Pos Usp Ngs Big Data Parte 2
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1. O documento discute as aplicações do sequenciamento de nova geração (NGS) e como ele revolucionou a ciência biológica ao permitir a análise de grandes volumes de dados genômicos, transcricionais e epigenéticos. 2. As novas tecnologias de sequenciamento, como Illumina e 454, permitem gerar terabytes de dados a um custo muito menor que as técnicas anteriores, possibilitando projetos de sequenciamento em larga escala. 3. O NGS permitiu o desenvolvimento de técnicas
![Produtividade
[Stratton MR, et al. 2009]
Roberta A. Campos PhD, MSc, PD](https://image.slidesharecdn.com/posuspngsbigdataparte2-13509096449455-phpapp02-121022074302-phpapp02/85/Pos-Usp-Ngs-Big-Data-Parte-2-26-320.jpg)
![Resumo de Aplicações
Category - NGS Examples of applications
Comprehensive polymorphism and mutation discovery in
Complete genome resequencing
individual human genomes
Reduced representation sequencing - Draft Large-scale polymorphism discovery
Targeted genomic resequencing Targeted polymorphism and mutation discovery
RNA-seq = Pairend or single end sequencing Discovery of inherited and acquired structural variation
Metagenomic sequencing Discovery of infectious and flora
Quantification of gene expression and alternative splicing;
Transcriptome sequencing transcript annotation; discovery of transcribed SNPs or
somatic mutations.
Small RNA sequencing microRNA profiling
Determining patterns of cytosine methylation in genomic
Sequencing of bisulfite-treated DNA
DNA
Chromatin immunoprecipitation– sequencing
Genome-wide mapping of protein-DNA interactions
(ChIP-Seq)
Nuclease fragmentation and sequencing Nucleosome positioning
Molecular barcoding - NGS Multiplex sequencing of samples from multiple individuals
[Shendure, J & Ji, H, 2008]
Roberta A. Campos PhD, MSc, PD](https://image.slidesharecdn.com/posuspngsbigdataparte2-13509096449455-phpapp02-121022074302-phpapp02/85/Pos-Usp-Ngs-Big-Data-Parte-2-40-320.jpg)
Pos Usp Ngs Big Data Parte 2
- 1. New Generation Sequencing The Big Data Era Roberta A. Campos
- 2. EM 2010 1 ZettaByte (ZB) = 1 Trilhão 1,000,000,000,000 GigaBytes (GB) Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 3. “Big Data Era” na Ciência Researchers need to adapt their institutions and practices in response to torrents of new data — and need to complement smart science with smart searching. Editorial Setembro 2008 1 PetaByte (PB) = 1,000 TeraBytes (TB) = 1,000,000 GigaBytes (GB) Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 4. Ciclo do Conhecimento Gene Knock-outs Protein Assays Point mutations … Microarrays (Kell DB et al., 2004) Genomics Meta-genomics hypothesis-driven science HT proteomics … data-driven science Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 5. Inundação de Dados na Área de Ciências Biológicas genomas completos sequenciados; dados de variações genômicas; projetos de Meta-Genômica; dados de transcritomas; dados de proteínas; dados de interações entre proteínas; ION Torrent… Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 6. E agora, quais são os desafios? Pontos urgentes que devem ser enfrentados: ◦ Transferência de dados, controle de acesso e gerenciamento. ◦ Padronização dos formatos de dados. ◦ Integração dos dados oriundos de múltiplas fontes. Dados com características Multi-dimensionais e em um volume imenso; Exemplo: Análise funcional de variações no DNA em múltiplas amostras em diferentes tipos de tumores utilizando dados de sequenciamento de nova geração... ◦ Modelos preditivos para fenótipos complexos demandam computação intensa (Problemas NP-difíceis – ex. Reconstrução de uma rede Bayesiana para representar um modelo de regulação gênica) Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 7. Integração dos Bancos de Dados Biológicos Características ◦ Grande volume de dados; Desenvolvimento de novos mecanismos e técnicas para o armazenamento e recuperação (e.g. Google BigTable ); ◦ Não há padrão para os nomes dos objetos; Ontologias (e.g. Gene Ontology) e organizações que regulam a nomenclatura (e.g. HUGO) ◦ Não há padrão para acesso aos dados, cuja natureza é distribuída; Utilização de formatação padrão para troca de informações (e.g. GFF) e web services; ◦ Definição variável para alguns conceitos; e.g. gene ◦ Dados altamente heterogêneos mas inter-relacionados; ◦ Informação dinâmica e em constante atualização; Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 8. Soluções computacionais Cloud-based computing; Ambientes computacionais heterogêneos; ◦ Integração de aceleradores especializados (GPUs); Aumento do número de computadores; Otimização de algoritmos; Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 9. Primeiros passos... Compreensão da natureza dos dados, ou seja, da sua magnitude e complexidade, e dos recursos disponíveis (memória, espaço, tenho um servidor?)