de la Ortiga. Planteamiento del problema: La ortiga (Urtica Urens L.) es una planta que posee diversas propiedades medicinales. El coste del mantenimiento de esta planta es muy alto por lo cual no es muy cultivada. La planta no ha sido llevada al sistema in vitro, no hay datos que comprueben que se halla establecido. Por lo cual se decidió llevar la planta al sistema, realizando la estandarización del cultivo in vitro, realizando los diferentes procesos que este conlleva.
- 3. La ortiga es aplicada en los campos de la medicina, en la industria, gastronomía y además tiene riqueza en vitaminas y sales. Pregunta de investigación: ¿Cuál es la relación entre las diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento ANA, BAP Y KIN en el establecimiento in vitro de la planta Ortiga (Urtica Urens L.) mediante organogénesis directa a partir de segmentos nodales? Descripción del problema La ortiga es una planta poco aceptada, es portadora de propiedades medicinales y nutritivas y hasta efectos secundarios para la salud de las personas, gracias a que tiene unos pequeños pelos urticantes en sus hojas y esto la lleva a provocar la urticaria. No se ha llevado a cabo un cultivo in vitro de ortiga, por ende no se han definido las cantidades adecuadas de reguladores de crecimiento adecuadas para hacerlo. Podría ser de gran ayuda para una amplia variedad de investigaciones futuras en campos medicinales y vegetales que se definiera ahora estandarización de la técnica del cultivo in vitro de la planta, ya, que entre otros beneficios, el cultivo in vitro permite que las plantas crezcan con menos cantidad de patógenos y se puede mantener gran cantidad de material vegetal en un pequeño espacio. Para iniciar el método de siembra de la Ortiga menor (Urtica Urens L.) esta necesita suelos muy fertilizados sobre todo en nitrógeno y fosfatos, y una temperatura entre los 15 y los 25°C. Aunque se puede producir muy fácilmente casi en cualquier lugar. Por otra parte el cultivo in vitro en la ortiga mediante segmentos nodales nunca se ha registrado en el sistema, este es uno de los aspectos que lleva a realizar este proyecto, Por eso gracias al cultivo in vitro se dejaría estandarizado el método de cultivo para esta planta. Antecedentes DIVISION BOTANICA DE LA ORTIGA (Urtica Urens L.) Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Rosales Familia Urticaceae Genero Urtica La ortiga menor (Urtica urens L.)se puede identificar por sus hojas opuestas y grandes, con pelos urticantes los cuales pueden causar gran irritación en la piel; con flores color lila, esta planta florece de otoño a primavera y fructifica en primavera. La ortiga también conocida como ortiga menor o yerba del ciego, es una planta de la familia urticácea. Esta planta crece al lado de la ortiga mayor, por eso se puede
- 4. encontrar en climas templados y tropicales, Crece en zonas rurales nitrificadas y arcillosas Esta planta a diferencia de la ortiga mayor sus propiedades medicinales son mas pocas, pero produce una mayor irritación en las personas y animales y sus efectos son más duraderos. (2) La ortiga contiene abundante clorofila, y también taninos, ácidos orgánicos, vitamina C, provitamina A y sales minerales. Los pelillos urticantes contienen ácido fórmico, resina, acetilcolina, histamina y otras sustancias. Tiene numerosas aplicaciones medicinales e industriales. Es un excelente hemostático, y por tanto un buen remedio contra las hemorragias. Es un buen diurético, especialmente útil en la eliminación del ácido úrico; por este motivo es igualmente hipotensor y antirreumático. Se emplea en catarros gastrointestinales, bronquiales y renales; adecuado como antidiarreico y contra el estreñimiento. Por su acción hipoglucemiante es un anti anémico coadyuvante en el tratamiento de la diabetes, estimulante de la actividad de las glándulas endocrinas y la producción de glóbulos rojos, así como un favorecedor de los intercambios metabólicos. Ejerce un buen drenaje hepático. Actúa también como depurativa y fortificante. En aplicaciones externas es cicatrizante, útil en heridas, úlceras, etc., y también como revitalizador del cuero Cabelludo. Las hojas tiernas se pueden consumir como verdura en primavera. Las sumidades también se utilizan en procesos industriales para obtener la clorofila, que es la sustancia más abundante de esta planta. Ésta es empleada como aditivo en productos cosméticos, jabones, etc. (3) ¿Hay evidencia científica en el campo de la medicina con la ortiga? La evidencia es mucho mejor para la raíz de ortiga y el agrandamiento de próstata que para la hoja de ortiga y las alergias. Raíz de Ortiga El uso de la raíz de ortiga para tratar la hiperplasia prostática benigna no se ha estudiado tan bien como la serenoa, pero la evidencia es al menos moderadamente convincente. La raíz de ortiga contiene numerosos químicos biológicamente activos que podrían influir en la próstata indirectamente interactuando con las hormonas sexuales o directamente alterando las propiedades de las células de la próstata.
