![Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal
(luminiscentes,cascadasenzimáticas...)que hanpermitidoelevarlasensibilidadde algunosELISA a
la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este métodohatenidounaenorme aplicaciónentodosaquelloscamposenlosque se precisabala
cuantificaciónde productosmediante anticuerpos:diagnósticoclínico,detecciónviral,clasificación
de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Dispositivos empleados en ELISA
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes hasta las
actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado, para aumentar su capacidad de adsorción
(en su superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente claros que permitan realizar
las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de
placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando
dispositivos de mayor capacidad —por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos—, adecuados para los
sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High-throughput system).
La técnica ELISA.
Los lectoresELISA son espectrofotómetroscapacesde realizarlecturasseriadasde cada unode los
pocillosde laplacaELISA.A diferenciade unespectrofotómetroconvencional,concapacidadde leer
todas las longitudesde onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectoresde ELISA
disponende sistemasde filtrosque solopermitenlalecturade unaopocaslongitudesde onda;son
la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos
más comúnmente utilizados.
Fases de un ensayo ELISA[editar]
Fasesde unensayoELISA,enitaliano:*ELISA:ensayoinmunoenzimático principiosde base.*Pocillo
*Anticuerpoprimarioespecíficoparael antígenoquehayque individualizar.Estáligadoal fondodel
pocillo.*Agregadode lasoluciónenlacual se busca lapresenciadel antígeno.*Unióndel antígeno
conel anticuerpoprimario.*Lavado*Agregadodel anticuerposecundarioespecíficoconjugadocon
una enzima. *El anticuerpo secundario conjugado con la enzima se liga al antígeno. *Lavado](https://image.slidesharecdn.com/practica-n-7-pruebas-vih-190710185109/85/Practica-n-7-pruebas-vih-8-320.jpg)
Practica n-7-pruebas-vih
- 1. PRUEBAS DE DETECCION VIH Pruebas de detección del VIH Última revisión: 21 junio, 2019 La prueba de detección del VIH muestra si una persona tiene ese virus. VIH significa virus de la inmunodeficiencia humana. Este es el virus causante del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). El SIDA es la fase más avanzada de la infección por el VIH. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades(CDC) recomiendan que todas las personasentre los13y los64 añosde edadse haganuna pruebade deteccióndelVIHporlomenos una vezcomo parte de la atenciónde saludde rutina,y que laspersonasexpuestasamayorriesgo de contraer la infección por ese virus se la hagan con más frecuencia. Los factores de riesgo del VIH incluyen tener relaciones sexuales por vía vaginal o anal con una personaseropositivao cuyo estadode infecciónporel VIH se desconoce;o con muchas parejas,e inyectarse drogasy compartiragujas,jeringasuotro equipode administraciónde drogasconotras personas. Los CDC recomiendanque todaslasmujeresembarazadasse sometanaestaspruebasconel finde que puedan comenzar a tomar los medicamentos contra el VIH si son seropositivas. ¿En qué consisten las pruebas de detección del VIH? La pruebadel VIHmuestrasi unapersonatieneese virus.VIHsignificavirusde lainmunodeficiencia humana.Este esel viruscausante del SIDA (síndrome de inmunodeficienciaadquirida).El SIDA esla fase más avanzada de la infección por el VIH. Estas pruebas permiten detectar la infección por el VIH pero no pueden determinar por cuánto tiempo la ha tenido la persona o si tiene SIDA. ¿Por qué son importantes las pruebas de detección del VIH? Estas pruebassonimportantesporque cuandounapersonasabe cuál essu estadode infecciónpor el VIH puede protegerse y proteger a los demás. Si usted es seronegativo:
- 2. Las pruebasmuestranque ustednotiene lainfecciónporel VIH.Sigatomandomedidasparaevitar esa infección,porejemplo,use condonesdurante lasrelacionessexualesy,si está expuestoaalto riesgode contraerla,tome medicamentosparaprevenirla(estose llamaprofilaxispreexposicióno PrEP). Para mayores detalles, lea la hoja informativa sobre la prevención del VIH publicada por infoSIDA. Si usted es seropositivo: La pruebamuestraque ustedtiene el VIH,pero aún puede tomarmedidaspara protegersu salud. Comience por hablar con su proveedor de atención médica sobre el tratamiento antirretroviral (TAR). Las personas a quienes se administra el TAR reciben una combinación de medicamentos contrael VIHtodoslosdíasparatratardichainfección.El TARse recomiendaparatodaslaspersonas seropositivas, quienesdeben iniciarlo lo más pronto posible. Este tratamiento no cura la infección por ese virus, pero los medicamentospara combatirla ayudan a las personas seropositivasa tener una vida más larga y más sana. La metaprincipal del TAResreducirlacarga viral de una personaaun nivel indetectable.Unacarga viral indetectable significa que la concentración del VIH en la sangre es demasiado baja para detectarla con una prueba realizada con ese fin. Las personas seropositivasque mantienen una carga viral indetectable, en realidad, no presentan ningún riesgo de transmitir el VIH a su pareja seronegativa por medio de las relaciones sexuales. ¿Quién debe someterse a las pruebas de detección del VIH? Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades(CDC) recomiendan que todas las personasentre los13 y los64 años de edadse haganla pruebadel VIHpor lo menosunavezcomo parte de la atenciónde saludde rutina.Porreglageneral,laspersonasexpuestasamayorriesgode contraer la infección por el VIH deben hacerse la prueba de detección cada año. Los hombres homosexualesybisexualessexualmente activospuedenbeneficiarsede unapruebamásamenudo, por ejemplo, cada 3 a 6 meses. Los factores que aumentan el riesgo de contraer la infección por el VIH incluyen los siguientes: Tener relacionessexuales por vía vaginal o anal con alguienque es seropositivo, o cuyo estado de infección por el VIH se desconoce Inyectarse drogasy compartiragujas,jeringasuotro equipode administraciónde drogasconotras personas Intercambiar relaciones sexuales por dinero o por drogas Tener una enfermedad de transmisión sexual (ETS) como sífilis
- 3. Tener hepatitis o tuberculosis (TB) Tener relaciones sexuales con una persona que tenga cualquiera de los factores de riesgo de infección por el VIH previamente citados Hable con suproveedorde atenciónde saludsobre suriesgode contraerlainfecciónporel VIHyla frecuencia con que debe hacerse la prueba de detección de ese virus. ¿Deben las mujeres embarazadas someterse a pruebas de detección del VIH? Los CDC también recomiendan que todas las mujeres embarazadas se sometan a la prueba de detección del VIH para que puedan comenzar a tomar medicamentos contra ese virus si son seropositivas.Lasmujeresconel VIHtomanmedicamentoscontraese virusdurante el embarazoy el parto para reducir el riesgo de transmisión maternoinfantil del VIH y proteger su propia salud. Parainformaciónadicional,lealahojainformativade infoSIDAsobrelaPrevenciónde latransmisión maternoinfantil del VIH. ¿Cuáles son los tipos de pruebas de detección del VIH? Se emplean tres tipos de pruebas para diagnosticar la infección por el VIH, a saber, pruebas de anticuerpos,pruebasde antígenosyanticuerposypruebasde ácidonucleico(NATporsussiglasen inglés).Larespuestaa la pregunta“¿qué tan pronto permite detectarcadapruebala infecciónpor el VIH?” varía porque cada una tiene un período silente distinto. El período silente es el tiempo transcurridoentre el momentode laposible exposiciónde unapersonaal VIHyel momentoenque una prueba permite detectar con exactitud la infección por ese virus. Las pruebas de anticuerpos examinan si hay anticuerpos contra el VIH en la sangre o en las secreciones bucales. Los anticuerpos son proteínas que combaten la enfermedad, que el cuerpo produce en respuesta a la infección por el VIH. La mayoría de las pruebas rápidas y las pruebas domiciliarias son pruebas de anticuerpos. Las pruebasde antígenosyanticuerpos,comosunombre loindica,puedendetectarantígenos(una parte del virus) y anticuerpos contra el VIH en la sangre. Las pruebas de ácido nucleico examinan la presencia del VIH en la sangre. La prueba inicial de detección del VIH de una persona será, por lo general, una prueba de anticuerpos o una de antígenos y anticuerpos. Las NAT son muy costosas y no se emplean
- 4. regularmente para detectar la infección por el VIH a menos que la persona haya tenido una exposición de alto riesgo o una posible exposición con síntomas iniciales de dicha infección. Cuando el resultado de una prueba de detección del VIH es positivo, se realizará una prueba de seguimiento. Algunas veces, las personas necesitarán una consulta con un proveedor de atención de salud para hacerse la prueba de seguimiento. Otras, esta última prueba puede realizarse en el laboratorioconla mismamuestrade sangre suministradaparalaprimera.Unresultadopositivode una prueba de seguimiento confirma que la persona tiene el VIH. Hable con su proveedorde atenciónde saludsobre sus factores de riesgode contraer la infección por el VIH y la mejor prueba de detección en su caso. ¿Es confidencial la prueba de detección del VIH? La prueba del VIH puede ser confidencial o anónima. Una pruebaconfidencial significaque losresultadosde supruebade deteccióndel VIHincluiránsu nombre y otros datos de identificación y se incluirán en su expediente médico. Los resultados positivos de la prueba de deteccióndel VIH se notificarán a los departamentos localeso estatales de salud para incluirlos en los informes estadísticos. Los departamentos de salud retiran toda la informaciónpersonal(inclusoelnombreyladirección)de losresultadosdelaspruebasde detección del VIH antes de compartir la información con los CDC. Los CDC usan esta información para sus informes pero no la comparten con ninguna otra organización, ni siquiera con las compañías de seguros. Una prueba