Efecto protector en la isquemia,NUTRISIM
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El estudio toxicólico Nutri-Sim, realizado en ratas Wistar, mostró que la administración de diversos compuestos no causó muertes ni alteraciones en la conducta o en los parámetros hematológicos y bioquímicos. Se analizó el efecto protector de Nutri-Sim en cerebros de gerbos tras isquemia-reperfusión, concluyendo que no se observaron diferencias significativas en la morfología o en los niveles de peroxidación lipídica. Los resultados indican que Nutri-Sim podría tener un efecto antioxidante al minimizar el daño oxidativo en condiciones de isquemia-reperfusión.
Efecto protector en la isquemia,NUTRISIM
- 1. ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM • Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas. • CIBO-IMSS. Guadalajara, México • Dr. en Ciencias. Genaro G. Ortiz.
- 2. NUTRISIM • Arginina • Lisina • Colina • Cloruro de Amonio • Cloruro de Calcio • Cloruro de Magnesio
- 3. ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM • 100 ratas (250 g. de peso) de la cepa Wistar • Grupos de 10 ratas por dosis administrada • La administración será por vía intraperitoneal
- 4. ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM • Curvas de Kaplan Meyer • Análisis histopatológico y Macroscópico post- morten – Hígado – Riñón – Pulmón • Análisis Bioquímico
- 5. ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM Dosis Administrada • 0.1 ml • 0.2 ml • 0.3 ml • 0.4 ml • 0.5 ml • 1 ml • 2 ml • 3 ml • 4 ml • 5 ml
- 6. Resultados Por Observación • No se presentó ninguna muerte. • Ninguna alteración en su patrón de conducta
- 7. Resultados Hematología y Bioquímica • En todos los animales estudiados no se apreció ninguna modificación de los valores normales tanto de la citología hemática como de la química sanguínea.
- 8. Citología hemática y química sanguínea • Eritrocitos 6.000.000 • Hemoglobina de 13.6 g/dl • Hematocrito 40.9 % • VEM 60 fl • CMHC 30/dl • Leucocitos 10,000 • Glucosa 97.2 mg.% • Urea 29.6 mg • Creatinina 0.41 • Colesterol 87.3 mg % • Albúmina 4.3 mg% • Globulina 2.8 mg%
- 9. Resultados Análisis Morfológico • No se apreció ninguna alteración en la laparotomía y toracotomía; no encontramos líquidos en cavidades ni datos de degeneración, congestión o edema en ninguno de los grupos estudiados.
- 10. Resultados Análisis Estructural • Los órganos estudiados: hígado, pulmón y riñón; no mostraron ninguna modificación en el patrón citoestructural como citoarquitectónico
- 11. HIGADO Fotomicrografía de hígado en la cual no se aprecia ninguna alteración
- 12. PULMON Fotomicrografía de pulmón en la cual no se aprecia ningún daño
- 13. RIÑON Fotomicrografía de riñón en la cual no se aprecia ningún daño
- 14. Estudio Estructural y Bioquímico del posible efecto protector del Nutri-Sim en cerebros de Gerbos (Mongolian gerbils - Meriones unguiculatus) sometidos a isquemia-reperfusión.
- 15. Dr. Rolando Romero Dávalos Lic. Luis Alfredo Romero Tirado. BIO-SIM S. A. de C. V., México Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas. CIBO-IMSS. Guadalajara, México Coordinador Dr. Genaro G. Ortiz.
- 16. La Enfermedad Isquémica Cerebrovascular ( EVC ) • Patología que surge como resultado de la alteración de los vasos sanguíneos que suministran su flujo al cerebro. • 3° causa de muerte en el mundo.
- 17. FACTORES • Hipertensión • Cardiopatías • Tabaquismo • Diabetes mellitus • Consumo de alcohol • La vida sedentaria • La obesidad • Anticonceptivos orales.
- 18. ISQUEMIA • La isquemia es la ausencia o disminución del aporte sanguíneo por un determinado tiempo, que lleva a un daño celular, en ocasiones no muy específico y delimitado.
- 19. REPERFUSION • Por otro lado, la reperfusión, es el período que sigue a la isquemia, y que se caracteriza por una reoxigenación cerebral acompañada del restablecimiento del aporte sanguíneo. Así pues, durante la isquemia se genera un daño al producirse radicales libres y en la reperfusión el daño puede ser mayor cuando se distribuyen estos radicales libres a través de la sangre.