- 5. Un estudio doble ciego controlado por placebo de 50 hombres con seguimiento de 9 semanas encontró un incremento significativo en el volumen de orina y en la tasa de flujo de orina en el grupo de ortiga en comparación al grupo de placebo. 7 En otro estudio doble ciego y controlado por placebo, el tratamiento de 67 hombres con ortiga produjo un 14% de mejoría en el flujo de orina y un 53% de disminución en la orina residual. 8 Finalmente, un estudio doble ciego y controlado por placebo de 40 hombres encontró una disminución significativa en la frecuencia de orinar después de 6 meses. Hoja de Ortiga Un estudio preliminar doble ciego y controlado por placebo que siguió a 69 individuos sugiere que la hoja de ortiga seca congelada podría al menos mejorar ligeramente los síntomas de alergia Un pequeño estudio doble ciego sugiere que la aplicación directa de la hoja de ortiga a una articulación dolorosa podría mejorar los síntomas. (4) La ortiga también se abre en el campo de la gastronomía, a pesar de ser una “hierba mala”. Es mejor recolectar los brotes tiernos y las hojas, y desechar los tallos más duros. Las propiedades urticantes desaparecen con la cocción o 12 horas después de recolectada. La forma más sencilla de prepararlas en el campo es, después de lavarlas con unos guantes, hervirlas entre 10 y 15 minutos. Luego aliñarlas con aceite y sal si se dispone de ello. También se puede prepararlas en tortilla, sopas, puré o cualquier otro plato que salga de vuestra imaginación. M. Pahlow recomienda las hojas de ortiga junto con diente de León y celidonea menor como una buena ensalada de primavera. Las virtudes de la ortiga como alimento superan probablemente a las de las espinacas, ya que, al contrario que estas, la ortiga no contiene oxalato sódico. Sin embargo sí aporta otros beneficiosos elementos como el hierro o el silicio. Además, contiene una importante cantidad de proteínas: de 6 a 8gr por cada 100gr de planta fresca y de 30 a 35gr si está seca; y vitaminas A, C y K. En la obra "Secretos y Virtudes de las Plantas Medicinales" de Selecciones del Reader's Digest se nos dice que no consumamos las semillas. También Alan Sauri, en su libro "La Vida Autosuficiente" de Ed. Blume, advierte "Desconfiad de las semillas: 10gr por día suprimen totalmente la orina". Es un dato curioso, sobre todo teniendo en cuenta que una de las principales propiedades reconocidas de la ortiga es su efecto diurético, para que nos entendamos, las plantas diuréticas eliminan las toxinas de la sangre y a menudo aumentan temporalmente la secreción de orina. Para evitar riesgos, se desechan las semillas al realizar cualquier plato o infusión con ortiga. (5)
- 6. Justificación: Este proyecto se realizará porque hasta el momento no se ha estandarizado la técnica de cultivo in vitro en la Urtica urens L, también porque La planta ortiga es una planta conocida poco a pesar de sus grandes propiedades medicinales (estimulante de aparato digestivo y antidiarreica, hemostática, anti-arteriosclerótica, antidiabética, anti anémica, galactogena, anti-prostática, Alzheimer, Diurético, Impotencia sexual, cosméticos, tratamiento capilar, ciática) En Colombia la aplicación del medio de cultivo in vitro es nulo para esta planta, pero por medio de cultivo en campo si se da, pero es muy costoso su mantenimiento a una gran escala por sus condiciones de cultivo, La aplicación en este país de a la ortiga es para materia prima de cosméticos, y productos medicinales sin embargo la producción es muy escasa por sus condiciones climáticas ya mencionadas. Esto principalmente fue lo que dio pie a la planeación de un proceso de propagación in vitro, mediante organogénesis directa, con los que se propagará la