Capitulo 16
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El documento describe la terapia génica para tratar la hipercolesterolemia familiar mediante la inserción de un gen normal para el receptor de LDL en las células del hígado de una paciente. Esto redujo sus niveles de LDL en un 20%, aunque los niveles de colesterol permanecieron altos y se desconoce si prolongará su vida. También explica los procesos de ingeniería genética como el aislamiento, modificación e inserción de genes en organismos usando ADN recombinante.
Capitulo 16
- 1. ADN Recombinante e Ingieniería Genética Capítulo 16
- 2. Hipercolesterolemia Familiar Un gen codifica una proteina que sirve como receptor celular para LDL Dos alelos normales para el gen mantienen bajos los niveles sanguíneos de LDLs. Dos alelos mutados producen niveles de colesterol anormalmente altos y enfermedad del corazón.
- 3. Ejemplo de Terapia Génica Mujer con hipercolesterolemia familiar Se le removió parte de su hígado Se utilizó un virus para insertar un gen normal para el receptor de LDL en las células del hígado cultivadas en el laboratorio Las células modificadas del hígado se pusieron de regreso en la paciente
- 4. Resultados de la terapia génica Las células modificadas vivieron en el hígado de la mujer Los niveles sanguíneos de LDLs bajaron en un 20% No presentó evidencias de aterosclerosis Los niveles de colesterol permanecieron altos Falta todavía saber si el procedimiento prolongará su vida.
- 5. Cambios Genéticos Los humanos han estado cambiando la genética de otras especies por miles de años seleccion artificial de plantas y animales Los procesos naturales también han trabajado Mutaciones, crossing over
- 6. Ingieniería Genética Los genes son aislados, modificados, e insertados dentro de un organismo Es posible gracias a la tecnología del ADN recombinante Corte del ADN y recombinación de piezas Las piezas modificadas se pueden amplificar
- 7. Discubriendo las Enzimas de restricción Hamilton Smith estaba estudiando la forma en que la bacteria Haemophilus influenzae se defiende del ataque de los virus bacteriófagos Descubrió que la bacteria tiene una enzima que corta el ADN viral
- 8. Especificidad de los cortes Las enzimas de restricción cortan el ADN en una secuencia específica El número de cortes hecho en el ADN dependerá del número de veces en que la secuencia de reconocimiento existe en ese genoma
- 9. Preparando ADN Recombinante 5’ 3’ G C T T A A A A T T C G G A A T T C C T T A A G 3’ 5’ one DNA fragment another DNA fragment 3’ 5’ In-text figure Page 254
- 10. nick 5’ 3’ 3’ 5’ G A A T T C C T T A A G nick G A A T T C C T T A A G DNA ligase action In-text figure Page 254
- 11. Usando Plásmidos Un plásmido es un pequeño cromosoma circular de ADN bacteriano ADN extraño puede ser insertado dentro de un plásmido Se forman plásmidos recombinantes Los plásmidos pueden servir como vectores de clonación Pueden enviar ADN a otra célula
- 12. DNA fragments + enzymes recombinant plasmids host cells containing recombinant plasmids Figure 16.4 Page 255
- 13. ¿Podría escapar del laboratorio una bacteria genéticamente modificada? Las bacterias genéticamente modificadas son diseñadas para que no puedan sobrevivir fuera del laboratorio Si se liberan al medio ambiente mueren, son dependientes de las condiciones del laboratorio.
- 14. Preparando ADNc mRNA transcript mRNA–cDNA hybrid single-stranded cDNA double-stranded cDNA Figure 16.5 Page 255
- 15. Amplificando ADN In vivo: Los fragmentos pueden ser insertados dentro de microorganismos de crecimiento rápido In vitro: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- 16. Reacción en cadena de la Polimerasa Se calienta la secuencia que se desea copiar Se agregan los iniciadores o primers, los cuales reconocen su secuencia complementaria y se unen a ella La ADN polimerasa usa nucleótidos para crear la hebra complementaria. Se obtienen miles de copias del fragmento deseado.
- 17. Polymerase Chain Reaction Double-stranded DNA to copy Figure 16.6 Page 256 Stepped Art DNA heated to 90°– 94°C Primers added to base-pair with ends Mixture cooled; base-pairing of primers and ends of DNA strands DNA polymerases assemble new DNA strands
- 18. Polymerase Chain Reaction Figure 16.6 Page 256 Stepped Art Mixture heated again; makes all DNA fragments unwind Mixture cooled; base-pairing between primers and ends of single DNA strands DNA polymerase action again doubles number of identical DNA fragments
- 19. Huellas genéticas o DNA Fingerprints Patron de bandas único que se obtiene después de una electroforesis del genoma previamente cortado con alguna enzima de restricción. Se heredan de padres a hijos de una forma mendeliana
- 20. Repeticiones en Tandem Cortas regiones de ADN que difieren sustancialmente entre las personas Existen muchos sitios del genoma donde existen repeticiones en tandem Cada persona es portadora de una única combinación de la cantidad de repeticiones.
