tecnologia adn recombinante-clonacion

ADN RECOMBINANTE O
CLONACIÓN CELULAR
Medicina Psicología Odontología Enfermería
Lic. ORLANDO GRANADOS MEJÍA

ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN
CELULAR
La técnica del ADN recombinante se utiliza en:
 estudios sobre la regulación de la expresión génica
 En la regulación de la producción comercial de síntesis de
proteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento
 En el desarrollo de organismos transgénicos
 en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número
de copias de un gen determinado. En este último caso, existe una
técnica mejor, denominada con las siglas PCR (REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA )

PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA ). TECNICA
• consiste en introducir el gen seleccionado en el
interior de un vector y éste, a su vez, dentro de
una célula, denominada célula anfitriona.
• Aprovechando la maquinaria celular, el gen se
expresa, sintetizándose así la proteína
codificada en el gen. Además, al dividirse la
célula, las nuevas células formadas contienen
ese gen que también sintetizan esa proteína.
• Se genera un grupo celular que contiene un
genoma distinto

1.PREPARACIÓN DE LA SECUENCIA DEL ADN PARA SU CLONACIÓN
Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.
•Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).
•Las proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben
separarse del ADN.
•El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de
restricción.
•Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía
líquida o por centrifugación.
Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores
de la expresión génica.

2.Preparación de un vector de clonación
El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar.
Un vector debe presentar las siguientes características:
•Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo,
un plásmido.
•Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que
sean conocidos.
•Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.
•Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.
Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y
seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador
puede ser la resistencia a un antibiótico.

Las etapas del proceso
1.Cortar el vector con enzimas de restricción, las
mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN
que se quiere insertar.
2.Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante
los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o
escalonados.
Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se
denomina ADN inserto, o simplemente, inserto.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser
plásmidos, virus como el fago l, cromosomas creados
de forma artificial.

3. Formación del ADN recombinante
En esta etapa se produce la unión covalente
del vector y el ADN inserto mediante una
ligasa. Así se realiza el sellado de la llamada
Mella, Muesca o Nick.

4. Introducción del ADN recombinante en la célula
anfitriona
Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay
que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.
Los tipos de células anfitrionas son:
•Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo
costo de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.
•Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan
levaduras y células tumorales:
•Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la
regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.
Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es
muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.
Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos
de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes
moléculas.

5.Propagacióndel cultivo
Se induce la división de células anfitrionas, de forma
que se producen también copias de ADN
recombinante y, por ello, la clonación.
Primero se efectúa una siembra en placas Petri con
agar como medio de cultivo.
Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas será
seleccionada y transferida a distintos medios
líquidos, donde seguirá aumentando el número de
individuos de la colonia.

6. Detección y selección de los clones recombinantes
En los procesos de clonación se utiliza un gran número de
células. Al final del proceso se hace necesario separar las células
que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.
La detección y la selección de colonias se realiza en los medios de
cultivo.
En los procesos de clonación se obtienen:
células anfitrionas que no han incluido el vector,
células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el
ADN para recombinar,
y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto.

métodos para detectar y seleccionar
Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que
hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se
transcribe a partir de él.
Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el
ADN recombinante mediante anticuerpos específicos.
Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser:
 Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de
la célula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la
colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN
recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese
gen.

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