planta. Objetivos Objetivo general: Evaluar los reguladores de crecimiento ANA/BAP/KIN en el establecimiento in vitro de la planta ortiga (Urtica Urens L.) mediante organogénesis directa a partir de segmentos nodales Objetivos específicos: - Determinar la concentración de NaClO (hipoclorito de sodio) óptima para la desinfección de los segmentos nodales. - Definir la concentración adecuada de los reguladores de crecimiento BAP y KIN en la fase de inducción en el medio de cultivo MS - Estimar la concentración necesaria de los reguladores KIN Y BAP/ANA en la fase multiplicación. Diseño metodológico Establecimiento de las plantas madres: 16 plántulas de ortiga, las cuales se llevaran a un lugar adecuado para su sostenimiento, ahí se multiplicaran por medio de esquejes, para poder establecer una gran cantidad de plantas madre. Las plantas serán controladas en cuanto, plagas, humedad, temperatura.
- 7. Desinfección: Primero se cortaran los segmentos nodales para luego lavarlos con agua corriente, para retirar restos de tierra u otras partículas. Luego se introducirán los segmentos nodales en etanol al 70% por no más de 5 segundos para luego dejarse evaporar. Después de este proceso se sumergirán los segmentos nodales en una solución de hipoclorito de sodio en distintas concentraciones (Ver tabla 1.1) donde se dejarán 1, 2 y 3 minutos en distintas pruebas. Seguido se enjuagarán los segmentos nodales con agua esterilizada 4 veces. Tabla 1.1 PRUEBAS DE DESINFECCION EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamiento s NaClO (hipoclorito de sodio) mg/l Repeticiones HONGO S BACTERIA S QUEMADURAS 1 0,00 3 2 0,5 3 3 1 3 4 1,5 3 5 2 3 Inducción: En esta fase se empezará por preparar la composición del medio de cultivo (MS) en el cual se probarán distintas concentraciones de reguladores de crecimiento los cuales van a ser Furfurilaminopurina (Kinetina) y Benzil Aminopurina (BAP) (ver tabla 1.2.1 y tabla 1.2.2). Las concentraciones de vitaminas, sales y carbohidratos no serán modificados, se usaran las concentraciones del medio de cultivo (MS). Se utilizará el gelificante agar en una concentración de 0,6 - 1%. PRUEBAS DE INDUCCIÓN EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamieno s KIN (KINETINA) mg/L Repeticiones BROTES 1 0,00 3 2 0,5 3 3 1 3 4 1,5 3 5 2 3 Tabla 1.2.1
- 8. PRUEBAS DE INDUCCIÓN EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamiento s BAP mg/L Repeticiones NÚMERO DE BROTES 1 0,00 3 2 0,5 3 3 1 3 4 1,5 3 5 2 3 Tabla 1.2.2 Multiplicación: En esta fase se probarán distintas concentraciones del regulador de crecimiento ANA (Ácido Naftilacético) con el que estadísticamente obtenga un mejor tenga resultado en la fase de inducción (X1) (ver tabla 1.3) PRUEBAS DE MULTIPLICACIÓN EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamiento s Unidades de concentración ANA/X1 mg/L Repeticiones BROTES 1 0,00 3 2 0,5 3 3 1 3 4 1,5 3 5 2 3 Tabla 1.3 Marco teórico: Clasificación taxonómica de la ortiga (Urtica urens L) Clase Magnoliosida Orden Urticales Familia Urticaceae Genero Urtica Especie Urtica urens La Urtica Urens L, más conocida como ortiga menor o picamoscas, es muy conocida por ser una hierba que nace mucho entre los escombros y el desorden, incluso se ha llegado a considerar como una plaga. Puede llegar a crecer entre 40- 60 cm también posee múltiples beneficios medicinales que la gente desconoce y además ha sido usada en varias investigaciones científicas de las cuales se habla en los antecedentes de este proyecto