- 20. FALLA DE ENERGÍA POR LA ISQUEMIA CEREBRAL • En condiciones normales, el 95% del ATP cerebral es producido en condiciones aerobias, por cada mol de glucosa y 6 moles de oxígeno se obtienen teóricamente 36 moles de ATP. (Hochachka y Somero1984)
- 21. FALLA DE ENERGÍA POR LA ISQUEMIA CEREBRAL • En contraste, en la glicólisis anaerobia, donde la glucosa se metaboliza a piruvato o lactato, sólo se obtienen 2 moles de ATP por cada mol de glucosa. (Hochachka y Somero1984)
- 22. La falla energética conduce a lo siguiente: • Se detiene la producción de ATP, como resultado caen los niveles de ATP, • La utilización de ATP por la bomba Na+ / K+ cae, • La salida neta de K+ conduce a una progresiva despolarización, • La despolarización se generaliza. Existe una rápida salida de K+ y un influjo de Ca+ y Na+
- 23. La falla energética conduce a lo siguiente: (2) • Muerte neuronal causada por: A) Activación de procesos líticos por Ca+ (proteasas, lipasas y endonucleasas), B) Hinchamiento celular y lisis debido al agua acompañada del influjo de iones que se traduce en un aumento en la presión cerebral y a su vez en una isquemia permanente, C) Elevación de los niveles de ácidos grasos libres y otros lípidos causantes de daño a nivel de membrana, D) Producción de radicales libres citotóxicos y aldehídos especialmente en la reperfusión. (Lutz y Nilsson, 1997)
- 24. RADICALES LIBRES • Los radicales libres son definidos como entidades químicas (átomos, moléculas, iones) que poseen uno o más electrones desapareados • Los radicales pueden formarse a partir de una molécula neutra a la que le han quitado o donado un electrón.
- 25. Efectos biológicos de los radicales libres • La toxicidad particular de los radicales libres es una consecuencia de su alta reactividad. En principio, los radicales libres pueden reaccionar con moléculas vivientes virtualmente importantes. Esto puede dirigir a alteraciones estructurales, las cuales, bajo ciertas condiciones, conducen a la muerte celular.
- 26. Efectos biológicos de los radicales libres (2) • Los radicales libres, también han sido asociados con procesos tóxicos más complejos, incluyendo reproducción en la toxicidad y tumorogénesis. • Debido a la diversidad de la generación biológica de radicales libres, y sus diferentes propiedades, es difícil generalizar acerca de sus efectos biológicos.
- 27. Efectos biológicos de los radicales libres (3) • Tales efectos pueden variar dependiendo del sitio de formación del radical, la vida media del mismo y la naturaleza de la célula blanco con la que interactúa.
- 28. HIPOTESIS • El Nutri-Sim protegerá del daño oxidativo al cerebro de gerbos después de la isquemia reperfusión.
- 29. HIPOTESIS NULA • El Nutri-Sim no protegerá al cerebro del daño oxidativo generado al realizar isquemia-reperfusión en gerbos.
- 30. OBJETIVO GENERAL • Estudiar el efecto antioxidante del Nutri-Sim en cerebros de gerbos (Mongolian gerbils: Meriones unguiculatus) despues de realizar isquemia-reperfusión.
- 31. Objetivos particulares • Demostrar que existe daño neuronal (agudo y crónico) al realizar el modelo de isquemia-reperfusión en gerbos. • Demostrar que existe estrés oxidativo en el modelo de isquemia-reperfusión en gerbos. • Estudiar el papel Nutri-Sim como protector, en los procesos de isquemia-reperfusión cerebral.