- 21. RFLPs ( R estriction f ragment l ength p olymorphisms) Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción El ADN de regiones con repeticiones en tandem se corta con enzimas de restricción Debido a la variación en la cantidad de ADN repetido, los fragmentos de restricción varían en tamaño La variación se detecta por una electroforesis
- 23. Electroforesis El ADN se pone en un “pozo” en uno de los extremos del gel. Se aplica una corriente al gel. Las moléculas de ADN están cargadas negativamente y se mueven hacia el extremo positivo Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes.
- 24. Analizando huellas genéticas El ADN se hace visible mediante el marcaje con un isótopo de una sonda de ADN que se hibridiza. El patrón de bandas se usa para: Identificar o rechazar al sospechoso de un crimen Identificar cuerpos Determinar paternidad
- 26. Huellas genéticas con sondas multilocus
- 27. Secuenciación de Genomas 1995 – Primera Secuencia en ser determinada: bacteria Haemophilus influenzae . Actualmente se usa la secuenciación automática como método principal La secuencia “borrador” del genoma humano completo se determinó de esta forma.
- 28. Nucleotidos para secuenciación Nucleótidos (A, T, C, G) Versiones modificadas de estos nucleótidos: Marcados para emitir fluorescencia Estructuralmente diferentes para que detengan la síntesis cuando ellos se unen a la molécula.
- 29. Mezcla para la reacción Copias del ADN a ser secuanciado Primer DNA polimerasa Nucleotides Nucleótidos Modificados
- 30. Procedimiento de la reacción Se sintetiza una hebra complementaria con los nucleótidos Cuando se incorpora un nucleótido modificado, se detiene la síntesis Como resultado se obtienen millones de copias de longitud variable
- 31. Obtención de la secuencia T C C A T G G A C C T C C A T G G A C T C C A T G G A T C C A T G G T C C A T G T C C A T T C C A T C C T C T electrophoresis gel one of the many fragments of DNA migrating through the gel one of the DNA fragments passing through a laser beam after moving through the gel T C C A T G G A C C A ADN se pone en un gel Fragmentos migran por el gel en orden de tamaños; pasan a través de un rayo laser. El color de la fluorescencia de cada fragmento se almacena en la computadora y se puede imprimir . Figure 16.8 Page 258
- 32. Bibliotecas de genes Bacterias que contienen diferentes fragmentos de ADNs clonados : Bibliotecas Genomicas Bibliotecas de ADNs copias
- 33. Usando una sonda para encontrar un gen Usted desea saber cual bacteria de todas en una librería contiene un gen específico Se necesita una sonda del gen Una secuencia de ADN del gen, marcada con radio-isótopo que reconocerá su secuencia complementaria en la librería.
- 34. Uso de una sonda Colonies on plate Cells adhere to filter Cells are lysed; DNA sticks to filter Probe is added Location where probe binds forms dark spot on film, indicates colony with gene Figure 16.9 Page 259
- 35. Ingieniería de proteinas Las bacterias pueden ser usadas para obtener miles o millones de copias de moléculas de una proteina de interés médico Insulina, interferon, Factores de coagulación de la sangre Vacunas
- 36. Limpieza del ambiente Bio-remediación Existen microorganismos que normalmente digieren basura orgánica y reciclan materiales Algunos pueden ser usados por la ingieniería para digerir contaminantes o grandas cantidades de materiales peligrosos.
- 37. El plásmido Ti Investigadores reemplazan genes que causan tumores por genes beneficiosos Los plásmidos transfieren estos genes a celulas vegetales en cultivo foreign gene in plasmid plant cell Figure 16.11 Page 261
- 38. Ingieniería de plantas Plantas de algodón pueden hacerse resistentes a hierbicidas Plantas de aspen pueden producir menos lignina y más celulosa Plantas de tabaco pueden producir proteínas humanas Células de la planta de mostaza pueden producir plástico biodegradable.
- 39. Primeros mamíferos manipulados genéticamente Usaron ratones deficientes en hormona del crecimiento (enanos) Los huevos fertilizados de ratón fueron inyectados con el gen de rata para la hormona del crecimiento Gen se integróal ADN del ratón Ratones modificados fueron 1,5 veces mas grandes que sus hermanos no modificados
- 40. Clonando a Dolly 1997 - Una oveja fué clonada a partir de una célula de adulto. Un nucleo de una célula de la glándula mamaria fué insertado en un ovulo sin núcleo El embrion fué implantado en una madre sustituta La oveja obtenida es una copia genética del animal del cual se obtuvieron las celulas de las glándulas mamarias
- 41. Diseñando Ganado Embriones de ganado vacuno se pueden hacer crecer en cultivo y modificados genéticamente para - crear resistencia a enfermedades Hacerlos producir albúmina humana u otras proteinas de uso médico.
- 42. Proyecto del Genoma Humano, U.S.A. Human Genome Organization HUGO, 1988 1990 planeado para 15 años: Mapear y secuenciar el genoma humano. Desarrollar tecnologías y métodos. Mapear y secuenciar genes de 5 organismos modelos: E.coli, Saccharomyses cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster y el ratón. Estudiar las implicaciones éticas y legales del proyecto (Subproyecto ELSI).
- 43. Anormalidades cromosómicas CLONES Enfermedades ADNc ADNg Familias Ligamiento Híbridos celulares FISH Clones contiguos etc. MAPA DEL GENOMA HUMANO Mapa físico Mapa genético Secuenciación Identificación de genes Mapa RATON P o l i m o r f i s m o s
- 44. Proyecto del Genoma Humano Se hizo en centros con capacidad industrial de secuenciar: Wellcome Trust Sanger Institute en Reino Unido. The Whitehead Institute y el Institute of Technology of Massachussetts. Washington University DoE Joint Genome Institute. Baylor College of Medicine Y una red de pequeños laboratorios en todo el mundo
- 45. 08_01.jpg Proyecto Genoma Humano
- 46. Proyecto del Genoma Humano Se desarrollaron grandes bases de datos de acceso gratuito por Internet, para los datos obtenidos con fondos públicos: Datos de mapeo y secuenciación de ADN y proteínas. Ej Genome database (GDB). Estos pueden ser accesados y analizados desde cualquier parte del mundo. Datos de interés local obtenidos por cada laboratorio.
- 47. Fechas importantes en el Mapeo y Secuenciación del Genoma Humano 1977: Fred Sanger: metodo de secuenciación usando dideoxinucleótidos. 1980: Bolstein et al propuso mapear con RFLPs 1981: Sanger publicó la secuencia mitocondrial completa 1987: El departamento de energía de los Estados Unidos ve la necesidad de hacer el proyecto del genoma humano 1988: Se crea el Centro Nacional para el estudio del Genoma Humano adscrito a los Institutos Nacionales de Salud. USA. 1990: lanzamiento oficial del proyecto 2001: Publicación del primer borrador de la secuencia del genoma humano (90%), por parte de Celera Genomics. 2003: Secuencia completa del genoma Humano
- 48. Proyecto del Genoma Humano se necesitaron más de 10 años, más de 1.000 científicos y aproximadamente 2.000 millones de dólares, de los cuales solamente entre un 3-5% se han destinado al subproyecto ELSI, el cual financia investigaciones sobre los aspectos éticos, legales, y sociales asociados al nuevo conocimiento.
- 49. Beneficio vrs riesgos Como cualquier conocimiento científico o avance tecnológico, éste puede traernos gran cantidad de beneficios, si se maneja con una visión humanista y solidaria, obedeciendo valores fundamentales como el respeto a la vida, a la privacidad, el derecho a la salud y de aspirar cada día a una mejor calidad de vida; y el derecho de proteger la identidad genética. Por el contrario si es usado en forma inescrupulosa, con fines comerciales o raciales podría conducirnos a una sociedad cada día más deshumanizada.
- 50. Temores Los ciéntificos y el público en general han manifestado preocupaciones: el posible irrespeto a la dignidad humana, la discriminación contra personas con desbalances genéticos, o portadoras de alguna mutación que les confiere un riesgo mayor de llegar a desarrollar alguna enfermedad degenerativa, incapacitante o que les acorte la vida. Esta discriminación se podría traducir en 1. Pago de mayores primas en seguros de salud o total ausencia de cobertura, en los países donde la salud es asegurada por empresas privadas (afortunadamente, todavía no es el caso de Costa Rica).
- 51. Temores 2. Obstáculo para obtener un trabajo, etc. Los expertos del subproyecto ELSI recomendaron legislar urgentemente con el fin de proteger la información genética de los individuos porque los temores mencionados tienen fundamento, y porque los incentivos económicos para cometer discriminaciones aumentarán, conforme aumente la investigación genética y bajen los costos del tipeo genético de los individuos. Por lo que se deben penalizar las acciones de discriminación.
- 52. Desafíos Existen aspectos éticos que están en discusión y que atañen a toda la sociedad, se pueden señalar: el uso de la información, la privacía y confidencialidad, quién es el dueño de la información, el impacto sicológico y la estigmatización social, el tamizaje genético individual (por pertenecer a una familia con historia de enfermedad genética) o poblacional (recién nacidos, prematrimonial y ocupacional), aspectos reproductivos, derecho a la reproducción, terapia génica, intervenciones genéticas, disponibilidad del uso de las tecnologías genéticas, acceso y financiamiento, aspectos clínicos, comercialización,. implicaciones filosóficas y conceptuales.
Notas del editor
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