... Compreensão dos algoritmos. Compreensão das vantagens e desvantagens das arquiteturas disponíveis. ◦ A decisão não é sempre óbvia e muitas vezes consiste em uma combinação delas Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 10. Soluções no Brasil O EMU (Equipamento MultiUsuário) é uma plataforma de alta- performance para análises computacionais aplicadas à genômica e à transcriptômica. Financiamento: Programa Multiusuário da FAPESP de 2010, com uma contra-partida do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer. Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 11. Sequenciamento - NGS Por quê sequenciar ? Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 12. Por quê sequenciar ? Motivação Aplicações diversas: • identificar sequencias funcionais e caracterizar genomas ou transcriptomas; • Da Genômica Comparativa à Expressão gênica... • Propósitos gerais... “NOVA ONDA NGS”... Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 13. Bioinformática • Bioinformática: Pesquisa, desenvolvimento, ou aplicação de ferramentas computacionais e abordagens para expandir a utilização de dados biológicos, médicos, comportamentais e de saúde, incluindo a aquisição, o armazenamento, a organização, o arquivamento a análise ou visualização desses dados. • Computational Biology: O desenvolvimento e aplicação de métodos teóricos e analíticos, incluindo modelagem matemática e aplicação de técnicas de simulações computacionais para o estudo de sistemas biológicos, sociais ou comportamentais. Biomedical Information Science and Technology Initiative Consortium (BISTI - NIH) Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 14. Repositórios de Dados Biológicos 1965 – Atlas of Protein Sequences and Structure (Dayhoff et al.) - ~1Mb 1982 – GenBank – 1988 – NCBI – National Center for Biotechnology Information 1997 – EMBL – European Molecular Biology Laboratory 1986 – DDBJ – DNA Data Bank of Japan Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 15. International Nucleotide Sequence Database Colaboration 1982 606 seqüências 2.427 bases 2008 98.868.465 seqüências 99.116.431.942 bases Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 16. Era “Pós-Genoma” "O PGH aumentou a capacidade de compreensão da complexidade que é a transmissão dos caracteres genéticos” (José Roberto Goldim, UFRGS) Genômica Estrutural ◦ Construção de mapas genéticos, físicos e de transcrição de um organismo. Genômica Funcional ◦ Caracterização das propriedades funcionais dos genes e determinação de Assinaturas Moleculares de Expressão Gênica. Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 17. Projetos “omas” x Pesquisa Clássica em Genética e Bioquímica Genômica Transcritômica Proteômica Epigenômica Metabolômica Nova Onda NGS Science 291:1221. 2001 A. Campos PhD, MSc, PD Roberta
- 18. Genômica Funcional: Análise de Expressão Gênica Genômica Funcional = Métodos de obtenção de dados em larga escala + Métodos de Bioinformática Revolução dos projetos “-omas” (Genome-wide expression “profiling”) Mayo Clin Proc. 2004 May;79(5):651-8 Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 19. Últimos anos – NGS Era Sequenciamento do Genoma Diplóide de um único indivíduo (Craig Venter) The diploid genome sequence of an individual human. (Levy, S. et al. 2007) 2005 2007 Legião de Sequenciadores ... ABI 3730 no JCVI 2003 2006 2008 Genoma James D. Watson Sequenciamento com 454 Conclusão do Projeto Genoma Humano 1000 Genomes Project Next-Generation Sequencing A.Revollution Roberta Campos PhD, MSc, PD
- 20. NEW GENERATION SEQUENCING AND APPLICATIONS Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 21. Nova Geração de Sequenciadores PLATÔ TECNOLOGIA Roche/454 FLX Illumina/Solexa GA ABI SOLiD ABI 3730xl ABI 3730xl Roche/454 FLX Illumina/Solexa GA ABI SOLiD Método Sanger Pirosequenciamento Sequenciamento Sequenciamento por Síntese por Ligação • Aumento na quantidade de Dados • IlluminaHiSeq 2000 (~1 Tb/run - >600Gb Q30 – Tamanho 100bp) • Redução no tempo relativo para obtenção dos dados ( genoma 3Gb (8x) em questão de poucos dias); • Aumento gradual do tamanho das sequências (curtas ~36pb – 400pb); • Redução do custo por base sequenciada. Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 22. Resumo das plataformas http://www.illumina.com/ http://www.my454.com/ http://www.appliedbiosystems.com.br/ Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 23. Trade-offs in Next Generation Sequencing technologies NHGRI Current Topics in Genome Analysis 2010 Elliott Margulies, Roberta A. Campos PhD, MSc, PD Ph.D