anónimo significa que usted no tiene que dar su nombre al someterse a la prueba de detección del VIH. Al hacerse la prueba, recibe un número. Para obtener los resultados, da el número en lugar de su nombre. Hay tres tipos principales de pruebas de VIH: Prueba de anticuerpos. Esta prueba trata de detectar anticuerpos contra el VIH en la sangre o la saliva.El sistemainmunitarioproduce anticuerposcuandounapersonaestáexpuestaabacteriaso virus como el VIH. La prueba de anticuerpos contra el VIH puede averiguar si una persona tiene el VIH de 3 a 12 semanas después de la infección. Eso se debe a que el sistema inmunitario puede tardar variassemanasomásenproduciranticuerposcontrael VIH.Ustedtal vezpuedahacerseuna prueba de anticuerpos contra el VIH en la privacidad de su casa. Pregúntele a su médico o profesional de la salud sobre los kits de pruebas de VIH para el hogar.
- 5. Prueba de anticuerpos y antígenos contra el VIH. Esta prueba trata de detectar anticuerpos y antígenos contra el VIH en la sangre. Un antígeno es una parte de un virus, que desencadena una respuesta inmunitaria.Cuando una persona ha estado expuesta al VIH, los antígenos aparecen en la sangre antes de que el cuerpo produzca anticuerpos contra el VIH. Esta prueba generalmente detectael VIHde 2a6semanasdespuésdelainfección.Lapruebade anticuerposyantígenoscontra el VIH es uno de los tipos más comunes de pruebas de VIH. Carga viral del VIH. Esta prueba mide el nivel de VIH en la sangre. Puede detectar el VIH más rápidamente que las pruebas de anticuerpos y antígenos, pero es muy costosa. Se usa principalmente para vigilar las infecciones por VIH. Examen de sangre ELISA ELISA es el acrónimoen inglésparaenzimoinmunoanálisisde adsorción.Se trata de un examende laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Un anticuerpo es una proteína que el sistema inmunitario del cuerpo produce cuando detecta subtancias dañinas, llamadas antígenos. Forma en que se realiza el examen Es necesaria una muestra de sangre.La mayoría de las veces, la sangre se extrae de una vena que se encuentra en el interior del codo o del dorso de la mano. La muestrase envíaa un laboratoriodonde el anticuerpooantígenoobjetode estudiose vinculaa unaenzimaespecífica.Si lasustanciaaestudiarestápresente enlamuestra,lasolucióndelaprueba se torna de un color diferente. Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado. Otras solo sienten un pinchazo o una picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil o un ligero hematoma. Esto desaparece poco después. Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuestoa virus u otras sustancias que causen infección. También se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
- 6. Resultados normales Losvaloresnormalesdependendel tipode sustanciaquese estéidentificando.Algunoslaboratorios utilizan medidas distintas o examinan muestras diferentes. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con su proveedor de atención médica acerca del significado de los resultados específicos de su examen. Significado de los resultados anormales Los valores anormales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. En algunas personas, un resultado positivo puede ser normal. Riesgos Hay pocos riesgos asociados con la toma de muestras de sangre. Las venas y las arterias varían en tamaño de una persona a otra y de un lado del cuerpo a otro. Puede ser más difícil tomar una muestra de sangre de algunas personas que de otras. Otros riesgos asociados con la extracción de sangre son leves, pero pueden incluir: Sangrado excesivo Desmayo o sensación de mareo Múltiples punciones para localizar la venas Hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel) Infección (un riesgo leve cada vez que se presenta ruptura de la piel) Nombres alternativos Inmunoanálisis ligado a enzimas; Enzimoinmunoanálisis (EIA) ELISA La técnica ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ‘ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas’) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un productodetectable,comocambiode coloroalgúnotrotipo;enocasiones,conel finde reducirlos costosdel ensayo,nosencontramosconque existeun anticuerpoprimarioque reconoceal antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
- 7. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestrade sangre de un paciente.Aunque el procedimientoesrutinarioysencillo,involucraa un gran número de variables, tales como selecciónde reactivo,temperatura, medición de volumen y tiempo,que si no se ajustancorrectamente,puede afectarlospasos sucesivosyel resultadode la prueba. Usos La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene unainfecciónounaenfermedadautoinmune.Perocomopruebadiagnóstica,posee diversas limitaciones que conviene conocer: En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo.El cuerpode una personaque ha estado enfermay que ya se ha recuperadopuede seguirproduciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que estos pueden pasar desapercibidosy