1 metodos de estudio en células.
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Las células pueden observarse mediante microscopía óptica, microscopía electrónica y métodos de fluorescencia. La microscopía óptica permite ver la organización estructural general de las células vivas o muertas, mientras que la microscopía electrónica ofrece mayor detalle al nivel subcelular. La fluorescencia permite marcar moléculas específicas para estudiar procesos dinámicos en células vivas.
1 metodos de estudio en células.
- 1. Métodos de Estudio en Biología Celular. Análisis Morfológico. MV. Dr. Daniel M. Lombardo. Curso de Biología Celular y Molecular Maestría de Salud Animal. FCV - UBA
- 3. ¿Cómo podemos observar las células? Las células son elementos pequeños y complejos. Conocerlas depende de las herramientas disponibles. Organización estructural. Composición molecular. Funcionamiento.
- 4. La microscopía de luz es un método poco destructivo. GFP un marcador que permite ver interacciones y desplazamientos. La MO permitió elaborar la teoría celular: Schleiden y Schwann - 1838 Concepto: Examinar células vivas o muertas depende de generar un contraste.
- 6. La MO vs la ME una cuestión de detalles en la escala de valores, ¡ Un siglo después !. La reconstrucción 3D una herramienta detallista.
- 7. El detalle depende de la WL Luz visible 0.4 µm – 0.7 µm Violeta - Rojo La luz tiene naturaleza ondulatoria
- 8. Marcha de los rayos en el MO La naturaleza ondulatoria de la luz genera efectos ópticos de difracción.
- 9. Efectos de interferencia a gran aumento ¿ Que pasa con: • Objetos puntuales • Objetos separados ? LR = 0.2 µm
- 10. ¿Como observamos las células vivas? La preparación de las muestras para MO significa una preocupación para los microscopistas Microscopio de contraste de fase. Microscopio de contraste interferencial. Microscopio de campo oscuro.
- 11. Microscopía de Contraste de Fase
- 12. Como se ven las células vivas.
- 13. Microscopía de Contraste Interferencial
- 14. Mediante un procesador de imágenes se pude incrementar el LR y los detalles en función del aumento de contraste. Concepto: El ojo humano no puede ver bien bajo una luz extremadamente débil y no puede percibir pequeñas diferencias de intensidad de luz sobre un fondo brillante Técnicas electrónicas y digitalización de las imágenes
- 15. ¿ Como observamos células muertas ?. La fijación y los fijadores. El corte y los micrótomos Las coloraciones selectivas: Basofilia – H Acidofilia - E
- 16. ¿ En que se basa la microscopía de fluorescencia ?
- 17. La energía de absorción es mayor que la de emisión
- 18. Las longitudes de onda mas largas son las menos energéticas
- 20. Triple fluorescencia Inmunofluorescencia Marcación fluorescente por anticuerpos
- 21. ¿ Es posible obtener imágenes 3D de objetos complejos en MO ?. MAC = TAC La decombolución se basa en la función de dispersión de un punto
- 23. Microscopía Con focal, una herramienta que genera imágenes bidimensionales
- 25. Reconstrucción 3D en Microscopía con focal Constituye una técnica analógica y no digital pues manipula la luz antes de llegar al objeto.
- 26. El ME resuelve la estructura fina de la célula El LR para un haz de electrones es superior que para la luz natural. La WL de un haz de electrones es inversamente proporcional a su velocidad. 100.000 v WL= 0.004 nm LR= 0.002 nm (100.000 mayor) • LR real = 0.1 nm (aberraciones electrónicas) • LR real = 2 nm (preparación de la muestra y el calor del bombardeo) – 100 veces mayor que el MO.
- 28. Similitudes y diferencias MO vs MET
- 29. ¿ Como se preparan las muestras para ME ? • Fijación • inclusión y corte (50 – 100 nm) ¿ Como aseguramos que luego del procesamiento de la muestra para ME su imagen representa la realidad ? Congelamiento rápido Estado de “Gel Vitreo”
- 30. El contraste de la muestra depende del número atómico de sus átomos C; O; H; N Bajo N° atómico ¡ Hay que contrastar !
- 31. En ME las macromoléculas se pueden inmuno localizar. Técnica de detección con partículas de oro coloidal Sólo para superficies La reconstrucción 3D en ME se hace dificultosa
- 32. Mediante SEM se pueden obtener imágenes de superficie.
- 33. MET vs SEM Sombreado con metales para observación de superficies mediante MET
- 34. ¿ Como podemos observar el interior de las células en ME ? Criofractura • Congelación • Corte • Metalizado con Platino • Disolver la materia orgánica Observación de Partículas de Intramembrana
- 35. Grabadp por congelación Frezze - Etch • Congelación • Corte • Sublimación de H20 en vacio • Sombreado
- 36. La Tinción negativa brinda mas resolución • Se usa para ver macromoléculas Se coloca sobre una película de carbono. Se metaliza con Ac. De Uranilo. Se bombardea con el haz de electrones. El haz de electrones atraviesa donde no hay metal y da una imagen negativa de la macromolécula.
- 37. Imágenes tomadas desde distintas direcciones se pueden combinar para dar lugar a una reconstrucción tridimensional Imágenes por micro tomografía electrónica
- 38. Como observar las células vivas Visualización de la movilización de Ca ++ intracelular utilizando sustancias luminicentes y fluorescentes Luminiscencia Fluorescencia
- 39. Métodos utilizados para introducir en la célula una sustancia para la cual la membrana es impermeable Cito química análoga fluorescente. Inyección de atc bloqueantes.
- 40. La activación inducida por la luz de moleculas precursoras “empaquetadas” facilita el estudio de la dinámica intracelular Moléculas empaquetadas de Ca++, AMPc, GTP e I3P
- 41. Determinación del flujo de microtúbulos del huso mitótico utilizando fluoresceina empaquetada unida a tubulina.
- 42. Estructura de GFP Marcaje con GFP Dinámica del marcaje con GFP
- 43. Las moléculas se pueden marcar con radio isótopos.
- 44. Las moléculas se pueden marcar con radio isótopos para seguir su dinámica en la célula Ensayo de pulso y caza