- 9. Sus principales beneficios medicinales son • Analgésica • Antialergica • Antianémica • Antigotosa • Antiinflamatoria • Antirreumática • Astringente • Diurética (Abies, Urtica Dioica Ortiga, Medellín 27 de septiembre de 2012 http://laboratoriosabies.com/pdf/25%20-%20Ortiga.pdf) Esta planta es muy conocida por poseer unos pelos urticantes tanto en sus hojas como en su tallo, que tiene un efecto sobre la piel de los humano, estos pelos al mínimo roce inyecta un liquido el cual causa ronchas urticantes. La composición de esta planta no se conoce parcialmente, pero se conocen algunos, por ejemplo, en la raíz está compuesta por escopetrol, alcohol homovainillico, lignanos y en las partes aéreas está compuesta principalmente por hierro y silicio, ácidos fenoles y numerosos flavonoiles, los pelos urticantes contienen aminas (acetilcolina, histamina, serotonina (7) MICROPROPAGACION La micro propagación "in vitro" de plantas es una técnica que utiliza pequeños trozos de tejido o de órganos en condiciones asépticas, con el fin de conseguir nuevas plantas idénticas a la planta madre. Esto se consigue gracias a que las células de las plantas son "totipotentes", es decir, tienen una capacidad latente para regenerar una planta nueva a partir de una única célula, de manera que la nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre. El cultivo in vitro permite entre otras muchas cosas una rápida propagación vegetativa de las plantas, y una mejora del estado sanitario de las mismas. ORGANOGENESIS DIRECTA Cuando los órganos se originan directamente del ex planto (yema axilar) en ausencia de proliferación del callo, aunque normalmente es indirecta. La organogénesis directa (es decir sin la formación previa de callo) es altamente deseable en los trabajos de micro propagación y de conservación de germoplasma. La organogénesis directa consta de 6 procesos, cuatro de ellos en el laboratorio, estos son: - Establecimiento de plantas madres - Desinfección - Inducción - Multiplicación
- 11. Establecimiento del cultivo: El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extraídos de la planta madre. Estos pequeños órganos o trozos de tejido se llaman explantos. Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas por microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente se introducirán en el medio a su vez estéril y se mantendrán allí en condiciones asépticas. Multiplicación: Una vez que la primera fase se ha completado con éxito, comienza la multiplicación de los explantos. El explanto encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales, azúcares, hormonas, etc). Tras un período de crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se produce la multiplicación de las plantas. AGAR Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. Tiene una elevada masa molecular, tiene la capacidad de hidratarse y formar una red. La planta no puede digerirlo ni adsorberlo, además no interactúa con los componentes nutritivos del medio. YEMAS AXILARES Las yemas auxiliares están situadas en los nudos de los tallos. De ellas salen las hojas y las flores. (8) CONDICIONES ASEPTICAS Una de las características básica de este tipo de cultivos in vitro es la rigurosidad fitosanitaria necesaria para que los plantines lleguen a campo sin ser portadores de hongos, bacterias u otros agentes patógenos. Para lograr esto, se debe controla distintos aspectos relacionados a la micro propagación: condiciones del ambiente del laboratorio; esterilización del medio de cultivo, tubos de ensayo, recipientes y las herramientas de trabajo; desinfección de los explantes; respetar y cumplir con las normas de higiene y asepsia, etc. El proceso se realiza en condiciones extremas de desinfección, endógenas y exógenas, por tal razón las instalaciones fueron especialmente diseñadas y construidas para una mejor climatización. MEDIO DE CULTIVO El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones.