Columnas Empacadas

HPLC: Columnas Empacadas
Daniel S. Parra González
Diseño, Desarrollo y Aplicación de Métodos Cromatográficos
Universidad Nacional de Colombia
Bogotá, mayo de 2017

CONTENIDO
• Aspectos Generales
• Soportes
• Fases Estacionarias
• Clasificación
• Selección de la columna

Partes de la columna
Empalme externo
Tubería
Funciones:
- No debe permitir el derrame de líquido
bajo las presiones de HPLC.
- Debe distribuir el flujo de fase móvil y la
muestra en la sección transversal de la
columna.
- Debe retener el empaque dentro de la
columna.
Funciones:
- Contiene al lecho empacado
- Debe resistir las presiones de HPLC.

CONTERA
(ferrule)
•Se acopla a la
tubería y la
deforma
•Útil con presiones
< 400 bar
JUNTA DE METAL
•Util con presiones
de 700 bar
•En teoría se
debilita cada vez
que se abre la
columna
SELLO DE PLÁSTICO
•Se usan sellos de
polímero
fluorocarbonados
•(PTFE)
SELLOS EN O
•Generar un cierre
hermético
•Tienen problemas
por compatibilidad
de solvente.
•Cauchos basados
en fluorocarbonos
pueden ser útiles
Mecanismo de Sello
Tomado de sitio web de HPLC-Supply Inc. Disponible en: www.hplcsupply.com. Consultado: 17-05-2017

 Los distribuidores permiten tener certeza que se da la
distribución en el área longitudinal de la columna.
 Aunque aplica más en columnas preparativas, si el ratio
diámetro:longitud excede ~0.05 empieza a tener influencia
en la separación (4.6mm x 50mm empacada con 3 μm)
Distribuidores
Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

Filtro
TIPOS DE FILTRO
•Fritas de partículas de acero sinterizado
•Gran capacidad filtrante
•Porosidad 30 a 40%
•Espesor mínimo de un 1mm
•Malla de acero tejido
•Porosidad 5%
•Espesor mínimo de 0.1mm
•Sin capacidad filtrante se puede tapar
•Malla híbrida
•Polvo a presión en malla
•Espesor de 0.1 mm
•Capacidad filtrante
•Malla de PEEK o PE
•No tiene capacidad filtrante
•Se puede deshacer con solventes (no NP-HPLC)
El Filtro presente en el empalme tiene como fin:
1. Contener las partículas en el sistema
2. Constribuir a la distribución de la muestra
3. Proteger al empaque de material particulado

Tubería
 En la mayor parte de los casos es acero
inoxidable 316.
 La rugosidad de la superficie interna
altera la uniformidad del lecho
empacado.
 Un diseño exitoso ha consistido en un
tubo externo de resistencia y un tubo
interno con un acabado sofisticado.
Tubería de PEEK no soportada en acero, <350barTubería de vidrio no soportada en acero, <100bar

Empaque de la columna
𝑈 𝑥 =
1
18
𝑑 𝑝
2
𝜂
𝜀 𝑆𝐾(𝜌 𝑆𝐾 − 𝜌𝑙)
Para una partícula de 10 μm con porosidad 75%, la
velocidad de sedimentación es 0.02 cm/s. Pero en
el empaque se alcanzan 1.33 cm/s.
Lo que determina la calidad del empaque son las
interacciones entre partículas
ADICIÓN AG. DEFLOCULANTE
Stoke’s

Química de las Columnas
• Soportes inorgánicos
– Poseen resistencia mecánica; soportan altas presiones.
– No se hinchan o encogen cuando se exponen a diferentes disolventes.
– Son empaques porosos, cuyas características físicas se pueden controlar
mediante procesos tecnológicos.
– Se disuelve en pH alcalinos.
• Soportes de polímeros orgánicos
– Tienen un rango de pH de uso de 1 a 14.
– No soportan grandes presiones (< 150 bar); poca resistencia mecánica.
– En comparaciones siempre tienen menor eficiencia, puesto que la
transferencia de masa es reducida.
– Pueden imbibir o sufrir sinéresis de acuerdo al tipo de disolvente.

