Replicación bacteriana
- 1. Las capsulas permiten adhesión y protección a las bacterias, por lo que es más difícil de eliminarlas con el sistema inmune. El principio transformador es tan importante el ADN como el material de origen proteico que se transfiere para generar virulencias a otras bacterias que no lo son. Experimento de Hershey y Chase: El fosforo o azufre marcado se adiciona al medio de cultivo de las bacterias, si solo agrego fosforo marcado a las bacterias estará todo marcado a futuro. Los fagos solo necesitan inyectar su material genético para ser replicados. En el sobrenadante queda marcado solo el azufre radioactivo y no en el pellet, mientras que las bacterias quedan marcadas con fosforo radiactivo. Por ende, se concluye que el material radioactivo está presente en el ADN que requiere de fosforo.
- 2. Los virus solo pueden capturar material genético mediante el ingreso a las bacterias o células eucariontes. En cambio, las bacterias si pueden hacerlo de otras bacterias muertas. Los virus ingresan también por endocitosis en las células eucariontes, por lo que también ingresan las cápsides por lo que este modelo hubiese sido mucho más complejo realizarlo en células eucariontes. Experimento de Messelson y Stahl Se cultivan las bacterias en un medio de cultivo marcado con N radioactivo, aparecen hebras de ADN pesadas, luego esas mismas bacterias se llevan a un medio que no contiene N radioactivo, luego de esperar 20 minutos y obtener el DNA de esas bacterias se obtiene una hebra de DNA intermedia marcada con N radioactivo y N no marcado, finalmente se esperan otros 20 minutos y se obtienen DNA intermedios y DNA ligeros. Se concluyó que la replicación en bacterias es semiconservativa a través de este experimento. los plásmidos se replican de manera independiente del cromosoma, de manera bidireccional y requiere de las mismas enzimas. Los plásmidos mueren si las enzimas de la bacteria no logran reconocer su Ori para replicarlo, a menos que se fuerce el reconocimiento por parte de la bacteria por parte del plásmido porque le genera resistencia y la única manera de vivir es tener esa resistencia. La bacteria induce la recombinación e integración del plásmido en su cromosoma, ahora utilizará el origen de replicación del cromosoma de la bacteria. Se puede quitar el ori y clonar el oric, sabiendo el origen de replicación, para que sea reconocido como el origen de replicación de mi plásmido. La inclusión del nuevo ori al cromosoma puede ser letal, pero no necesariamente debe tener síntomas adversos. Uno de alta número de copias podría comandar la replicación, lo que es usualmente tóxico.
- 3. El cromosoma puede mutar de tal manera que podría utilizar el ori del plásmido para lograr su integración total. Los ori de alta replicación de los plásmidos pueden ser tóxicos para las bacterias. Las topoisomerasas II utilizan ATP y sacan dos grados de desviación, siempre. La topoisomerasa remueven de un solo grado o giro, por así decirlo. *Estudiar las polimerasas y recordar que solo una saca los partidores de RNA. PCR amplifica el RNA y basta con la temperatura para abrir las hebras, no aplicamos las SSD al mantener las temperatura mantiene las hebras juntas. Se utiliza una enzima termoestable a las temperaturas que aplicamos. El PCR anidado se utiliza cuando quiero amplificar algo amplificado, hago partidores específicos del producto que yo quiero para poder amplificarlo aún más, para tener más masa crítica de algo amplificado. PCR Múltiple es útil para la genotificación, se utilizan muchos partidores por lo que puede generar dimeros de ellos. RAPD PCR secuencias al azar de no más de 10 nucleotidos, especialmente enriquecido con GC (60-70%) es un partidor al azar. PCR invertido, poder determinar una secuencia desconocida que esté aledaña a una secuencia conocida. Aplico enzimas de restricción que no corten mi segmento conocido para dejar extremos cohesivos, se generarán múltiples fragmentos que luego podrán ser circulares. Luego corto el fragmento en un lugar que conozco en la secuencia conocida, luego los partidores quedaran divergentes, por lo que podré amplificar de una secuencia conocida a una desconocida. GenomeWalking -> en una secuencia desconocida que se interrumpe con una secuencia conocida, en vez de ligar y seleccionar el fragmento del tranposon y lugar de interés, se agregan secuencias de DNA que son lugares donde colocamos partidores. Cuando se abren las hebras se genera un loop, pero con esta técnica favorecemos que no se realice con los partidores y podemos amplificar lo que queremos.
- 4. QPCR->Taqman: Requiere de dos grupos funcionales en la sonda, el fluoroforo y el quencher, se agrega una sonda al DNA que quiero amplificar. La polimerasa avanzará durante la replicación y cortará la sonda por lo que liberará el fluoroforo, por lo que a mayor intensidad significa que estoy amplificando más. SYBRgreen: emite fluorescencia cuando está en las doble hebra, o sea cuando se está replicando emite menos fluorescencia. Los dimeros de primer van a emitir y existirá una mayor concentración de DNA que no quiero evaluar. Apuntes de SoutherBlot aquí: Sí quiero saber la cantidad de copias de mi gen es lo más útil para utilizar, para conocer la presencia o no se realiza solamente un PCR. Mutación Puntual: el plásmido contiene el gen que quiero mutar, el gen lo muto a través de los partidores donde está la mutación puntual, ya que incorporo el nucleótido que quiero cambiar y dejo que se amplifique. Logrando así cambiar una Alanina por una Citocina. Rondas de replicación: Incorporamos el partidor con su mutación para obtener un fragmento, se genera una segunda mutación con otro partidor y así consecutivamente se obtiene un megaprimer los que serán utilizados como templados por la DNA polimerasa.Convergaran y serán rellenados por la DNA polimerasa y complementariedad. ¿Cómo podemos incorporar genes a un organismo? A través de fagos que insertan su material genético similar a las bacterias que se produce la recombinación homologa con la del hospedero, permitiendo mayor varialidad genética. Intercambio alélico por producto de PCR: No deben ingresar a las bacterias de manera lineal, excepto en levaduras, por la presencia de exonucleasas. Puede ingresar por conjugación, en la que no se debe volver lineal, o transformación, pero de muy baja frecuencia porque necesariamente ingresa linealmente.
- 5. pkD3 o pkD4 se ocupan como templado de PCR, para amplificar el cassette de resistencia que se encuentra en ellos. El extremo 3’ idéntico a la secuencia a amplificar, mientras que el extremo 5’ idéntico a la secuencia que deseo mutar. Sin la proteína pir pKD3-4 se vuelven plásmidos suicidas. En presencia de arabinosa se sintetizan las proteínas Gam, Bet y Exo, la primera inhibe a las exonuclesas. RecA permite que los fragmentos de PCR encuentren los sitios homólogos donde se produce la recombinación alélica. El cromosoma está altamente compactado y las zonas de homologías están cercanas entre si lo que permite mutar genes completos. Al insertar un plásmido solo existe la recombinación por homología, o sea que haya al menos alguna secuencia homologa entre el plásmido y el cromosoma del hospedero. PKD20 produce recombinación en las regiones FRT, saca el casete de resistencia de las bacterias mutadas con PKD46. Hipoinvasiva: es menos invasiva que una Wyldtype. El screening es útil para saber cuales bacterias mutadas son las que me sirven, de las bacterias sin casete de resistencia.
- 6. Se puede restaurar el fenotipo a través de clonamiento. Se incorpora el plásmido, PCR, cortar con enzimas de amplificación de PCR y el vector, ligo, transformo. Selecciono según la resistencia del plásmido y luego realizo un screening. X-Gal -> Azul, se degrado el x-gal está el óperon X-gal y no se incorporó el gen de interés, sí está blanca está en el lugar de interés. *Dosis génica: es cuando una cantidad de síntesis de proteína es tóxica para la bacteria, al estar más de una vez en el genoma por la transformación de la bacteria. *La cepa no recuperó todo el fenotipo, o sea no se transcribe completamente el gen incluso luego de *Mutaciones generadas por una Taq no tan fiable, por lo que se requiere de secuenciar para saber sí nuestro primer amplicón era fidedigno a lo que necesitábamos. Piri-secuenciación