- 24. NGS no mundo http://pathogenomics.bham.ac.uk/hts/ Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 25. Novas promessas HeliScope ◦ Helicos BioSciences 2008 ION Torrent ◦ Applied Biosystems 2010 PacBio RS ◦ Pacific Biosciences 2010 Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 26. Produtividade [Stratton MR, et al. 2009] Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 27. Aplicacao Biotecnologica i5K ◦ 5000 genomas de insetos importância especialmente para a agricultura. Genome10K ◦ 10000 genomas de vertebrados diversidade genética entre vertebrados; 1001 Genomes ◦ 1001 genotipos de Arabdopsis thaliana planta modelo, base de estudos outras plantas; 1KP ◦ 1000 genomas de plantas desenvolvimentos de produtos biotecnológicos. Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 28. “Counting Experiments” Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 29. Análise RNA-Seq RNA-Seq RNA-Seq – Quantificação da expresão dos genes no transcriptoma Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 30. Análise ChIP-Seq ChIP-Seq ChIP – Chromatin ImunoPreciptation Reproducibilidade High-Throughput sequencing r = 0.906 (p-value < 2.2e-16). ChIP-Seq – Estudo da estrutura da cromatina Padrão de metilação de histonas no genoma humano ChIP-Seq X GMAT (Genome-wide Mapping Technique) Uma das primeiras publicações utilizando Illumina 1G Genome Analyzer Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 31. Análise Methyl-Seq Methyl-Seq DNA treatment with methyl-sensitive restriction enzymes (HpaII - não metilada, MspI - indiferente) High-Throughput sequencing Methyl-Seq – Estudo de padrões de metilação do DNA em hESCs, células derivadas de hESCs e fígado fetal humano AUC = 0.94 Methyl-Seq x Illumina Infinium methylation status: presence or absence of HpaII tags: average tag count > 1 unmethylated Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 32. Análise microRNA-Seq microRNA-Seq small RNA library (mirVana miRNA Isolation Kit) High-Throughput sequencing microRNA-Seq – Caracterização dos miRNAs expressos em tecido gástrico humano (cardia - estômago) Plataforma SOLiD qRT -PCR 2 -∆Ct Pearson correlation (SOLiDxqRTPCR) r2 = 83.9 (p-value < 0.05) Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 33. Análise de Vias Biológicas Vias metabólicas/regulatórias relacionadas JASMONATO em plantas em diferentes contextos ecologicos Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 34. Interações entre Proteínas Cobertura Ontologia - Paralogia Regioes Conservadas Problemas de ANOTACAO!!! Estima-se que 20% de anotacoes erradas!!! Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 35. Análise de Interações entre Proteínas – Redes Baysianas Protein–protein interactions networks for mutated genes in HCC1954 (A) and HCC1954BL (B). Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 36. Biologia Sistêmica – “New hit” Estudo das interações entre as componentes de um sistema biológico, e como essas interações fazem emergir função e comportamento no sistema; "Systems Biology is the science of discovering, modeling, understanding and ultimately engineering at the molecular level the dynamic relationships between the biological molecules that define living organisms “ Leroy Hood Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 37. CONCLUSÃO Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 38. Perguntas? Roberta Alvares Campos OBRIGADA !!! Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 39. ABORDAGENS EM GRUPOS Brain storm Roberta A. Campos PhD, MSc, PD
- 40. Resumo de Aplicações Category - NGS Examples of applications Comprehensive polymorphism and mutation discovery in Complete genome resequencing individual human genomes Reduced representation sequencing - Draft Large-scale polymorphism discovery Targeted genomic resequencing Targeted polymorphism and mutation discovery RNA-seq = Pairend or single end sequencing Discovery of inherited and acquired structural variation Metagenomic sequencing Discovery of infectious and flora Quantification of gene expression and alternative splicing; Transcriptome sequencing transcript annotation; discovery of transcribed SNPs or somatic mutations. Small RNA sequencing microRNA profiling Determining patterns of cytosine methylation in genomic Sequencing of bisulfite-treated DNA DNA Chromatin immunoprecipitation– sequencing Genome-wide mapping of protein-DNA interactions (ChIP-Seq) Nuclease fragmentation and sequencing Nucleosome positioning Molecular barcoding - NGS Multiplex sequencing of samples from multiple individuals [Shendure, J & Ji, H, 2008] Roberta A. Campos PhD, MSc, PD