Soporte de Sílice (1)
Procesos de obtención
Hidrólisis completa de silicato sódico
Policondensación de polietoxisiloxano
emulsificado, y deshidratación
Gel de Sílica
(Irregular o Esférico)
 pH
 Concentración
 Aditivos
 V. de agitación
 Volumen reactor
 Cont. metales

Soportes de Sílice (2)
Siloxano
Hidrofóbicos
Poco reactivos
↑ con trat. térmico
Silanol
Grupo ácido
Ionizable a pH>3
Genera colas
Adsorción en NP-HPLC
Centro reactivo en RP-HPLC
Silanol Vecinal
No tienen acidez
Ávidos por -OH
Silanol Geminal
No tienen acidez
Conc. silanol en superficie
8 – 14 μmol/m2
(4.6-8 grupos/nm2)
Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

Contenido de Metales
La presencia de metales como aluminio
es indeseable, genera grupos silanol.
Genera fuerte adsorción de
compuestos básicos
Sílicas convencionales:
250 ppm Na+; 150 ppm Al3+
Sílicas modernas:
< 1 ppm Na+, Ca2+, Mg2+, Al3+, Fe3+.
Contenido de Metales en Sílice

 pH
 Concentración
 Aditivos
 V. de agitación
 Volumen reactor
 Cont. metales
Proceso de manufactura
Amplitud de poro
Área de superficie
específica
Distribución de
amplitud de poro
Densidad
Sílica 2.2 g·cm-3
Empaque 0.3-0.6 g·cm-3
Una distribución uniforme
permite picos simétricos
En RP-HPLC > 50Å.
En SEC > 300 Å.
100m2·g-1 para 300Å
300m2·g-1 para 100Å
500m2·g-1 para 60Å
Proceso de Manufactura
LA AMPLITUD DE PORO Y EL ÁREA
DE SUPERFICIE ESPECÍFICA
ALTERAN LA RETENCIÓN
EL DIÁMETRO DE PARTÍCULA ALTERA
LA PRESIÓN Y TIEMPO DE ANALISIS!!

Fases Enlazadas (1)
Se hace modificación química de los grupos silanoles libres por:
A. Esterificación
Se usa principalmente para GC, esta reacción se da con grupos silanol superficiales. La fase
enlazada es susceptible de hidrólisis en presencia de FM acuosa.

Fases Enlazadas (2)
B. Enlace con cloruro de tionilo y amina
El enlace tipo imina es menos susceptible a la hidrólisis.

Fases Enlazadas (3)
C. Formación de enlaces siloxanos
Las fases enlazadas con un enlace siloxano son las más estables de todas. El octadecilsilano
(ODS) es uno de los productos mas utilizados en RP-HPLC.
Se pueden tambier utilizar silazanos para generar la unión
ODS

Fases Enlazadas (4)
D. Formación de polisiloxanos
Se pueden producir estructuras poliméricas con
estructura de aceite de silicona. Estas columnas
tienen unas estabilidad mayor frente a pH alcalino.

Superficie Cubierta
χ =
%C
100 · SA 1 −
%C
100
MW − 1
nC · 12
Donde χ - superficie de cobertura,
%C - contenido de carbono
SA - área superficial
MW - peso molecular
nC – número de átomos de carbono
La superficie de cobertura máxima para columnas de
sílica es 4 μmol/m²
Como la superficie posee hasta 8 μmol/m² de grupos
silanol, tras la reacción queda la mitad de los grupos
sin reaccionar.
Capping
Con el fin de minimizar los grupos silanol residuales tras la adición de FE se adicionan grupos
trimetilsilil - con ClSi(CH3)3 - para eliminar sitios de adsorción que producen tailing.
Inclusive con capping es imposible eliminar del todo la
influencia de la adsorción en la separación

Fase Estacionarias (1)
C18
C12
C8
C6, hexil
Usar cadenas lineales de HC
aumenta levemente la selectividad
hasta el umbral C18
RP-HPLC

Fases Estacionarias (2)
Ciclohexil
Fenil
Alquilfenil
Alquil-F5-fenil
Útil para separar compuestos
aromaticos
RP- HPLC
Se presentan diferencias importantes
cuando se compara selectividad con
cadenas de hidrocarburos lineales.