no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infecciónen el momentode realizar la prueba,o que esténinfectadas por una cepa extraña. En tercer lugar, pueden aparecer falsos negativos cuando se da inespecificidad entre antígeno- anticuerpo. En estos casos de diagnóstico de enfermedad, es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayoy puedan ocasionar un resultadofalsopositivo,careciendoaquelde especificidad.También,debemostenerencuentaque cuandose trata de diagnosticarunaenfermedadque poseeunvalorpredictivopositivobajoenuna determinada población —es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población—, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presenciade varios anticuerpos,simultáneamente,frente ala mismainfecciónenuna muestra.El resultadodel westernse considerapositivocuandoaparecenal menos5 bandas,que indicaque 5 anticuerpos diferentes estánpresentesen el sujetofrente a esa infección.Es entonces cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto y simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
- 8. Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes,cascadasenzimáticas...)que hanpermitidoelevarlasensibilidadde algunosELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este métodohatenidounaenorme aplicaciónentodosaquelloscamposenlosque se precisabala cuantificaciónde productosmediante anticuerpos:diagnósticoclínico,detecciónviral,clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Dispositivos empleados en ELISA Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes hasta las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado, para aumentar su capacidad de adsorción (en su superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente claros que permitan realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad —por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos—, adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High-throughput system). La técnica ELISA. Los lectoresELISA son espectrofotómetroscapacesde realizarlecturasseriadasde cada unode los pocillosde laplacaELISA.A diferenciade unespectrofotómetroconvencional,concapacidadde leer todas las longitudesde onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectoresde ELISA disponende sistemasde filtrosque solopermitenlalecturade unaopocaslongitudesde onda;son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados. Fases de un ensayo ELISA[editar] Fasesde unensayoELISA,enitaliano:*ELISA:ensayoinmunoenzimático principiosde base.*Pocillo *Anticuerpoprimarioespecíficoparael antígenoquehayque individualizar.Estáligadoal fondodel pocillo.*Agregadode lasoluciónenlacual se busca lapresenciadel antígeno.*Unióndel antígeno conel anticuerpoprimario.*Lavado*Agregadodel anticuerposecundarioespecíficoconjugadocon una enzima. *El anticuerpo secundario conjugado con la enzima se liga al antígeno. *Lavado
- 9. *Agregadodel sustratode la enzima.*La enzimaconvierte el sustratoenuncompuestocoloreado (amarillo, en este ejemplo). *Prueba positiva. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpoconjugadoa la enzimase empleaenlosensayosdirectose indirectos,sandwich,etc.El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo- enzimaoantígeno-enzimahade producirse durante undeterminadoperíodode tiempoenarasde producirunasolucióncoloreadayque puedaservaloradavisualmente ocuantificadapormediode unespectrofotómetro(normalmenteaunalongitudde ondade 414nm).Si notranscurre el tiempo adecuadoparaque se dé lareacción,nose evidenciaráningúncolor,interpretándoseesteresultado como un falso negativo y disminuyendo la sensibilidad de la técnica. Unión del antígeno(o del anticuerpo) a lospocillos.Launiónde anticuerposo antígenosse realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente.Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, esto dará lugar a una reacción falsa negativa. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto).Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa, se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidadfijade antígenomarcado. Es el ensayode competicióndel antígeno.En esta etapa esmuy importante controlarlos factorestiempoy temperaturade incubaciónpara evitarla aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpotampocose completaráenel tiempoestablecido,mientrasque si esmuyalta, las proteínas(antígenoy anticuerpo) se desnaturalizany,por tanto,disminuyensucapacidadpara interaccionar, dando igualmente falsos negativos. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade el sustrato enzimático, se incuba durante un tiempo estandarizado por cada casa comercial, en el cual se producirá una reacción enzimática,luegose frenaesta reacciónmediante el usode una soluciónstopy se lee la densidad óptica mediante espectrofotometría. Tipos de ensayos ELISA