- 32. VARIABLES • Independientes – Nutri-Sim • Dependientes – Peroxidación de Lípidos de Membrana – Oxido Nítrico (Nitratos y Nitritos) – Glutatión Peroxidasa – Estructura celular
- 33. MATERIAL • 78 animales de la especie Meriones unguiculatus (Gerbos) • Anestésicos – Droperidol – Ketamina
- 34. DETERMINACIONES • Concentración de proteínas totales: Método Bradford. • Peroxidación de lípidos de membrana, 4- Hidroxialquenos (HA) y malonaldehídos (MDA) • Oxido Nítrico, método de Griess • Glutatión Peroxidasa
- 35. GRUPOS A ESTUDIAR • Testigo • Testigo Manipulado • Isquemia-Reperfusión • Isquemia Reperfusión mas Nutri-Sim • Nutri-Sim
- 36. Testigo • A este grupo de animales se les mantuvo en condiciones de bioterio. Se decapitaron para la extracción de cerebro. (n=10)
- 37. Testigo Manipulado • A este grupo se le mantuvo en sus jaulas con alimentación propia para animales de laboratorio y bajo condiciones de bioterio. Después se manipularon bajo anestesia. Se incidieron de cuello simulando el proceso de isquemia-reperfusión cerebral. Al final se sacrificaron para obtener la muestra de tejido. (n=10)
- 38. NUTRISIM • Estos animales fueron manipulados bajo anestesia. Se incidieron de cuello, al igual que el grupo 1, pero con la diferencia de que a éstos se les aplicó una dosis de Nutrisim® 30 minutos antes del sacrificio. (n=10)
- 39. Isquemia-Reperfusión • Se incidieron de cuello bajo anestesia, después se les realizo la isquemia bilateral en carótidas por 5 minutos seguida de reperfusión por 90, 120 minutos y 7días. (n=8 por cada tiempo)
- 40. Isquemia-Reperfusión más NUTRISIM • Se procedió igual que con el grupo anterior con la diferencia de que a este grupo se le aplico una dosis de NutriSim® 30 minutos antes de realizar la isquemia. (n=8 por cada tiempo)
- 41. RESULTADOS • PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS • ÓXIDO NÍTRICO • GLUTATIÓN PEROXIDASA • MORFOLOGÍA – ANÁLISIS MACROSCÓPICO – ANÁLISIS MICROSCÓPICO
- 42. Peroxidación lipídica • Los lípidos contienen una gran cantidad de dobles enlaces como los ácidos grasos poliinsaturados y el colesterol, que pueden ser sujetos a un daño oxidativo. • En el caso de los fosfolípidos de membrana cuya destrucción peroxidativa de sus ácidos grasos poliinsaturados, generalmente resulta en un debilitamiento de la función celular y las membranas subcelulares. Este debilitamiento puede llevar a la muerte celular. (toxicology)
- 43. Peroxidación lipídica (2) • La peroxidación (autooxidación) de los lípidos expuestos al oxígeno es la responsable del daño a los tejidos, ya que se puede producir cáncer, enfermedades inflamatorias, envejecimiento, etc.
- 44. Peroxidación lipídica (3) • Los efectos deletéreos se consideran debidos a los radicales libres (ROO·, RO·, OH·) producidos durante la formación de peróxido a partir de los ácidos grasos con enlaces dobles interrumpidos por metileno; es decir, los enlaces presentes en los ácidos grasos poliinsaturados naturales. • La peroxidación lipídica consiste en una reacción en cadena, la cual proporciona un suministro continuo de radicales libres, los que inician la peroxidación subsecuente. (Harper)
- 48. ÓXIDO NÍTRICO • A bajas concentraciones, el NO media muchos procesos fisiológicos, por ejemplo neurotransmisión, vasodilatación y respuesta inmune; • A concentraciones elevadas, muestra un efecto citotóxico y genotóxico (efectos dañinos en el DNA).
- 49. ÓXIDO NÍTRICO
- 50. ÓXIDO NÍTRICO OXIDO NITRICO, 120 MIN (Nitratos y Nitritos) 300 250 200 150 100 50 0 nM/mg/Pr TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
- 51. ÓXIDO NÍTRICO
- 52. Glutatión peroxidasa • El peróxido de hidrógeno también es reducido por la glutatión peroxidasa, que es abundante en la mayoría de las células, y gracias a su grupo tiol libre, constituye un importante mecanismo de protección frente al estrés oxidativo.
- 53. Glutatión peroxidasa (2) • Este enzima juega un papel clave en la destoxificación porque reacciona con el peróxido de hidrógeno y los peróxidos orgánicos, que son los subproductos dañinos de la vida aeróbica. (S), y los reduce a H2O, junto con la oxidación del glutatión. • 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O
- 57. TESTIGO
- 60. ISQUEMIA REPERFUSIÓN 7 DIAS
- 61. ISQUEMIA REPERFUSIÓN + NS 7 DIAS
- 62. MORFOLOGÍA 30 25 20 15 10 5 0 TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 90´ ISQUEMIA 5´Perfusion 120´ ISQUEMIA 5´Perfusion 7 días NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 90´ NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 120´ NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 7 días Células Piramidales
- 63. MORFOLOGÍA 25 20 15 10 5 0 TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 90´ ISQUEMIA 5´Perfusion 120´ ISQUEMIA 5´Perfusion 7 días NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 90´ NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 120´ NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 7 días Células Hipercromáticas
- 64. MORFOLOGÍA 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 90´ ISQUEMIA 5´Perfusion 120´ ISQUEMIA 5´Perfusion 7 días NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 90´ NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 120´ NUTRI-SIM ISQUEMIA 5´Perfusion 7 días Células Gliales
- 65. Protección en Apoptosis T SS B I-90 IB-90 I-120 IB-120 I-7D IB-7D Grupos 20 Apoptosis en 1000 μ2 10 0
- 66. EFECTO PROTECTOR DE NUTRI-SIM ISQUEMIA + NS 7 DIAS TESTIGO ISQUEMIA 7 DIAS