C4
C3
C2
C1
Usado para capping
RP-HPLC

Ciano, nitrilo
Amino
Diol
SAX – Strong Anion Exchange
SCX – Strong Cation Exchange
Intercambiadores iónicos
IEC y HILIC
Polar
HILIC
Polar
SEC acuoso
Polar
NP-HPLC y RP-HPLC

Nitro
SymmetryShield RP8 - Alquilcarbamato
Supelcosil ABZ
Selectividad por compuestos aromaticos
NP-HPLC
Fases apolares con grupos polares
incrustados
RP-HPLC
Previene la interacción del analito con silanoles libres
Los compuestos exhiben significativa selectividad en
comparación con fases con HC

Fase Estacionaria Bifuncional
Fases Quirales

LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LA
FASE ESTACIONARIA ALTERAN LA
SELECTIVIDAD DE LA SEPARACIÓN
Tomado de sitio web de: Advanced Chromatography Technologies Ltd. Disponible en: http://www.ace-
hplc.com/products/product.aspx?id=105. Consultado el 16-05-2017
Efecto de FE en Separación
!
Se cambia el órden con
el cual los picos son
eluidos con FE

Reproducibilidad Intramarca
El desarrollo de la industria
de columnas ha permitido
reducir la variabilidad lote a
lote en una misma marca

Otros soportes: Alumina
 Es efectiva para la separación de hidrocarburos
aromáticos policíclicos e isómeros estructurales.
 Es estable a pH 2 a 12, pero tiene fuertes
propiedades quimiosorptivas (tailing)
 En general, tienen menos eficiencia que
columnas de sílica.
 Puede actuar como intercambiador de cationes
o aniones de acuerdo a su tratamiento.
Tomado de sitio web de Advanced NanoFabric Engineering. Disponible en:
http://voitlab.com/courses/thermodynamics/index.php?title=Advanced_Na
noFabric_Engineering Consultado el 16-05-2017

Otros soportes: Zircón o Titanio
 El zircón se puede usar en NP-HPLC y RP-HPLC
 Tiene muchos grupos básicos en superficie,
algunos ácidos
 Estable a pH entre 1 y 13
 El titanio se puede usar en NP-HPLC y RP-HPLC
 Tiene grupos básicos en superficie
 Estable a pH alto
Tomado de sitio web de ZirChrom Newsletter. Disponible en:
https://www.zirchrom.com/newsletters/2005-07.asp Consultado el 16-05-2017
Tomado de sitio web de ZirChrom Newsletter. Disponible en:
https://www.zirchrom.com/newsletters/2005-07.asp Consultado el 16-05-2017

Otros soportes: Estireno-Divinilbenceno
• Fueron originalmente desarrollados para cromatografía de macromoléculas.
• Basados en unión de monómeros de isómeros de estireno y divinilbenceno.
• Utilizados principalmente en IEC y SEC
• La proporción de DVB determina el entrecruzamiento y tamaño de poro:
– Si DVB (<6%) – poca estabilidad frente a presión y no es útil para HPLC
– Si DVB (8%) – se trata de poliestireno semirígido; estable a 80 bar; se hincha o encoge dependiendo
la fase móvil.
– Si DVB (>10%) – se tiene poliestireno rígido que es un material que no se hinchan y soporta
presiones hasta 350 bar
Estireno
p-divinil benceno
↑ alta hidrofobicidad

Otros soportes: Estireno-Divinilbenceno
Los empaques microporosos se producen con menor
entrecruzamiento, son no porosos en estado seco y
adquieren volumen de poro al imbibir solvente
(usualmente uno no polar).
Se utilizan más para SEC de moléculas pequeñas y
analitos oligoméricos.
En los empaques macroporosos, los poros no se
encuentran dentro del retículo del polímero y se trata
de espacios entre esférulas de polímero sólido.
La estructura de poro y superficie específica es
permanente.
Estos empaques se usan más en SEC de moléculas
grandes y cromatografía de retención.

Otros soportes: Metacrilato
 Son preparados de metacrilato y un agente de entrecruzamiento apropiado como etilenglicol metacrilato.
El monómero más usado es glicidoximetacrilato, el grupo epoxi se puede derivatizar con grupos
funcionales.
 Se pueden formar resinas micro y macroporoso con el mismo rango de tamaño de poro que en resinas de
poliestireno.
 Son estables a hidrólisis entre pH 2 y 12; estas resinas son útiles para HILIC y SEC acuosa. La resina se
puede derivatizar para formar intercambiadores aniónicos.