- 10. Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificación de un antígenoen solución,ladetecciónde un anticuerpoenuna solución(porejemploenel clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.1 ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerposmarcados.Indicanlapresenciade antígenoenlasoluciónanalizada.Esnecesarioincluir controlesnegativosque seránmuestrasdelmismotipoque lasanalizadas(sangre,orina...),peroen las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).2 ELISA indirecto.LasplacasELISA se preparande lamismaformaalaanterior.Loscontrolespositivos y negativos son los mismos.El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígenoyunosecundariomarcadocontrael primario.Ladeteccióntienemayorsensibilidadpor presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismosecundariomarcadoyun mismosistemaenzimáticopermitencuantificarunagran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por teneruneslabónmásconrespectoal métododirecto.Ladiluciónde lasoluciónque contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener en cuentapara evitarla apariciónde falsosnegativos,yaque si la muestraestá muydiluida,nosaldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.). El ELISA indirectoesel métodode elecciónparadetectarlapresenciade anticuerposséricoscontra el virusde lainmunodeficienciahumana(VIH),agente causantedel síndromede inmunodeficiencia adquirida(SIDA).Segúnestatécnica,proteínasrecombinantesde laenvoltura yel núcleodelVIHse absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos.Las personas afectadas de VIH producen anticuerposséricoscontraepítoposenestasproteínasvíricas.Engeneral,elELISA indirectopermite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.3 ELISA «sándwich» (Ensayodecapturade antígenoydetecciónmediante inmunocomplejos).Se trata de unensayomuyempleadoenel quese recubre elpocilloconunprimeranticuerpoanti-antígeno. Después de lavar el excesode anticuerpo,se aplicala muestraproblemaenla que se encuentrael antígeno,que seráretenidoenel pocilloal serreconocidoporel primeranticuerpo.Despuésde un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpoenlabase que loretiene yunsegundoanticuerpo,al menos,que lomarca.Este ensayo tiene unagranespecificidadysensibilidad debidoalaamplificaciónde señalque permite elsegundo anticuerpo.
- 11. ELISPot.ELISpot esun métodoaltamente sensible enlainmunologíaparaenumerarlascélulasque producen una citoquina dada. Las células se estimularon en una placa de microtitulación per- recubierta con un anticuerpo específico anti-analito. En respuesta a la estimulación, las células liberan citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Después de una etapa de lavado, que elimina las células de los pozos, la ubicación de citoquinas secretadas se visualiza mediante un anticuerpo de detección marcado con enzima y su sustrato cromogénico correspondiente. El resultadofinalesunconjuntode manchasde color,cadaunode loscualesrepresentaunáreadonde se había localizadounacélula que secretalacitoquina.Existeunmétodode ELISpotestándaryuna variación denominada de células dendríticas DC-ELISpot para la detección de las células tras la estimulación con oligopéptidos y antígenos de proteína, respectivamente. Quimioluminiscencia Ensayo ELISA para el VIH. Durante determinadas reacciones químicas, la luz generada por este fenómeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurrenalaquimioluminiscenciautilizanunsustratoque generaluz,enlugardelsustrato cromógeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidación del compuesto luminol por peróxido de hidrógeno y la enzima peroxidasa de rábano (HRP), que producen luz.La luzque se generaen dichasreaccionespuede detectarsegraciasa su capacidadde sensibilizaruna película fotográfica. La medición cuantitativa de la emisión de luz puede hacerse mediante el uso de un luminómetro. La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromógenas es la mejoría de la sensibilidad.Engeneral,el límite de detecciónpuede aumentarse al menosdiezvecessi se cambia un sustrato cromógeno por uno que emita luz, y más de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores. Prueba ELISPOT Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el número de células en una población productora de anticuerpos específicos contra un antígeno determinadoounantígenocontrael quese disponede unanticuerpoespecífico.Aquí,dichasplacas se recubrencon el antígenoreconocidopor el anticuerpode interésocon el anticuerpoespecífico para el antígeno cuya producción se valora. Seguidamente, se añade a las placas recubiertas una suspensiónde lapoblacióncelularque se investigae incuba.Lascélulasse disponenenlasuperficie de laplaca,y lasmoléculassecretadasreactivasalasmoléculasde capturasonunidasenlacercanía de las células secretoras, produciéndose un anillode complejosantígeno-anticuerpo alrededor de cada célula que sintetiza la molécula de interés. Después, la placa se lava y un anticuerpo unidoa enzimaespecíficoparael antígenosecretado,o para la especie de anticuerposecretado,se añade y dejaque se unan.El posteriorreveladodel ensayomediante adiciónde unsustratocromógenoo emisorde luz adecuadoindicala posiciónde cada célulaproductorade anticuerpo(ode antígeno) como un punto de color o luz.