Otros soportes: Vinilalcohol
• La estructura es muy hidrofílica, y al tener cadenas de hidrocarburo
lineal es resistente a hidrólisis en extremos de pH.
• Si se adicionan cadenas largas de ácido graso se puede obtener
resinas útiles para RP-HPLC.
• Como ventaja clave es que no se tienen grupos silanol ácidos libres.

Otros Soportes de HPLC
• Silicato de Magnesio
• Agarosa
• Vidrio de poro controlado (CPG)
• Hidroxilapatita
• Carbono poroso grafítico
• Materiales de acceso restringido
Pese a que existen una gran
variedad de columnas en LC no
siempre se piensa en todas

Propiedades Físicas de la Columna
𝑅 𝑆 =
𝑁
4
·
𝛼 − 1
𝛼
·
𝑘2
𝑘2 + 1
𝑡 𝑎 =
𝐿
𝑢0
· (𝑘 𝑁 + 1)
𝐵0 =
𝐹𝜂𝐿
𝜋𝑟2Δ𝑃
=
1
185
𝜀𝑖
2
(1 − 𝜀𝑖
2
)
· 𝑑 𝑝
2
 Longitud
 Diámetro interno
 Tamaño de partícula
Resolución
Tiempo de análisis
Contrapresión
de la columna
LAS PROPIEDADES FÍSICAS DE LA
COLUMNA ALTERAN LA EFICIENCIA
DE LA SEPARACIÓN
!

Las columnas más grandes pueden ser usadas para análisis con alta resolución, pero como
tiene un tiempo de análisis muy largo.
Las columnas más pequeñas pueden ser usadas para análisis rápidos a costa de la resolución.
Influencia de la Longitud en la Separación

Influencia de la Longitud en la Separación (2)
5 cm
10 cm
15 cm

Influencia de Tamaño de Partícula
A menores tamaños de partículas se tiene mejor resolución posible. Pero al aumentar este se tiene un
rango dinámico más amplio.
Se debe reservar una columna con rango intermedio para propósitos generales, se puede usar una columna
con rango pequeño para alta resolución.

Efecto del Tamaño Partícula
5 μm
10 μm
15 μm

Efecto del Ratio l:dp
La resolución máxima y el tiempo
de análisis son determinadas por el
ratio entre longitud y dp
solamente.
Se deben escoger los menores
valores de dp, a medida que se
escala la longitud hasta alcanzar el
límite de presión.
Los ratios óptimos tienen
problemas con
sobrecalentamiento

Influencia del Diámetro de la Columna

Influencia del Diámetro de la Columna (2)
USAR MENOR ID
Ventajas
Ahorro de solvente
El tamaño de la muestra puede ser más
pequeño
Desventajas
No siempre el equipo se adapta a un ID
pequeño
Sobrecarga de volúmen
Sobrecarga de masa
Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH.
Canada, 1997.

Elección de Columna – Desarrollo de
Métodos
• A priori
• Definir el conocimiento de la muestra
• Definir los objetivos para el método de separación
• Eliga la columna a considerar
• En el laboratorio
• Elija la química inicial de la fase móvil
• Elija el tipo de detección y parámetros de inicio
• Evalúe las colúmnas potenciales para la muestra
• Optimize las condiciones de separación (G o I) para la columna escogida
• Valide

Desarrollo del Método
Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL,
Consultado el 16-05-2017

Desarrollo del Método
Relacione los objetivos del método
con la columna
Una columna adecuada para empezar es:
15cm x 4.6 mm, 5µm, 200m2/g, 100Å,
10% C, monomérica, esférica)

Ejemplo (1)

Ejemplo (2)
Mezcla de compuestos
OH
(CH2)5CH3
N
(CH2)3CH3
Phenol 3-Butylpyridine
Anthracene 3-Hexylanthracene

Ejemplo (3)

Ejemplo (4)

Ejemplo (5)

Columnas Empacadas

Más contenido relacionado

La actualidad más candente (20)

Similar a Columnas Empacadas (20)

Más de D P (20)

Último (20)

Columnas Empacadas

Notas del editor